Luận văn thạc sỹ nghiên cứu xác định một số hợp chất hữu cơ có hoạt tính sinh học bằng phương pháp von ampe hòa tan

Từ năm 1998 cho đến nay rất nhiều các loại dược phẩm đã phân tích được bằng phương pháp điện hóa như các loại vitamin, thuốc kháng sinh, mocphin, các họ thuốc β - lactam, quinolone… Tuy

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Thị Thu Hòa

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ HỢP CHẤT HỮU CƠ CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC BẰNG PHƯƠNG PHÁP VON-AMPE HÒA TAN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2011

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Thị Thu Hòa

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ HỢP CHẤT HỮU CƠ CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC BẰNG PHƯƠNG PHÁP VON-AMPE HÒA TAN

Chuyên ngành: Hóa Phân tích

Mã số: 604429

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Hoàng Thọ Tín

Hà Nội – 2011

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Hoàng Thọ Tín, đã hướng dẫn tận tình về mặt khoa học đồng thời tạo điều kiện thuận lợi về mọi mặt giúp tôi có thể hoàn thành luận văn của mình

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo khoa Hóa học - trường ĐH Khoa học Tự nhiên đã dạy dỗ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình tôi, tất cả bạn bè, những người đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt những năm học tập vừa qua

Hà Nội, tháng 01 năm 2012 Học viên

Nguyễn Thị Thu Hòa

MỤC LỤC

Chương 1 TỔNG QUAN 9

1.1 Giới thiệu về chất kháng sinh β-lactam 9

1.2.1 Đặc điểm của Cefaclor 14

1.2.2.Tính chất, vai trò và ứng dụng của Cefaclor 14

1.2.2.1 Tính chất dược lực học 14

1.2.2.2.Tính chất dược động lực học 14

1.2.2.3 Tác dụng 15

1.2.2.4 Chỉ định 15

1.2.2.5 Chống chỉ định 16

1.2.2.6 Chú ý khi dùng 16

1.2.2.7 Tương tác thuốc 17

1.2.2.8 Tác dụng phụ 18

1.2.2.9.Liều lượng 18

1.2.2.10.Quá liều 19

1.2.2.11.Bảo quản 19

1.3 Các phương pháp phân tích định lượng β-lactam 19 1.3.1 Phương pháp quang học 19

1.3.2 Phương pháp điện hóa 21

1.3.3 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 21

1.3.4 Phương pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis - CE) 23

1.4 Một số phương pháp xác định Cefaclor 24 1.4.1 Phương pháp đo quang 24

1.4.2 Phương pháp điện hóa 26

1.5 Giới thiệu về phương pháp Von-ampe hòa tan (SV) 27 1.5.1 Nguyên tắc chung của phương pháp Von-ampe hòa tan 27

1.5.2.Các kỹ thuật ghi đường von-ampe hòa tan 33

1.5.2.1.Kỹ thuật Von-ampe hòa tan quét tuyến tính 33

1.5.2.2.Kỹ thuật von-ampe xung vi phân DP 34

1.5.2.3.Kỹ thuật von-ampe sóng vuông SqW 35

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 36 2.1 Nội dung nghiên cứu 37 2.2 Thiết bị, dụng cụ và hoá chất 37 2.2.1 Thiết bị 37

2.2.2 Dụng cụ 37

2.2.3 Hoá chất 37

2.2.4 Chuẩn bị dung dịch 38

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 3.1 Khảo sát các điều kiện thủy phân 39 3.1.1 Khảo sát sự xuất hiện pic của cefaclor 39

3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến sự thủy phân 41

3.1.3 Khảo sát thời gian thủy phân 43

3.2.Khảo sát các kĩ thuật quét 45 3.2.1.Phương pháp von-ampe vòng (CV) 45

3.2.2.Kĩ thuật xung vi phân và kĩ thuật quét sóng vuông 46

3.3 Khảo sát các thông số đo 47 3.3.1 Khảo sát thế hấp phụ 47

3.3.2 Khảo sát thời gian làm giàu 49

3.3.3 Khảo sát thời gian cân bằng 54

3.3.4 Khảo sát tốc độ quét thế 55

3.3.5 Khảo sát ảnh hưởng của biên độ xung 57

3.3.6 Khảo sát ảnh hưởng của bước thế 59

3.3.7 Khảo sát tốc độ khuấy 60

3.3.8 Khảo sát thời gian sục khí 62

3.4 Xây dựng đường chuẩn, đánh giá phương pháp 64 3.4.1 Xây dựng đường chuẩn 64

3.4.2 Khảo sát độ lặp lại và giới hạn phát hiện của phương pháp 67

3.4.2.1 Độ lặp lại 67

3.4.2.2 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp 69

3.5 Phân tích một số mẫu thuốc trên thị trường 70 3.5.1.Mẫu Cefaclor của công ty cổ phần hóa dược MEKOPHAR (MKP) 70

3.5.2 Mẫu Cefaclor của công ty cổ phần hóa dược phẩm TW 25 75

3.5.3 Mẫu CEFACLOR 125 mg 80

KẾT LUẬN 85

độ lặp và độ chính xác cao.Ứng dụng chính của phương pháp này là: phân tích môi trường, phân tích lâm sàng, phân tích thực phẩm Đặc biệt là hướng ứng dụng mới trong phân tích dược phẩm, mẫu sinh học bằng phương pháp von-ampe hòa tan hấp phụ Do số lượng lớn các hợp chất hữu cơ gồm các chất sinh học, dược học đều có tính chất hoạt động bề mặt tốt nên đây là điều kiện thuận lợi để hấp phụ làm giàu chúng lên bề mặt các điện cực Giới hạn phát hiện rất thấp từ 10-6 đến 10-10 M Quá trình này ứng dụng rất thành công trong việc định lượng lại các loại thuốc, dược phẩm từ đó mở rộng vào việc xác định các mẫu sinh học hoặc xét nghiệm các mẫu bệnh phẩm

Tính đến những năm 70 người ta đã xác định rất nhiều các loại dược phẩm khác nhau chứa nhóm sunfonamide và nitro, các loại này thuộc hơn 10 nhóm khác nhau Từ năm 1998 cho đến nay rất nhiều các loại dược phẩm đã phân tích được bằng phương pháp điện hóa như các loại vitamin, thuốc kháng sinh, mocphin, các

họ thuốc β - lactam, quinolone…

Tuy quá trình ứng dụng phân tích điện hóa vào phân tích thuốc và mẫu sinh học đã được làm nhiều trên thế giới nhưng ở Việt Nam vẫn còn tương đối mới mẻ, chưa có nhiều công trình về lĩnh vực này, trong luận văn này chúng tôi chỉ dừng lại

ở việc xác định một chất trong thuốc kháng sinh và định lượng trên một số mẫu thuốc thật Có nhiều loại kháng sinh đặc biệt các chất thuộc họ β- lactam, cefa , quinolone… khá phổ biến song trong luận văn này chúng tôi chọn chất nghiên cứu

là Cefaclor thuộc họ β - lactam Cefaclor là loại thuốc kháng sinh thường được sử dụng để điều trị các bệnh nhiễm trùng đường tiết niệu, hô hấp, nhiễm trùng sau

mổ…Vì vậy việc phân tích kiểm nghiệm thuốc này trong sản xuất và phân phối là hết sức cần thiết để đảm bảo chất lượng thuốc tốt và đủ hàm lượng.Hiện nay có rất nhiều phương pháp phân tích loại thuốc trên như phương pháp đo quang, phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC), phương pháp phân tích điện hoá Trong đó phương pháp phân tích điện hoá là phương pháp có khả năng phân tích nhanh, thiết

bị hoá chất đơn giản, và đặc biệt là rẻ tiền hơn nhiều so với các phương pháp khác.Chính vì những lí do đó mà trong luận văn này chúng tôi tiến hành nghiên cứu

xác định Cefaclor trong một số dược phẩm bằng phương pháp von - ampe hòa tan

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về chất kháng sinh β-lactam [1,2,15,33]

Là các kháng sinh mà phân tử chứa vòng β-Lactam Gồm các nhóm: penicillin, cephalosporin, monobactam, cacbapenem trong đó hai nhóm sử dụng phổ biến và lớn nhất là penicillin và cephalosporin

Các penicillin thu được từ môi trường nuôi cấy nấm Penicilium notatum và Penicillium chryrogenum, bán tổng hợp từ axit 6-amino penicillanic (6APA)

Các cephalosporin tự nhiên được phân lập từ môi trường nuôi cấy nấm Cephalosporium acremonium và bán tổng hợp từ axit 7- amino cephalosporinic ( 7ACA) xuất phát từ các kháng sinh thiên nhiên

Cấu trúc và phân loại:

C H 3

N H

O

C O R

C O O M

2 3 4

1

5 6

7

Hình 1.1 Công thức cấu tạo các kháng sinh penicillin

Tên gọi chung công thức của các penicillin khi chưa có gốc R là:

(2S,5R,6R 3,3-dimethyl-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid)

Khi thay thế R bằng các gốc khác nhau, những cacbon bất đối có cấu hình 2S, 5R, 6R ta có các penicilin có độ bền, dược động học và phổ kháng khuẩn khác nhau Với M là gốc cation thường là: K, Na, H

Nhóm kháng sinh penicillin được chia thành 3 nhóm chính với hoạt tính khác nhau

Bảng 1.1 Phân loại và cấu trúc một số penicillin

C-C H3

phenyl-1,2-oxazole-4-

6-[(5-methyl-3-carbonyl)amino]

Là các Penicillin bán tổng hợp Phổ hẹp như nhóm I Kháng penicilliiase,không tác động vào vòng

β – Lactam được Cloxacillin

(CLO)

Cl NO C-

C H3

chlorophenyl )-5-methyl-oxazole- 4-carbonyl]amino}

CH- phenylacetyl]amino)

6-([(2R)-2-amino-2-Phổ rộng, tác dụng cả khuẩn gram (+) và (-) Không kháng β-lactamase

N H

O

C O

R 1

N S

R 3

R 2

C O O M

1 2 3 4 5

6 7 8

Hình 1.2 Công thức cấu tạo các kháng sinh cephalosporin

Tên gọi chung của các cephalosporin khi chưa có gốc R là: (6R,7R)

8-oxo-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylic acid

Khi thay đổi các gốc R, những cacbon bất đối có cấu hình 6R, 7R được các

cephalosporin có độ bền, tính kháng khuẩn và dược động học khác nhau

Dựa vào phổ kháng khuẩn, chia các cephalosporin thành 4 thế hệ Các cephalosporin thế hệ trước tác dụng trên vi khuẩn gram dương mạnh hơn, nhưng trên gram âm yếu hơn thế hệ sau Trong bản luận văn này, chúng tôi chỉ trình bày thế hệ I (CEP) và thế hệ III (CEF)

Bảng 1.2 Phân loại và cấu trúc một số cephalosporin

I: Phổ tác dụng trung

bình, tác dụng mạnh nhất

trên vi khuẩn gram (+),

yếu nhất trên gram (-)

Cực đại hấp phụ chủ yếu do nhân phenyl, tùy vào cấu trúc khác làm dạng phổ thay đổi (đỉnh phụ, vai, sự dịch chuyển sang bước sóng ngắn hoặc dài, giảm độ hấp thụ)

Các β-lactam là các axit với nhóm –COOH có pKa= 2.5-2.8 tùy vào cấu trúc phân tử Trong môi trường axit, kiềm, β-lactamase có tác dụng phân cắt khung phân

tử, mở vòng β-lactam làm kháng sinh mất tác dụng

Bảng 1.3 Hằng số axit của các kháng sinh nghiên cứu

Tên kháng sinh pK a1 Tên kháng sinh pK a1 Tên kháng sinh pK a1

PEN 2.74 AMO 2.8 CLO 2.7

Ngăn cản xây dựng và giảm độ bền của mang tế bào vi khuẩn nên chủ yếu kìm hãm sự tồn tại và phát triển của vi khuẩn Các kháng sinh β-lactam có hoạt phổ rộng

Kháng thuốc:

Vi khuẩn sinh ra các β-lactamase, là enzim có tác dụng mở vòng β-lactam, theo phản ứng ái nhân vào nhóm C=O, làm kháng sinh mất tác dụng Tất cả các cách kháng không sinh ra β-lactamase để thực hiện gọi là kháng gián tiếp (được gọi

là kháng methicillin)

Độc tính:

Các kháng sinh β-lactam độc tính thấp, nhưng cũng dễ gây dị ứng thuốc: dị ứng, mày đay, vàng da, gây độc với thận, rối loạn tiêu hóa…nguy hiểm nhất là sốc phản vệ

Thuốc không dùng cho trẻ sơ sinh và trong thời kỳ cho con bú Chống chỉ định dị ứng với thành phần của thuốc

1.2 Giới thiệu về Cefaclor [6,7]

1.2.1 Đặc điểm của Cefaclor

Tên theo IUPAC : 3-chloro-7-D-(2-phenylglycinamido)-3-cephem- 4-carboxylic acid monohydrate

Cấu trúc phân tử của Cefaclor

Công thức hóa học : C15H14ClN3O4S

Khối lượng phân tử : 367,8 g/mol

Công thức hóa học dạng monohidrat : C15H14ClN3O4S H2O

Khối lượng phân tử : 385,8 g/mol

1.2.2.Tính chất, vai trò và ứng dụng của Cefaclor

Nhóm Dược lý: Thuốc trị ký sinh trùng, chống nhiễm khuẩn

Tên Biệt dược : Afeclor cap; Arlico Cefaclor; Bocefac Dạng bào chế : Bột pha hỗn dịch uống; Viên nang Thành phần : Cefaclor

1.2.2.1 Tính chất dƣợc lực học

Cefaclor là một cephalosporin diệt khuẩn và cũng như các cephalosporin khác,

nó ức chế sự tổng hợp thành tế bào vi khuẩn Nó axyl hóa các enzym transpeptidase gắn kết với màng vì vậy ngăn ngừa sự liên kết chéo của peptidoglycan cần thiết cho

sự vững chắc và độ bền của thành tế bào vi khuẩn

1.2.2.2.Tính chất dƣợc động lực học

Cefaclor được hấp thu rất tốt khi uống ở tình trạng đói Tổng số thuốc được hấp thu giống nhau dù bệnh nhân dùng lúc đói hay lúc no, tuy nhiên khi dùng

chung với thức ăn nồng độ đỉnh chỉ đạt được 50%-70% so với nồng độ đỉnh đạt được khi bệnh nhân nhịn đói và đạt được chậm hơn khoảng 45-60 phút Khi uống ở tình trạng đói, sau khi dùng liều 250mg, 500mg, 1 g, nồng độ đỉnh trung bình trong huyết thanh tương ứng là 7,13 và 23mg/L, đạt được sau 30-60 phút Khoảng 60-85% lượng thuốc được thải trừ dưới dạng không đổi trong nước tiểu trong vòng 8 giờ, một phần lớn thuốc được thải trừ trong 2 giờ đầu Trong khoảng 8 giờ này, nồng độ đỉnh trong nước tiểu tương ứng sau khi uống 250mg, 500mg, 1 g đạt được

là 600, 900 và 1900mg/L Thời gian bán hủy trung bình trong huyết thanh ở người bình thường khoảng 1 giờ (từ 0,6 đến 0,9) Ở bệnh nhân có chức năng thận suy giảm, thời gian bán hủy thường kéo dài hơn một chút Ở người suy giảm hoàn toàn chức năng thận, thời gian bán hủy trong huyết thanh của dạng thuốc ban đầu là 2,3 đến 2,8 giờ Ðường thải trừ thuốc ở bệnh nhân suy thận nặng chưa được xác định

Lọc máu làm giảm thời gian bán hủy của thuốc khoảng 25-30%

1.2.2.3 Tác dụng

Các thử nghiệm cho thấy rằng cephalosporin có tác dụng diệt khuẩn do ức chế quá trình tổng hợp thành tế bào Trong khi các thử nghiệm in vitro đã chứng minh được tính nhạy cảm của phần lớn các chủng vi khuẩn sau đây với cefaclor, thì hiệu quả lâm sàng đối với các chủng không được đề cập trong phần chỉ định lại chưa được biết Các vi khuẩn hiếu khí, gram dương như : Staphylococci, bao gồm chủng tạo men penicillinase, coagulase dương tính, coagulase âm tính (khi được thử nghiệm in vitro), có biểu hiện đề kháng chéo giữa cefaclor và methicillin, các vi khuẩn hiếu khí, gram âm như Citrobacter diversus ,Escherichia coli ,Hemophilus influenzae, bao gồm các chủng tạo men b-lactamase, kháng ampicillin Các vi khuẩn kị khí như Bacteroides spp (ngoại trừ Bacteroides fragilis), Peptococcus niger

1.2.2.4 Chỉ định

Cefaclor được sử dụng trong các trường hợp nhiễm vi khuẩn nhạy cảm với thuốc:

- Nhiễm trùng đường hô hấp trên

- Nhiễm khuẩn tai mũi họng, đặc biệt là viêm tai giữa, viêm xoang, viêm amidale

- Nhiễm trùng đường hô hấp dưới như viêm phế quản, cơn kịch phát của viêm phế quản mãn

- Nhiễm khuẩn da và mô mềm

- Nhiễm trùng đường tiết niệu không biến chứng như viêm bàng quang, niệu đạo, viêm thận - bể thận do lậu cầu

Phải ngưng dùng ở những bệnh nhân có phản ứng dị ứng với thuốc , và cần được điều trị thích hợp với các thuốc tăng áp loại amine, kháng histamine hay corticosteroide

Dùng Cefaclor kéo dài có thể làm cho các vi khuẩn không nhạy cảm phát triển quá mức

Tính sinh ung thƣ và đột biến :

Chưa có bằng chứng nào cho thấy cefaclor gây ra ung thư và đột biến

Khả năng sinh sản :

Các nghiên cứu đầy đủ và có kiểm tra ở người chưa được tiến hành Tuy nhiên các nghiên cứu trên động vật cho thấy cefaclor không ảnh hưởng lên khả năng sinh sản

Sử dụng trong nhi khoa :

Chuyển hóa và/hoặc thanh thải qua thận của cephalosporin thấp hơn dẫn đến thời gian bán hủy kéo dài đã được ghi nhận ở trẻ sơ sinh

Các nghiên cứu đầy đủ về mối liên hệ giữa tuổi và tác dụng của cefaclor chưa được tiến hành ở trẻ sinh thiếu tháng và trẻ dưới một tháng tuổi Tuy nhiên, các ảnh hưởng đặc hiệu trên nhi khoa cho đến nay chưa được ghi nhận ở trẻ một tháng tuổi hoặc lớn hơn

Sử dụng trong lão khoa :

Cho đến nay chưa ghi nhận được ảnh hưởng đặc hiệu nào trên lão khoa khi dùng cephalosporin ở người lớn tuổi Tuy nhiên ở bệnh nhân lớn tuổi thường có giảm chức năng thận liên quan đến tuổi nên có thể cần điều chỉnh liều và/hoặc khoảng cách giữa liều nếu chỉ định cephalosporin cho các bệnh nhân này

Sử dụng trong nha khoa :

Điều trị cephalosporin kéo dài có thể dẫn đến phát triển Candida albicans quá mức, dẫn đến nấm candida miệng

Sử dụng ở bệnh nhân suy gan/ suy thận :

Vì cefaclor không chuyển hóa ở gan, không cần điều chỉnh liều ở bệnh nhân suy gan Tuy nhiên, liều dùng phải được giảm ở bệnh nhân suy thận

- Dùng đồng thời cefaclor và warfarin hiếm khi gây tăng thời gian prothrombin và

điều chỉnh liều nếu cần thiết

- Probenecid làm tăng nồng độ cefaclor trong huyết thanh

- Cefaclor dùng đồng thời với các thuốc kháng sinh aminoglycosid hoặc thuốc lợi

niệu furosemid làm tăng độc tính đối với thận

1.2.2.8 Tác dụng phụ

Tỉ lệ xuất hiện các phản ứng quá mẫn là 1,5% với các đặc trưng gồm hồng ban đa dạng, nổi ban hoặc các biểu hiện khác trên da đi kèm với viêm khớp/ đau khớp, có sốt hoặc không sốt Những phản ứng này thường thấy ở trẻ em hơn người lớn Các triệu chứng này thường xảy ra một vài ngày sau khi dùng thuốc và giảm dần trong vài ngày sau khi dùng thuốc Dùng thuốc kháng histamin và glucocorticoid để điều trị các dấu hiệu và triệu chứng

Hệ tiêu hoá: Tiêu chảy và viêm kết mạc màng giả

Gan mật: Tăng men gan nhẹ, viêm gan

Hệ thần kinh trung ương: Nhức đầu và chóng mặt, bồn chồn

Mẫn cảm: Dị ứng nổi ban, ngứa, nổi mày đay

1.2.2.9.Liều lƣợng

Cefaclor được sử dụng bằng đường uống

- Người lớn: Liều thông thường là 250mg mỗi 8 giờ Ðối với viêm phổi và viêm phế quản, dùng 250mg, 3 lần mỗi ngày Ðối với viêm xoang, dùng 250mg, 3 lần mỗi ngày trong 10 ngày Ðối với nhiễm khuẩn trầm trọng hơn (như viêm phổi) hoặc nhiễm khuẩn do các vi khuẩn khác ít nhạy cảm hơn, có thể tăng liều gấp đôi Liều 4g/ngày đã được dùng một cách an toàn cho người bình thường trong vòng 28 ngày, tuy nhiên liều tổng cộng hàng ngày không nên vượt quá lượng này Ðể điều trị viêm niệu đạo cấp do lậu cầu ở nam và nữ, dùng một liều duy nhất 3g, phối hợp với 1g probenecid

- Trẻ em: Liều thông thường là 20mg/kg/ngày, chia ra mỗi 8 giờ Ðối với viêm phế quản và viêm phổi, dùng liều 20mg/kg/ngày, chia làm 3 lần Ðối với các nhiễm khuẩn trầm trọng hơn, viêm tai giữa, và nhiễm khuẩn do vi khuẩn ít nhạy cảm nên dùng liều 40mg/kg/ngày chia làm nhiều lần uống Liều tối đa là 1g/ngày

- Cefaclor có thể dùng cho bệnh nhân suy thận, trong trường hợp này thường không cần điều chỉnh liều Trong điều trị nhiễm khuẩn do Streptococcusb tán huyết, nên

dùng Cefaclor ít nhất 10 ngày

1.2.2.10.Quá liều

- Dấu hiệu và triệu chứng: Các triệu chứng ngộ độc khi dùng cefaclor có thể gồm:

buồn nôn, nôn, đau thượng vị, tiêu chảy Mức độ đau thượng vị và tiêu chảy phụ thuộc vào liều lượng Nếu có thêm các triệu chứng khác, có thể là do phản ứng thứ phát của một bệnh tiềm ẩn, của phản ứng dị ứng hay tác động của chứng ngộ độc khác kèm theo

- Ðiều trị: Ðể điều trị quá liều, cần cân nhắc đến khả năng quá liều của nhiều loại

thuốc, tương tác giữa các loại thuốc, dược động học bất thường của bệnh nhân Ngoại trừ trường hợp uống liều gấp 5 lần liều bình thường, không cần thiết phải áp dụng biện pháp rửa dạ dày Bảo vệ đường hô hấp của bệnh nhân, hỗ trợ thông khí

và truyền dịch Theo dõi cẩn thận và duy trì các dấu hiệu sinh tồn của bệnh nhân, khí máu, chất điện giải trong huyết thanh v.v Có thể làm giảm sự hấp thu thuốc ở đường tiêu hóa bằng than hoạt tính Trong nhiều trường hợp, biện pháp này có hiệu quả hơn gây nôn hoặc rửa dạ dày Cân nhắc xem nên dùng than hoạt tính thay cho rửa dạ dày hay phải kết hợp cả hai Dùng nhiều liều liên tiếp than hoạt tính có thể làm gia tăng sự đào thải thuốc đã được hấp thu Cần bảo vệ đường hô hấp của người bệnh khi áp dụng phương pháp rửa dạ dày hay dùng than hoạt tính Các biện pháp khác như dùng thuốc lợi tiểu mạnh, thẩm phân phúc mạc, lọc máu, thẩm tách máu bằng than hoạt, chưa được xác định là có hiệu quả trong điều trị quá liều cefaclor

1.2.2.11.Bảo quản

Bảo quản thuốc ở nhiệt độ phòng, 59 độ-86 độ F (15 độ-30 độ C) Nên cất thuốc ở dạng dung dịch treo đã pha trong tủ lạnh Vặn nắp chặt và lắc kỹ trước khi dùng Có thể cất giữ thuốc trong 14 ngày mà hiệu lực giảm không đáng

kể

1.3 Các phương pháp phân tích định lượng β-lactam

1.3.1 Phương pháp quang học

Phương pháp đo quang là phương pháp phân tích dựa trên tính chất quang học của chất cần phân tích như tính hấp thụ quang, tính phát quang… Các phương pháp này đơn giản, dễ tiến hành, thông dụng, được ứng dụng nhiều khi xác định β-lactam, đặc biệt trong dược phẩm

Các β-lactam hấp thụ UV nhưng không nhiều cực đại hấp thụ, chúng cũng tạo phức với một số ion kim loại giúp nâng cao độ nhạy của phép đo Trong nhiều trường hợp, các β-lactam được thủy phân thành các chất đơn giản hơn để phân tích

Các phương pháp phát quang có thể dùng xác định các β-lactam với độ nhạy khá cao dựa trên đặc tính tạo phức với ion kim loại hay phản ứng quang hóa của các β-lactam

A Fernández-González và cộng sự [17] dùng Cu2+ thủy phân và tạo phức với AMP, với bước sóng kích thích 343nm, phát xạ 420nm có giới hạn phát hiện thu được 4.10-7

M (0.16 mg/l) Phương pháp này kết hợp phương pháp dòng chảy cho hiệu quả và tốc độ phân tích cao, sử dụng để phân tích AMP trong thuốc uống, huyết thanh…

Theo [26], F Belal và cộng sự xác định AMO và AMP trong thuốc uống

bằng phương pháp phổ hấp thụ phân tử Phương pháp cải tiến sự thủy phân của kháng sinh với HCl 1M, NaOH 1M sau đó thêm PdCl2, KCl 2M Kết quả tạo ra phức màu vàng được đo tại bước sóng 335 nm Khoảng tuyến tính từ 8- 40 mg/l và giới hạn phát hiện của AMP là 0.73 mg/l, AMP 0.76 mg/l

Wei Liu và cộng sự [39], sử dụng phản ứng quang hóa của β-lactam với hệ luminol-K3Fe(CN)6 kết hợp phương pháp chiết pha rắn mắc trực tiếp đã phân tích một số β-lactam (penicillin, cefradine, cefadroxil, CEP ) trong sữa đạt độ nhạy cao: PEN là 0.5 mg/l, cefradine 0.04 mg/l, cefadroxil là 0.08 mg/l, 0.1 mg/l CEP Kết quả được kiểm chứng lại bằng phương pháp HPLC, detector UV-VIS, nồng độ CEP trong mẫu là 0.1 mg/l

Tuy nhiên, nếu không kết hợp với phương pháp chiết pha rắn mắc nối tiếp, các phương pháp quang học chủ yếu chỉ dùng xác định riêng rẽ từng chất kháng

sinh và trong các đối tượng có nhiều yếu tố ảnh hưởng hay chất tương tự chất phân tích, việc xác định sẽ kém chính xác Ngoài ra, trong nhiều trường hợp chất phân tích cần thủy phân mới phát hiện được cũng là sự hạn chế của phương pháp này

1.3.2 Phương pháp điện hóa

Một số phương pháp điện hóa đã được ứng dụng để phân tích các β-lactam nhưng không phổ biến nhiều Theo [25], Daniela P Santos và cộng sự sử dụng sensor điện thế phân tích AMO, đạt giới hạn phát hiện 0,92 μM (0,39 mg/l) trong môi trường đệm axetat 0,1M pH=5,2

Theo [23], các tác giả khẳng định cephalexin có thể xác định được bằng phương pháp điện hóa trong cả môi trường axit và bazơ Trong môi trường HCl 0,1M cephalexin được đo bằng phương pháp DPP có Epic = -1V, giới hạn phát hiện LOD = 2,88.10-7M Trong môi trường kiềm ở pH = 8,3 cephalexin được đo bằng phương pháp DPP có Epic = -0,72V, giới hạn phát hiện đạt 2.10-7M

Theo [34] các tác giả xử lí các kháng sinh cephalosporin trước khi đo bằng cách cho tạo phức với các ion Cu (II), Pd(II) và Zn(II) sau đó đo von-ampe sóng vuông thì thu được pic cao và rõ nét hơn rất nhiều Giới hạn phát hiện LOD có thể đạt 7.10-10

M

1.3.3 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Trong những năm gần đây, phương pháp HPLC đã đóng một vai trò vô cùng quan trọng trong việc tách và phân tích các chất trong mọi lĩnh vực khác nhau, nhất

là trong việc tách và phân tích lượng vết các chất Phương pháp HPLC với cột tách pha đảo được sử dụng rất rộng rãi để xác định các kháng sinh β-lactam trong các loại mẫu khác nhau do có nhiều ưu thế so với các phương pháp khác vì có độ chính xác, độ nhạy, độ lặp lại cao, khoảng tuyến tính rộng…

Detector ghép nối trong máy HPLC cho phép phát hiện sự xuất hiện chất sau khi rửa giải Hiện nay có rất nhiều loại detector được sử dụng cho mục đích này đã

mở rộng khả năng phân tích được rất nhiều loại chất bằng phương pháp HPLC Đối

với phân tích dư lượng, detector khối phổ (MS) là một sự lựa chọn ưu tiên do có thể phát hiện và phân tích chất trong các đối tượng phức tạp

Theo [40], Blanchflower WJ và cộng sự dùng HPLC – MS phân tích penicillin V, PENG, OXA, CLO, dicloxacillin trong thịt, thận và sữa Điều kiện chạy sắc ký: cột Inertsil ODS2 (4,6 mm×150 mm, 5 μm); pha động: ACN – (C2H5)3N 0,5% (45/55), dùng nafcillin làm nội chuẩn đạt giới hạn phát hiện trong sữa 2-10 μg/kg, trong thịt 25-100 μg/kg

J.M Cha và cộng sự [27] dùng phương pháp HPLC – MS để phân tích lactam trong nước sông và nước thải Điều kiện chạy sắc ký: cột Xterra MS C18 (2.1 mm×50 mm, 2.5 μm); pha động: A = axit focmic 0,1%, B = Metanol (MeOH), C = Acetonitril (ACN); chạy gradient: bắt đầu A/B/C=90:5:5(v/v/v), 8 phút A/B/C=50:40:10, 20 phút A/B/C=90:5:5; tốc độ pha động 0.25 ml/phút; nhiệt độ cột

β-450C; thời gian 20 phút Áp dụng phân tích AMO, AMP, oxacillin, CLO, cephapirin

có giới hạn phát hiện của phương pháp là 8 – 10 ng/l với nước bề mặt, 13 – 18 ng/l với nước thải trước xử lý, 8 – 15 ng/l với nước thải sau xử lý

Một detector quan trọng trong phương pháp HPLC là detector huỳnh quang, với ưu điểm tăng độ nhạy, độ chọn lọc cao Như trong [24] C.Y.W Yang và cộng sự dùng cột Spherisorb ODS2 (250 mm x 4,6 mm, 5 μm) phân tích AMO trong sữa bò (pha động: ACN/đệm photphat 10mM pH 5.6 – 24/76; detector huỳnh quang: 346

nm – 422 nm) đạt giới hạn phát hiện lần lượt 0.5 μg/kg và 0.3 μg/kg Tuy vậy, do các β-lactam ít tạo phức phát huỳnh quang và cơ chế phát quang dựa trên phản ứng quang hóa [24, 32] nên chỉ áp dụng với số ít chất hoặc phân tích riêng từng chất chứ không áp dụng phân tích đồng thời nhiều kháng sinh cùng lúc được

Tác giả Ngô Quang Trung [14] đã xây dựng quy trình phân tích đồng thời 6 kháng sinh β_Lactam gồm: AMO, CEP, AMP, CLO, CEF, PENG trong nước thải bệnh viện tại khu vực Hà Nội Tác giả sử dụng cột tách Supelcosil ODS 250 mm x 4.6 mm, 5 µm, pha động gồm đệm axetat 12 mM pH 4, 70%; ACN 20%, MeOH 10% Detector UV-VIS đo ở bước sóng 212 nm Xây dựng đường chuẩn các kháng

sinh trong khoảng 0.1 – 1 mg/l, hệ số tương quan R > 99.8% Giới hạn phát hiện LOD và LOQ là 0.4 và 0.1 mg/l

Ngoài ra, còn dùng các detector khác như detector điện hóa, detector độ dẫn… để phân tích các β-lactam

Nói chung, khi phân tích kháng sinh trong các đối tượng mẫu phức tạp như thực phẩm, mẫu sinh học, mẫu nước thải, việc xử lý mẫu đối với các phương pháp đều đòi hỏi qui trình xử lý phức tạp do các kháng sinh liên kết chặt chẽ với nền mẫu

và có nhiều chất nhiễu cần loại trừ

1.3.4 Phương pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis - CE)

Gần đây, phương pháp CE được sử dụng rộng rãi do tính chất ưu việt về hiệu quả tách cao, thời gian tách ngắn, lượng mẫu tiêu tốn ít Phương pháp đã được ứng dụng để tách và xác định các kháng sinh β-lactam trong nhiều đối tượng mẫu khác nhau

L Nozal, L Arce ,A.Ríos, M Valcárcel [29] sử dụng phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) với thành phần dung dịch đệm điện

di gồm 40 mM đệm Borat, 100 mM SDS pH 8.5 Tiến hành phân tích tại thế điện di

10 kV, nhiệt độ 200C, thời gian bơm mẫu 10s Phương pháp cho phép tách 6 kháng sinh gồm: AMO, AMP, PENG, OXA, penicillin V và CLO ứng dụng phân tích trong mẫu nước thải của trang trại chăn nuôi Giới hạn phát hiện từ 0.14 đến 0.27 mg/l, độ lệch chuẩn tương đối thời gian lưu từ 0.25 đến 0.86%, diện tích pic 1.3 đến 4.15% Độ thu hồi trên 96%

Biyang Deng và cộng sự [22] đã sử dụng phương pháp điện di với detector điện quang hóa xác định AMO trong nước tiểu người với giới hạn phát hiện thấp 0.31 μg/l, khoảng tuyến tính rộng 1 μg/l – 8 mg/l cùng độ thu hồi cao 95.77%, độ lệch chuẩn tương đối không lớn hơn 2.2% và thời gian phân tích ngắn 6 phút/ mẫu

Attila Gaspar và cộng sự [21] đã tách và xác định thành công 14 kháng sinh

họ cephalosporin bằng phương pháp điện di mao quản vùng (capillary zone electrophoresis – CZE) Quá trình tách dùng đệm photphat 25 mM có pH = 6.8

Phương pháp này tách được 14 kháng sinh trong vòng 20 phút, giới hạn phát hiện

14 kháng sinh cefalosporin C, cefoxitin, cefazolin, cefadroxil, cefoperazon, cefamandol, cefaclor, CEP, CEF, ceftibuten, cefuroxim, ceftazidim, cefotaxim, ceftriaxon với giới hạn phát hiện 0.42 – 1.62 mg/l Trong đó CEP và CEF có giới hạn phát hiện tương ứng 1.62 và 0.89 mg/l; khoảng tuyến tính 5 – 200 mg/l Mục đích của phương pháp được ứng dụng để nghiên cứu độ bền của kháng sinh họ Cephalosporins trong nước tại nhiệt độ khác nhau (+25, +4 và -180C) Kết quả cho thấy các kháng sinh giảm nồng độ không lớn hơn 20% tại nhiệt độ phòng sau khi pha loãng

M.I.Bailon-Perez và cộng sự [30] sử dụng phương pháp CZE và detector UV – DAD, pha động dùng hệ đệm tris 175 mM pH 8 và 20% (v/v) ethanol, dùng kĩ thuật chiết pha rắn làm sạch và làm giàu mẫu ứng dụng phân tích đồng thời AMP, AMO, dicloxacillin, CLO, OXA, PEN, nafcillin trong nền mẫu nước ( nước sông, nước thải…) Giới hạn phát hiện tương ứng 0.8; 0.8; 0.25; 0.30; 0.30; 0.9; 0.08 μg/l cùng độ thu hồi đạt 94 – 99 % với độ lệch chuẩn tương đối thấp hơn 10%

Phương pháp MEKC cũng được M.I Bailón Pérez, L Cuadros Rodríguez,

C Cruces-Blanco [31] xác định 9 loại kháng sinh β_Lactam gồm CLO, dicloxacillin, OXA, PENG, penicillinV, AMP, nafcillin, piperacillin, AMO trong mẫu dược phẩm Các điều kiện tối ưu được chọn là 26 mM đệm Borat, 100 mM SDS pH = 8.5 làm chất nền điện di và thế điện di 25 kV Giới hạn phát hiện LOD 0.35 đến 1.42 mg/l, giới hạn định lượng 2.73 đến 5.74 mg/l, độ lệch chuẩn tương đối thời gian lưu từ 1.5 đến 1.7% Độ thu hồi từ 91 – 95.6%

1.4 Một số phương pháp xác định Cefaclor

1.4.1 Phương pháp đo quang

Các nhà khoa học Tây Ban Nha nghiên cứu áp dụng phương pháp quang đơn giản xác định cefaclor dựa vào phản ứng thuỷ phân cefaclor trong môi trường dung dịch đệm amoni pH=10 tạo ra dẫn xuất diketopiperazine-2,5- dion thông qua phản ứng nucleophil nội phân tử và đo quang ở 340 nm Định luật Beer tuân theo trong

khoảng 1,8-55µg/ml Phương pháp này áp dụng thành công phân tích cefaclor trong thuốc [38]

Một phương pháp quang khác cũng được nghiên cứu xác định Cefaclor trong thuốc, phương pháp này dựa trên phản ứng của cefaclor với p–di methyl amino benzaldehyde tạo ra phức chất có cực đại hấp thụ ở 484,4nm Hoà tan 10 mg cefaclor vào trong nước và lọc qua giấy lọc whatman, định mức đến 100ml thêm vào dung dịch 50mg bột Zn và 5ml HCl đặc HCl được thêm vào để giữ môi trường axit, để trong 1 giờ để đảm bảo phản ứng xảy ra hoàn toàn Sau đó thêm vào 1ml p–di methyl amino benzaldehyde và gia nhiệt đến 100ºC trong 15 phút , để nguội đến nhiệt độ phòng và định mức đến 10ml bằng nước cất thu được hỗn hợp màu vàng và quét phổ trong khoảng 200nm-750nm, cực đại hấp thụ ở 484,4nm Khoảng nồng độ tuân theo định luật Lambert Beer 2.5-15 µg/ml , hệ số tương quan 0,9947, hiệu suất thu hồi 99,8%.[35]

Phương pháp trắc quang xác định các thuốc thuộc nhóm Cephalosporin trong đó

có Cefaclor đã được nghiên cứu Phương pháp này kết hợp với kỹ thuật phân tích dòng chảy (FIA) , thuốc được thuỷ phân trong dung dịch NaOH 0,1 M trong 15

phút ở 80 ºC và oxy hoá bởi Fe3+

trong môi trường axit H2SO4 loãng tạo thành

Fe2+

Fe2+ sau đó được tạo phức với o-phenanthrolin trong dung dịch đệm citrat pH = 4,2 và đo độ hấp thụ quang ở cực đại hấp thụ 510nm Hiệu suất thu hồi của cefaclor bằng phương pháp này là 103,3± 2,7%, giới hạn phát hiện 30 µg/ml, giới hạn định lượng 100µg/ml, hệ số tương quan là 0,993, khoảng tuyến tính 0,04 - 0,4 mg/ml.[19]

Sơ đồ FIA phân tích Cefaclor

P: Bơm

Q: tốc độ dòng

FC : detectơ quang (λ = 510nm)

R1, R2 : ống phản ứng

1.4.2 Phương pháp điện hóa

Các nhà nghiên cứu thuộc Brazil và Anh đã tiến hành nghiên cứu xác định gián tiếp cefaclor bằng phương pháp von-ampe hoà tan catôt Cefaclor không bị khử trên điện cực thuỷ ngân, nhưng nó lại được xác định bằng phương pháp cực phổ von ampe hoà tan catot dưới dạng sản phẩm thuỷ phân trong môi trường kiềm, sản phẩm này đạt được hiệu suất cao trong dung dịch đệm Britton-Robinson pH =10 ở 50ºC

trong 30 phút (pic khử tại pH = 10 ở thế -0,7V ) Đường chuẩn theo phương pháp cực phổ xung vi phân tuyến tính đến khoảng 10-4

M Hiệu suất thu hồi 93% cefaclor trong nước tiểu có nồng độ cefaclor 38,6 µg/ml Sử dụng phương pháp von-ampe hoà tan và hấp phụ lên điện cực thuỷ ngân ở thế hấp phụ là -0,2 V trong 30s, đường chuẩn tuyến tính thu được trong khoảng 0,35 đến 40 µg/ml trong dung dịch đệm B-R pH =10 Độ lệch chuẩn tương đối 4,2%, giới hạn phát hiện 2,9 ng/ml Phương pháp này có thể được dùng để xác định trực tiếp cefaclor trong nước tiểu

mà không cần xử lý mẫu.[28]

Theo [42] tác giả đã nghiên cứu xác định Cefaclor bằng phương pháp von – ampe xung vi phân với điện cực làm việc là điện cực giọt thủy ngân và điện cực so sánh là Ag/AgCl , thủy phân cefaclor trong dung dịch NaOH 0,5M , pic của cefaclor xuất hiện tại – 0,85V Trong khoảng nồng độ từ 1.10-8

M đến 5.10-6 M nồng độ cefaclor có độ tuyến tính cao với chiều cao pic Phương pháp có giới hạn phát hiện là 5.10-9

M

1.5 Giới thiệu về phương pháp Von-ampe hòa tan (SV) [3,5,10]

1.5.1 Nguyên tắc chung của phương pháp Von-ampe hòa tan

Phương pháp von – ampe là nhóm các phương pháp phân tích dựa vào việc nghiên cứu đường von – ampe hay còn gọi là đường phân cực, là đường biểu diễn

sự phụ thuộc của cường độ dòng điện vào điện thế khi tiến hành điện phân dung dịch chất phân tích

Quá trình điện phân được thực hiện trong một bình điện phân đặc biệt gồm

Nắp bình điện phân còn có một lỗ để dẫn một luồng khí trơ vào với mục đích

để đuổi khí oxi hoà tan trong dung dịch ra khỏi bình điện phân Để vẽ được đường phân cực người ta liên tục theo dõi và đo cường độ dòng điện chạy qua mạch khi tăng dần điện thế đặt vào hai cực của bình điện phân, sau đó vẽ đồ thị biễu diễn sự phụ thuộc của I – E, trong đó I là cường độ dòng điện chạy qua mạch, E là điện thế đặt vào hai cực của bình điện phân Ta sẽ được một đường cong đó chính là đường cong Von – Ampe hoà tan

Để làm tăng độ nhạy và tín hiệu đo của phương pháp ta cần phải có quá trình làm giàu chất lên bề mặt điện cực Quá trình làm giàu các hợp chất cần xác định lên

bề mặt điện cực được tiến hành bằng phương pháp điện phân để tập trung chất lên

bề mặt điện cực, nhờ đó mà làm tăng độ nhạy lên rất nhiều Quy trình chung của một phương pháp phân tích điện hoá gồm hai giai đoạn :

Giai đoạn làm giàu: Chất phân tích được làm giàu bằng cách điện phân dung

dịch phân tích ở một thế xác định và được giữ không đổi trong quá trình điện phân tập trung chất phân tích (thường chọn thế ứng với dòng giới hạn khuếch tán của chất phân tích và thế chỉ có một số tối thiểu các chất bị khử hoặc bị oxi hoá) lên bề mặt điện cực làm việc Khi điện phân, dung dịch phân tích được khuấy trộn đều bằng cách dùng khuấy từ hoặc cho cực quay Nếu dùng cực rắn đĩa quay thì cho cực quay với tốc độ không đổi (từ 1000 đến 4000 vòng/phút để đảm bảo chuyển động của chất lỏng là sự chảy thành dòng chứ không phải là chuyển động soáy) Nếu dùng cực rắn tĩnh hoặc cực thuỷ ngân tĩnh thì dùng máy khuấy từ và cũng phải giữ tốc độ khuấy không đổi trong quá trình điện phân Thời gian điện phân tuỳ thuộc vào nồng độ của chất cần xác định trong dung dịch phân tích và kích thước của cực làm việc (ví dụ khi dùng cực đĩa quay bằng than thuỷ tinh có đường kính nằm trong khoảng 3 – 5 mm, khi điện phân để khử catot nhiều ion kim loại ở thế ứng với dòng khuếch tán của chúng, khi nồng độ nằm trong khoảng 10-7

– 5.10-7M chỉ cần điện phân làm giàu trong khoảng 10-15 ph)

Kết thúc điện phân thì ngừng khuấy (hoặc cho cực ngừng quay) để dung dịch phân tích yên tĩnh giữ trong khoảng 15 giây đến 30 giây Nếu dùng cực giọt thuỷ ngân tĩnh hoặc cực màng thuỷ ngân điều chế tại chỗ trên bề mặt cực đĩa thì cần có thời gian nghỉ tức là để yên hệ thống trong khoảng thời gian ngắn 30 – 60 s để lượng kim loại phân bố đều trong hỗn hống trên toàn cực

Giai đoạn hoà tan: Hoà tan chất phân tích được làm giàu khỏi bề mặt điện

cực làm việc bằng cách quét thế tuyến tính theo một chiều xác định (anot hoặc catot) đồng thời ghi đường von – ampe hoà tan bằng một kỹ thuật điện hoá nào đó như SqW, DP, CV Trong giai đoạn này thường không khuấy dung dịch phân tích Nếu điện phân là quá trình khử catot ở thế không đổi và đủ lớn (20-50 mV/sec) từ giá trị Eđp về phía các giá trị dương hơn Như vậy, trong trường hợp này quá trình hoà tan là quá trình anot và phương pháp phân tích gọi là phương pháp Von – ampe hoà tan anot (ASV) Ngược lại nếu điện phân là quá trình oxi hoá anot chất phân tích để tập trung lên bề mặt điện cực thì quá trình phân cực hoà tan gọi là quá trình catot và phương pháp đó được gọi là phương pháp Von-ampe hoà tan catot (CSV)

Trên đường Von-ampe hoà tan xuất hiện pic của chất cần xác định Cũng gần tương tự như sóng cực phổ dòng một chiều (cực phổ cổ điển) hoặc các đường cực phổ sóng vuông, cực phổ xung, trong phương pháp Von – ampe hoà tan thế ứng với cực đại của pic Eđp và chiều cao của pic (dòng hoà tan cực đại) Icđ phụ thuộc vào nhiều yếu tố rất phức tạp, nhưng trong các điều kiện tối ưu và giữ không đổi một số yếu tố thì Ecđ đặc trưng cho bản chất của chất phân tích và Icđ tỉ lệ thuận với nồng độ của chất phân tích trong dung dịch

* Ưu điểm của phương pháp von-ampe hòa tan

So sánh với các phương pháp phân tích vết khác, phương pháp von – ampe hoà tan

có các ưu điểm sau:

-Phương pháp von-ampe hòa tan có khả năng xác định đồng thời nhiều kim loại ở những nồng độ cỡ vết và siêu vết

-Thiết bị của phương pháp von-ampe hòa tan không đắt, nhỏ gọn So với các phương pháp khác, phương pháp von-ampe hòa tan rẻ nhất về mặt chi phí đầu tư cho thiết bị Mặt khác, thiết bị của phương pháp von-ampe hòa tan dễ thiết kế để phân tích tự động, phân tích tại hiện trường và ghép nối làm detector cho các phương pháp phân tích khác

-Phương pháp von-ampe hòa tan có quy trình phân tích đơn giản: không có giai đoạn tách, chiết hoặc trao đổi ion nên tránh được sự nhiễm bẩn mẫu hoặc làm mất chất phân tích do vậy giảm thiểu sai số Mặt khác, có thể giảm thiểu ảnh hưởng của các nguyên tố cản trở bằng cách chọn điều kiện thí nghiệm thích hợp như: thế điện phân làm giàu, thời gian làm giàu, thành phần nền, pH

-Khi phân tích theo phương pháp von-ampe hòa tan anot không cần đốt mẫu nên phương pháp von-ampe hòa tan thường được dùng để kiểm tra chéo các phương pháp AAS và ICP-AES khi có những đòi hỏi cao về tính pháp lý của kết quả phân tích

-Trong những nghiên cứu về động học và môi trường, phương pháp ampe hòa tan có thể xác định dạng tồn tại của các chất trong môi trường, trong khi

von-đó các phương pháp khác như AAS, ICP-AES, NAA không làm được điều von-đó

* Phương pháp von-ampe hoà tan hấp phụ

Phương pháp AdSV là phương pháp bổ xung cho phương pháp ASV, vì nó

có thể xác định được lượng vết và siêu vết các chất (vô cơ cũng như hữu cơ) mà phương pháp ASV không thể hoặc rất khó xác định Về mặt cơ sở lý thuyết, phương pháp AdSV khác với phương pháp ASV và điểm khác biệt cơ bản là ở cơ chế của

quá trình làm giàu (hay quá trình tích luỹ chất trên bề mặt điện cực làm việc)

Nếu trong dung dịch phân tích, ion kim loại Men+

phản ứng với phối tử L (giả sử L là phối tử trung hoà) phức chất MeLn

n+

có tính chất hoạt động bề mặt, thì

nó có thể tích luỹ trên bề mặt cực làm việc theo các cơ chế sau:

1 Trong trường hợp đơn giản nhất, Me n+

phản ứng với L theo phản ứng sau

Phản ứng này xảy ra trong dung dịch và là giai đoạn hoá học của quá trình:

Men+ + nL ↔ MeLn

n+

(dd) Tiếp theo, phức hình thành được hấp phụ lên bề mặt điện cực làm việc:

MeLnn+ (dd) ↔ MeLnn+ (hp)

2 Sự hấp phụ phối tử L xảy ra trước khi tạo phức

nL (dd) ↔ nL (hp) Sau đó, phối tử đã hấp phụ phản ứng tạo phức với Men+

(giai đoạn hoá học):

Men+ + nL (hp) ↔ MeLnn+ (hp) Nếu tốc độ các giai đoạn hấp phụ và hoá học tương đương nhau, thì sự hấp phụ phối tử và sự tạo phức thực tế xảy ra đồng thời và do vậy rất khó phân biệt

3 Me n+ không tạo thành phức chất hoạt động bề mặt với phối tử L, mà sản phẩm của quá trình oxy hoá hoặc khử điện hoá nó phản ứng tạo phức với L

Men+ - me → Men +m

Men +m + (n + m) L ↔ Men + m L(n + m)

Men + mL(n + m) (dd) ↔ Men + m

L(n + m) (hp)

4 Cuối cùng và cũng thường gặp là quá trình làm giàu Me n+

xảy ra theo cơ chế bao gồm cả cơ chế (2) và (3)

nL (dd) ↔ nL (hp)

Men+ - me → Men + m (dd)

Men + m + (n + m)L ↔ Men + mL(n + m) (hp)

Trong giai đoạn tiếp theo, giai đoạn hoà tan, thế được quét theo chiều catôt (chiều

âm hơn) và lúc này xảy ra quá trình khử các tiểu phần đã bị hấp phụ theo 3 cơ chế sau:

1 Khử ion kim loại trong phức chất

2 Khử phối tử trong phức chất

3 Khử xúc tác hyđro

Trong phương pháp Von – Ampe hoà tan hấp phụ, khi ghi đường Von – Ampe hoà tan, có thể sử dụng kỹ thuật Von – Ampe bất kì như kĩ thuật Von – Ampe xung vi phân, kĩ thuật Von – Ampe bậc thang, kĩ thuật Von – Ampe sóng vuông Tín hiệu đỉnh trên đường Von – Ampe hoà tan là cơ sở để định lượng theo

phương pháp AdSV Theo PihLar, Valenta và Nurnberg tín hiệu Von – ampe hoà tan tỷ lệ thuận với nồng độ bề mặt của phức được hấp phụ trên cực làm việc theo

phương trình :

Q = n.F.S.C0

Q(C) : điện lượng cần thiết để khử chất điện hoạt đã được hấp phụ

N : số electron trao đổi trong phản ứng điện cực tổng cộng

F (C/mol) : hằng số Faraday

S(cm2) : diện tích bề mặt điện cực làm việc

C0 (mol/cm2) : nồng độ bề mặt của phức được hấp phụ trên cực

Với một tốc độ quét thế xác định, độ lớn pic hoà tan (Ip) tỷ lệ thuận với Q (C), nên Ip tỷ lệ thuận với S (cm2) và Co ( mol/cm2) Vì Co tỷ lệ thuận với nồng độ chất trong dung dịch phân tích (C), nên Ip tỷ lệ với S và C: Ip tỷ lệ với S.C Như vậy, để nâng cao độ nhạy, có thể tăng diện tích bề mặt cực hoặc tăng thời gian hấp phụ làm giàu

Do có những điểm khác biệt về bản chất của phương pháp, nên ngoài những

ưu điểm giống như của phương pháp von – ampe hoà tan, phương pháp AdSV còn

có những điểm riêng sau:

Xác định được nhiều kim loại hơn và độ chọn lọc cao hơn so với phương pháp ASV và CSV: Dựa vào một số phức chất, có thể lựa chọn được thuốc thử tạo

phức bền và chọn lọc đối với kim loại cần phân tích và như vậy có thể sử dụng nhiều loại thuốc thử tạo phức khác nhau để xác định rất nhiều kim loại

Có thể xác định được tổng kim loại cần phân tích hoà tan trong nước và thường đạt được giới hạn phân tích thấp hơn so với phương pháp ASV và CSV: bằng cách chọn thuốc thử tạo phức rất bền với kim loại cần phân tích (bền hơn so với phức của kim loại với các chất hữu cơ khác có mặt trong mẫu), sẽ xác định được tổng kim loại cần phân tích hoà tan, mà không cần xử lý mẫu bằng chiếu xạ

UV hoặc phân huỷ bằng hỗn hợp axit Điều này tránh được sự nhiễm bẩn mẫu và do

đó đạt được giới hạn phân tích thấp hơn

1.5.2.Các kỹ thuật ghi đường von-ampe hòa tan

1.5.2.1.Kỹ thuật Von-ampe hòa tan quét tuyến tính (Linear Scan Voltammetry)

Trong kỹ thuật này, thế được quét tuyến tính theo thời gian như trong phương pháp cực phổ cổ điển, nhưng tốc độ quét lớn hơn (khoảng từ 10-30 mV/s) Đồng thời ghi dòng là hàm của thế đặt lên điện cực làm việc Khi dùng cực HMDE với tốc độ quét thế > 20mV/s, quá trình oxy hóa khử kim loại (khi phân tích theo phương pháp ASV) là thuận nghịch, thì theo Nicholson và Shain, Reinmuth dòng đỉnh hòa tan tuân theo phương trình:

C (mmol/L)- nồng độ ion kim loại trong dung dịch phân tích

Vries và Van Dalen cho rằng khi phân tích theo phương pháp ASV: cực MFE có độ nhạy và độ phân giải đỉnh cao hơn so với cực HMDE Roe và Toni cũng

có kết luận tương tự và đưa ra phương trình dòng đỉnh trên cực MFE (nếu cực MFE

có bề dày màng thuỷ ngân < 10μm và tốc độ quét thế < 1V/min):

Ip = n2.F2.S  C.v

e

Trong đó, S (cm2

) và  (cm) là diện tích và bề dày màng thuỷ ngân, e là cơ

số của logarit tự nhiên, F (C/mol) là hằng số Faraday, các đại lượng khác tương tự trên

Nghiên cứu phương pháp ASV trên cực rắn đĩa, Brainina đã thiết lập được các phương trình dòng đỉnh và thế đỉnh đối với hệ thuận nghịch và bất thuận nghịch Nhưng các phương trình đó rất phức tạp, nên khó sử dụng trong phân tích

Kỹ thuật von-ampe quét thế tuyến tính có nhược điểm là độ nhạy chưa cao, LOD còn lớn, do nó còn bị ảnh hưởng nhiều của dòng tụ điện

1.5.2.2.Kỹ thuật von-ampe xung vi phân DP (Differential Pulse Voltammetry)

Kỹ thuật DP là một trong những kỹ thuật phổ biến hiện nay Theo kỹ thuật này, những xung thế có biên độ như nhau khoảng 10-100 mV và bề rộng xung không đổi khoảng 30-100 ms được đặt chồng lên mỗi bước thế Dòng được đo hai lần: trước khi nạp xung (I1) và trước khi ngắt xung (I2), khoảng thời gian đo dòng thông thường là 10-30 ms Dòng thu được là hiệu giá trị của hai dòng và I được ghi

là hàm của thế đặt lên cực làm việc

Hình 1.2: Ghi dòng theo kỹ thuật von-ampe xung vi phân

Khi xung thế được áp vào, dòng tổng cộng trong hệ sẽ tăng lên do sự tăng dòng Faraday (If) và dòng tụ điện (Ic) Dòng tụ điện giảm nhanh hơn nhiều so với dòng Faraday vì Ic ~ e-1/RC* và If ~ t-1/2, ở đây t là thời gian, R là điện trở, C* là điện dung vi phân lớp kép Theo cách ghi dòng như trên, dòng tụ điện được ghi trước khi nạp xung và trước khi ngắt xung là gần như nhau và do đó, hiệu số dòng ghi được chủ yếu là dòng Faraday Như vậy, kỹ thuật DP cho phép loại trừ tối đa ảnh hưởng dòng tự điện, dẫn đến LOD thấp hơn khoảng 1000 lần khi dùng cực HMDE Mặt khác, với kỹ thuật DP cực MFE đạt được LOD thấp hơn khoảng 3-5 lần so với cực HMDE

1.5.2.3.Kỹ thuật von-ampe sóng vuông SqW (Square Wave voltammetry)

Kỹ thuật này được Barker đề ra từ năm 1958, theo kỹ thuật này điện cực giọt thuỷ ngân được phân cực bởi một điện áp một chiều biến thiên đều theo thời gian có cộng thêm một điện áp xoay chiều dạng vuông góc có tần số khoảng 200Hz và biên

độ có thể thay đổi từ 1-50 mV Trong mỗi chu kỳ xung dòng được đo ở hai thời điểm: thời điểm 1 ứng với dòng dương I1, thời điểm 2 ứng với dòng âm I2 Dòng thu được là hiệu của hai dòng I1 và I2, theo cách ghi như vậy có thể loại trừ tối đa ảnh hưởng dòng tụ điện

Hình 1.3 Ghi dòng theo kỹ thuật von-ampe sóng vuông

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung nghiên cứu

Mục đích nghiên cứu của đề tài là xây dựng quy trình phân tích định lượng cefaclor bằng phương pháp von-ampe hòa tan, từ đó áp dụng xác định hàm lượng Cefaclor trong một số mẫu thuốc trên thị trường Vì vậy nội dung nghiên cứu bao gồm:

1 Khảo sát các điều kiện thủy phân

2 Khảo sát các phương pháp ghi đường hòa tan

3 Khảo sát các điều kiện đo tối ưu

4 Xây dựng đường chuẩn, đánh giá phương pháp

5 Phân tích một số mẫu thuốc trên thị trường

2.2 Thiết bị, dụng cụ và hoá chất

2.2.1 Thiết bị

Thiết bị phân tích điện hoá đa năng μ-Autolap ghép nối với hệ 3 điện cực

663 của Metrohm Hệ điện cực gồm 3 điện cực sau:

- Điện cực so sánh là điện cực Ag/AgCl

- Điện cực làm việc là điện cực giọt thuỷ ngân treo HMDE

- Điện cực phù trợ là điện cực Cacbon

Máy đo pH của hãng Orion research

H3BO3

Cefaclor chuẩn và mẫu thuốc có trên thị trường

2.2.4 Chuẩn bị dung dịch

 Pha dung dịch đệm vạn năng

- Dung dịch A: Dung dịch hỗn hợp ba axit H3PO4 ; H3BO3 và CH3COOH cùng ở nồng độ 0,04M

Lấy 2,74ml dung dịch H3PO4 85% + 2,4ml dung dịch CH3COOH 98% + 3,12gam H3BO3 rồi định mức thành 1lít

- Dung dịch B: Là dung dịch NaOH 0,2M Lấy 4 gam NaOH rắn hoà tan vào nước cất rồi định mức thành 500ml

- Pha dung dịch đệm vạn năng bằng cách trộn hai dung dịch A và B theo tỉ lệ thích hợp

 Pha dung dịch chất chuẩn 10 -2

 Pha dung dịch mẫu thực

- Lấy 4 viên nang cefaclor 250 mg của công ty MEKOPHAR trộn đều rồi đem cân lấy 385,8 mg pha bằng nước cất 2 lần rồi định mức thành 100ml

ta thu được dung dịch gốc 10-2M Các dung dịch có nồng độ thấp hơn được pha loãng từ dung dịch gốc

- Lấy 4 viên nang cefaclor 250 mg của công ty TW trộn đều rồi đem cân lấy 385,8 mg pha bằng nước cất 2 lần rồi định mức thành 100ml ta thu được dung dịch gốc 10-2

M Các dung dịch có nồng độ thấp hơn được pha loãng từ dung dịch gốc

- Lấy 4 gói cefaclor 125 mg của công ty cổ phần dược phẩm BIDIPHAR1 trộn đều rồi đem cân lấy 385,8 mg pha bằng nước cất 2 lần rồi định mức thành 100ml ta thu được dung dịch gốc 10-2M Các dung dịch có nồng độ thấp hơn được pha loãng từ dung dịch gốc

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát các điều kiện thủy phân

3.1.1 Khảo sát sự xuất hiện pic của cefaclor

Về mặt lý thuyết, một chất muốn xác định được bằng phương pháp ampe hòa tan thì bản thân nó hoặc các sản phẩm trung gian hình thành từ chất đó phải có hoạt tính điện hóa Theo các tài liệu tham khảo được, thì bản thân Cefaclor không có hoạt tính điện hóa nhưng sản phẩm của phản ứng thủy phân bằng dung dịch NaOH thì lại có hoạt tính điện hóa

von-Vì vậy, chúng tôi tiến hành khảo sát trong hai trường hợp: Đo trực tiếp trong dung dịch đệm vạn năng (Đệm Britton-Robinson) và đo sau khi đã được thủy phân bằng dung dịch NaOH 0,1M

Khi đo trực tiếp Cefaclor trong nền đệm vạn năng ở các pH < 7 thì không thấy có pic xuất hiện

Khi đo trực tiếp trong nền đệm vạn năng ở pH > 7 và trong nền là dung dịch NaOH 0,1M (đem đo ngay) đã có pic xuất hiện nhưng pic không cao và không cân đối (hình 3.1)

U (V)

-40.0n -30.0n -20.0n -10.0n 0

Hình 3.1 Pic của Cefaclor thu được khi đo trực tiếp trong nền có pH > 7

(1) Đệm vạn năng ; (2) Dung dịch NaOH

Sự xuất hiện pic của Cefaclor khi đo trong nền dung dịch NaOH trên hình 3.1 có thể được lí giải do sản phẩm thủy phân của Cefaclor đã có phản ứng điện hóa Vì vậy sau khi thủy phân trong 30 phút tôi tiến hành đo thấy pic xuất hiện, cân đối và khá cao.Sự xuất hiện pic sau khi đã được thủy phân chứng tỏ phản ứng điện hóa có được là do vòng β – Lactam đã được mở vòng Chúng tôi tiến hành kiểm tra pic xuất hiện có phải là pic chất phân tích không , chúng tôi thêm chất phân tích vào dung dịch đo và đợi thủy phân trong 30 phút chúng tôi đo thấy pic xuất hiện cao hơn và có cùng vị trí với pic ban đầu Vậy pic xuất hiện chính là pic của sản phẩm thủy phân Cefaclor trong dung dịch NaOH.(hình 3.2)

1

2