góp phần tìm hiểu thành phần hóa học cỏ lưỡi rắn (hedyotis corymbosa (l.) lam, rubiaceae)

Đã có một số công bố về thành phần hóa học của cây thuốc này thu hái ở Hong kong, trong đó một số chất có hoạt tính sinh học khá tốt.. Bài báo này trình bày một số kết quả khảo sát hóa h

GÓP PHẦN TÌM HIỂU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

CỎ LƯỠI RẮN (Hedyotis corymbosa (L.) Lam, Rubiaceae)

Tôn Nữ Liên Hương

Bộ môn Hóa Khoa Khoa học

ABSTRACT

Four compounds have been isolated from the arial and root parts of Hedyotis corymbosa (L.) Lam, Rubiaceae By means of IR, MS, 1 H and 13 C NMR spectra and chemical data they were identified as stigmasterol, β-sitosterol, acid oleanolic, acid ursolic

β-sitosterol, acid oleanolic, acid ursolic

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Cỏ Lưỡi rắn Việt Nam có tên khoa học là Hedyotis corymbosa (L.) Lam, họ Cà

phê (Rubiaceae) mọc hoang dại nơi mát, đất cát, trong đông y sử dụng trị rắn cắn, đau gan, mụn nhọt, các chứng viêm nhiễm Nghiên cứu của các nước Nhật, Trung quốc,

Mỹ về các cây Hedyotis corymbosa và diffusa cho thấy dịch trích nước của chúng có

hoạt tính kháng ung bướu - in vivo đối với tế bào ung thư Sarcoma, kháng protease HIV-1 Đã có một số công bố về thành phần hóa học của cây thuốc này thu hái ở Hong kong, trong đó một số chất có hoạt tính sinh học khá tốt Tại Việt Nam cây thuốc này dễ tìm, đã được dùng trong nhiều toa thuốc cổ truyền nhưng chưa có thông báo nào về khảo sát hóa học ngoài khảo sát sinh học thực hiện tại trường Đại học Y Dược Tp.Hồ Chí Minh

Bài báo này trình bày một số kết quả khảo sát hóa học, phân lập và định danh các hợp

chất sterol, triterpenoid có trong cây Hedyotis corymbosa, Cỏ Lưỡi rắn Việt Nam

2 PHƯƠNG PHÁP VÀ PHƯƠNG TIỆN

Nguyên liệu Cỏ Lưỡi rắn thu hái ở Mỹ Tho được giám định là Hedyotis

corymbosa L (Lam), Rubiaceae Cỏ mọc sà, thân mảnh, dài 30-40cm, có nhiều

nhánh; lá nhỏ hẹp dài, nhọn hai đầu, nổi gân giữa, không có khía, mọc đối, cuống rất ngắn, lá nhìn giống lưỡi rắn; hoa rất nhỏ, màu trắng, 4 cánh, 4 lá đài, 4 nhị, thường có

2 đến 5 hoa với cuống phụ ngắn tụ lại thành chùm trên cuống chính dài 1-2cm mọc từ nách lá

Việc khảo sát hóa thực vật được tiến hành trên nguyên liệu bột khô của riêng từng

bộ phận hoa trái, lá, thân, rễ Trước tiên, khảo sát độ ẩm trong cây, hàm lượng tro và định tính các ion vô cơ có trong tro bằng các phản ứng đặc trưng Trích kiệt bột cây khô bằng alcol etil và eter dầu hỏa, sau đó khảo sát định tính các cấu tử hữu cơ bằng các phản ứng đặc trưng đối với các hợp chất sterol, triterpen, flavonoid, tanin, iridoid, glicosid

Chúng tơi tiến hành phân lập các hợp chất sterol, triterpen cĩ trong Cỏ Lưỡi rắn Bằng soxhlet chúng tơi tiến hành trích nĩng kiệt bột cây với dung mơi eter dầu hỏa rồi

xà phịng hĩa thu lấy cao eter dầu hỏa phần khơng xà phịng hĩa và sau đĩ tiếp tục trích kiệt bột cây bằng dung mơi cloroform thu được cao cloroform Từ hai cao này thực hiện sắc ký cột nhanh khơ để phân lập các chất Nạp cột sắc ký dùng silica gel 60H, Merck với các dung mơi giải ly cĩ tính phân cực tăng dần, từ eter dầu hỏa

(60-90oC), benzen, cloroform, etil acetat, alcol etil (cĩ t ỷ lệ tăng dần từ 0-100%) Kiểm tra các phân đoạn ly trích dùng sắc ký bản mỏng loại 25 DC- Alufolien Kieselgel 60 F255, Merck Đối với hợp chất phân lập được đem tinh chế qua sắc ký bản dày, Merck Định danh hợp chất sau khi tổng hợp các kết quả phân tích hĩa lý chuyên sâu Đo điểm nĩng chảy trên khối maquenne Phân tích nguyên tố carbon, hydrogen trên máy phân tích C, H tự động tại Trung tâm Dịch vụ phân tích và thí nghiệm Tp Hồ Chí Minh Ghi phổ hồng ngoại trên máy IR-470 SIMADU Ghi phổ 1H RMN, phổ 13C kết hợp kỹ thuật DEPT RMN trên máy BRUKER AC.200, tần số cộng hưởng 200 và

50 MHz Phổ khối lượng ghi trên máy MS-Engine-5989B-HP (Viện Hĩa học, Trung tâm KHTN và CNQG) theo kiểu va chạm electron (EI) ở 70 eV

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Kết quả xác định độ ẩm của cỏ Lưỡi rắn: hoa và trái 84,6%, lạ 82,3%, thân 82,0%, rễ 77,8% Kết quả hàm lượng tro của cỏ Lưỡi rắn: hoa và trái 8,7%, lá 9,3%, thân 9,6%, rễ 7,0% Kết quả định tính các ion vơ cơ cĩ trong tro: cĩ các ion K+,

Ca2+, Mg2+, Cl-, SO42-, PO43-, khơng cĩ các ion Fe2+, Fe3+, Mn2+ Trắc nghiệm dương tính với thuốc thử Liebermann Burchard, Salkowski, Noller cho biết trong cây cĩ sterol, triterpen Ngồi ra các trắc nghiệm dương tính với các thuốc thử khác như Shibata, H2SO4 đậm đặc; Stiasny, acetat chì, FeCl3 1%; Baljet, Molish; Trim Hill, cho biết trong cây cĩ flavonoid, tanin, glicosid, iridoid, saponin

Thực hiện sắc ký cột cao eter dầu hỏa phần khơng xà phịng hĩa của Cỏ Lưỡi rắn phân lập được 3 chất I, II và IV Thực hiện sắc ký cột cao cloroform phân lập được 2 chất III và IV (vì chất IV thu được ở hai cơng đoạn qua kiểm tra chính là một chất)

* Chất I thu được khi giải ly cột sắc ký cao eter dầu hỏa phần khơng xà phịng hĩa bởi eter dầu hỏa, là tinh thể hình kim, khơng màu, khi sắc ký bản mỏng hiện hình vết màu nâu đỏ với thuốc phun H2SO4 50% Chất I tan tốt trong cloroform, cĩ nhiệt độ nĩng chảy: 165-1660C Phân tích nguyên tố: 84,60% C; 11,20% H Phổ IR (KBr) cho các hấp phụ đặc trưng của nhĩm -OH (3432 1), C=C (1639 1), C-O- (1062 cm-1),-CH, -CH3 (2936-2866 cm-1)

Phổ 1H RMN (CDCl3) cho thấy 1 nhĩm >C=CH với (=5,35ppm (1H, d), 1 nhĩm -CH=CH- với (= 5,09ppm (2H, dd), xác thực nhĩm >CHOH với (= 3,51ppm (1H, m) Phổ 13C RMN định lượng kết hợp DEPT (CDCl3) cho biết phân tử chất I cĩ 29 C gồm 1 nhĩm >C= (140,73ppm) và 3 nhĩm CH= (các pic 138,29; 129,25; 121,68ppm),

1 C tam cấp mang nhĩm -OH, hai C tứ cấp, 9 nhĩm -CH2- và 13 nhĩm loại CH và

-CH3

CH3

HO

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

1 2

3

4 5 6 7 8 9 10

11 12

13

16 17 18

19

20

21 22

23

24 25 26

27

28 29

β - Sitosterol

CH 3

HO

CH 3

CH 3

CH 3

CH 3

CH 3 1 2 3

8 9 10

11 12 13

16 17 18 19

20

21 22 23

24

27

28 29

Các dữ liệu phổ nghiệm so sánh với phổ chuẩn đều trùng khớp, cho phép kết luận chất I là Stigmasterol, công thức C29H48O

* Chất II thu được khi giải ly cột sắc ký cao eter dầu hỏa phần không xà phòng

hóa bởi hệ dung ly (eter dầu hỏa: benzen = 7: 3) là tinh thể hình kim, không màu, khi sắc ký bản mỏng hiện hình vết màu nâu đỏ với thuốc phun H2SO4 50% Chất II có nhiệt độ nóng chảy: 1400C, tan tốt trong cloroform Phân tích nguyên tố: 84,07%C, 11,67%H

Phổ IR (KBr) cho các hấp phụ đặc trưng của nhóm -OH (3421 cm-1), C=C (1640

cm-1), C-O- (1380 cm-1),-CH, -CH3 (2936-2868 cm-1)

Phổ 1H RMN (CDCl3) khác chất I là chỉ cho thấy 1 nhóm >C=CH- δ=5,36ppm (1H, d), nhóm >CHOH với pic δ=3,37ppm (1H,dd)

Phổ 13C RMN định lượng (CDCl3) kết hợp DEPT của chất II cho biết phân tử có

29 C gồm 1 nhóm >C= (140,74ppm), 1 nhóm -CH= (121,70ppm), 1 C tam cấp mang nhóm -OH, 11 nhóm -CH2-, hai C tứ cấp và 13 C khác Các dữ liệu phổ nghiệm so sánh với phổ chuẩn đều trùng khớp cho phép kết luận chất II là (-Sitosterol, công thức

C29H50O

* Chất III thu được khi giải ly cột sắc ký cao cloroform bởi hệ dung ly benzen:

cloroform = 1: 1) là tinh thể hình kim, không màu, nhiệt độ nóng chảy: 2990C, tan trong alcol metil, sắc ký bản mỏng hiện hình vết tròn màu đỏ sen với thuốc phun

H2SO450%

Phổ IR (KBr) cho các hấp phụ đặc trưng của nhóm -OH (3437 cm-1), -CH, -CH3 (2943-2868 cm-1), -COOH (1694 cm-1), C-O- (1030 cm-1)

Phổ 1H RMN (MeOD) cho thấy có 1 nhóm -COOH (=11,78ppm (1H, m), 1 nhóm

>C=CH- (=5,08 ppm (1H, m), nhóm >CHOH với tín hiệu vùng 4,59 và 4,20ppm

CH3

CH3

CH 3 1 2 3

4 5 6 7

8 9 10

11

12 13 14

1516

17 18 19 20 21 22

27

28 29

CH 3

H3C

COOH

H3C

CH3

30

Acid oleanolic

Phổ 13C RMN định lượng (MeOD) kết hợp DEPT cho biết phân tử của chất III cĩ

30 C gồm 1 nhĩm -COOH (181,72ppm), 1 nhĩm =C< (145,11ppm), 1 nhĩm -CH= (123,58ppm), 1 C tam cấp mang nhĩm -OH (79,62ppm), 10 nhĩm -CH2-, 5 C tứ cấp

và 11 C khác Chúng tơi nhận thấy chất III là triterpen cĩ chứa 1 nhĩm OH, 1 nhĩm -COOH, 1nối đơi đặc trưng của họ β-amyrin (trên phổ 13C RMN cĩ cặp pic ở vùng từ trường thấp khoảng 123ppm và 145ppm) nên đã chọn acid Oleanolic làm mẫu chuẩn

để so sánh với nĩ và thấy kết quả trùng khớp Song song đĩ khi ghi phổ MS với [M]+

= 456, các mảnh phân cắt chính phù hợp số liệu trong tư liệu khẳng định rằng chất III này là acid Oleanolic cơng thức C30H48O3

* Chất IV thu khi được giải ly cột sắc ký cao cloroform bởi cloroform, là tinh thể hình kim, khơng màu, khi sắc ký bản mỏng hiện hình vết trịn màu đỏ sen với thuốc phun H2SO4 50% Chất IV cĩ nhiệt độ nĩng chảy: 259 -2600C, tan trong alcol metil

Phổ IR (KBr) cho các hấp phụ đặc trưng của nhĩm -OH (3429 cm-1), -CH, -CH3 (2932-2800 cm-1), -COOH (1689 cm-1), C-O- (1040 cm-1)

Phổ 1H RMN (DMSO-d6) cho thấy cĩ 1 nhĩm -COOH δ=12,57ppm (1H, m), 1 nhọm >C=CH- δ=5,12 ppm (1H, m), nhĩm >CHOH với tín hiệu

ở vùng 4,14 và 4,10ppm

Phổ 13C RMN định lượng (DMSO-d6) kết hợp DEPT RMN cho biết phân tử của chất IV cĩ 30 C gồm 1 nhĩm -COOH (178,49ppm), 1 nhĩm =C< (138,37ppm), 1nhĩm CH= (124,81ppm), 1 C tam cấp mang nhĩm -OH (77,08ppm), 9 nhĩm -CH2-, 4 C tứ cấp và 13 C khác

Phổ MS cho biết [M]+ = 456, thỏa đúng cơng thức C 30 H 48 O 3 Chúng tơi nhận thấy chất

IV là triterpen cĩ chứa 1 nhĩm -OH, 1 nhĩm -COOH, 1 nối đơi đặc trưng của họ (-amyrin nên chúng tơi chọn acid Ursolic làm mẫu chuẩn để so sánh với nĩ và thấy kết quả trùng khớp

Acid ursolic

HO

CH3

CH3

CH3

1 2 3

4 5 6 7

8 9 10

11

12 13 14

1516

17 18

1920 21 22

23 24

25 26

27

28 29

CH3

COOH

H3C

CH3 30

CH3

4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

Cỏ Lưỡi rắn thu hái ở Mỹ Tho có độ ẩm trung bình 81,68%, hàm lượng tro trung bình 8,65%, trong tro có các ion K+, Ca2+, Mg2+, Cl-, SO42-, PO43-, không có các ion

Fe2+, Fe3+, Mn2+, trong bột cây khô có sterol, triterpen, flavonoid, tanin, iridoid, glicosid,saponin

Từ bột cây khô của cỏ Lưỡi rắn bằng sắc ký cột silica gel chúng tôi đã phân lập và khảo sát cấu trúc hóa học được 4 hợp chất tinh khiết: stigmasterol (hiệu suất 0,01% trên cây khô), β-sitosterol (hiệu suất 0,09%), acid oleanolic (hiệu suất 0,04%), acid ursolic (hiệu suất 0,18%)

Qua các tài liệu đã công bố stigmasterol và β-sitosterol có khả năng chữa trị rắn cắn, acid oleanolic và đặc biệt acid ursolic là những hợp chất chống viêm gan (đã thử

nghiệm in-vivo trên chuột), và có tác dụng ức chế sự phát triển tế bào ung thư (đã thử nghiệm in-vitro trên các tế bào ung thư phổi người A549, buồng trứng SK-OV-3, da

SK-MEL-2, não XF498, ruột kết HCT-15, dạ dày SNU-1, bệnh bạch cầu và u hắc sắc tố) Các chất đã phân lập được với hàm lượng khá cao từ cỏ Lưỡi rắn bước đầu góp phần chứng minh khoa học cho khả năng trị liệu của cây thuốc được biết đến từ thời Tuệ Tĩnh này

Chúng tôi hy vọng rằng các kết quả nói trên sẽ thu hút ngày càng nhiều hơn sự chú

ý của các nhà hóa học và dược học ở nước ta

TÀI LIỆU THAM KHẢO

o Cosimo Pizza, Zhou Zhong Liang, Nunziatina de Tomasi 1987 Journal of Natural Products Vol 50 (5) p 927-931

o Greca Marina Della, Pietro Monaco 1990 J of Nat Products Vol 53 (6) p 1430-1435

o Hong Xi Xu, Min Wan, Boon Nei Loh 1996 Screening of traditional medicines for their inhibitory activity againt HIV-1 protease Phytotherapy research Vol 10 p 207-210

o Horst Fribolin 1993 Basic one and two dimensional NMR spectrocopy p

384

o Lê Quang Toàn 1993 Tổng quan về thành tựu trong nghiên cứu hợp chất thiên nhiên từ thực vật dùng để phòng và chữa bệnh Hóa học và hóa chất

Số 3

o Lim Sung Hoon, Ahn Byung Zun, Ryo Shi Yong 1998 Antiturmor effects

of ursolic acid isolated from Old diffusa Phytotherapy research 12 (8) p 553-556

o Nuno A Pereira, Bettina M Ruppelt Pereira, Maria Celia do Nascimento, Walter B Morst 1994 Planta Medica 60 p 90-100

o 1993 The Aldrich Liabry of 13C, 1H NMR spectra S 440-9 CAS [83-49-7] Aldrich chemical company Inc

o Võ Văn Chi 1997 Từ điển cây thuốc Việt Nam Nhà xuất bản Y học

o Walter Martz 1992 Plants with a reputation againt snakebite Toxicon 30 (10) p 1131-1142

PHỤ LỤC

Bảng số liệu phổ 13 C RMN ( δ ppm) của các chất stigmasterol (I), β-sitosterol (II), acid oleanolic (III), acid ursolic (IV) đã phân lập

Vị trí

C

Chất (I)

Chất (II)

Chất

(III)

Chất

(IV)

Vị trí

C

Chất (I)

Chất (II)

Chất (III)

Chất

(IV)

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

37,23 28,91 71,78 39,66 140,73 121,68 31,63 31,87 50,13 36,49 21,08 42,27 42,19 56,84 24,35

37,23 31,64 71,79 42,29 140,74 121,70 31,88 31,88 50,11 36,49 21,06 39,75 42,29 56,74 24,28

39,77 27,81 79,62 40,34 56,68 19,45 33,75 40,48 48,14 38,09 24,48 123,58 145,11 42,81 29,00

34,85 27,30 77,09 38,58 55,04 18,40 33,00 39,70 47,03 36,73 23,30 124,81 138,37 41,81 28,10

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

29

30

28,20 55,93 19,39 12,02 40,47 21,09 138,29 129,25 51,21 31,87 21,20 19,38 25,39 12,23

28,90 55,93 11,84 19,37 36,00 18,60 33,90 26,10 45,69 29,10 19,70 18,96 23,04 11,84

24,30 47,72 42,64 47,55 31,55 34,85 34,20 28,73 16,28 15,99 17,65 26,40 181,72 33,55 23,96

24,30 47,25 52,59 39,28 38,87 30,70 36,56 28,47 15,45 16,28 17,10 23,49 178,49 17,24 21,33