Cải biến gen mã hóa enzyme phytase từ nấm mốc Aspergillus niger nhằm tăng khả năng hồi tính của phytase sau khi bị biến tính ở nhiệt độ cao

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --- Đặng Thị Kim Anh CẢI BIẾN GEN MÃ HÓA ENZYME PHYTASE TỪ NẤM MỐC Aspergillus niger NHẰM TĂNG KHẢ NĂNG HỒI TÍNH CỦA PHYTASE

Trang 1

-

Đặng Thị Kim Anh

CẢI BIẾN GEN MÃ HÓA ENZYME PHYTASE TỪ NẤM MỐC

Aspergillus niger NHẰM TĂNG KHẢ NĂNG HỒI TÍNH CỦA PHYTASE SAU KHI BỊ BIẾN TÍNH Ở NHIỆT ĐỘ CAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2015

Trang 2

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Đặng Thị Kim Anh

CẢI BIẾN GEN MÃ HÓA ENZYME PHYTASE TỪ NẤM MỐC

Aspergillus niger NHẰM TĂNG KHẢ NĂNG HỒI TÍNH CỦA PHYTASE SAU KHI BỊ BIẾN TÍNH Ở NHIỆT ĐỘ CAO

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Trang 3

K21-Sinh học thực nghiệm Đặng Thị Kim Anh

Lời cảm ơn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Vũ Nguyên Thành, Thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn này Thầy cũng chính là tấm gương đầy nhiệt huyết, say mê nghiên cứu khoa học giúp tôi tiếp cận, trau dồi kiến thức mới từ đó có thể định hướng, giải quyết các vấn đề trong quá trình nghiên cứu

Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn TS Trần Văn Tuấn cùng các thầy, cô giáo trong Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã nhiệt tình giảng dạy, dìu dắt tôi trong thời gian học tập tại trường

Trong quá trình thực hiện luận văn, tôi cũng nhận được rất nhiều sự quan tâm giúp đỡ của các thầy cô giáo thuộc Bộ môn Sinh lý thực vật và Hóa sinh Tôi xin chân thành cảm ơn

Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới các anh, chị nghiên cứu viên và các bạn sinh viên làm việc tại Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp, Viện Công nghiệp Thực phẩm đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và làm việc tại Trung tâm

Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình và bạn bè đã luôn ở bên, khích

lệ động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Hà Nội, ngày 25 tháng 06 năm 2015

Học viên

Đặng Thị Kim Anh

Trang 4

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN 3

1.1 AXIT PHYTIC VÀ PHYTATE 3

1.2 ENZYME PHÂN GIảI PHYTATE (PHYTASE) 4

1.2.1 Phân loại enzyme phytase 4

1.2.2 Nguồn phytase 6

1.3.ỨNG DụNG CủA PHYTASE 7

1.3.1 Trong chăn nuôi 7

1.3.2 Trong công nghệ thực phẩm 8

1.3.3 Trong công nghiệp giấy 8

1.3.4 Trong cải tạo đất 9

1.3.5 Trong tổng hợp các dẫn xuất myo-inositol phosphate 9

1.4.CÁC NGHIÊN CứU TÁCH DÕNG BIểU HIệN PHYTASE TRÊN THế GIớI 10

1.5.CÁC NGHIÊN CứU Về ENZYME PHYTASE ở VIệT NAM 11

1.6.CấU TRÖC PROTEIN LIÊN QUAN ĐếN KHả NĂNG HồI TÍNH CủA PHYTASE Từ A NIGER VÀ A FUMIGATUS 13

CHƯƠNG 2 – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1.NGUYÊNLIỆU 18

2.1.1 Hóa chất 18

2.1.2 Vi sinh vật 19

2.1.3 Thiết bị 21

2.1.4 Môi trường nuôi cấy 21

2.2.PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU 21

2.2.1 Phương pháp Mega-PCR 21

2.2.2 Tinh sạch sản phẩm PCR từ gel agarose bằng bộ kit GenJET TM Gel Extraction 22

2.2.3 Ghép nối plasmid 23

2.2.4 Biến nạp sản phẩm ghép nối plasmid vào E coli bằng sốc nhiệt 23

2.2.5 Tách chiết plasmid từ vi khuẩn E.coli bằng bộ kit GenJET TM Plasmid Miniprep 24

2.2.6 Chuyển gen vào tế bào nấm men Pichia pastoris bằng phương pháp biến nạp xung điện 24

Trang 5

2.2.7 Tách chiết DNA tổng số của Pichia pastoris 25

2.2.8 Phương pháp nuôi biểu hiện nấm men Pichia pastoris 26

2.2.9 Phương pháp điện di protein SDS - PAGE 26

2.2.10 Xác định hoạt tính phytase 27

2.2.11 Lọc enzyme bằng thiết bị Viva Flow 200 29

2.2.12 Tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký tương tác kỵ nước 29

CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 29

3.1.CẢIBIẾNTRÌNHTỰGENMÃHÓAPHYTASE 30

3.1.1 Phân tích đặc tính các gen phyA đã được tách dòng tại Viện Công nghiệp Thực phẩm liên quan tới tính bền nhiệt 30

3.1.2 Tạo đột biến điểm thay thế 4 axit amin bằng Mega-PCR 31

3.1.3 Tạo plamid chứa gen phyA-P12 mang đột biến điểm 34

3.2.CHUYỂNGENPHYAVÀOTẾBÀONẤMMENPICHIA PASTORIS 38

3.2.1 Chuyển gen vào tế bào Pichia pastoris X33 bằng phương pháp biến nạp xung điện 38

3.2.2 Kiểm tra gen mã hóa phytase trong genome của Pichia pastoris 40

3.2.3 Sàng lọc các thể biến nạp sinh phytase tái tổ hợp 41

3.3.THUHỒIVÀTINHSẠCHENZYMEPHYTASETÁITỔHỢP 42

3.4.XÁCĐỊNHCÁCĐẶCTÍNHCỦAENZYMEPHYTASETÁITỔHỢPSAU KHICẢIBIẾNGEN 44

3.4.1 Xác định pH tối ưu của phytase tái tổ hợp 44

3.4.2 Kiểm tra độ bền với các dải pH của phytase tái tổ hợp 45

3.4.3 Xác định nhiệt độ tối ưu của phytase tái tổ hợp 46

3.4.4 Kiểm tra khả năng hồi tính của phytase tái tổ hợp sau khi bị biến tính ở nhiệt độ cao 47

KẾT LUẬN 50

KIẾN NGHỊ 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

PHỤ LỤC 60

Trang 6

BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis

YPDS Yeast Extract-Peptone-Dextrose-Sorbitol

Trang 7

đĩa 24 giếng 41

Bảng 3.2 Hiệu suất thu hồi enzyme phytase tái tổ hợp bằng phương pháp lọc luân

hồi Viva Flow 200 với kích thước màng 5 kDa 42

Trang 8

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc phân tử của myo-inositol - 1, 2, 3, 4, 5, 6 - hexakis dihydrogen

phosphate (axit phytic) 3

Hình 1.2 Cấu trúc protein của 4 nhóm enzyme phytase 5

Hình 1.3 Cấu trúc tinh thể của enzyme phytase từ Aspergillus fumigatus 14

Hình 1.4 Các cấu trúc đóng vai trò trong khả năng hồi tính của phytase

A fumigatus 16

Hình 2.1 Sơ đồ cấu trúc của vector pPICZαA, B, C 18

Hình 2.2 Phương pháp Mega-PCR cơ bản 22

Hình 3.1 Mô tả thí nghiệm tạo đột biến điểm thay thế 4 axit amin trên gen phyA 31

Hình 3.2 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR, Mega – PCR 1 trên gel agarose 1% trong đệm TAE ×0.5 32

Hình 3.3 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR, Mega – PCR 2 trên gel agarose 1% trong đệm TAE ×0.5 33

Hình 3.4 Kết quả biến nạp sản phẩm ghép nối gen phyA mang 4 đột biến điểm vào vector pPICZαA 34

Hình 3.5 Điện di kiểm tra sản phẩm cắt giới hạn trên gel agarose 1% trong đệm TAE ×0.5 35

Hình 3.6 Kết quả phân tích trình tự 5 plasmid pPICZαA/phyA/AAS1 - 5 sau khi tạo đột biến điểm bằng phần mềm Bioedit 7.2.5 36

Hình 3.7 Trình tự gen mã hóa phyA bền nhiệt từ Aspergillus niger CNTP 5131 và vị trí liên kết trong pPICZαA của chủng tái tổ hợp Pichia pastoris CNTP 9057 37

Hình 3.8 Kết quả điện di sản phẩm cắt giới hạn bằng MssI trên gel agarose 1% trong đệm TAE ×0.5 39

Hình 3.9 Kết quả biến nạp vector pPICZαA/phyA/P12 và pPICZαA/phyA/AAS5 vào tế bào Pichia pastoris X33 bằng phương pháp xung điện 39

Hình 3.10 Kết quả điện di sản phẩm PCR bằng cặp mồi T-EcoRI-F/ phyA-Stop-XbaI-R2 trên gel agarose 1% trong đệm TAE ×0.5 40

Hình 3.11 Kết quả điện di phytase tái tổ hợp trên gel SDS – PAGE 12% 43

Hình 3.12 Xác định pH tối ưu của phytase tái tổ hợp sau khi thay thế 4 axit amin

45

Hình 3.13 Đánh giá độ bền pH của phytase tái tổ hợp sau khi thay thế 4 axit amin 46

Trang 9

Hình 3.14 Xác định nhiệt độ tối ƣu của phytase tái tổ hợp sau khi thay thế 4 axit

amin 47

Hình 3.15 Đánh giá độ bền nhiệt của phytase tái tổ hợp sau khi thay thế 4 axit

amin 48

Trang 10

K21-Sinh học thực nghiệm 1 Đặng Thị Kim Anh

MỞ ĐẦU

Axit phytic (myo-inositol hexakisphosphate) là dạng phospho dự trữ chủ yếu

của thực vật Axit phytic có thể chiếm 65 – 80% lượng phospho trong các loại ngũ cốc, hạt các cây họ đậu và họ cải Ngoài chức năng dự trữ phospho, axit phytic còn liên kết chặt chẽ với các nguyên tố khoáng như Ca, Mg, Fe, Zn Axit phytic có tính chất kháng tiêu hóa do khả năng liên kết với các protein, enzyme trong dịch tiêu hóa của động vật

Enzyme phytase (myo-inositol-1,2,3,4,5,6-hexakisphosphate hydrolase) có vai trò quan trọng trong chăn nuôi Phytase xúc tác cho phản ứng thủy phân axit phytic thành những gốc phospho đơn vô cơ và các dẫn xuất đơn giản của

phospho-myo-inositol Do vậy, khi bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, phytase không chỉ có tác

dụng làm tăng khả năng hấp thu phospho, các nguyên tố khoáng mà còn cải thiện khả năng tiêu hóa các hợp chất khác, đồng thời làm giảm lượng phospho thải ra ngoài, góp phần bảo vệ môi trường

Phytase thương phẩm hiện nay được sản xuất chủ yếu dựa trên nguồn gen từ

nấm mốc Aspergillus niger Phytase từ A niger có một số ưu điểm như hoạt động ở

pH thấp, phù hợp với môi trường axit của dịch dạ dày, có tính đặc hiệu cơ chất với

phytate cao, và bền với tác động của pepsin Phytase từ A niger có nhược điểm là

kém bền nhiệt Trong công đoạn ép viên, thức ăn chăn nuôi thường được gia nhiệt

tới 70-80°C để diệt Salmonella Chính vì vậy, enzyme bổ sung vào thức ăn chăn

nuôi phải đáp ứng yêu cầu về độ bền nhiệt

Để đáp ứng yêu cầu kỹ thuật ngày càng cao, enzyme công nghiệp thường được cải biến theo hướng thay đổi cấu trúc nội tại Một số nghiên cứu cấu trúc của

phytase bền nhiệt từ A fumigatus cho thấy liên kết hydro và tương tác ion trong cấu

trúc không gian có vai trò đảm bảo khả năng “đàn hồi” nhiệt của enzyme Phytase

của A niger không có những liên kết này nên dễ dàng bị bất hoạt và không có khả

năng hồi tính Việc cải biến trình tự axit amin của phytase có thể gia tăng tính “đàn hồi” nhiệt của enzyme

Một trong những hướng nghiên cứu được thực hiện tại Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp, Viện Công nghiệp Thực phẩm là khai thác nguồn gen thiên nhiên Việt Nam nhằm tạo enzyme tái tổ hợp phục vụ ứng dụng trong chăn nuôi Với phytase,

đã có 24 gen từ các loài khác nhau thuộc chi Aspergillus được tách dòng và nghiên

Trang 11

cứu Trong số đó, phytase từ A niger đƣợc tách dòng và biểu hiện trên Pichia pastoris Giống nhƣ các phytase tự nhiên khác từ A niger, enzyme thu nhận đƣợc

chƣa đảm bảo đƣợc tính bền nhiệt nhƣ mong muốn Vì vậy, chúng tôi tiến hành

thực hiện đề tài nghiên cứu: “Cải biến gen mã hóa enzyme phytase từ nấm mốc Aspergillus niger nhằm tăng khả năng hồi tính của phytase sau khi bị biến tính ở nhiệt độ cao” nhằm cải thiện đặc tính công nghệ của enzyme tái tổ hợp Để đạt

đƣợc mục tiêu trên, gen mã hóa phytase từ nấm mốc A niger đƣợc biến đổi bằng

Mega-PCR tạo 4 axit amin mới thay thế cho 4 axit amin trong cấu trúc protein nhằm tăng độ bền vững đồng thời duy trì các đặc tính cơ bản về hoạt tính và pH hoạt động của enzyme

Trang 12

Chương 1 – TỔNG QUAN 1.1 Axit phytic và phytate

Axit phytic lần đầu tiên được Hartig tìm thấy năm 1855 ở dạng hạt nhỏ trong hạt giống của một số loài thực vật và có kích thước tương đương hạt tinh bột khoai tây Khi kiểm tra bằng phương pháp thử iod, Hartig nhận thấy các hạt này không phải là tinh bột và chứa chất dinh dưỡng dự trữ cho sự nảy mầm của hạt [27, 28] Sau Hartig, cũng đã có nhiều nhà nghiên cứu tìm thấy hạt phytic và khẳng định thành phần hóa học chính của nó là carbon, phospho và các ion kim loại và không phải protein hay lipid Chúng có tên là „phytin‟ do nguồn gốc từ thực vật và không được phát hiện thấy ở thịt hay trong các sản phẩm từ sữa Winterstein, Schulze và Posternak đã chỉ ra rằng thủy phân phytin bằng axit sẽ giải phóng axit phosphoric

và inositol [66] Năm 1914, Anderson đã mô tả cấu trúc phân tử của myo-inositol -

1, 2, 3, 4, 5, 6 – hexakis dihydrogen phosphate, được gọi là axit phytic [7] (Hình1.1):

Hình 1.1 Cấu trúc phân tử của myo-inositol - 1, 2, 3, 4, 5, 6 - hexakisdihydrogen phosphate (axit phytic)

Phytate là muối của axit phytic là dạng dự trữ phospho và khoáng chất chủ yếu của thực vật đặc biệt ở ngũ cốc, cây họ đậu và các loại hạt có dầu Chúng chiếm khoảng 75% tổng lượng phospho của hạt và thấp hơn ở các bộ phận khác của cây như rễ, củ, chồi, với hàm lượng chỉ khoảng 0.1% [44, 45] Trong quá trình nảy mầm của hạt, phytate bị thủy phân tạo phospho vô cơ cùng với khoáng chất như canxi, magiê là những chất cảm ứng cho quá trình nảy mầm và phát triển của cây con Điều này giải thích cho vai trò quan trọng của phytate trong quá trình chuyển hóa của thực vật

Trang 13

Với động vật, axit phytic có hiệu ứng kháng dinh dưỡng rất mạnh nhờ khả năng liên kết chặt chẽ với các phân tử protein và các nguyên tố kim loại như Ca2+

,

Mg2+, Zn2+ Những liên kết này tạo phức hợp không hòa tan trong đường tiêu hóa, dẫn đến ức chế khả năng hấp thụ khoáng của động vật [17, 47] Trong số các kim loại, kẽm là nguyên tố vi lượng mà hoạt tính sinh học của nó bị ảnh hưởng lớn nhất bởi axit phytic Axit phytic bổ sung vào thức ăn có thể làm giảm mạnh khả năng hấp thụ ion Zn2+ và giảm trọng lượng của chuột [48] Axit phytic còn tương tác với protein trong dải pH rộng để tạo thành phức hợp phytate-protein Liên kết giữa protein thực vật với axit phytic làm giảm độ hòa tan, giảm khả năng bị phân cắt của protein và do vậy làm giảm giá trị dinh dưỡng của chúng Hơn nữa, ngoài liên kết với muối khoáng, protein, axit phytic còn tương tác với các enzyme tiêu hoá như trypsin, pepsin, α-amylase và β-galactosidase, làm giảm hoạt tính của những enzyme này [20, 32, 55]

1.2 Enzyme phân giải phytate (phytase)

Phytase (myo-inositol-1,2,3,4,5,6-hexakisphosphate phosphohydrolase) xúc tác phản ứng thủy phân myo-inositol-1,2,3,4,5,6-hexakisphosphate (phytate) thành những gốc phosphate đơn vô cơ và những dẫn xuất đơn giản hơn của myo-inositol phosphate Ở một số loài nấm, phytase có thể giải phóng myo-inositol tự do

1.2.1 Phân loại enzyme phytase

Ủy ban danh pháp enzyme thuộc Hiệp hội Hóa sinh Quốc tế (The Enzyme Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry) phân loại phytase thành ba dạng bao gồm [75]:

Dạng 1: EC 3.1.3.8

Tên đề xuất: 3-phytase

Tên phân loại: myo-inositol-hexakisphosphate-3-phosphohydrolase Tên khác: phytase, phytate-1-phosphatase, phytate-3-phosphatase,

phytate-6-phosphatase

Dạng 2: EC 3.1.3.26

Tên phân loại: myo-inositol-hexakisphosphate-4-phosphohydrolase

Trang 14

Tên khác: phytase, 6-phytase, phytate-6-phosphatase

Dạng 3: EC 3.1.3.72

Tên phân loại: myo-inositol-hexakisphosphate-5-phosphohydrolase

Tên khác: phytase; phytate-5-phosphatase

Sự phân loại này dựa trên cơ sở vị trí nhóm phosphate đầu tiên bị phytase tấn công Enzyme 3-phytase (EC 3.1.3.8) tấn công vào nhóm phosphate ở vị trí thứ 3 và 4-phytase (EC 3.1.3.26) tấn công đầu tiên vào nhóm phosphate số 4; đây là hai dạng phytase điển hình của vi sinh vật Enzyme 5-phytase (EC 3.1.3.72) tấn công đầu tiên vào nhóm phosphate số 5; đây là dạng điển hình cho phytase từ thực vật

Hình 1.2 Cấu trúc protein của 4 nhóm enzyme phytase: β-Propellar Phytase (BPPhy), Protein tyrosine phytase (PTPhy), Purple Phosphatase Acid (PAPhy) và Histidine Acid Phosphatase (HAPhy) [67]

Theo tính năng và cấu trúc, người ta còn chia phytase ra 4 nhóm như sau: (1) Propellar Phytase (BPPhy): hoạt động ở pH kiềm và cần ion Ca2+ cho khả năng xúc

β-tác và bền nhiệt, sản phẩm cuối cùng là myo-inositol triphosphate (IP3); (2) Protein

tyrosine phytase (PTPhy): hoạt động ở pH axit, chứa nhóm xúc tác cysteine, sản phẩm cuối cùng là inositol 2-monophosphate; (3) Purple Phosphatase Acid (PAPhy): chứa axit amin có gắn kim loại Fe2+ và Fe3+, Zn2+, Mg2+ hoặc Mn2+ ở trung tâm hoạt động, cơ chế xúc tác của enzyme này vẫn chưa được làm sáng tỏ; (4) Histidine Acid Phosphatase (HAPhy): hoạt động ở pH thấp, chứa trình tự axit amin bảo thủ: RH[GN]xRx[PAS] ở đầu N và HD ở đầu C (Hình 1.2) Các nhóm này khác nhau về cấu trúc phân và cơ chế xúc tác cho phép chúng sử dụng axit phytic làm

Trang 15

nguồn cơ chất trong các môi trường khác nhau Trong đó, phytase của Aspergillus niger và Aspergillus fumigatus thuộc nhóm Histidine Acid Phosphatase được

nghiên cứu rộng rãi nhất

1.2.2 Nguồn phytase

Phytase rất phổ biến trong tự nhiên, nó đã được tìm thấy từ vi sinh vật, thực vật và động vật

Phytase từ vi sinh vật

Hoạt tính phytase từ vi sinh vật thường thấy nhất ở nấm mốc, đặc biệt ở các

loài thuộc chi Aspergillus Shieh và Ware (1968) đã phân lập và tuyển chọn từ đất

hơn 2000 chủng vi sinh vật để sản xuất phytase Hầu hết các chủng sản sinh phytase nội bào, chỉ có 30 chủng sinh phytase ngoại bào và chúng đều là nấm sợi, trong đó

28 chủng thuộc chi Aspergillus, 1 chủng thuộc chi Penicillum và 1 chủng thuộc Mucor Trong 28 chủng của chi Aspergillus sản sinh phytase, có 21 chủng thuộc về loài A niger [53] Những nhóm nghiên cứu khác như Howson và Davis (1983), Volfova và cs (1994) đã khẳng định rằng A niger là loài có khả năng sản sinh

phytase ngoại bào tốt nhất [31, 65] Một số phytase từ một số nấm men khác đã

được phát hiện như: Pichia anomala [64], Saccharomyces cerevisiae [59]

Phytase cũng đã được tìm thấy trong các nhóm vi khuẩn như: Aerobacter aerogenes, Pseudomonas sp., Bacillus subtilis, Klebsiella sp., Enterobacter sp [25,

33, 52, 72] Những vi khuẩn sinh phytase ngoại bào là những chủng thuộc về chi

Bacillus và Enterobacter còn phytase từ E coli lại là enzyme nội bào Năm 2005, Cheng và CS đã mô tả cấu trúc phytase dạng β ở loài ưa lạnh Shewanella oneidensis MR-1 nó có 30% peptide tương đồng với trình tự phytase của Bacillus sp Đặc biệt,

với khả năng hoạt động ở nhiệt độ thấp phytase này có tiềm năng ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản, khi nhiệt độ thường thấp hơn 30°C [12]

Phytase từ thực vật

Phytase được tìm thấy rộng rãi trong giới thực vật Phytase từ phấn hoa lily hoạt động ở pH tối ưu 8,0 và nhiệt độ tối ưu 55 C [34] Hegeman (2001) đã tìm ra gen mã hóa phytase từ mầm đậu tương [29] Sự có mặt của phytase được tìm thấy trong ngũ cốc, cây họ đậu và hạt có dầu [63] hoặc rau quả như: lê tàu và lá hành

Trang 16

tươi [43] Đặc biệt, một số loại hạt ngũ cốc (lúa mì, lúa mạch .) có hoạt tính phytase cao và có thể đạt trên 5000 IU kg-1

Phytase từ động vật

Các nhà khoa học đã chứng minh có sự tồn tại phytase trong cơ thể động vật dạ dày đơn [13] Tuy nhiên, phytase này trong ruột non động vật dạ dày đơn không có vai trò rõ ràng trong việc phân giải muối phytate có trong thức ăn [66] Một enzyme giống như phytase cũng đã được tìm thấy trong động vật nguyên

sinh Paramecium [24] Cá vược sọc lai có chứa phytase hoạt động ở pH tối ưu

3,5-4,5 [21]

1.3 Ứng dụng của phytase

1.3.1 Trong chăn nuôi

Động vật nhai lại tiêu hóa được muối phytate là nhờ phytase do hệ vi sinh vật sống trong dạ cỏ tiết ra Phospho vô cơ giải phóng trong dạ cỏ sẽ được khu hệ vi sinh vật ở đó và bản thân động vật chủ sử dụng Tuy nhiên, động vật dạ dày đơn như lợn, gia cầm và cá không có khả năng tiêu hóa phytate vì chúng không có hoặc

có rất ít phytase trong đường tiêu hóa Do đó, để đáp ứng nhu cầu phospho cho cơ thể vật nuôi, người ta đã bổ sung phospho vô cơ vào thức ăn Điều này sẽ làm tăng chi phí thức ăn và gây ra ô nhiễm phospho, đặc biệt đối với ngành nuôi trồng thủy sản Ô nhiễm phospho xuất phát từ lượng dư thừa trong thức ăn hòa tan vào môi trường nước, cộng với muối phytate không được tiêu hoá thải qua phân và được vi sinh vật sống trong đất phân giải thành phospho vô cơ Khi chất này dư thừa tạo điều kiện thuận lợi cho các loài tảo sinh trưởng, phát triển Tảo phát triển quá mức

sẽ gây hiện tượng "nước nở hoa", khi đó tảo sử dụng hầu hết oxy hòa tan trong nước khiến các sinh vật thủy sinh (động vật và thực vật) chết hàng loạt [2] Khi bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, phytase làm tăng khả năng hấp thu phospho ngay trong chính thành phần của thức ăn, đồng thời làm giảm lượng chất này thải qua phân [4] Nhiều nghiên cứu chứng minh phytase giúp giải phóng phospho khó tiêu trong đường tiêu hóa của động vật; tăng cường khả năng hấp thu khoáng như Zn2+, Mg2+,

Fe2+ cải thiện khả năng tiêu hóa protein Bổ sung phytase vào thức ăn cho gia cầm

Trang 17

giúp tăng trọng cơ thể, tăng vật chất khô của xương, tăng sản lượng trứng và chất lượng trứng [46] Ngoài ứng dụng nổi trội cho vật nuôi, enzyme phytase còn có vai trò rất quan trọng cho ngành thủy sản Thử nghiệm phytase trên loài cá da trơn Châu

Phi (Clarias gariepinus) giúp tăng hiệu quả khả năng sử dụng phospho [62] Cá hồi Đại Tây Dương (Salmo salar) khi cho ăn phytase đã kích thích sinh trưởng và giảm

tác động kháng dinh dưỡng của axit phytic lên khả năng tiêu hóa protein [49] Bổ

sung phytase vào thức ăn có nguồn gốc thực vật cho cá trắm con (Labeo rohita)

kích thích sử dụng các loại khoáng và làm tăng tỷ lệ khoáng chất trong xương [9] Tác động tích cực của phytase còn được tăng thêm 3% khi bổ sung axit citric vào

thức ăn Cá basa con (Pangasius pangasius) khi nuôi với khẩu phần chứa 35%

protein thô có bổ sung phytase cải thiện được tăng trọng, tăng vật chất khô và khả năng sử dụng protein [19] Những nghiên cứu khác về việc bổ sung phytase trong ngành nuôi trồng thủy sản chỉ ra rằng phytase giúp tăng khả năng sử dụng phospho sinh học, nitơ sinh học và các muối khoáng đồng thời giảm lượng phospho thải ra môi trường nước [10, 41]

1.3.2 Trong công nghệ thực phẩm

Anno và CS (1985) đã loại bổ sung thêm phytate vào sữa đậu nành bằng cách sử dụng phytase từ lúa mỳ để thủy phân [8] Bổ sung phytase từ nấm mốc

A niger vào bột mỳ có chứa cám lúa mỳ đã làm tăng khả năng hấp thụ sắt ở

người [51] Như vậy, vai trò quan trọng của phytase với thực phẩm dành cho con người cũng khá rõ ràng Phytase không những làm tăng khả năng tiêu hóa protein mà còn tăng hấp thụ khoáng Có lẽ trong tương lai không xa, enzyme này

sẽ được dùng phổ biến như một chất phụ gia cho thực phẩm

1.3.3 Trong công nghiệp giấy

Việc loại bỏ axit phytic rất quan trọng trong ngành công nghiệp giấy Trước khi ứng dụng enzyme phytase, việc loại bỏ thành phần axit phytic được tiến hành bằng con đường hóa học Phương pháp này có mặt trái tạo ra những chất có khả năng gây ung thư và những chất thải có độ độc cao Trong khi đó ứng dụng công nghệ enzyme để loại bỏ axit phytic trong thực vật sẽ giúp cải thiện môi trường cũng

Trang 18

như góp phần vào sự phát triển của công nghệ sạch [37] Những phytase bền ở nhiệt

độ cao thường được sử dụng để phân giải axit phytic trong quá trình chế biến giấy

1.3.4 Trong cải tạo đất

Ở một số vùng, axit phytic và dẫn xuất của nó chiếm tới 50% tổng lượng phospho hữu cơ trong đất [16] Nghiên cứu của Findenegg và Nelemans (1993) cho thấy khả năng sinh trưởng của ngô tỷ lệ thuận với mức độ phân giải axit phytic khi

bổ sung phytase vào đất trồng [22] Nghiên cứu này cũng mở ra một hướng trong tương lai có thể chuyển và biểu hiện gen phytase vào rễ cây thực vật nhằm làm tăng giá trị phospho dễ tan trong đất

1.3.5 Trong tổng hợp các dẫn xuất myo-inositol phosphate

Một số myo-inositol phosphate có ứng dụng quan trọng trong dược học

Inositol phosphate và phospholipid có vai trò nòng cốt trong việc truyền tín hiệu qua màng và huy động nguồn canxi dự trữ trong tế bào [11] Một số inositol triphosphate được sử dụng để phòng tránh viêm khớp, bệnh hen, hoặc làm thuốc giảm đau [56] Este của inositol triphosphate được sử dụng làm chất ức chế chống lại sự lây nhiễm các bệnh do nhóm retrovirus gây ra bao gồm cả HIV [57] Tuy

nhiên, việc tổng hợp bằng con đường hoá học các myo-inositol phosphate này gặp

rất nhiều khó khăn vì qui trình được thực hiện ở điều kiện nhiệt độ và áp suất cao

[11] Từ khi phytase được phát hiện có hoạt tính thủy phân các myo-inositol hexaphosphate thành các dẫn xuất khác nhau thì việc sản xuất myo-inositol tự do từ myo-inositol phosphate được thực hiện bằng con đường sinh học để thay thế

phương pháp tổng hợp hóa học Tổng hợp bằng con đường sinh học mang tính đặc hiệu, sản phẩm có độ tinh khiết cao, phản ứng diễn ra trong điều kiện "ôn hoà" hơn Việc sản xuất D-myo-inositol-1,2,6-trisphosphate, D-myo-inositol-1,2,5-

trisphosphate, L-myo-inositol-1,3,4-trisphosphate và trisphosphate bằng con đường thủy phân axit phytic nhờ phytase đã được nghiên

myo-inositol-1,2,3-cứu và thực hiện [26, 60]

Trang 19

1.4 Các nghiên cứu tách dòng biểu hiện phytase trên thế giới

Từ những năm 1990, Laboure và CS đã tinh sạch, mô tả đặc điểm của phytase

từ hạt ngô đang nảy mầm và gen mã hóa cũng đã được tách dòng từ cDNA [35] Phytase có lợi cho tiêu hóa do khả năng phân giải Fe-phytate, Zn-phytate, tuy nhiên, phytase của lúa mỳ bị mất tác dụng khi đun nấu ở nhiệt độ cao Nhóm nghiên cứu của Viện Khoa học Nông nghiệp Đan Mạch đã nhân giống thành công lúa mỳ biến

đổi gen khi chuyển gen phytase chịu nhiệt từ A fumigatus Phytase của chủng lúa

mỳ biến đổi gen bền nhiệt hơn và có hàm lượng tăng gấp 6 lần so với giống chưa biến đổi gen Một số nghiên cứu tương tự cũng được tiến hành trên lúa với nguồn

gen phytase của vi khuẩn [42], hoặc trong khoai tây với gen phyA từ nấm [61]

Craxton và CS (1997) đã tách dòng và biểu hiện một inositol polyphosphatase phức tạp từ gan chuột (MIPP) có hoạt tính phytase RNA thông tin của MIPP có mặt trong tất cả các mô của chuột, nhưng nó chỉ biểu hiện rõ nhất ở gan và thận

[15] Chuột mang gen appA của E coli biểu hiện phytase trong tuyến nước bọt giúp giảm lượng phytate trong phân từ 8,5-12,5% [71] Lợn chuyển gen mang gen appA của E coli có khả năng tiết nước bọt chứa phytase giúp giảm đến 60% lượng

phospho thải qua phân [23]

Vi sinh vật là đối tượng được sử dụng rộng rãi để biểu hiện phytase, với nhiều nghiên cứu biểu hiện thành công gen mã hóa phytase trên các đối tượng vi sinh vật

khác nhau Năm 2004, Xiong và CS đã chuyển gen có kích thước 1347 bp của A niger SK-57 vào P pastoris và thu được 6,1 g protein tinh khiết trên 1 lít môi

trường nuôi cấy, với hoạt tính 865 IU ml-1 Do quá trình glycosyl hoá nên phytase tái tổ hợp thu được có kích thước khác nhau (64, 67, 87, 110 và 120 kDa) Những phân tích hóa sinh cho thấy enzyme này hoạt động tối thích ở pH 2,5 và 5,5, nhiệt

độ 60C [68] Gen appA mã hóa enzyme phytase tách dòng từ Yersinia kristeensenii

được biểu hiện trên P pastoris Enzyme tái tổ hợp hoạt động tối ưu đạt 2656 U mg-1

ở nhiệt độ 55 °C trong điều kiện pH thấp khoảng 4,5 Hoạt tính của nó duy trì tốt trong dải pH 1,5 – 11,0 còn khoảng 90% Enzyme này cũng khá bền nhiệt, hoạt tính còn lại là 46% sau khi bị biến tính ở 80 °C trong 10 phút [18]

Trang 20

Yan Wang và cộng sự (2007) đã nhân dòng và biểu hiện thành công enzyme

phytase từ chủng A fumigatus WY-2 trên nấm men P pastoris GS115 Enzyme tái

tổ hợp sau khi tinh chế có hoạt tính riêng đạt 51U mg-1 và có khối lượng phân tử khoảng 88 kDa Nhiệt độ và pH tối ưu của enzyme này tương ứng là 55 °C và pH 5,5 Khi ủ với pepsin trong vòng 2 giờ ở 37 °C theo tỷ lệ 0,1 (pepsin/phytase, wt/wt), enzyme tái tổ hợp còn giữ được 90,1% hoạt tính [70] Năm 2011, enzyme

phytase chịu nhiệt mới được tìm thấy từ A aculeatus RCEF 4894 trong mẫu đất ở

Trung Quốc Enzyme tái tổ hợp được mã hóa bởi gen kích thước 1404 bp bao gồm

467 axit amin, hoạt tính sau khi biểu hiện trên P pastoris đạt 3000 U ml-1 ở nhiệt độ tối ưu 55 °C Hoạt lực của enzyme này chỉ mất khoảng 13,9% sau khi biến tính ở 90°C trong 10 phút và duy trì tốt trong dải pH 2,5 – 6,5 [74]

Năm 2013, Li và CS đã tách dòng thành công gen mà hóa phytase dài 1327 bp

từ Bacillus Enzyme tái tổ hợp được sinh tổng hợp trên nấm men Pichia pastoris có

trọng lượng phân từ khoảng 53 kDa, pH hoạt động tối ưu là 7,0 – 8,0 Sau khi xử lý nhiệt 70 °C trong vòng 10 - 30 phút enzyme vẫn duy trì 80 – 62% hoạt tính [36]

Khi nghiên cứu trên nấm mốc Aspergillus niger, tác giả Mrudula đã tách dòng gen

mã hóa phytase và biểu hiện trên hai hệ thống biểu hiện của E coli BL21 (DE3) sử

dụng T7 RNA promoter và Tac promoter Kết quả phân tích hoạt tính cho thấy enzyme này hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 50 °C và pH 6,5 [38] Gen phytase tách

dòng từ Penicillium chrysogenum được chuyển vào tế bào trần Penicillium griseoroseum PG63 Hoạt tính của enzyme tái tổ hợp cao hơn hẳn so với chủng gốc,

có pH tối ưu là 5,0, duy trì hoạt tính trong dải pH 3,0 – 8,0 và nhiệt độ 70 – 80 °C [14] Phytase từ vi sinh vật có sự đa dạng cao nhất về khả năng công nghệ Phytase

từ A aculeatus có khả năng bền nhiệt [74], phytase từ A fumigatus có khả năng bền với pepsin [70], phytase từ Yersinia kristeensenii hoạt động tốt trong dải pH rộng

1,5 – 11,0 [18]

1.5 Các nghiên cứu về enzyme phytase ở Việt Nam

Với hiệu quả kinh tế rõ rệt trong chăn nuôi, phytase hiện đang được sử dụng rộng rãi ở Việt Nam Hầu hết các nhà máy sản xuất thức ăn chăn nuôi công nghiệp đều sử dụng phytase trong thành phần dinh dưỡng bổ sung cho vật nuôi Nguồn

Trang 21

phytase được nhập chủ yếu từ Châu Âu và Trung Quốc Trong số các enzyme, phytase được nhập khẩu với lượng lớn nhất kể cả về giá trị và khối lượng Chính vì vậy, những nghiên cứu về sản xuất phytase giá thành thấp thay thế phytase nhập khẩu đang được nhiều nhà khoa học trong nước quan tâm Nguyễn Thùy Châu từ

2007 - 2009 đã nghiên cứu và hoàn thiện công nghệ sản xuất phytase bằng hình

thức lên men bề mặt Trong nghiên cứu, tác giả sử dụng các chủng A niger ATCC

9142 và A ficcum NRRL 3135 từ bộ sưu tập giống của Mỹ, A niger NCIM,

Rhizopus microsporus từ Cộng hòa Séc và chủng A niger DL1 phân lập từ Việt

Nam Nhóm tác giả đã nghiên cứu qui trình lên men rắn sản xuất phytase ở qui mô pilot Theo đó, chủng sản xuất được lên men ở nhiệt độ 30C trong 7 ngày trên môi trường P3 Cơ chất sau lên men được tách chiết enzyme bằng dịch oxy già 5%, enzyme thô được thu bằng ly tâm và tủa bằng cồn 96, sấy khô tạo chế phẩm VS1 Khảo nghiệm tác động của chế phẩm trên gà cho thấy, 200 g chế phẩm VS1 bố sung cho 1 tấn thức ăn có thể thay thế cho dicanxi phosphate trong khẩu phần thức ăn [1] Ngoài việc ứng dụng các kỹ thuật lên men truyền thống, một con đường khác

là sử dụng công nghệ DNA tái tổ hợp để sản xuất enzyme, đây là hướng đi hiện đại phù hợp để sản xuất enzyme ở qui mô công nghiệp mà các nước tiên tiến đã và đang thực hiện Hướng đi này giúp nâng cao năng suất sinh tổng hợp enzyme đồng thời lượng enzyme thu được dễ dàng tinh sạch hơn khi sử dụng chủng tự nhiên Tại Việt Nam, trong những năm gần đây cũng đã có một số nghiên cứu tách dòng và tạo

phytase tái tổ hợp Năm 2007, Đỗ Thị Ngọc Huyền đã tách dòng và thể hiện phyC tái tổ hợp từ Bacillus subtilis trên E coli và thu được lượng enzyme tái tổ hợp ở

nồng độ 288 mg l-1, gấp 48 lần phytase từ chủng tự nhiên [3] Năm 2008, Nguyễn

Văn Viết biểu hiện phyC tái tổ hợp từ Bacillus subtilis trên E coli BL21 (DE3) đạt

tổng năng suất phytase nội bào và ngoại bào là 92 IU ml-1 [5]

Trong khuôn khổ đề tài “Nghiên cứu công nghệ sản xuất enzyme Phytase tái

tổ hợp từ nấm men” của Bộ Công Thương, nhóm nghiên cứu chúng tôi (Viện Công nghiệp Thực phẩm) đã thực hiện thử nghiệm tách dòng gen mã hóa enzyme phytase

(phyA) từ Aspergillus niger XP và biểu hiện trên P pastoris Phytase tái tổ hợp thu

nhận được hoạt động tối ưu ở pH 2,5 và pH 5,0, nhiệt độ 60C Mức độ thể hiện sản

Trang 22

phẩm phytase ngoại bào đạt trên 1000 IU ml-1 Một trong những yếu điểm của enzyme tạo được là tính bền nhiệt thua kém so với enzyme thương phẩm [6, 40] Những kết quả nghiên cứu của các tác giả trong nước về phytase là hết sức có

ý nghĩa Đây cũng là động lực và cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo nhằm phát triển, hoàn thiện tiến tới sản xuất phytase trong nước

1.6 Cấu trúc protein liên quan đến khả năng hồi tính của phytase từ A niger

và A fumigatus

Phytase ứng dụng trong chăn nuôi cần đảm bảo các yêu cầu như tính bền nhiệt

để xử lý ở 70 - 80 C trong quá trình ép viên, hoạt động tốt ở pH thấp trong điều kiện dịch dạ dày của động vật, chống chịu được enzyme thủy phân protein như pepsin, pancreatin để duy trì hoạt tính trong hệ tiêu hóa của vật nuôi Một enzyme nguyên bản khó có thể đồng thời đáp ứng các điều kiện công nghệ kể trên Vì vậy một hướng nghiên cứu mới đang được quan tâm, đó là nghiên cứu ảnh hưởng của cấu trúc không gian đến hoạt tính của enzyme phytase từ đó cải biến nguồn gen sẵn

có để sinh tổng hợp một enzyme đáp ứng được các yêu cầu kỹ thuật ngày càng cao Năm 2007, Zhang và CS chỉ ra rằng liên kết hydro và tương tác ion trong cấu trúc

không gian của phân tử phytase từ A fumigatus có vai trò rất quan trọng làm tăng khả năng “đàn hồi” nhiệt Đó là những liên kết mà phytase từ A niger không có

được nên hoạt tính của enzyme này giảm hơn hẳn khi bị biến tính ở nhiệt độ cao

Tác giả cũng khuyến cáo thay thế bốn vị trí axit amin của phytase từ A niger theo

A fumigatus sẽ làm tăng đáng kể hoạt tính của nó [73] Theo quan điểm của Zhang

và CS, các nhà nghiên cứu sau đó đã thu được những kết quả thú vị khi tiến hành

cải biến gen mã hóa phytase từ chủng nấm mốc A niger nhằm tăng tính bền nhiệt

của enzyme này [30, 39, 58, 69]

Phân tích cấu trúc của phytase chịu nhiệt cho ta cái nhìn sâu sắc về các tương tác trong phân tử góp phần duy trì sự ổn định cấu trúc, từ đó giúp cho các nhà nghiên cứu tạo ra enzyme phytase có chất lượng tốt hơn Cấu trúc phân tử của

phytase từ A fumigatus bao gồm 435 axit amin trong đó gốc His59 được

phosphoryl hóa, liên kết với 6 phân tử N-acetylglucosamine và 614 phân tử nước Giống như các enzyme thuộc họ Histidine acid phytase khác, enzyme thủy phân

Trang 23

phytate từ A fumigatus cũng có trung tâm hoạt động được tạo bởi hai trình tự bảo

thủ RHGXRXP và HD nằm xa đầu N và C [73] Và tương tự như cấu trúc của

A niger, enzyme này bao gồm một cấu trúc α/β lớn và một cấu trúc xoắn α nhỏ hơn

cùng với một trung tâm hoạt động tích điện dương tương đối lớn nắm ở vùng phân

cách giữa hai cấu trúc này (Hình 1.3 -A)

Hình 1.3 Cấu trúc tinh thể của enzyme phytase từ Aspergillus fumigatus [67]

A: Mô hình ba chiều của phytase A fumigatus Trung tâm hoạt động

phosphohistidine được hiển thị ở trung tâm của mô hình, sáu N-acetylglucosamine tại sáu vị trí glycosyl hóa (Asn) được biểu thị bằng hình cầu và que màu trắng Cấu trúc α nhỏ được biểu thị màu tím, cấu trúc α/β lớn được biểu thị bởi các màu khác

Năm liên kết disulfide được biểu thị màu lục lam B: Mô hình mạng lưới liên kết

hydrogen ở trung tâm hoạt động giúp ổn định phản ứng trung gian

Các nghiên cứu trên thế giới cho thấy enzyme phytase bền nhiệt có thể được

thu nhận từ chủng nấm mốc A fumigatus Trên thực tế, enzyme này cũng không bền

với nhiệt độ cao nhưng lại có một đặc tính đáng quý là có khả năng phục hồi lại cấu trúc ban đầu sau khi bị biến tính bởi nhiệt độ Nhược điểm lớn nhất của phytase từ

A fumigatus là ít được kiểm chứng trong sản xuất phục vụ chăn nuôi và hoạt động

tối ưu ở dải pH tương đối cao (4,0 – 7,3) Tìm hiểu về khả năng hồi tính của

enzyme này, các nhà nghiên cứu đã chọn cấu trúc của phytase A niger làm mô hình

so sánh để làm sáng tỏ vấn đề này Nhìn chung, cấu trúc của hai enzyme có độ tương đồng khá cao, trong đó ba vùng cấu trúc có sự khác biệt được cho là yếu tố có

Trang 24

ảnh hướng lớn đến khả năng hồi tính của phytase A fumigatus Ba vùng này là

Glu35-Ser42, Gly163-Arg168, Arg248-Ser254 Vùng Glu35-Ser42 liên quan đến sự thay thế gốc kỵ nước bởi gốc axit dẫn đến khả năng tăng số lượng các tương tác hydro Còn cấu trúc vùng Gly163-Arg168 và Arg248-Ser254 liên quan đến các tương tác ion gây ra bởi gốc arginine [67]

Kết quả so sánh cấu trúc không gian vùng axit amin 35-42 của phytase từ

A fumigatus so với A niger cho thấy sự thay thế Ala35 bởi Glu35 có vai trò quan

trọng trong việc hình thành mạng lưới liên kết hydro bao gồm 12 liên kết (Hình

1.4-A, bên trái) Sự tương tác giữa Glu35 và Ser42 tạo cấu trúc thòng lọng bền vững

thông qua các liên kết hydro Ngược lại, cấu trúc tại vùng này của phytase A niger

chỉ có ba liên kết hydro (Hình 1.4-A, bên phải) Do vậy, mạng lưới liên kết hydro

có thể là yếu tố quan trọng giải thích sự khác biệt về cấu trúc tại vùng axit amin

35-42 giữa hai enzyme này Tương tự, sự thay thế Pro35-42 bởi Ser35-42 của phytase

A fumigatus cũng đóng vai trò quan trọng Gốc Ser42 không những tạo thêm các liên kết hydro mà còn linh động hơn gốc Pro42 của phytase A niger, tạo điều kiện

hình thành các tương tác hydro rộng hơn của gốc Glu35 Điều này giúp chúng ta

hiểu thêm được tại sao sau khi bị biến tính ở nhiệt độ cao, phytase của A fumigatus

có thể khôi phục lại cấu trúc không gian của nó nhờ các liên kết hydro được phục

hồi dẫn đến hoạt tính của enzyme không bị ảnh hưởng lớn như phytase của A niger

Hai liên kết cầu muối giữa hai vùng Gly163-Arg168 và Arg248-Ser254 được

tìm thấy ở enzyme phytase của A fumigatus Hai liên kết này được hình thành do hai axit amin arginine 168 và 248 mà ở A niger không có nên không tạo liên kết ion

ở hai vùng này Cả hai gốc arginine cùng tương tác với gốc aspartate 244 tạo nên cấu trúc hộp có gắn mũ ở đầu C của chuỗi xoắn Các cấu trúc gắn mũ như vậy có vai trò duy trì cấu trúc xoắn của các sợi oligopeptide, góp phần làm tăng sự ổn định

của protein Do đó, việc thay thế gốc Glu168 của phytase A niger bởi gốc Arg168 của A fumigatus sẽ dẫn đến sự hình thành cấu trúc gắn mũ ở đầu C của chuỗi xoắn

α 140-161 đồng thời liên kết hydro giữa nguyên tử NH2 Arg168tích điện dương và nguyên tử O Asp161 tích điện dương cũng được hình thành (Hình 1.4-B, bên trái)

Tuy nhiên, axit amin ở vị trí 166 của phytase từ A niger lại là axit amin kỵ nước

Trang 25

proline làm cho cấu trúc của chuỗi chính bị bẻ gập vào trong vùng ưa nước, hạn chế

sự linh động của gốc này (Hình 1.4-B, bên phải) Một cấu trúc gắn mũ ở đầu C cũng được tìm thấy ở vùng Val246-Gln254 nhờ tương tác liên kết hydro giữa nguyên tử

NH1 Arg 248 và nguyên tử OAsp244 giúp ổn định chuỗi xoắn α 230-247 (Hình C)

1.4-Hình 1.4 Các cấu trúc đóng vai trò trong khả năng hồi tính của phytase A fumigatus [67] A So sánh cấu trúc thòng lọng Glu35-Ser42 trên miền α/β của phytase A fumigatus (trái) và A niger (phải) B So sánh cấu trúc thòng lọng Ala163-Ala168 trên miền α/β của phytase A fumigatus (trái) và A niger (phải) C

Cấu trúc hộp gắn mũ C trong trung tâm miền α nhỏ cho thấy sự tương tác qua liên

kết hydro ở đầu C của chuỗi xoắn D Sơ đồ một cấu trúc hộp gắn mũ C mà C1, C2,

C3 là phần còn lại của đầu C của chuỗi xoắn α và C‟, C‟‟ là phần còn lại chuỗi xoắn

sau đó

Trang 26

Như vậy, ba vùng cấu trúc được trình bày ở trên đóng vai trò quan trọng trọng việc ổn định cấu trúc của phytase Bởi vì trung tâm hoạt động của enzyme nằm sâu trong khe phân cách giữa hai cấu trúc α/β lớn và α nhỏ, sự sắp xếp chính xác hai cấu trúc này liên quan đến hoạt tính enzyme Cả ba vùng cấu trúc này đều tham gia vào

sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc hai giúp enzyme có thể cuộn gập lại sau khi bị biến tính dưới điều kiện nhiệt độ cao Để cải thiện khả năng hồi tính của enzyme

phytase từ A niger, Tao Xiang và cộng sự đã khuyến cáo cải biến gen mã hóa

phytase bằng cách tạo đột biến điểm thay thế axit amin A35, P42, Q168, T248 tương ứng với E35, S42, R168, R248 [67] Năm 2007, Zhang và cộng sự cũng đã chỉ ra rằng 4 axit amin có liên quan đến đặc tính bền nhiệt của enzyme phytase từ

A niger là A58, P65, Q191, T271 tương ứng với A35, P42, Q168, T248 trong

nghiên cứu của nhóm tác giả Tao Xiang và cộng sự Nếu phytase có 4 a.a này thì khả năng bền nhiệt của enzyme là thấp Kết quả nghiên cứu cho thấy, đột biến điểm thay thế A58E, P65S, Q191R, T271R đã làm tăng độ bền nhiệt của phytase nhưng đồng thời không ảnh hưởng đến đặc tính pH [73]

Tiếp tục thực hiện hướng nghiên cứu tạo chủng nấm men Pichia pastoris tái tổ

hợp sinh enzyme phytase có khả năng bền nhiệt cao, chúng tôi tiến hành cải biến

gen mã hóa phytase từ nấm mốc A niger đã được sàng lọc, bằng cách tạo đột biến

điểm trình tự gen mã hóa 4 axit amin để cải thiện khả năng hồi tính của enzyme sau khi bị biến tính ở nhiệt độ cao đồng thời vẫn duy trì được khả năng bền pH của chủng gốc Kết quả này là cơ sở để chúng tôi sản xuất enzyme phytase tái tổ hợp

bền nhiệt trên nấm men Pichia pastoris ở quy mô công nghiệp

Trang 27

Chương 2 – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu

2.1.1 Hóa chất

Các hóa chất dùng trong nghiên cứu đều thuộc loại tinh khiết ở mức độ phân tích hoặc là hóa chất chuyên dụng cho sinh học phân tử Phần lớn chúng có nguồn gốc từ các hãng như Sigma (Mỹ), Merck (Đức), Difco (Mỹ), Invitrogen (Mỹ), Thermo Scientific (Đức), Roth (Đức) Trong nghiên cứu cũng sử dụng một số loại

kit chuyên dụng như: Kit tinh sạch DNA, sản phẩm PCR (GenJETTM Gel Extraction kit), kit tách chiết plasmid (GenJETTM Plasmid Miniprep kit); dNTPs, T4 DNA ligase, Pfu DNA polymerase, thang DNA chuẩn 1kb được cung cấp bởi hãng Thermo Scientific, Ronozyme® P5000 CT (Đan Mạch)

Hình 2.1 Sơ đồ cấu trúc của vector pPICZαA, B, C (www.invitrogen.com)

Vector nhân dòng và biểu hiện được sử dụng trong nghiên cứu: pPICZαA của

hãng Invitrogen là vector biểu hiện trên nấm men Pichia pastoris được thiết kế bao

gồm: trình tự tiết α-factor hỗ trợ tiết protein mục tiêu ra ngoài môi trường nuôi cấy,

trình tự promoter AOX1 tương đồng với trình tự AOX1 trong genome của Pichia pastoris giúp cài gen mục tiêu vào hệ gen của tế bào vật chủ bằng trao đổi chéo,

Trang 28

điểm khởi đầu sao chép pUC ori giúp có khả năng sao chép độc lập với hệ gen của

tế bào chủ E coli, trình tự gen chỉ thị kháng kháng sinh zeocin cho phép sàng lọc

các thể biến nạp mang vector này trên môi trường nuôi cấy chứa zeocin (Hình 2.1)

Các cặp mồi chính sử dụng cho PCR được trình bày qua bảng 2.1

Bảng 2.1 Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu

T-phyA-EcoRI-F GCTGAATTCCTGGCAGTCCCCGCCTCGAGA Tách dòng

phyA Thiết kế phyA-

Stop-XbaI-R2

TGTTCTAGATTAAGCAAAACACTCCGCCCAATC Tách dòng

phyA Thiết kế 5‟--factor TACTATTGCCAGCATTGCTGC Kiểm tra gen

trên vector Invitrogen 3'-AOX1 GCAAATGGCATTCTGACATCC Kiểm tra gen

trên vector Invitrogen A58E-F TTCTTTTCTCTGGAAAACAAATCGGCC

Tạo đột biến điểm thay axit amin vị trí 58

Thiết kế dựa theo [73] P65S-R AATCGGCCATCTCCTCTGATGTTCC

Thiết kế dựa theo [73] Q191R GCCCAGCCCGGCAGATCGTCGCCCAAGATC

Thiết kế dựa theo [73] T271R GACACCATCTCCAGAAGCACCGTCGA

Thiết kế dựa theo [73]

Trang 29

Bảng 2.2 Danh sách các chủng phục vụ trong nghiên cứu tách dòng gen mã hóa phyA

STT Mã chủng Mã tắt Kí hiệu gốc Nguồn Tên loài Mã số Genebank

5 CNTP 5033 P6 1920 F Viện CNTP Aspergillus niger HM369366

6 CNTP 5037 P8 1923 F2 Viện CNTP Aspergillus niger

Trang 30

2.1.4 Môi trường nuôi cấy

LB: 0,5% yeast extract, 1% tryptone, 1% NaCl, pH 7,0

YPD: 1% yeast extract, 2% peptone, 2% D-glucose

YPDS: 1% yeast extract, 2% peptone, 2% D-glucose, sorbitol 1M

BMGY: 1% glycerol, 1% yeast extract, 2% peptone, 0,34% YNB, 1% (NH4)2SO4 và 410−5

để tạo ra mồi Mega có kích thước khá lớn Đoạn DNA được tạo thành từ hai mồi F,

M được tinh chế và đóng vai trò là mồi trong bước PCR thứ hai cùng với mồi R Sản phẩm PCR lần thứ hai chính là đoạn DNA gốc đã được cải biến bên trong nhờ mồi M

Trang 31

Hình 2.2 Phương pháp Mega-PCR cơ bản

Sản phẩm Mega-PCR sau đó được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 1% trong đệm TAE 0,5× Mẫu gồm 5 l sản phẩm PCR được trộn với 1 l đệm mẫu có chứa: glycerol 20%, chất chỉ thị màu bromophenol blue, xylene cyanol và nạp vào các giếng trên gel Chạy điện di với hiệu điện thế ổn định là 10 volt cm-1gel, sau 25 phút, gel được lấy ra và nhuộm trong dung dịch chứa ethidium bromide (EtBr) trong 10 phút Gel agarose được vớt ra và rửa bằng nước để loại bỏ EtBr bám không đặc hiệu Các băng DNA được quan sát và chụp ảnh dưới ánh sáng UV bằng máy soi gel SynGene

2.2.2 Tinh sạch sản phẩm PCR từ gel agarose bằng bộ kit GenJET TM Gel Extraction

Bộ kít GenJETTM Gel Extraction được thiết kế để tinh sạch các phân đoạn DNA từ gel agarose chạy trong đệm TAE hoặc TBE với hiệu suất cao trong thời gian ngắn Quy trình được thực hiện như sau:

- Băng DNA quan tâm được cắt chính xác bằng lưỡi dao sạch từ gel agarose và được hòa tan bằng đệm bám (binding buffer) ở nhiệt độ 60 °C trong khoảng

10 phút

- Dung dịch gel agarose đã hòa tan được chuyển lên cột tinh sạch và ly tâm

10000 vòng phút-1 trong 1 phút Phần dịch đi qua màng được gạn bỏ

- DNA được rửa sạch bằng 500 µl đệm rửa (wash buffer), phần dịch đi qua màng sau khi ly tâm được gạn bỏ Bước này được lặp lại một lần nữa

Trang 32

- Cột tinh sạch có chứa DNA được chuyển sang ống Eppendorf 1,5 mới và bổ sung 100 µl elution buffer Sau đó, DNA được thu bằng cách ly tâm 1 phút với tốc độ 10000 vòng phút-1 DNA tinh sạch được bảo quản ở -20°C

2.2.3 Ghép nối plasmid

Đoạn DNA sau khi cắt bằng enzyme hạn chế được nối vào vector cũng đã được xử lý cùng một enzyme tương ứng theo tỷ lệ nồng độ 3:1 Thành phần của phản ứng trong tổng thể tích 20 μl như sau: 9 μl H2O (DNase, RNase - free); 2 l đệm 10 của T4 DNA ligase; 1 l T4 DNA ligase 400 U ml-1; 4 l vector; 4 l DNA Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 16 C qua đêm (16 giờ) 10 μl sau phản ứng

ghép nối sẽ được biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng phương pháp sốc

nhiệt

2.2.4 Biến nạp sản phẩm ghép nối plasmid vào E coli bằng sốc nhiệt

Tạo tế bào E coli DH5α khả biến [50]

Cấy chuyển một khuẩn lạc E coli DH5α vào 5 ml môi trường LB, lắc 200 rpm

ở 37 C qua đêm Chuyển 0.5 ml dịch tế bào sang 50 ml môi trường LB, tiếp tục cấy lắc 200 rpm ở 37 C cho tới khi đạt OD600nm từ 0,4 – 0,6 Sau đó lấy mẫu ra và đặt lên đá khoảng 15 phút Từ bước này tất cả các thao tác đều phải tiến hành ở 4C

Ly tâm 4000 rpm trong 10 phút Hòa tế bào thu được trong 50 ml 100 mM CaCl2 lạnh (vô trùng) Ủ mẫu 15 phút và ly tâm thu tế bào ở 3500 rpm/ 10 phút Hòa tủa trong 25ml dung dịch 100 mM CaCl2, ủ mẫu trong 60 phút trên đá Ly tâm 4000 rpm/ 10 phút/ 4C Hòa tế bào trong 0,5 ml dung dịch 100 mM CaCl2, bổ sung 15% glycerol Hút 0,1 ml dịch tế bào trên vào mỗi ống Eppendorf sử dụng trực tiếp hoặc bảo quản ở -75 C

Biến nạp bằng sốc nhiệt [50]

Tế bào khả biến được lấy ra từ tủ -75 C, làm tan trên đá trong khoảng 15 phút Sau đó bổ sung vào mỗi ống tế bào khả biến 10 - 100 ng DNA, đảo nhẹ nhàng để DNA phân bố đều trong dịch tế bào khả biến Sau đó để mẫu trên đá trong 30 phút Mẫu được chuyển ủ ở 42C trong 90 giây Sau đó, mẫu được đặt trên đá trong

2 phút Bổ sung 1 ml môi trường LB, lắc hỗn hợp tế bào ở 37C trong 60 phút Hút

Trang 33

100 ml dịch tế bào cấy trải trên đĩa môi trường LB-ampicillin hoặc LB low zeocin, ủ đĩa ở 37C qua đêm

salt-2.2.5 Tách chiết plasmid từ vi khuẩn E.coli bằng bộ kit GenJET TM Plasmid Miniprep

DNA tái tổ hợp được tinh sạch từ tế bào vi khuẩn E coli bằng bộ kit

GenJETTM Plasmid Miniprep Quy trình được thực hiện như sau:

- Một khuẩn lạc dương tính được nuôi lắc trong 5 ml môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh với tốc độ 200 vòng phút-1

ở 37°C qua đêm Sinh khối sau khi thu bằng ly tâm được hòa tan trong 250 µl đệm P1 (resuspension solution)

- Một thể tích đệm P2 (lysis solution) được bổ sung vào dịch tế bào và đảo nhẹ

3 - 5 lần, ủ ở nhiệt độ phòng 5 phút để phá vỡ tế bào giải phóng plasmid

- Hỗn hợp trên được trung hòa bởi 350 µl đệm P3 (neutralization solution), đảo đều 4 - 6 lần và ủ ở nhiệt độ phòng 5 phút Mảnh vỡ tế bào và protein biến tính được loại bỏ bằng cách ly tâm hỗn hợp với vận tốc 13000 vòng phút-1/ 10 phút/ 4 °C

- Dịch nổi sau khi ly tâm được đưa lên cột tinh sạch plasmid và ly tâm 10000 vòng phút-1 trong 1 phút Plasmid được giữ lại trên lớp màng silica còn dịch qua cột được gạn bỏ

- Plasmid được rửa sạch bằng 500 µl đệm rửa (wash buffer), sau đó gạn bỏ dịch qua cột Bước này được lặp lại một lần nữa

- Cột tinh sạch chứa plasmid được chuyển sang ống Eppendorf 1,5 ml mới, 100µl đệm đẩy (elution buffer) được bổ sung vào cột và ủ ở nhiệt độ phòng

2 phút Plasmid được thu bằng cách ly tâm với vận tốc 10000 vòng phút-1trong 1 phút và bảo quản ở -20°C

2.2.6 Chuyển gen vào tế bào nấm men Pichia pastoris bằng phương pháp biến nạp xung điện

Chuẩn bị tế bào:

- Nuôi sơ cấp Pichia pastoris X33: lấy một vòng que cấy tế bào nấm men nuôi

trong 10 ml YPD lỏng 200 rpm/ 28 °C qua đêm

Trang 34

- Nuôi thứ cấp: 500 µl dịch nuôi sơ cấp được bổ sung vào 100 ml môi trường YPD lỏng 200 rpm/ 28 °C qua đêm

- Dịch nuôi thứ cấp được ủ trên đá 10 phút Sinh khối được thu bằng cách ly tâm 3000 rpm/ 4 °C/ 5 phút, gạn bỏ dịch Nước cất 2 lần vô trùng, lạnh được

bổ sung vào mỗi ống sinh khối, tế bào được hòa tan bằng cách lắc nhẹ nhiều lần

- Ly tâm, gạn bỏ dịch, thu sinh khối tế bào Tế bào được rửa lại bằng nước cất 2 lần đã hấp, lạnh Sau đó tế bào được rửa bằng Sorbitol 1M lạnh

- Ly tâm 3000 rpm/ 4°C/ 5 phút, gạn bỏ dịch, thu sinh khối tế bào Sorbitol 1M lạnh được bổ sung vào ống falcon sinh khối, hòa tan tế bào bằng cách lắc nhẹ Dịch tế bào được chuyển sang các Eppendorf ủ trên đá cho đến khi biến nạp

Biến nạp xung điện:

- DNA tinh chế sau khi cắt giới hạn được bổ sung vào 100 µl dịch tế bào Pichia pastoris, đảo nhẹ để DNA phân bố đều trong dịch tế bào, chuyển dịch này sang Cuvette và ủ trên đá 15 phút

- Cuvette được đưa vào máy Micro Pulser (Biorad) đã cài đặt chế độ biến nạp

Pichia pastoris (2.0 kV, 1 msec) nhấn enter

- Lập tức bổ sung 1 ml Sorbitol 1M vào Cuvette và chuyển dịch sang ống Falcon 15 ml Nuôi tĩnh tế bào ở 28 °C trong 1-2 giờ

- Môi trường YPDS được bổ sung vào dịch tế bào biến nạp và nuôi lắc 200 rpm/

28 °C/ 1-2 giờ Sau đó, tế bào được cấy chang trên đĩa YPDS (zeocin 100

µg ml-1) Ủ ở 30 °C 3 - 10 ngày Các tế bào biến nạp thành công sẽ mang gen kháng zeocin có khả năng phát triển tạo khuẩn lạc màu trắng trên đĩa YPDS-zeocin

2.2.7 Tách chiết DNA tổng số của Pichia pastoris

- Dòng nấm men cần tách chiết DNA được cấy trên đĩa thạch YPD ở 28 °C trong 2 ngày Dùng que cấy lấy một lượng sinh khối nấm men cho vào ống Eppendorf có chứa 750 µl dung dịch 2×SSC, vortex rồi ủ ở 99 C trong 20 phút

Trang 35

- Sinh khối được thu bằng cách ly tâm 12000 rpm/ 1 phút/ 10 °C, gạn bỏ dịch,

bổ sung thêm 750 µl nước deion để rửa sạch tế bào

- Dịch tế bào được bổ sung 100 µl hạt thủy tinh và 100 µl dung dịch Phenol: Chloroform: Isoamyl alcohol (25: 24: 1) Sau đó sinh khối được đồng hóa bằng máy phá tế bào Biospec Hỗn hợp được ly tâm ở 12000 rpm trong

10 phút Dịch chứa DNA phía trên được dùng trực tiếp làm khuôn cho PCR [50]

2.2.8 Phương pháp nuôi biểu hiện nấm men Pichia pastoris

Nuôi biểu hiện Pichia pastoris trên vi đĩa 24 giếng

Một khuẩn lạc nấm men Pichia pastoris đã biến nạp được cấy vào 1 ml môi

trường BMGY trong giếng của vi đĩa, nuôi lắc ở 28 °C với tốc độ 125 rpm trong 48 giờ Sau 48 giờ tăng sinh khối, mỗi giếng được bổ sung 0,1 ml dung dịch methanol 5% Dịch tế bào được tiếp tục nuôi lắc ở 28 °C với tốc độ 125 rpm Sau mỗi 24 giờ, 0,1 ml dung dịch methanol 5% được bổ sung vào dịch nuôi cấy để nồng độ methanol trong môi trường đạt 0,5% Sau 96 giờ, dịch nuôi biểu hiện được ly tâm ở

13000 rpm/ 5 phút/ 10 °C để thu enzyme Enzyme sau khi thu nhận được phân tích hoạt tính để tìm ra những thể biến nạp sinh enzyme phytase có hoạt tính cao

Nuôi biểu hiện Pichia pastoris trong bình tam giác 1 lít

Một khuẩn lạc nấm men Pichia pastoris đã biến nạp được cấy hoạt hóa trong

25 ml môi trường YPD Sau 36 giờ, dịch nuôi cấy được chuyển sang 225 ml môi trường BMGY trong bình tam giác 1 lít, nuôi lắc ở 28 °C với tốc độ 125 rpm trong

24 giờ Sau khi tăng sinh khối, mỗi 24 giờ, 2,5 ml dung dịch methanol 100% được

bổ sung vào môi trường để biểu hiện sinh tổng hợp enzyme tái tổ hợp Sau mỗi

96 giờ biểu hiện, dịch nuôi được ly tâm ở 13000 rpm/ 5 phút/ 10 °C để thu enzyme Enzyme sau khi thu nhận được phân tích hoạt tính và nghiên cứu các đặc tính

2.2.9 Phương pháp điện di protein SDS - PAGE

Chuẩn bị mẫu: Enzyme được trộn với protein loading dye (Glycerol 20%, SDS

4%, Brommophenol blue 0,2%, β-mercaptoethanol 0,5 ml, Tris – HCl 1,5M pH 6,8

1 ml, định mức lên 10 ml bằng nước cất) theo tỷ lệ 4: 1 Protein được biến tính trong vòng 5 phút ở 100 °C

Trang 36

Gel polyacrylamide có SDS bao gồm hai lớp: lớp gel tách có nồng độ 12%, lớp gel cô có nồng độ 5%, với tỉ lệ các thành phần như Bảng 2.3

Bảng 2.3 Thành phần gel chạy điện di protein

Chuẩn bị gel: Sau khi lắp kính,đổ lớp gel tách đến vị trí dưới chân lượcrồi cho

ngay 1 lớp nước cất lên bề mặt Chờ 30 phút để lớp gel này đông, đổ tiếp lớp gel cô, cài lược, chờ 30 phút để gel đông Đặt bản gel vào buồng điện di, đổ dung dịch điện giải (Tris base 0,3%; Glycine 1,44%; SDS 0,1%) đến mép bể điện di, gỡ lược, loại

bỏ các mẩu gel thừa bên trên giếng nhằm tạo cho giếng sạch để nạp mẫu dễ dàng

Chạy mẫu: Mẫu đã chuẩn bị ở trên được nạp vào giếng với thể tích 15 μl mẫu

Chạy 90V trong khoảng 20 phút sau đó chạy 120V cho đến khi mẫu cách mép dưới

của gel còn 0,5 cm thì dừng

Tiến hành nhuộm gel:

- Nhuộm gel trong 50 ml Coomassie brilliant blue (0,1 g Coomassie brilliant blue, 10 ml axit acetic, 45 ml Methanol, 45 ml nước cất) trong 1 giờ hoặc

lâu hơn để Coomassie brilliant blue bắt màu với protein

- Tẩy màu bằng dung dịch tẩy I (140 ml axit acetic, 800 ml Methanol,

1060ml nước cất) trong 30 phút kèm theo lắc, lặp lại 2 lần mỗi lần 50 ml

- Ngâm gel trong 100 ml dung dịch tẩy II (140 ml axit acetic, 100 ml

methanol, 1760 ml nước cất), kèm theo lắc tới khi thấy rõ các vạch protein

2.2.10 Xác định hoạt tính phytase

Hoạt tính phytase được xác định theo phương pháp của Shimizu và CS, đề xuất năm

1992 [54] Lượng Pvc giải phóng dưới tác động của phytase được xác định bằng

Trang 37

dung dịch thử màu chứa 4 lần thể tích dung dịch A (1,5% (NH4)6Mo7O24 + 5,5% H2SO4) và 1 lần thể tích dung dịch B (2,7% FeSO4.7H2O ) Dung dịch thử mầu được pha và sử dụng trong ngày

amoniummolypdate-Phản ứng enzyme

Mẫu thí nghiệm: 0,2 ml dịch enzyme + 0,2 ml dịch cơ chất (3 mM Na-phytate trong đệm 0,1 M Na - acetate pH 5,5) ủ 50 C trong 20 phút, sau đó bổ sung 0,4 ml dung dịch 15% TCA (trichloroacetic acid) để dừng phản ứng, tiếp theo bổ sung 0,8 ml thuốc thử, để phản ứng màu bền sau 5 phút rồi xác định OD ở bước sóng 700nm

Mẫu đối chứng: Thực hiện như mẫu thí nghiệm nhưng bổ sung TCA 15% trước khi bổ sung cơ chất

Xác định đồ thị chuẩn phospho

Dung dịch KH2PO4 được sử dụng làm chuẩn phospho Cân chính xác 1,36 g

KH2PO4 hoà tan vào 100 ml nước cất thu được dung dịch 100 mM KH2PO4, từ dung dịch gốc này ta pha loãng thành các nồng độ: 0; 0,5; 1,0; 1,5; 2 mM Từ mỗi

độ pha loãng này lấy ra 0,4 ml để thử phản ứng màu bằng cách bổ sung 0,4 ml TCA, ủ 20 phút ở 50oC rồi bổ sung 0,8 ml thuốc thử màu và xác định OD700nm(Bảng 2.4)

Bảng 2.4 Tương quan giữa hàm lượng phospho vô cơ và OD700nm

Nồng độ

Thể tích mẫu lấy đi thử (ml)

Định dạng
Số trang	74
Dung lượng	4,12 MB