Luận văn thạc sĩ ứng dụng chỉ thị phân tử liên kết gần trong chọn giống lúa chịu ngập chìm

MỘT SỐ LOẠI CHỈ THỊ PHÂN TỬ THƯỜNG ĐƯỢC SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU GENOME VÀ CHỌN GIỐNG THỰC VẬT .... Bằng con đường chọn giống nhờ chỉ thị phân tử và lai trở lại nhiều gen chống chịu mặn,

Vũ Thị Thu Hằng

ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ LIÊN KẾT GẦN TRONG CHỌN

GIỐNG LÚA CHỊU NGẬP CHÌM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2011

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Vũ Thị Thu Hằng

ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ LIÊN KẾT GẦN TRONG CHỌN

GIỐNG LÚA CHỊU NGẬP CHÌM

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 ẢNH HƯỞNG CỦA BIẾN ĐỔI KHÍ HẬU, NƯỚC BIỂN DÂNG ĐẾN SẢN XUẤT LÚA GẠO 4

1.1.1 Ảnh hưởng của biến đổi khí hậu, nước biển dâng đến sản xuất lúa gạo trên thế giới 4

1.1.2 Ảnh hưởng của biến đổi khí hậu, nước biển dâng đến sản xuất lúa gạo ở Việt Nam 7

1.2 CÁC VÙNG TRỒNG LÚA Ở VIỆT NAM CÓ KHẢ NĂNG BỊ NGẬP THEO KỊCH BẢN BIẾN ĐỔI KHÍ HẬU 9

1.2.1 Vùng trồng lúa có khả năng bị ngập ở Đồng bằng sông Hồng 10

1.2.2 Vùng trồng lúa có khả năng ngập ở Đồng bằng Sông Cửu Long 11

1.3 NGHIÊN CỨU VỀ CƠ THẾ TÍNH CHỐNG CHỊU NGẬP CỦA CÂY LÚA 13

1.3.1 Gen chịu ngập của cây lúa và cơ chế hoạt động 13

1.3.2 Sinh lý học tính chống chịu ngập của cây lúa 16

1.3.3 Di truyền tính chống chịu ngập của cây lúa 18

1.4 MỘT SỐ LOẠI CHỈ THỊ PHÂN TỬ THƯỜNG ĐƯỢC SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU GENOME VÀ CHỌN GIỐNG THỰC VẬT 19

1.4.1 Chỉ thị phân tử ADN 19

1.4.1.1 Chỉ thị dựa trên cơ sở lai ADN 20

1.4.1.2 Chỉ thị dựa trên cơ sở nhân bản ADN 21

1.4.1.3 Chỉ thị dựa trên những cơ sở những chuỗi có trình tự lặp lại 24

1.4.2 Tính ưu việt và những ứng dụng của chỉ thị phân tử 25

1.4.2.1 Tính ưu việt của chỉ thị phân tử 25

1.4.2.2 Những ứng dụng của chỉ thị phân tử 27

1.5 NHỮNG NGHIÊN CỨU CHỌN TẠO GIỐNG CHỊU NGẬP 30

1.5.1 Những nghiên cứu chọn tạo giống chịu ngập trên thế giới 30

1.5.2 Những nghiên cứu chọn tạo giống chịu ngập ở ViệtNam 33

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 35

2.1.1 Các giống lúa nghiên cứu 35

2.1.2 Hóa chất và thiết bị thí nghiệm 35

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35

2.2.1 Phương pháp lai hữu tính - lai trở lại giữa giống cho và nhận gen chịu ngập 36

2.2.2 Phương pháp tách chiết ADN tổng số 36

2.2.3 Phương pháp PCR với mồi SSR 38

2.2.4 Phương pháp điện di trên gel agarose 0,8% 39

2.2.5 Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide 40

2.2.5.1 Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide biến tính 40

2.2.5.2 Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide không biến tính 42

2.2.6 Phương pháp xử lý số liệu 43

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 44

3.1 TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH ADN TỔNG SỐ 44

3.2 KHẢO SÁT ĐA HÌNH GIỮA HAI GIỐNG BỐ MẸ 45

3.3 QUY TỤ GEN CHỊU NGẬP CHÌM SUB1 VÀO GIỐNG LÚA AS996 50

3.3.1 Xác định con lai F1 50

3.3.2 Quy tụ gen Sub1 vào giống AS996 ở thế hệ BC1F1 51

3.3.3 Quy tụ gen Sub1 vào giống AS996 ở thế hệ BC2F1 57

3.3.4 Quy tụ gen Sub1 vào giống AS996 ở thế hệ BC3F1 60

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 68

TÀI LIỆU THAM KHẢO 69

MỞ ĐẦU

Cây lúa (Oryza Sativa) là một trong những cây lương thực quan trọng cho

khoảng 2/3 dân số thế giới Theo thống kê của Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ, thế giới có

khoảng 156,1 triệu ha đất dùng cho việc trồng lúa, sản lượng là 697,9 triệu tấn, 90%

diện tích này thuộc các nước châu Á với 651 triệu tấn thóc chiếm 92% tổng sản

lượng lúa gạo thế giới (Bộ Nông nghiệp và PTNT, 2010)[3]

Ở Việt Nam lúa là nguồn lương thực chủ yếu của hơn 89 triệu dân với diện

tích khoảng 7,4 triệu ha, năm 2010 sản xuất được 39,710 triệu tấn thóc, xuất khẩu

khoảng 6,493 triệu tấn đứng thứ 2 trên thế giới về xuất khẩu gạo sau Thái Lan Ước

tính năm 2011 sản xuất khoảng 41,05- 41,5 triệu tấn Nước ta có hai vùng trồng lúa

chính là Đồng bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) diện tích 3,79 triệu ha chiếm 50%

sản lượng lúa cả nước và Đồng bằng Sông Hồng (ĐBSH) diện tích 1,18 triệu ha

chiếm 17% sản lượng (Bộ Nông Nghiệp và Phát triển Nông thôn, 2009); MPI,

2009)[2][60]

Trên thế giới, an ninh lương thực không chỉ là vấn đề với các nước nghèo mà

nó đang trở thành vấn đề có tính toàn cầu Dân số thế giới liên tục tăng (khoảng 7 tỷ

người năm 2011) trong khi diện tích đất dành cho việc trồng lúa hầu như không

tăng mà ngày càng giảm do đất được chuyển sang sử dụng cho các mục đích khác

như xây dựng khu công nghiệp, trường học, nhà ở, khu du lịch

Bên cạnh đó, các dấu hiệu về sự biến đổi khí hậu hiện nay đã có thể nhận

thấy như trái đất đang nóng lên, băng tan ở hai cực, bão lũ xảy ra thường xuyên Ở

Việt Nam nhiệt độ trung bình hàng năm tăng 0,10C và mực nước biển tăng 2,5 – 3,0

cm mỗi năm trong thập kỷ qua Tính đến cuối thế kỷ 21, nhiệt độ ở Việt Nam sẽ

tăng khoảng 2,30C và mực nước biển tăng 75 cm tính theo mức trung bình các năm

1980 – 1999 Hàng năm có tới trên 20 triệu hecta chịu ảnh hưởng của nước biển

dâng tại Nam và Đông Nam châu Á, hàng trăm nghìn ha hoa màu có thể bị ảnh

hưởng do hậu quả của nước biển dâng vào cuối thế kỷ (MONRE, 2009)[61]

Do vậy, để ứng phó với biến đổi khí hậu trong thời gian tới, các nhà khoa

học trên thế giới ở các lĩnh vực khác nhau không ngừng nghiên cứu các khả năng

làm giảm thiểu những yếu tố, tác nhân gây ảnh hưởng tới môi trường trái đất, quan

tâm tới các nguồn năng lượng sạch trong tương lai, tạo ra và phát triển các loại cây

lương thực vừa có năng suất, chất lượng cao, vừa thân thiện, thích nghi và bền vững

trong điều kiệu môi trường thay đổi khắc nghiệt

Hầu hết các loại cây trồng đều có tiềm năng chống chịu với các điều kiện

sinh học và phi sinh học bất lợi Tuy nhiên, các giống cây trồng có khả năng chống

chịu này thường thuộc loài hoang dại, đi kèm với một số tính trạng không mong

muốn khác như năng suất rất thấp, cao cây Các nhà chọn giống hiện nay đã gặp

rất nhiều khó khăn trong việc đưa gen quy định tính chống chịu với các điều kiện

phi sinh học bất lợi từ giống này sang giống khác do sự đổ vỡ tính kháng và bản

chất đa gen liên quan đến tính kháng của các tính trạng

Thêm vào đó, các chương trình chọn giống cây trồng đặt ra hiện nay còn

phải tính đến khả năng đối phó với các tác động kép của nhiều yếu tố phi sinh học

bất lợi, xảy ra đồng thời trong cùng một thời vụ cây trồng do tác động của biến đổi

khí hậu Như vụ lúa Đông Xuân năm 2011 ở Việt Nam, cây trồng phải đối phó với

thời tiết lạnh đầu vụ ở miền Bắc làm ảnh hưởng tới khả năng sinh trưởng phát triển

của cây và thời tiết khô nóng ở thời điểm trỗ muộn, ĐBSCL đầu vụ hạn hán cuối vụ

thiếu nước ngọt do xâm nhập mặn sâu vào nội đồng với nồng độ mặn cao, điều này

sẽ có khả năng ảnh hưởng tới năng suất

Định hướng chọn tạo giống chống chịu với điều kiện phi sinh học và sinh

học nói chung trong thời gian tới là tạo giống bằng cách quy tụ nhiều gen khác nhau

vào một giống lúa ưu việt nhờ công nghệ sinh học Do vậy, việc chọn tạo nhanh

những giống lúa vừa có năng suất cao, chất lượng tốt, mang nhiều gen chống chịu

với các điều kiện phi sinh học là công việc được quan tâm không chỉ ở Việt Nam

mà còn ở nhiều quốc gia khác

Bước đột phá trong việc chọn giống chịu ngập chìm trở nên có thể thực hiện

được sau khi các vùng chính trên nhiễm sắc thể (Quantitative trait loci- QTLs) điều

khiển tính chống chịu ngập chìm được xác định Việc phát triển và sử dụng chỉ thị

phân tử để đẩy nhanh quá trình quy tụ gen đó vào những giống mới năng suất cao

thông qua phương pháp chọn giống lai trở lại kết hợp với chỉ thị phân tử (marker

assisted backcrossing - MABC; Thomson và ctv., 2009; Septiningsih và ctv., 2009;

Singh và ctv., 2009) [87][77][78] đã đạt được các kết quả bước đầu

Phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử và lai trở lại (MABC) cho phép

rút ngắn thời gian chọn lọc, và chọn lọc được những tính trạng khó hay nhiều gen

cùng một lúc Bằng con đường chọn giống nhờ chỉ thị phân tử và lai trở lại nhiều

gen chống chịu mặn, hạn, lạnh, chống chịu độc tố nhôm, sắt và gen quy định chất

lượng đã được quy tụ thành công vào một số dòng lúa ở các nước có nền công nghệ

sinh học phát triển

Đối với gen chống chịu ngập cho đến nay các nhà khoa học ở Viện Nghiên

cứu Lúa Quốc tế đã xác định được một số các chỉ thị phân tử liên kết chặt với gen

có thể ứng dụng trong chọn giống, sử dụng phương pháp MABC để chọn giống

chịu ngập chìm Để góp phần tạo ra giống lúa có khả năng chịu ngập chìm ứng phó

với biến đổi khí hậu trong thời gian tới, ứng dụng kết quả nghiên cứu vào sản xuất,

chúng tôi thực hiện đề tài: ―Ứng dụng chỉ thị phân tử liên kết gần trong chọn

giống lúa chịu ngập chìm”

Đề tài được đề ra với mục tiêu cụ thể sau:

- Sử dụng phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử kết hợp lai trở lại để

quy tụ gen chịu ngập (Sub1) đã được xác định trước vào giống lúa năng suất cao

đang được trồng phổ biến ở Việt Nam với thời gian ngắn đáp ứng nhu cầu giống

trong sản xuất

Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ là cơ sở dữ liệu và vật liệu cho các nghiên

cứu khoa học tiếp theo về gen chịu ngập (Sub1) trên cây lúa, đồng thời góp phần

vào công tác chọn tạo giống lúa có khả năng chịu ngập, năng suất cao, phù hợp với

điều kiện canh tác lúa vùng ngập lụt, giúp người nông dân tăng thêm thu nhập, giảm

đói nghèo

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 ẢNH HƯỞNG CỦA BIẾN ĐỔI KHÍ HẬU, NƯỚC BIỂN DÂNG ĐẾN

SẢN XUẤT LÚA GẠO

1.1.1 Ảnh hưởng của biến đổi khí hậu, nước biển dâng đến sản xuất lúa

gạo trên thế giới

Biến đổi khí hậu (BĐKH) là sự biến động trạng thái trung bình của khí

quyển toàn cầu hay khu vực theo thời gian từ vài thập kỷ đến hàng triệu năm

Những biến đổi này được gây ra do quá trình động lực của trái đất, bức xạ mặt trời,

và gần đây có thêm hoạt động của con người (IPCC,2007, Nguyễn Văn Cường) [8]

[47]

Biến đổi khí hậu ngày nay không còn là vấn đề của một quốc gia hay của

một khu vực mà là vấn đề toàn cầu Biến đổi khí hậu sẽ tác động nghiêm trọng đến

sản xuất, đời sống và môi trường trên phạm vi toàn thế giới Nhiệt độ tăng, mực

nước biển dâng cao gây ngập lụt, gây nhiễm mặn nguồn nước, ảnh hưởng đến nông

nghiệp, gây rủi ro lớn đối với công nghiệp và các hệ thống kinh tế - xã hội trong

tương lai

Những thách thức của biến đổi khí hậu đối với sản xuất lúa gạo là vô cùng

quan trọng Phần lớn lúa gạo mà thế giới sử dụng được trồng ở các vùng đất thấp

hoặc vùng đồng bằng ở các quốc gia như Việt Nam, Bangladesh, Ấn Độ Những

khu vực này lại có nguy cơ bị nước biển xâm nhập khi mực nước biển dâng cao,

cho thấy sự cần thiết của các giống lúa có khả năng chịu đựng được cả tình trạng

ngập nước lẫn độ mặn cao Lâu nay, châu Á là nơi sản xuất và tiêu thụ gạo cao nhất

trên thế giới Ngoài ra, châu Á còn là nơi xuất khẩu gạo chủ yếu Trong đó, Thái

Lan là nước xuất khẩu gạo lớn nhất toàn cầu, lượng xuất khẩu hàng năm lên tới 9

triệu tấn Xét tới những thiệt hại trực tiếp trong lĩnh vực nông nghiệp cũng như tính

thời vụ của sản xuất lương thực của các nước khu vực này, các chuyên gia cho rằng,

ngoài một số nước khu vực Đông Nam Á có thể phải đối mặt với khan hiếm gạo,

lượng cung cầu gạo trên thị trường thế giới cũng sẽ bị thu hẹp ở mức độ nhất định,

giá gạo chắc chắn sẽ tăng cao

Mỗi năm lũ lụt đã làm mất hàng triệu tấn lúa - chiếm khoảng 25% sản lượng

lúa gạo, thất thoát hàng tỷ USD Trong đó phổ biến nhất là ở châu Á, nơi sản xuất

hơn 90% lúa gạo thế giới Theo thống kê mới nhất của Tổ chức Nông lương thế giới

(FAO) hàng loạt hoa màu bao gồm lúa gạo bị tàn phá mang tính hủy hoại, trong đó

diện tích lúa bị mất trắng ở các nước như Thái Lan khoảng 12,5%, Philippines

khoảng 6%, Campuchia khoảng 12%, Lào khoảng 7,5% và Việt Nam khoảng 0,4

% Ngoài ra, giá gạo trong nước Campuchia, Việt Nam và Thái Lan cũng bắt đầu

tăng, trong đó mức tăng giá gạo ở Campuchia dự đoán sẽ lên tới 50% (Susmita

10000km2 đất canh tác và diện tích nuôi trồng thủy sản trở thành đầm lầy ngập mặn

Ở hạ lưu Ai Cập 6 triệu người phải di dời và 4.500km2 đất nông nghiệp bị ngập

chìm trong nước Ở Bangladesh 18% diện tích đất nông nghiệp bị ngập ảnh hưởng

đến 11% dân số Theo ước tính của Viện nghiên cứu Lúa Quốc tế (IRRI) mỗi năm

nông dân Ấn Độ và Bangladesh bị thiệt hại tới 4 triệu tấn thóc do lũ lụt, do nhiều

giống lúa chỉ chịu ngập trong vòng chưa đầy một tuần Còn ở Maldives hơn 80%

diện tích đất thấp hơn mực nước biển và có thể bị ngập khi nước biển dâng cao

Việt Nam là nước bị ảnh hưởng nghiêm trọng nhất bởi mực nước biển dâng,

tác động chủ yếu đến Đồng bằng sông Hồng và đồng bằng sông Cửu Long khoảng

10.8% dân số Việt Nam sẽ bị ảnh hưởng khi mực nước biển dâng 1m (Susmita

Dasgupta, 2007)[22]

Nguồn www.combatclimatechange.ie

Hình 1 Biểu đồ diện tích đất nông nghiệp bị ảnh hưởng khu vực Đông Á

Biến đổi khí hậu ngoài nước biển dâng gây ngập lụt thì hạn hán, xâm nhập

mặn ngày càng gia tăng Với kịch bản biến đổi khí hậu, cường lực và tần suất hạn

hán được dự báo ngày càng tăng ở vùng tưới nước mưa và hạn hán còn kéo dài đến

vùng lúa nước có tưới Thiếu nước có thể ảnh hưởng 23 triệu ha lúa tưới bằng nước

mưa ở Nam và Đông Nam Á Tại châu Phi, hạn hán nặng có thể đe dọa 80% diện

tích lúa tưới nhờ nước mưa của 23 triệu ha Hạn hán còn ảnh hưởng đến sản xuất

lúa của Úc, Trung Quốc, Mỹ và các nước khác

1.1.2 Ảnh hưởng của biến đổi khí hậu, nước biển dâng đến sản xuất lúa

gạo ở Việt Nam

Việt Nam là một trong những nước chịu ảnh hưởng nặng nề do mực nước

biển tăng, nước biển tăng phần lớn đất màu mỡ nhất của Việt Nam sẽ bị ngập Theo

đó, sản lượng lúa có thể giảm đáng kể do mực nước biển dâng cao và sự thay đổi

lượng mưa làm thay đổi thủy học ở các vùng đồng bằng (Wassmann và ctv., 2004;

Hoanh và ctv 2004)[92][46] Do chúng ta có bờ biển dài hơn 3.200 km, 28 tỉnh,

thành phố giáp biển nên mực nước biển dâng cao sẽ làm giảm lưu lượng dòng chảy

của các con sông, thậm chí ngay cả tại các nơi xa bờ biển

Sự hiện hữu của biến đổi khí hậu ở Việt Nam đã và đang trở nên rõ ràng hơn

bao giờ hết: Cụ thể, nhiệt độ tăng 2 đến 3oC trên phần lớn diện tích cả nước Riêng

khu vực Đông bắc, Bắc Trung bộ và Tây Nguyên có nhiệt độ tăng nhanh hơn so với

những nơi khác Lượng mưa/năm tăng trên hầu khắp lãnh thổ Mức tăng phổ biến từ

10-20%, riêng Tây Nguyên, Nam Trung bộ từ tăng 5-10% Lượng mưa mùa khô

giảm (có nơi giảm đến 30%) và lượng mưa mùa mưa tăng (có nơi tăng từ 20-30%)

Ở các khu vực khác nhau lại có thể xuất hiện những ngày mưa dị thường với lượng

mưa gấp đôi so với kỷ lục hiện nay Mực nước biển cao nhất ở vùng từ Cà Mau đến

Kiên Giang (82 cm), thấp nhất ở vùng Móng Cái (64 cm) Trung bình toàn Việt

Nam là 72,6 cm (Bộ TNMT, 2009)[4]

Nếu mực nước biển dâng 1,0m, khoảng 40 nghìn km2 đồng bằng ven biển

Việt Nam sẽ bị ngập hàng năm, trong đó có các đồng bằng nhỏ hẹp ven biển vùng

Nam Trung Bộ, Việt Nam sẽ bị mất khoảng 5% diện tích, 45% diện tích đất nông

nghiệp ở vùng đồng bằng sông Cửu Long, 11% diện tích đồng bằng Sông Hồng và

3% diện tích của các tỉnh khác thuộc vùng ven biển, 10% GDP, 7% sản lượng nông

sản, 10,8% dân số khoảng 22 triệu dân Việt Nam phải di tản (Nguyễn Kỳ Phùng,

Bùi Chí Nam)[21]

Bảng 2 Các kịch bản nước biển dâng ở Việt Nam qua các thời kỳ

Kịch bản BĐKH nước biển dâng cho Việt Nam, phần II

Theo kịch bản phát thải trung bình (B2): Vào cuối thế kỷ 21, lượng mưa năm

có thể tăng khoảng 7 - 8% ở Tây Bắc, Đông Bắc, Đồng bằng Bắc Bộ, Bắc Trung Bộ

và từ 2 - 3% ở Nam Trung Bộ, Tây Nguyên, Nam Bộ so với trung bình thời kỳ 1980

– 1999 Lượng mưa thời kỳ từ tháng III đến tháng V sẽ giảm từ 4-7% ở Tây Bắc,

Đông Bắc và Đồng bằng Bắc Bộ, khoảng 10% ở Bắc Trung Bộ, lượng mưa vào

giữa mùa khô ở các vùng khí hậu phía Nam có thể giảm tới 10-15% so với thời kỳ

1980-1999 Lượng mưa các tháng cao điểm của mùa mưa sẽ tăng từ 10 đến 15% ở

cả bốn vùng khí hậu phía Bắc và Nam Trung Bộ, còn ở Tây Nguyên và Nam Bộ chỉ

tăng trên dưới 1%

Ở Việt Nam biến đổi khí hậu cũng sẽ gây hạn hán, làm giảm đến 20-25%

lượng mưa ở khu vực miền Trung-Tây Nguyên, gây ra hạn hán không chỉ phổ biến

và kéo dài mà thậm chí còn gây khô hạn thời đoạn ngay trong thời gian El Nino

Tác động này ở Nam Trung Bộ lớn hơn Bắc Trung Bộ, Bắc Tây Nguyên lớn hơn

Nam Tây Nguyên Nhiều vùng của nước ta sẽ bị sa mạc hóa không trồng trọt được

Mặn là hiện tượng liên kết với nước biển dâng mang nước mặn tiến sâu vào đất liền,

biến nhiều vùng đất trồng lúa bị mặn hóa (Nguyễn Đức Ngữ, 2008)[20]

1.2 CÁC VÙNG TRỒNG LÚA Ở VIỆT NAM CÓ KHẢ NĂNG BỊ NGẬP

THEO KỊCH BẢN BIẾN ĐỔI KHÍ HẬU

Việt Nam là một quốc gia nằm trong khu vực Đông Nam châu Á chịu ảnh

hưởng của vùng gió mùa, khí hậu nóng và ẩm rất đặc trưng Việt Nam có một bờ

biển dài hơn 3.200 km Việt Nam hiện nay có khoảng hơn 89 triệu người, mật độ

dân số cao ở các vùng tập trung nguồn nước như các châu thổ sông Hồng, sông Cửu

Long và các cửa sông, cửa biển dọc theo miền Trung Hoạt động sản xuất chính ở

Việt Nam là nông nghiệp, thuỷ hải sản và diễn ra chủ yếu ở vùng nông thôn, vùng

núi và vùng ven biển Hầu hết các thiên tai gây thiệt hại cho sản xuất và đời sống ở

Việt Nam đều có liên quan với sự bất thường của khí hậu và nguồn nước (Lê Anh

Tuấn, 2009)[25]

Việc đưa ra các chiến lược thích nghi với sự biến đổi khí hậu và mực nước

biển dâng cho hai vùng ĐBSH và ĐBSCL có tính chất quyết định đối với nền kinh

tế và an ninh lương thực của Việt Nam, góp phần đảm bảo an ninh lương thực thế

giới

Vùng trồng lúa bị ảnh hưởng bởi lũ lụt có thể được chia thành 4 nhóm như sau:

- Nhóm lúa chống chịu ngập hoàn toàn trong vòng 10 ngày, sau đó chúng có

thể phục hồi sau khi nước rút Đó là những vùng bị lũ quét, hay vùng bị ngập bất

ngờ và tính chống chịu trong điều kiện như vậy được gọi là ―chịu ngập hoàn toàn‖

- Nhóm lúa có khả năng vượt nước 5-10cm / ngày hoặc nhiều hơn, trong

vùng lũ lụt kéo dài 3-4 tháng/năm Đó là vùng lúa nổi ở Đồng bằng Sông Cửu Long

trước đây, nước dâng từ từ, kéo dài nhiều tháng Tính chống chịu trong điều kiện

như vậy được gọi là ―khả năng vươn lóng‖

- Nhóm lúa có khả năng thích nghi vùng đầm lầy ven biển, nơi đó thủy triều

lên xuống trong ngày làm cây lúa bị ngập lúc triều cường Đó là vùng bị ngập xen

kẽ

- Nhóm lúa không có khả năng vượt nước, nhưng thích nghi tốt trong vùng

nước ngập sâu, lũ lụt kéo dài 2-3 tháng gọi là (lúa nước sâu), lúa có tính cảm quang,

thời gian trỗ thường xảy ra khi nước rút (Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang 2003)[6]

1.2.1 Vùng trồng lúa có khả năng bị ngập ở Đồng bằng sông Hồng

Đồng bằng sông Hồng rộng gần 1,18 triệu ha, chiếm 3,8% diện tích toàn

quốc với một vùng biển bao quanh ở phía Đông và Đông Nam Dân số là 14,8 triệu

người (1999), chiếm 19,4% số dân của cả nước ĐBSH là một trong hai vựa lúa

chính của cả nước, chiếm 15% diện tích gieo trồng và 17% sản lượng lúa

Diện tích lúa vùng ÐBSH dự kiến đến năm 2020 là 560 nghìn ha, đến năm

2030 là 540 nghìn ha, sản lượng dự kiến hơn 7,3 triệu tấn Nhiều vùng trong ĐBSH

tiếp giáp với hơn 400km bờ biển Nếu mực nước biển dâng cao 1m và không có các

giải pháp ứng phó, sẽ có khoảng 11% diện tích vùng đồng bằng này có nguy cơ bị

ngập và khoảng 35% dân số bị ảnh hưởng trực tiếp Chủ yếu thuộc các tỉnh: Hải

Phòng, Nam Định, Thái Bình, Ninh Bình, Hải Dương Tỉnh Hải Phòng bị ngập

nặng nề nhất chủ yếu tập trung tại các huyện: Kiến Thụy, Tiên Lãng, Thuỷ Nguyên,

Vĩnh Bảo, Đồ Sơn… Tỉnh Thái Bình ngập chủ yếu ở các huyện Thái Thuỵ, Tiền

Hải, Kiến Xương,… Tỉnh Nam Định ngập chủ yếu ở các huyện Nghĩa Hưng, Xuân

(ha)

Diện tích trong đê

(ha) Hiện tại

1.2.2 Vùng trồng lúa có khả năng ngập ở Đồng bằng Sông Cửu Long

ĐBSCL là vùng sản xuất lúa gạo chủ yếu cho an ninh lương thực Quốc gia

và là nơi sinh sống của hơn 17 triệu dân, là một vùng đất thấp và tiếp giáp với biển

Đông thông qua rất nhiều cửa sông lớn Đây là đồng bằng châu thổ lớn nhất nước

ta, với diện tích 3,79 triệu ha, chiếm khoảng 11,9% diện tích toàn quốc Tại đây có

16,1 triệu người sinh sống, chiếm khoảng 21,1 số dân cả nước (số liệu năm 1999)

Vùng ĐBSCL chiếm 52% diện tích gieo trồng và 53% sản lượng lúa Dự

kiến đến năm 2020, diện tích đất lúa của ÐBSCL là 1,755 triệu ha, sản lượng 21,4

triệu tấn lúa, đến năm 2030 diện tích dự kiến 1,74 triệu ha, phấn đấu đạt năng suất

bình quân 62 tạ/ha, sản lượng lúa 22 triệu tấn

Dựa theo những kịch bản đã được công bố năm 2009 thì vào năm 2100 mực

nước biển sẽ dâng 65 cm (kịch bản B1– thấp) ĐBSCL ngập 5.133km2 (12,8%),

75cm (kịch bản B2 – trung bình) ngập 7.580km2

(19%), và 1m (kịch bản A1F1 – cao), ngập 15.116km2 (37,8%) Cụ thể, Bến tre mất 1.131km2 (hơn 50% diện tích),

Long An mất 2.169km2 (gần 50% diện tích), Trà Vinh mất 1.021km2 (gần 46%),

Sóc Trăng mất 1.425km2

(gần 44%), Vĩnh Long mất 606km2 (gần 40%) (theo TTXVN)

Đặc biệt, hàng năm vào mùa lũ mực nước biển dâng cao, nước ở thượng

nguồn sông Mekong đổ về nhiều sẽ gây ra lụt lội trên diện rộng thuộc các vùng

Đồng Tháp Mười và Tứ giác Long Xuyên, vùng kẹp giữa 2 con sông Tiền và sông

Hậu sẽ bị ngập nghiêm trọng hơn Ngoài các thành phố, thị xã đã bị ngập hiện nay

như Châu Đốc, Long Xuyên, Cao Lãnh, Sa Đéc, Vĩnh Long, Tân An, Mỹ Tho, Cần

Thơ, Vị Thanh, Sóc Trăng, Rạch Giá và Hà Tiên bị ngập trên 1m, trong đó nghiêm

trọng nhất là Cần Thơ và Vĩnh Long Nước biển dâng sẽ làm cho tiêu thoát nước

các thành phố, thị xã Mỹ Tho, Bến Tre, Trà Vinh, Bạc Liêu và Cà Mau khó khăn

hơn

Tại Kiên Giang và An Giang, năng suất lúa có nơi giảm tới gần 21%, tương

đương với giảm trên 1,5 tấn lúa cho mỗi ha

Nguồn: Viện Khoa học Khí tượng Thủy văn và Môi trường (Bộ TNMT)

Hình 2 Phạm vi ngập khu vực ĐBSCL theo kịch bản nước biển dâng 75cm

Đối với các tỉnh ven biển miền Trung, khoảng 3% tổng diện tích của khu vực

có nguy cơ bị ngập, ảnh hưởng trực tiếp đến khoảng 10% số dân Nếu nước biển

dâng lên 1m, tỉnh Quảng Trị có tới 37km2

đất bị ngập, gây hậu quả nghiêm trọng đến sản xuất nông nghiệp và sinh kế của người dân (Lê Anh Tuấn, 2009)[25

Bảng 4 Diện tích ngập các vùng ven biển Việt Nam kịch bản nước biển dâng 1m

Hội thảo Việt Nam thích ứng với BĐKH 2009, GS.TS Đào Xuân Học

Tt Vùng đồng bằng Diện tích

(ha)

Tăng 1.0 m Bán ngập Ngập

1.3 NGHIÊN CỨU VỀ CƠ THẾ TÍNH CHỐNG CHỊU NGẬP CỦA CÂY

LÚA

1.3.1 Gen chịu ngập của cây lúa và cơ chế hoạt động

Cây lúa bản thân nó có thể phát triển tốt trong môi trường ngập nước, khi bị

chìm trong nước, chúng sẽ tự động khởi động một loạt phản ứng kích thích sự tồn

tại Tuy nhiên nếu ngập mà không kiểm soát được thì sẽ trở thành vấn đề vì cây lúa

sẽ không thể sống được nếu bị ngập trong nước thời gian dài Sự ngập úng có thể

ảnh hưởng đến sinh trưởng của cây lúa ở bất cứ giai đoạn sinh trưởng nào, cả trong

thời gian dài hoặc trong thời gian ngắn Cơ hội sống thấp khi cây lúa bị ngập hoàn

toàn và xảy ra suốt thời gian sinh trưởng Suốt thời gian lũ, cây lúa có thể kéo dài

thân và lá để thoát khỏi sự ngập úng Những giống lúa nước sâu cổ truyền có thể

làm việc này đủ nhanh để tồn tại Những giống lúa cải tiến không thể kéo dài thân,

lá kịp theo nước nên không thể tồn tại được Nếu ngập lũ kéo dài, chúng sẽ tiêu thụ

quá nhiều năng lượng nhưng không thành công trong việc ngoi lên mặt nước và thu

nhận o-xy, ánh sáng,… để tái tạo năng lượng và phục hồi sự sống

Ở miền Đông Ấn Độ có một loại lúa dại năng suất thấp, nhưng lại có một đặc

tính vượt trội là có thể sống nhiều ngày trong môi trường ngập nước Những nhà di

truyền đã khám phá ra một gen, do một locus tính trạng số lượng điều khiển đặt tên

là Submergence1 (Sub1) gen Sub1 này định vị trên nhiễm sắc thể số 9, có liên quan

tới tính chịu ngập nước lên tới 17 ngày Tuy nhiên, để biết chính xác gen Sub1 hoạt

động thế nào thì Kenong Xu và các đồng nghiệp thuộc Viện nghiên cứu Lúa Quốc

tế (IRRI) ở Philippine và Trường Davis & Riverside thuộc Đại học California, đã

phân tích thành phần của locus Sub1 và nhận thấy Sub1A là gen đóng vai trò chủ

đạo giúp cây lúa có tính chống chịu úng ngập Gen Sub1A hoạt động khi cây lúa bị

ngập, gen này làm cây lúa ngủ nghỉ và dự trữ năng lượng, hạn chế tăng trưởng, giữ

lại các chất diệp lục cho tới khi nước lũ rút Gen này cũng có đặc tính kích thích đẻ

nhánh mạnh sau khi nước rút

Khi phân tích gen này các nhà khoa học nhận thấy locus Sub1 thực tế bao

gồm 3 gen từ nhân tố phản ứng ethylene (ethylene-respone-factor), là Sub1A, Sub1B

và Sub1C Các nhân tố này gồm các protein có chức năng cho phép cây trồng chống

chịu với các điều kiện bất lợi Gen Sub1A đầu tiên được phát hiện, hay thay đổi

nhưng cần thiết cho tính chống chịu úng ngập, một vài giống indica và giống

japonica không có gen Sub1A Khi kết hợp Sub1A và Sub1C làm tăng khả năng

chống chịu ngập Gen Sub1B và Sub1C được xác định là gần tâm động xấp xỉ

100bp (Xu et al,2006)[95]

Một biến thể khác của Sub1A là Sub1A-1 cũng được các nhà khoa học phát

hiện thấy chỉ có trong cây lúa chịu úng ngập, trong khi đó Sub1A-2, không giống

với gen Sub1A-1 do một sự thay đổi của nucleotide, lại là một kiểu gen không chịu

được ngập Khi đưa gen Sub1A vào giống lúa Swarna của Ấn Độ, giống lúa không

chịu được úng ngập do thiếu gen này, các nhà khoa học nhận thấy rằng cây chuyển

nạp gen không chỉ chịu được trong điều kiện ngập nước mà còn cho sản lượng cao

hơn và giữ được các đặc tính có lợi khác của giống này (Septiningsih và ctv,

2009)[77]

Một gen Sub1C không chịu ngập kết hợp với gen chịu ngập sub1A-1 không

làm giảm mức độ chống chịu Sự biểu hiện của Sub1C-1 độc lập với Sub1A Tuy

nhiên khi Sub1C-1 biểu hiện thì hoàn toàn tắt sự biểu hiện của Sub1A-2 lúc đó cây

không có khả năng chống chịu Nghiên cứu còn cho thấy tỷ lệ sống sót và sự biểu

hiện của Sub1A thấp hơn đáng kể trong cây dị hợp tử so với cây đồng hợp tử mang

gen chống chịu Sub1A là gen đóng góp chính làm tăng mức chống chịu trong khi

sub1C dường như không quan trọng (Septiningsih, 2009)[77]

Takeshi Fukao, Kenong Xu nghiên cứu theo cơ chế thoát ngập, các cơ quan

của cây lúa tạo bẫy ―ethylene‖, làm giảm đối kháng với abscisic acid, làm gia tăng

phản ứng với gibberillin (GA) cho phép vươn dài lóng thân Ethylene cũng tác động

đến gen Sub1A, làm hạn chế sản sinh ra ethylene và làm tăng các thể ức chế GA Do

đó, Sub1A làm mất tác dụng của ethylene trong phản ứng của GA ở các mô bị ngập

trong nước Phân tích microarray cho thấy Sub1A điều hoà yếu tố phiên mã mRNAs

và làm thay đổi sự tích tụ mRNAs liên quan đến tiêu thụ carbohydrate, cơ chế biến

dưỡng trong điều kiện kỵ khí (Takeshi Fukao, Kenong Xu, 2006)[85]

Ashikari và các đồng nghiệp tại đại học Nagoya, ĐH Kyushu, Viện nguồn

lợi sinh học nông nghiệp Tsukuba (Nhật Bản) đã nghiên cứu ba vùng trong bộ gen

có khả năng ảnh hưởng đến sự phát triển của lúa Tại vùng có ảnh hưởng lớn nhất,

một cặp gen đã được xác định và đặt tên là Snorkel 1 và Snorkel 2 Cặp gen này có

thể biểu hiện đồng thời dẫn đến tăng chiều cao thêm 80 cm trên mặt nước.Khi lúa bị

ngập, ethylene được tích tụ và kích thích hai gen này Biều hiện của chúng dẫn đến

tăng chiều cao cây thông qua tác dụng của gibberellin Các chuyên gia cho rằng nếu

tình trạng ngập xảy ra nhanh thì gen Submergence có vai trò quan trọng nhưng nếu

tình trạng ngập kéo dài thì cặp gen Snorkel 1 và Snorkel 2 sẽ thể hiện ưu thế giúp

cây lúa tồn tại, Như vậy, cả Submergence và Snorkel đều có vai trò quan trọng và

khả năng ứng dụng rất lớn Ethylene có thể kích thích cả hai phương thức chống

chịu của cây (duy trì khả năng hô hấp dưới nước và kích thích tăng trưởng khi bị

ngập) nhưng dường như chọn lọc tự nhiên đã làm biến đổi nhiều khả năng vốn có

của thực vật Theo các nhà khoa học, có thể đột biến Snorkel đã xảy ra trước đột

biến của Submergence Hiện tại chỉ có một số loại lúa hoang có gen Snorkel trong

khi Submergence chỉ có ở các giống lúa trồng [98]

S Abdolhamid Angaji và ctv đã sàng lọc trong ngân hàng gen lúa chọn ra

được giống Khao Hlan On liên quan đến khả năng chịu ngập giai đoạn nảy mầm và

lập bản đồ QTL liên quan đến tính chịu ngập giai đoạn này Nghiên cứu đã sử dụng

quần thể lai trở lại giữa giống cho gen là Khao Hlan On với IR64 đã cho kết quả sự

sống sót của quần thể BC2F2 từ 6-68% trung bình 28% Bản đồ liên kết được thiết

lập có tổng chiều dài 1475,7cM với khoảng cách trung bình giữa hai chỉ thị 11,9cM,

sử dụng 135 chỉ thị SSR cho đa hình và 1 chỉ thị indel Tổng số 5 QTLs được phát

hiện Trên NST số 1 là (qAG-1-2), trên NST số 3 là (qAG-3-1), trên NST số 7 là

(qAG-7-2), trên NST số 9 là (qAG-9-1 và qAG-9-2) với LOD từ 5,69- 20,34 (S

Abdolhamid Angaji et al, 2009)[73]

Abdelbagi M Ismail và ctv cũng nghiên cứu cơ chế chịu ngập trong giai

đoạn nảy mầm thấy rằng tinh bột trong hạt giống nảy mầm giảm trong khi nồng độ

đường tăng và tăng nhiều hơn ở những cây mang gen kháng Còn ở giống nhạy

cảm, tinh bột tập trung cao và chỉ giảm nhẹ từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 8 Hoạt

động của amylase tương quan với chiều dài (r =0.85 cho chồi và 0.83 cho chiều dài

rễ) với cây sống sót (r = 0.92) Ở cây kháng amylase hoạt động cao và cao hơn khi

gen RAmy3D biểu hiện Ethyene không được tìm thấy trong hạt sau 2 ngày bị ngập

nhưng tăng lên sau đó và tăng mạnh ở giống kháng sau 3 ngày bị ngập Enzym

Peroxidase hoạt động cao trong hạt nảy mầm của giống mẫn cảm Trong điều kiện

oxy thấp thì hạt nảy mầm của giống kháng phát triển nhanh hơn và sống sót nhiều

hơn, nó duy trì khả năng sử dụng tinh bột thông qua hoạt động của amylase và hô

hấp kỵ khí, ethylene được sản xuất nhiều hơn, peroxidase hoạt động thấp hơn

(Abdelbagi M Ismail, 2008)[26]

1.3.2 Sinh lý học tính chống chịu ngập của cây lúa

Cơ chế sinh lý giải thích hiện tượng đáp ứng của cây trồng đối với điều kiện

bất lợi, và nhằm mục đích cải tiến cấu trúc, hoạt động sinh lý, sinh hóa của cây,

giúp cây thoát khỏi, hoặc né tránh, hoặc chống chịu sự thiệt hại do điều kiện bất lợi

gây ra

 Diệp lục tố

Giống nhạy cảm với những điều kiện bất lợi do ngập úng thường có hàm

lượng diệp lục giảm nhanh theo thời gian cây bị ngập Hiện tượng quang hợp dưới

nước vẫn có thể hoạt động, nhưng tốc độ quang hợp giảm do sự giảm oxy và thiếu

ánh sáng Hoạt động quang hợp liên quan rất chặt với hoạt động của RuBP

carboxylase trong lục lạp, và sự ngập hoàn toàn như vậy làm giảm đi hoạt động của

RuBP carboxylase (Rai và Murty 1979)[71] Do đó, các yếu tố ánh sáng giảm,

oxygen giảm, diệp tục tố giảm, chúng phối hợp với nhau làm cho hoạt động quang

hợp giảm trong suốt thời gian bị ngập nước Những giống chống chịu có khả năng

sống sót nhờ hàm lượng diệp lục giảm rất chậm và khả năng duy trì hoạt động

quang hợp trong điều kiện như vậy

 Carbohydrate

Trong suốt quá trình bị ngập hoàn toàn, sự cung cấp oxy bị hạn chế Sự hô

hấp kỵ khí gia tăng (Yamada 1959, Rai và Murty 1976, Setter và ctv 1987)

[96][70][79] Điều này tạo ra sự tiêu thụ nhanh chóng lượng carbohydrate và ức chế

thủy phân protein Hàm lượng chất bột giảm nhanh, ethylene gia tăng trong chồi

thân bị ngập, gia tăng chiều dài lá (Setter và ctv 1988)[80] Trường hợp cây lúa chỉ

bị ngập sâu 30-50cm, không có sự thay đổi đáng kể về carbohydrate, tinh bột,

đường trong cây lúa (Setter và cvt 1987)[79] Khi cây lúa bị ngập, lượng oxy trong

thân giảm do sự cung cấp không đầy đủ, sự hô hấp kỵ khí tăng lên và sự tiêu thụ các

cơ chất hô hấp cũng tăng lên, do đó Yamada (1959) cho rằng: tính kháng ngập của

cây lúa được xác định bằng số lượng cơ chất hô hấp có trong cây trước khi bị ngập

Các giống kháng có sự gia tăng về trọng lượng chất khô rất cao và phục hồi nhanh

hơn sau khi ngập (Mazarado và Vergara 1982)[59] Khác với kết luận của Yamada

(1959)[96] và hàm lượng carbohydrate của giống kháng rất cao trước khi ngập

Mazaredo và Vergara (1982)[59] thấy rằng sự sống sót và khả năng phục hồi nhanh

chóng tuỳ thuộc vào số lượng carbohydrate sau khi bị ngập

 Hàm lượng nitrogen

Hàm lượng nitrogen tổng số giảm trong cây mạ bị xử lý ngập hoàn toàn

(Mazaredo và Vergara 1982)[59], ở cây lúa thuộc giống không chống chịu ngập,

mức độ giảm này nhiều hơn so với cây chống chịu

 Hoạt động của peroxidase

Peroxidase trong qúa trình tăng trưởng và phân hóa chức năng được nhiều

báo cáo ghi nhận trong điều kiện bị ngập nước hoàn toàn (Kadam và ctv 1973,

Murty và Nada 1974)[54][66], nhưng vai trò chính xác của nó như thế nào vẫn chưa

được hiểu rõ Có thể mối quan hệ tương tác giữa chất kích thích sinh trưởng IAA và

peroxidase giữ một vai trò quan trọng của cây, đặc biệt trong rễ nhằm mục đích

giúp cây chịu đựng trong thời gian dài hơn đối với điều kiện bất lợi do ngập

(Krishnayya và ctv 1990)[56] Hoạt động của peroxidase ở bẹ lá lúa gia tăng từ

trước khi bị ngập cho đến sau khi bị ngập trong tất cả các giống thử nghiệm Sự gia

tăng này càng mạnh trong giống chống chịu Nhưng hoạt động peroxidase trong lá

và rễ của giống không chống chịu tỏ ra suy giảm trong quá trình bị ngập, trong khi

đó, peroxidase gia tăng một ít trong giống chống chịu

1.3.3 Di truyền tính chống chịu ngập của cây lúa

Phần lớn những tính trạng chống chịu với điều kiện bất lợi do môi trường là

tính trạng di truyền số lượng Do đó, phân tích những locus của tính trạng số lượng

QTL (quantitative trait locus-số ít, quantitative trait loci-số nhiều) đã được phát

triển với nhiều mô hình nhằm đáp ứng yêu cầu nghiên cứu Tính trạng số lượng

được điều khiển bởi nhiều gen, mỗi gen có một ảnh hưởng nhỏ đối với tính trạng

mục tiêu

Tính trạng chống chịu ngập được thể hiện do sự điều khiển của gen chủ lực,

gen điều khiển Sub1 định vị tại một locus giúp cho cây lúa chống chịu được ngập và

phục hồi bình thường

Tính chống chịu ngập hoàn toàn là một đặc tính quan trọng cho lúa nước Di

truyền về tính chống chịu ngập thực sự vẫn chưa được hiểu rõ Một nghiên cứu đã

kết luận rằng tính kháng ngập là một tính trạng di truyền (Mazaredo và Vergara

1982)[59], và tính chịu ngập hoàn toàn trội so với tính mẫn cảm, có ít nhất một gen

chủ lực cùng tồn tại bên cạnh nhiều gen khác (Mohanty và ctv 1982)[64], với ít

nhất 3 gen trội, trong đó 2 gen lặp đoạn, và gen thứ ba hoạt động bổ sung với 2 gen

còn lại (Suprihatno và Coffman 1981)[83] Một vài nghiên cứu sau đó đã ghi nhận

tính trạng chống chịu ngập có hệ số di truyền cao và ảnh hưởng gen cộng tính với ít

nhất một gen chủ lực thể hiện tính trội hoàn toàn hoặc trội từng phần (Mohanty và

ctv 1982, Mohanty và Khush 1985, Haque và ctv 1989)[64][63][45] Có tác giả kết

luận đây là tính trạng được điều khiển bởi cả gen chủ lực và các gen thứ yếu

(Mohanty và Khush 1985)[63], hay được điều khiển bởi một gen trội trong FR13A,

Kurkaruppan và Thavalu (Thạch 1994)[86], hoặc được điều khiển bởi chỉ một gen

trội (Mishra 1995)[62]

Khả năng chống chịu ngập hoàn toàn là một tính trạng di truyền giúp cây lúa

phục hồi sau khi bị ngập hoàn toàn trong nước (10-14 ngày) Cây có thể sống mà

không cần có khả năng vươn lóng Rất ít giống lúa cổ truyền được ghi nhận có khả

năng này Những vật liệu đã được công bố là FR13A, FR43B có nguồn gốc từ Ấn

Độ, giống Kurkaruppan, Thavalu, Goda Heenati có nguồn gốc từ Sri Lanka

Những gen mục tiêu điều khiển tính chống chịu ngập đã được phân lập bởi

công trình nghiên cứu của Xu và Mackill (1995)[94] Các tác giả này đã tìm thấy

gen chủ lực điều khiển tính trạng chống chịu ngập từ giống lúa IR40931-26-3-3-5,

định vị trên nhiễm sắc thể số 9, liên kết với chỉ thị RFLP (C1232), thông qua đó, có

69% biến thiên kiểu hình về tính trạng này được giải thích

Một nghiên cứu khác của Vanavichit (1996) cho thấy các gen chống chịu

ngập của giống lúa IR49830-7-1-2-2, liên kết với chỉ thị RFLP (RZ698) và hai chỉ

thị RAPD (AO2c và HO3b), định vị trên nhiễm sắc thể số 9, với giá trị liên kết

khoảng 4 cM Vị trí của gen chủ lực được nghiên cứu một cách hệ thống tại IRRI

với kỹ thuật AFLP trên quần thể cận giao tái tổ hợp F8 của tổ hợp lai IR74 /

FR13A, những gen thứ yếu được công bố định vị trên nhiễm sắc thể số 6, 7, 11 và

NST số 12 (Nandi và ctv 1997)[67]

1.4 MỘT SỐ LOẠI CHỈ THỊ PHÂN TỬ THƯỜNG ĐƯỢC SỬ DỤNG TRONG

NGHIÊN CỨU GENOME VÀ CHỌN GIỐNG THỰC VẬT

1.4.1 Chỉ thị phân tử ADN

Chỉ thị phân tử (CTPT) là các chỉ thị chọn lọc trực tiếp dựa trên cấu trúc phân tử

ADN Chỉ thị phân tử ADN có nhiều loại, đa dạng và ổn định trong mọi giai đoạn

của sinh vật Cây trồng có khoảng 108 – 1010

nucleotide trong ADN tổng số Thậm chí, nếu chỉ tính một sai khác rất nhỏ giữa hai cá thể đã dẫn đến một số lượng khổng

lồ các chỉ thị ADN giữa 2 cá thể CTPT ADN rất phong phú do sự đa dạng của

ADN, có tính ổn định và không lệ thuộc vào các yếu tố môi trường cũng như giai

đoạn phát triển của sinh vật

Một chỉ thị ADN lý tưởng phải đạt các yêu cầu sau: Bản chất cho đa hình

cao, di truyền đồng trội, xuất hiện nhiều trong hệ gen, dễ tiếp cận, phân tích nhanh

và dễ dàng Tuy nhiên, gần như không thể tìm thấy một CTPT nào có thể thỏa mãn

tất cả những điều kiện trên Tùy thuộc vào những nghiên cứu mà người ta sử dụng

một hệ thống chỉ thị thỏa mãn được một số điều kiện (Nguyễn Duy Bảy và ctv.,

2001)[1]

Chỉ thị phân tử được chia làm 3 loại chính:

- Chỉ thị dựa trên cơ sở lai ADN

- Chỉ thị dựa trên nguyên tắc nhân bội ADN bằng PCR

- Chỉ thị dựa trên cơ sở những chuỗi có trình tự lặp lại Nhóm chỉ thị này

thực ra cũng dựa trên cơ sở nhân bội ADN nhưng do chúng có bản chất là chuỗi lặp

lại nên có thể xếp vào một nhóm riêng

1.4.1.1 Chỉ thị dựa trên cơ sở lai ADN

 Chỉ thị RFLP (Restriction fragment length polymorphism - Đa hình chiều

dài mảnh giới hạn )

Chỉ thị này được các nhà di truyền học lần đầu tiên giới thiệu trong nghiên

cứu lập bản đồ các gen liên quan đến bệnh ở người (Bostein và ctv, 1980)[29]

Trong chỉ thị RFLP, enzym giới hạn được sử dụng để cắt ADN hệ gen thành nhiều

mảnh ADN có độ dài khác nhau Các đa hình RFLP sinh ra bởi những đột biến tự

nhiên ở những điểm cắt enzym giới hạn trong ADN bộ gen như đảo đoạn, thêm

hoặc mất đoạn ADN tùy thuộc vào mỗi giống, mỗi loài thậm chí mỗi cá thể Mỗi

loài sinh vật có một bộ gen đặc hiệu trong cấu trúc Vì vậy khi sử dụng những

enzym giới hạn để cắt phân tử ADN của hệ gen, các đoạn cắt ra của ADN với kích

thước hay chiều dài khác nhau có thể được dùng như các dấu hiệu di truyền để xem

xét các mẫu nhiễm sắc thể Sự nhận biết các đoạn cắt được thực hiện nhờ kỹ thuật

lai với các ADN mẫu dò (Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh)[24]

Chỉ thị RFLP là chỉ thị đồng trội nghĩa là có khả năng biểu hiện tất cả các

alen của cùng một locus gen Do vậy có thể phân biệt được các thể đồng hợp tử

(AA hoặc aa) và các cá thể dị hợp tử (Aa) Đây là đặc điểm ưu việt của chỉ thị

RFLP Hạn chế của phương pháp này là tốn nhiều thời gian và công sức, đòi hỏi có

phòng thí nghiệm với nhiều trang thiết bị kỹ thuật cao, đặc biệt là tiêu hao một

lượng lớn ADN mà số lượng đa hình thu được khá ít, thậm chí ở một số loài khó

nhận được đa hình (Lưu Thị Ngọc Huyền, 2003)[14]

1.4.1.2 Chỉ thị dựa trên cơ sở nhân bản ADN

Phản ứng chuỗi trùng hợp hay kĩ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)

do Kary Mullis đưa ra, giúp phát hiện sự đa hình ADN dựa trên cơ sở nhân bản các

đoạn ADN với số lượng lớn dựa trên nguyên lí tái bản của ADN trong tự nhiên

 Chỉ thị RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNAs – Đa hình các đoạn

ADN nhân bản ngẫu nhiên)

Chỉ thị RAPD hay còn gọi là RAPD – PCR được hình thành dựa trên

nguyên lý của kỹ thuật PCR được William và ctv phát triển vào năm 1990 Trong

chỉ thị RAPD không cần dùng cặp mồi đặc hiệu để nhân đoạn ADN nhất định mà

dùng các mồi đơn ngẫu nhiên để nhân các đoạn ADN một cách ngẫu nhiên Mồi

ngẫu nhiên là đoạn oligonucleotide dài khoảng từ 6 – 12 nucleotide, nhiệt độ kết

cặp thấp Do tính ngẫu nhiên nên các đoạn mồi này vừa là mồi xuôi, vừa là mồi

ngược Các đoạn này sẽ bắt cặp với trình tự bổ sung trong hệ gen của sinh vật để

nhân bản Sự đa hình phát hiện được khi sử dụng kỹ thuật RAPD có thể là do sự

thay đổi bazơ nucleotide ở vị trí gắn mồi, hoặc sự thêm hay mất nucleotide nằm

trong vùng nhân bản (Williams J.G, et al (1990)[91]

 Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism – Đa hình chiều

dài các đoạn ADN nhân bản chọn lọc)

Chỉ thị AFLP dựa trên nguyên tắc sử dụng enzym giới hạn và PCR (Vos và

ctv, 1995) Để thiết kế được các mồi đặc trưng trước hết cắt các mẫu nghiên cứu

bằng enzym giới hạn Khi xử lý enzym giới hạn ADN sẽ bị cắt thành vô số mảnh có

kích thước khác nhau Mỗi mảnh cắt, đều biết trước trình tự nucleotide của chúng ở

hai đầu cắt Dựa vào trình tự ở hai đầu cắt thiết kế các đoạn gắn (adaptor) Sau đó

dùng enzym ligase để nối các đoạn ADN thích ứng vào hai đầu ADN đã cắt Dựa

vào trình tự adaptor ta thiết kế mồi PCR Mồi PCR gồm hai phần: Một phần có trình

tự bổ sung với adaptor và phần kia là những nucleotide được thêm vào tùy ý,

thường từ 1 – 3 nucleotide Với mồi thiết kế như vậy thì chỉ có những đoạn ADN có

trình tự ở hai đầu bổ sung với trình tự mồi mới được nhân bản

Ưu điểm của phương pháp này là lượng ADN sử dụng cho nghiên cứu ít,

băng ADN ổn định, khả năng ứng dụng rộng rãi và do có thể bổ sung các nucleotide

khác nhau khi thiết kế mồi nên số lượng mồi có thể thiết kế được và tiềm năng ứng

dụng rất lớn AFLP còn cung cấp một lượng đa hình ADN lý tưởng từ ADN của bất

kỳ nguồn gốc nào từ đơn giản đến phức tạp AFLP cũng được coi là công cụ hiệu

quả nghiên cứu tính đa hình di truyền, tìm chỉ thị liên kết, xây dựng bản đồ di

truyền mật độ cao Đặc biệt được dùng trong phân tích ADN từ nhiều nguồn gốc

với mức độ phức tạp khác nhau

 Chỉ thị STS (Sequence Tagged Site – Vị trí trình tự được đánh dấu)

Chỉ thị STS do M Olson và cộng sự đề xuất năm 1989 STS là một đoạn

ADN ngắn gồm khoảng 60- 1000bp có thể được phát hiện bằng kỹ thuật PCR Nó

cho phép xác định những vị trí được đánh dấu bằng cách sử dụng các trình tự

nucleotide đã biết trước của ADN trong hệ gen

STS là chỉ thị nhân bản trực tiếp những locus đã biết bằng việc sử dụng cặp

mồi PCR được thiết kế, theo trình tự đoạn đầu và đoạn cuối của những locus đặc

trưng này (Trịnh Đình Đạt, 2006)[9] Các đoạn mồi STS chứa khoảng 20 nucleotide

nên có tính đặc hiệu cao với PCR Mỗi một STS được xác định tại một điểm trên

bản đồ như là một mốc trong hệ gen Ở cây lúa, các STS được coi như là mốc chuẩn

và người ta đã xác lập được các STS liên kết với một số gen kháng sâu bệnh, sử

dụng để phát hiện tính đa hình xây dựng bản đồ di truyền liên kết như STS liên kết

với gen chống chịu với điều kiện bất lợi ở lúa (Lê Duy Thành, 2000)[23] Nhờ đó

việc tìm kiếm các gen kiểm soát hoặc liên quan chặt chẽ đến một tính trạng di

truyền nào đó có thể được tiến hành dễ dàng Sử dụng trong lĩnh vực chọn giống

dựa vào các dấu phân tử STS để tìm kiếm các gen quan tâm trong quần thể và phân

tích nguồn gen, nghiên cứu mối quan hệ họ hàng giữa các loài

 Chỉ thị RGA (Resistance Gene Analog – Vùng tương đồng gen kháng)

Khi so sánh trình tự ADN của những gen kháng đã phân lập từ nhiều loài thực

vật khác nhau, các nhà khoa học đã thấy rằng những gen này có chung những vùng

lặp lại, như vùng lặp lại giàu leucin (Leucine Rich Repeat: LRR), vùng vị trí liên kết

nucleotide (Nucleotide Binding Site: NBS) và vùng protein Kinaza (PK) (Grant và

ctv., 1995[43] Bản chất của kỹ thuật RGA là những cặp mồi ADN được xây dựng

dựa vào những vùng bảo tồn nằm trong gen kháng Bởi vậy, sản phẩm ―nhận dạng‖

ADN có thể là một vùng hoặc toàn bộ gen kháng Kỹ thuật RGA đã được dùng để

tách, lập bản đồ gen kháng và phân tích đa dạng di truyền (Chen và ctv., 1999)[32]

Những mồi RGA đã sử dụng cũng tách biệt những giống lúa có hệ gen di truyền

Indica từ hệ gen di truyền japonica Ngoài ra, mối liên kết giữa chỉ thị RGA với gen

kháng bệnh rỉ sắt cũng được phát hiện (Chen X M., Line R F., Leung H, 1998)[33]

 Chỉ thị SNPs (Single nucleotide polymorphism - Đa hình của các nucleotide

đơn)

SNP là những biến dạng của chuỗi trình tự ADN được tìm thấy với tần suất

cao nhất trong hệ gen người Theo phân tích chi tiết chuỗi trình tự của những phần

nào đó trong hệ gen, ADN từ hai cá thể khác nhau phần lớn đều giống nhau với số

cặp base khác biệt nhau nằm ở trong khoảng cho phép 500-1000bp Một cặp base ở

một vị trí nào đó sẽ biểu thị sự khác nhau của cá thể có tính chất phổ biến, và một

cặp base khác là biến dị, ít phổ biến hơn ở cùng một vị trí Nếu cặp base ít phổ biến

hơn xuất hiện nhỏ hơn 1% trong quần thể, người ta gọi vị trí cặp base đó là một

SNP Hiện nay, người ta đã công bố 3 triệu SNP trong hệ gen người, nhiều hơn bất

cứ chỉ thị phân tử nào đã được công bố trước đó Chỉ thị SNP được áp dụng vào đầu

những năm 2000, từ hệ gen người cho đến hệ gen các sinh vật khác như cây

Arabidopsis, cây lúa (Oryza sativa)

1.4.1.3 Chỉ thị dựa trên những cơ sở những chuỗi có trình tự lặp lại

Chuỗi lặp lại có trật tự (Tandemly Repeated Sequence) là những trình tự lặp

lại một cách có trật tự từ đầu đến cuối trong một hệ gen, thường được gọi là ADN

vệ tinh, tiểu vệ tinh hay vi vệ tinh tuỳ thuộc vào số lượng bản sao của chúng trong

hệ gen và tính chất của chuỗi Thực ra, một số chuỗi lặp lại cũng thuộc loại chỉ thị

dựa trên cơ sở nhân bội ADN như chỉ thị vi vệ tinh Tuy nhiên, do chúng có bản

chất là chuỗi lặp lại nên có thể xếp chung vào một nhóm riêng

 Tiểu vệ tinh (Minisatellite)

Tiểu vệ tinh là loại chuỗi lặp lại nhiều lần, có đơn vị lặp lại gồm từ 6

nucleotide trở lên (thường vào khoảng 15bp), bao phủ một vùng từ 0,5-3kb Không

giống như ADN vệ tinh, tiểu vệ tinh được tìm thấy ở những vùng dị nhiễm sắc và

thường thay đổi rất nhiều về kích thước (Armour và Jeffreys)[27] Có 2 loại ADN

tiểu vệ tinh Đó là ADN đầu mút NST và ADN tiểu vệ tinh siêu biến ADN đầu mút

NST nằm ở vai NST, gồm một vài kilobase ADN tiểu vệ tinh siêu biến nằm ở vùng

phụ đầu mút NST (subtelomeric regions) (Napvi N I., ctv)[68]

 Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeats - Sự lặp lại của trình tự đơn giản)

SSR là chỉ thị nhân bản các đoạn lặp lại đơn giản hay còn gọi là vi vệ tinh

(Microsatellites)

Chỉ thị này được phát triển bởi Litt và Luty năm 1989 Là những đoạn ADN

lặp lại một cách có trật tự, gồm những đơn vị lặp lại từ 2- 6 nucleotide, theo kiểu lặp

lại ngắn và vài chục lần Hiện tượng tồn tại các SSR trong cơ thể sinh vật Eukaryote

là khá phổ biến, tuỳ từng loài mà số lượng nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại có thể

thay đổi từ một đến hàng chục và số lượng đơn vị lặp lại có thể biến động từ 2 đến

hàng trăm ngàn lần hoặc nhiều hơn.(Lê Thị Ánh Hồng, 2002)[12]

Ưu điểm của chỉ thị SSR là dễ thực hiện, không tốn kém SSR là chỉ thị đồng

trội có khả năng phát hiện đa hình rất cao, nhưng quá trình thiết kế mồi rất tốn kém

mà mỗi loại mồi lại chỉ đặc trưng cho một loài Tuy nhiên, SSR là một loại chỉ thị

chính xác và hữu hiệu trong nghiên cứu đa dạng di truyền, phân loại các giống vật

nuôi, cây trồng khác nhau trong cùng một loài động vật hay thực vật Người ta sử

dụng chỉ thị SSR để phân tích hệ gen để chọn giống, xây dựng bản đồ liên kết gen,

trong chọn lọc tính kháng bệnh, nghiên cứu một số tính trạng liên quan đến năng

suất cây trồng, các bệnh hại và sử dụng trong việc phân định sự sai khác giữa các

giống trong cùng một loài phụ do khả năng cho phép đánh giá mức độ alen thuộc

một locus

Chỉ thị SSR được nghiên cứu lần đầu tiên trên người (Hamada và ctv,

1982)[44] sau đó chỉ thị này đựơc dùng trong nghiên cứu di truyền ở lúa (Caldo và

ctv, 1998)[30] Hệ gen Eukaryote có nhiều đoạn ADN lặp lại, các đoạn lặp ADN có

kích thước dài ngắn khác nhau tuỳ từng loài

1.4.2 Tính ưu việt và những ứng dụng của chỉ thị phân tử

1.4.2.1 Tính ưu việt của chỉ thị phân tử

Trong những năm gần đây việc nghiên cứu hệ gen sinh vật sử dụng các chỉ

thị phân tử được phát triển nhanh chóng Chỉ thị phân tử cho phép xác định được

các chỉ tiêu trực tiếp của kiểu gen thông qua việc xác định các trình tự nhất định của

các gen hay các trình tự đặc hiệu liên kết chặt với các gen mang các tính trạng mong

muốn Bằng việc sử dụng các chỉ tiêu phân tích trực tiếp kiểu gen, khắc phục ảnh

hưởng của các yếu tố môi trường, theo dõi và phát hiện được các gen mong muốn,

sự biến đổi của chúng qua các thế hệ khi chưa có sự biểu hiện ra kiểu hình Điều

này giúp công tác chọn tạo giống tiền hành một cách chính xác, rút ngắn thời gian

và chi phí

Trên rất nhiều loại cây trồng hiện nay người ta đã thiết lập bản đồ chi tiết về

các chỉ thị ADN liên kết với nhiều gen quy định các tính trạng nông sinh học khác

nhau, trên cơ sở đó đã tiến hành chọn lọc gián tiếp dựa trên các chỉ thị phân tử này

Nhờ vào những ưu điểm của chỉ thị phân tử đó là:

- Tìm và phát hiện những cá thể có chứa một gen nhất định nào đó trong

quần thể đang phân ly, trên cơ sở tìm sự có mặt của một mẫu ADN đánh dấu liên

kết chặt với gen đó chứ không phải dựa vào kiểu hình của nó

- Đánh giá từng cá thể trong quần thể ở bất kì giai đoạn sinh trưởng nào: tế

bào, mô hay toàn bộ cơ thể, trong bất kì điều kiện môi trường đánh giá nào, cùng

một lúc đánh giá được nhiều tính trạng khác nhau trên một cá thể sinh vật

- Loại trừ được ảnh hưởng của mối tương tác giữa các alen khác nhau của

một locus hoặc giữa các locus khác nhau lên sự biểu hiện tính trạng

- Tăng hiệu quả và độ chính xác của chọn lọc đặc biệt đối với những tính

trạng khó biểu hiện ra kiểu hình

- Số lượng các chỉ thị phân tử là cực kỳ lớn, giúp cho nhà chọn giống phân

biệt được sự sai khác rất nhỏ giữa hai cá thể sinh vật có họ hàng gần nhau, thậm chí

khác nhau chỉ do đột biến nhỏ hoặc do tái tổ hợp, phân biệt được giữa các alen, các

chủng sinh lý gây bệnh

- Là công cụ hữu hiệu để khẳng định quyền tác giả đối với các loại giống cây

trồng, vật nuôi, phát hiện các loại bệnh di truyền trong y tế, phát hiện tội phạm

1.4.2.2 Những ứng dụng của chỉ thị phân tử

 Phân tích đa dạng di truyền

Nhờ sự ra đời của các loại chỉ thị phân tử đã cung cấp cho các nhà khoa học

một công cụ hữu ích trong việc nghiên cứu di truyền thực vật nói chung cũng như

nghiên cứu đa dạng di truyền, chọn tạo giống thực vật nói riêng Ưu điểm của CTPT

trong phân tích đa dạng di truyền là rút ngắn thời gian chọn lọc đối với các tính

trạng không hoặc khó đánh giá thông qua kiểu hình Các chỉ thị phân tử thường được

sử dụng để nghiên cứu, xác định mối quan hệ di truyền các cá thể trong cùng một loài

hoặc giữa các loài là cơ sở cho việc phân loại dưới loài, phát hiện loài mới và mối quan

hệ tiến hoá giữa loài Đặc biệt, nghiên cứu đa dạng di truyền có thể giúp tiên đoán

khả năng cho ưu thế lai giữa các cặp bố mẹ (Cặp bố mẹ nào có khoảng cách di

truyền xa hơn thường sẽ cho ưu thế lai lớn hơn)

RFLP là một trong những chỉ thị hình thành sớm nhất được sử dụng trong

nghiên cứu đa hình di truyền Wangz và ctv đã sử dụng chỉ thị RFLP để thiết kế sơ

đồ cây chủng loại phát sinh ở lúa (Wangz và ctv, 1992)[90] Jena S và ctv đã dùng

RAPD để xác định đa dạng cấu trúc ADN cây họ đậu (Jena S và ctv, 2004)[52]

Lưu Minh Cúc và ctv đã sử dụng SSR để khảo sát đa dạng di truyền một số giống

lúa nếp phục vụ cho xây dựng quy trình tính khác biệt của giống lúa hỗ trợ cho khảo

nghiệm DUS (Lưu Minh Cúc, 2010)[7] Chỉ thị phân tử ADN còn được ứng dụng

trong nghiên cứu sự sai khác ADN giữa các giống đột biến so với các giống gốc ở

thực vật

 Tìm chỉ thị phân tử liên kết gen và lập bản đồ gen

Một trong những ứng dụng quan trọng của chỉ thị phân tử ADN là tìm chỉ thị

liên kết gen (Gene tagging) và lập bản đồ gen Chỉ thị ADN cũng cho phép các nhà

chọn giống thực vật đặt chính xác các QTL vào bản đồ phân tử Bản đồ đối với tính

trạng số lượng (QTL) thường có rất ít thông tin về sự kiểm soát của gen Nhưng nó

vô cùng quan trọng, vì hầu như các tính trạng chống chịu với điều kiện bất lợi đều

yêu cầu bản đồ QTL Người ta cần phải quét từ đầu đến cuối hệ gen với những chỉ

thị bao phủ toàn bộ các NST, với khoảng cách trung bình 10cM giữa 2 chỉ thị

Thông qua đó, người ta xác định những khu vực giả định có chứa các gen điều

khiển tính trạng số lượng mà ta đang nghiên cứu

Những chỉ thị được ứng dụng trong chọn giống cây trồng phải liên kết chặt

với gen mục tiêu, trên cơ sở bản đồ di truyền phân tử

Bản đồ di truyền lúa đầu tiên được thiết lập bởi Nagao và Takashuki năm

1963, gồm 12 nhóm liên kết Vào những năm 70 của thế kỷ XX, nhiều nhà di truyền

chọn giống đã đề xuất bản đồ di truyền của lúa thiết lập nhờ các thể ba (Trisomic) Sau

đó bản đồ di truyền liên kết ở lúa được thiết lập trên cơ sở các chỉ thị đột biến hình thái

và các chỉ thị izozym (Ishikawa và ctv, 1991; Wu và ctv, 1993)[48][93]

Hiện nay, các nhà khoa học đã xác định có khoảng trên 30 gen chính kháng

bệnh bạc lá, 30 gen kháng đạo ôn, trên 20 gen kháng rầy nâu và một số QTL kháng

đạo ôn và rầy nâu đã được phát hiện Ngoài ra, nhiều gen và QTL có liên quan đến

các tính trạng khác của cây lúa như chịu ngập, hạn, mặn, chịu độc nhôm, chịu thiếu

phốt-pho, bất dục đực nhân nhậy cảm quang chu kỳ, bất dục đực nhân nhậy cảm

nhiệt độ, gen tương hợp rộng cũng được lập bản đồ phân tử để đưa vào sử dụng

trong chọn giống Lưu Thị Ngọc Huyền và ctv bằng kỹ thuật AFLP để xác định chỉ

thị phân tử liên kết gen kháng rầy nâu ở lúa CR203 (Thông tin CNSH ứng dụng,

2001)[14] Michael J Thomson và ctv đã lập bản đồ QTL và bằng chỉ thị phân tử và

lai trở lại tạo giống lúa chống chịu mặn (Michael J Thomson, 2010)[88] Nguyễn

Thị Lan Hoa và ctv đã sử dụng các chỉ thị SSR cho đa hình lập bản đồ các nhóm

liên kết trong hệ gen và xác định vị trí gen kháng bệnh xanh lùn ở cây bông cỏ

(Nguyễn Thị Lan Hoa, 2009)[10]

 Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử

Từ lâu, các nhà chọn giống đã quan tâm đến các chỉ thị hình thái liên kết với

một số tính trạng nông học quan trọng và sử dụng chúng như một phương tiện hữu

ích trong quy trình tạo giống mới Với chỉ thị hình thái các nhà chọn giống phải

đánh giá kiểu hình của cả một quần thể nhằm phát hiện những cá thể chứa gen

mong muốn

Mặt khác chỉ thị hình thái vốn có số lượng không nhiều, những chỉ thị liên

kết với gen quan tâm lại càng hiếm gặp vì thế giá trị thực tiễn của chỉ thị hình thái

trong chọn giống gặp nhiều hạn chế Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ

CTPT các nhà chọn giống bắt đầu quan tâm đến vấn đề chọn giống nhờ chỉ thị phân

tử và lai trở lại -MABC) với ý đồ sử dụng các chỉ thị phân tử liên kết với các gen

mong muốn trong chọn tạo giống mới

Thông thường, trong quy trình chọn tạo giống truyền thống, người ta đưa

nguồn gen mới có tính trạng mong muốn vào 1 giống khác bằng phương pháp lai

trở lại liên tục qua 5-6 thế hệ, hoặc chọn lọc cá thể trong quần thể phân ly từ thế hệ

F2 đến các thế hệ tiếp theo Bằng phương pháp này việc đưa gen lặn vào tổ hợp lai,

hoặc du nhập cùng một lúc vài gen mong muốn vào một dòng ưu việt thường gặp

rất nhiều khó khăn hoặc đôi khi không thể thực hiện được (Mohan và cs., 1997)

[65] Còn đối với quy trình chọn giống nhờ chỉ thị phân tử, nguồn gen mới nhập

được phát hiện gián tiếp thông qua các chỉ thị phân tử liên kết chặt với những gen

đó

Nguyên lý của phương pháp MABC là chuyển một QTL/gen từ dòng cho

gen vào dòng nhận gen trong khi chọn lọc sự hội nhập của dòng cho thông qua phần

còn lại của hệ gen (Thomson và ctv., 2009; Septiningsih và ctv., 2009; Singh và

ctv., 2009).[87][77][78] Việc sử dụng các chỉ thị phân tử cho phép khảo sát di

truyền của con lai ở mỗi thế hệ, đẩy nhanh tốc độ của quá trình chọn lọc, vì thế tăng

cường nền di truyền qua mỗi thế hệ Ưu điểm chính của phương pháp MABC là: (1)

Chọn lọc bằng chỉ thị phân tử đối với locut gen đích; (2) Chọn lọc nền di truyền đối

với hệ gen cây bố mẹ tái tổ hợp, (3) Tiến gần đến locus quan tâm trên bản đồ liên

kết, và (4) Chọn giống ngẫu nhiên kiểu gen mới với một số tính trạng quan tâm

Hiệu quả của các sản phẩm MABC sẽ được thể hiện trên đồng ruộng (Singh và ctv.,

2009, Sarkar và ctv., 2009)[78][76] Ngoài ra, thông qua phương pháp này, tốc độ

của quá trình chọn lọc được đẩy nhanh lên gấp đôi, thậm chí gấp ba (chỉ cần đến thế

hệ BC2 hoặc BC3 là đạt kết quả tương đương với BC6 theo phương pháp thông

thường

IRRI đã lập bản đồ chính xác QTL liên kết với tính trạng chịu ngập (Sub1)

nằm trên nhiễm sắc thể số 9, và đã thành công đưa vào 6 giống lúa cho vùng ngập

bằng phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử và lai trở lại Sáu giống lúa được

chuyển gen Sub1 là những giống phổ biến được nông dân trồng ở Nam và Đông

Nam châu Á; Swarna, Sambha Mahsuri, IR64, BR11, TDK1 và CR1009, những

giống này đã được trồng với diện tích trên triệu ha, đạt năng suất từ 1-3,5 tấn/ha

trong điều kiện ngập hoàn toàn trong giai đoạn lúa con gái Phương pháp chọn

giống nhờ chỉ thị phân tử và lai trở lại (MABC) cũng đã thành công trong việc chọn

tạo giống lúa chịu mặn bằng việc chuyển QTL Saltol có khả năng chịu mặn nằm

trên nhiễm sắc thể số 1, và đã thành công trên ba giống lúa trồng đại trà BR11,

BRRI dhan28 và IR64

Để đánh giá các giống lúa có mùi thơm Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu đã

nghiên cứu di truyền mùi thơm trên lúa và nhận thấy rằng gen mùi thơm được kiểm

soát bởi một gen lặn và chỉ thị ADN liên kết với gen mùi thơm từ đó có thể phát

hiện thể đồng hợp tử và dị hợp tử ngay từ thế hệ ban đầu (Nguyễn thị Lang và Bùi

Chí Bửu, 2004)[17]

Lưu Thị Ngọc Huyền và ctv đã dùng chỉ thị SSR để tạo giống lúa thuần

kháng rầy nâu cho ĐBSH và ĐBSCL (Lưu Thị Ngọc Huyền, 2010)[15] Lã tuấn

Nghĩa cũng sử dụng chỉ thị SSR để tạo giống lúa kháng bệnh đạo ôn có năng suất

chất lượng cao (Lã Tuấn Nghĩa, 2011)[19]

1.5 NHỮNG NGHIÊN CỨU CHỌN TẠO GIỐNG CHỊU NGẬP

1.5.1 Những nghiên cứu chọn tạo giống chịu ngập trên thế giới

Nghiên cứu giống lúa nước sâu, giống lúa chống lụt đã có từ lâu ở châu Á

Chương trình khảo nghiệm lúa nước sâu quốc tế từ năm 1976 đã được thực hiện liên

tục với nhiều báo cáo trong những hội nghị quốc tế về lúa gạo (Thái Lan 1976, Ấn

Độ 1978, Thái Lan 1982, Úc 1985) Các nhà khoa học nghiên cứu lúa nước sâu

phần lớn chú ý vào đặc tính khả năng vươn lóng của lúa nên nghiên cứu các giống

lúa nổi là trọng tâm vào thời bấy giờ

Công trình nghiên cứu về lúa nước sâu được công bố từ năm 1934 tại trạm

lúa nổi Habiganj – Bangladesh (Jackson và Vergara 1979)[51] Công trình tập trung

vào việc nghiên cứu tuyển chọn giống cải tiến, ảnh hưởng của tuổi mạ đối với tính

chịu ngập, điều kiện đất đai, thời vụ và phương pháp gieo sạ

Năm 1941, Ramiah và Ramaswami đã công bố một chương trình nghiên cứu

về di truyền tính trạng nổi của cây lúa Đặc tính tăng trưởng theo kiểu ngã rạp (bò)

của lúa nổi do hai gen lặn, lặp đoạn điều khiển, một gen liên kết với gen trội của

tính chín muộn Những phát hiện chủ yếu dựa trên việc nghiên cứu quần thể F2

được trồng trong điều kiện nước cạn của các cặp lai, giữa lúa nước sâu với giống

không phải nuớc sâu của Ấn Độ, Bangladesh, Pakistan Tác giả cho rằng không có

khả năng vươn lóng của những cây đang phân ly (Ramiah và Ramaswami,

1941)[72]

Năm 1965, Chang xác định thêm về hai gen lặn dw1 và dw2 điều khiển tính

trạng nổi.[31]

Tất cả các giống lúa nổi được biết hiện nay thuộc loại hình Indica, chưa thấy

giống lúa nổi loại hình Japonica, cũng như chưa truyền được gen nổi của Indica

vào Japonica (Oka 1975)[69] Tác giả lưu ý: có vài giống lúa không thể hiện tính

vượt nước nhưng vẫn có thể có gen nổi bởi có tổ tiên của nó là giống hoang dại, có

sự khác biệt một cách đáng chú ý về khả năng nổi từ trung bình đến mạnh Khả

năng nổi là yếu tố thuộc dạng hình hoang dại và nửa hoang dại để cây lúa thích nghi

với chế độ nước thay đổi bất thường

Sự vươn dài lóng thân của giống lúa nước sâu địa phương xảy ra ở cây mạ

4 tuần tuổi, trong khi đối với loại hình cải tiến (nửa lùn) là 10 tuần tuổi Các giống

lúa nổi vượt nước giỏi nhất có xu hướng trỗ muộn nhất, thích nghi với điều kiện

ngập lụt, nước rút khô chậm Tác giả còn ghi nhận: lúa nổi khác với lúa thường là

sự kéo dài lóng thứ 5 và 6 khi cho phản ứng với GA (gibberellic acid) (Inouye và

ctv 1985)[49]

Các trạm nghiên cứu lúa nước sâu đều bắt đầu thực hiện việc cải tạo giống

bằng cách chọn các giống lúa địa phương được sử dụng nhiều trong các chương

trình lai tạo giống là: Leb Mue Nahng 111, Pingaew 56, Chamara, Khama, Baisbish

về khả năng vượt nước FR13A, Goda Heenati, Kurkaruppan, Thavalu, Saran

Kraham về khả năng chịu ngập

Tại Viện Nghiên cứu Lúa Quốc Tế, các nhà khoa học đã sử dụng kỹ thuật

AFLP để phân tích bản đồ di truyền trên cơ sở quần thể cận giao tái tổ hợp (RIL),

quần thể F8 của tổ hợp lai IR74 x Jalmagna (Sripongpankul 1998)[82] Tác giả đã

sử dụng 247 dòng lai để đánh giá kiểu hình, áp dụng với 201 chỉ thị phân bố trên 12

nhiễm sắc thể lúa, với sự phối hợp của 20 cặp mồi của Pst1 và Mse1 thấy rằng 9

QTL phối hợp với tính trạng vươn cao thân định vị ở nhiễm sắc thể số 1, 4, 5, 6, 10

và 12 Sáu QTL phối hợp với tính trạng vươn lóng thân định vị trên nhiễm sắc thể

số 1, 4, 5, 6, và 10 Ba QTL phối hợp với tính trạng vươn dài của lá định vị trên

nhiễm sắc thể số 1, 4, và 12.(Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2003)[6]

Với lúa chịu ngập hoàn toàn thì từ những năm 1950, các nhà khoa học phát

hiện ra giống bản địa của Ấn Độ có khả năng này Những năm 1980 công tác chọn

tạo giống chống chịu ngập bắt đầu được tiến hành Năm 1993 có giống lúa bán lùn

năng suất cao chịu ngập đầu tiên Năm 1995 gen Sub1 đã được lập bản đồ trên

nhiễm sắc thể số 9 Năm 2002 C N Neeraja và ctv đã dùng phương pháp MABC

chọn tạo giống SwanaSub1 từ giống Swana của Ấn Độ lai với giống IR49830-7

mang gen Sub1 có nguồn gốc từ FR13A., chỉ thị 464A với khoảng cách là 3,4 cM

và SSR1 với khoảng cách 0,7 cM, chỉ thị RM316 với khoảng cách 1,5 cM đã được

sử dụng để chọn lọc cây mang gen kháng, đến thế hệ BC3F2 đã nhận được cây lai

mang gen Sub1 có nền di truyền của Swana Năm 2006, Neeraja phát hiện gen

Sub1A là gen chính điều khiển tính chống chịu ngập.(C N Neeraja,2007)[34] Năm

2009, Swana Sub1 đã được chính phủ Ấn Độ công nhận Kể từ tháng 8/2009, IRRI

đã phân phối giống lúa ―Swarna-Sub1‖ cho 100.000 hộ nông dân ở Ấn Độ và giống

lúa này hiện đã được trồng trên 12 triệu ha trên tổng số 44 triệu ha diện tích trồng

lúa ở Ấn Độ Năm 2010 nhiều giống mang gen Sub1 đã được trồng ở Ấn Độ,

Philippine, Indonesia, Bangladesh Ấn Độ đã cho trồng đại trà hai giống lúa chịu

ngập là Swarna-Sub1, Mahsuri-Sub1

Tại Bangladesh - một đất nước bị ngập lụt thường xuyên vào mùa mưa bão,

giống Swarna-Sub1 với tên địa phương là BRRI dhan51 còn được gieo trồng phổ

biến hơn Ngoài ra, K M Iftekharuddaula cũng dùng phương pháp MABC để

chuyển QTL Sub1 từ dòng IR40931-33-1-3-2 vào giống BR11- một giống đang

được trồng phổ biến, với hai thế hệ lai trở lại và một thế hệ tự thụ Tác giả dùng 1

chỉ thị SSR liên kết chặt RM8300 để sàng lọc cây mang gen và 4 chỉ thị nằm về hai

phía của gen kháng là RM23679 ở vị trí 0,8Mb, RM23805 ở vị trí 4,5Mb để sàng

lọc đầu trên của NST, RM23915 ở vị trí 7,1Mb, RM23958 ở vị trí 7,9Mb ở đầu

dưới của NST, trong đó có vùng gen Sub1 ở vị trí 6,3Mb Giống BR11-Sub1 được

đưa vào trồng rộng rãi tại Bangladesh năm 2009 với tên địa phương BRRI dhan 52

(K M Iftekharuddaula, 2010)[55]

Giống lúa chống chịu ngập đầu tiên tại Philippines đã được công nhận trong

cuộc Họp Hội đồng thư ký lần thứ 27 ngày 7 tháng 7 năm 2009 NSIC Rc 194 (Aka

Submarino 1) là giống IR64 mang gen chống chịu ngập úng (Sub1), mà gen này đã

được phát hiện bởi Viện nghiên cứu lúa quốc tế (IRRI) và Đại học California- Davis

từ một giống lúa Ấn Độ là FR13A Giống lúa BR11Sub1 năm 1997 cũng được

trồng phổ biến với tên địa phương là PSB Rc68 (Sacobia)

Myanma năm 2003 đã đưa vào trồng rộng rãi giống lúa BR11Sub 1với tên

địa phương là Emata Latt Indonesia năm 2008 đưa vào trồng rộng rãi giống lúa

IR70213-9-CPA-12-UBN-2-1-3-1 với tên địa phương là INPARA 3, năm 2009 đưa

vào trồng rộng rãi giống Swana- sub1 với tên địa phương là INPARA 5, và giống

IR64Sub1 với tên là INPARA 4 Thái Lan đưa vào trồng rộng rãi một giống lúa

chịu ngập là Homcholasit

1.5.2 Những nghiên cứu chọn tạo giống chịu ngập ở ViệtNam

Ở Việt Nam hiện nay tiến độ cải tiến giống chống chịu đối với các điều kiện

môi trường bất lợi rất chậm bởi chúng ta chưa có sự hợp tác nghiên cứu một cách

hiệu quả giữa nhà sinh lý thực vật, sinh hóa và nhà di truyền Một vài tiến bộ được

ghi nhận trong cải tiến giống chống chịu, hoặc tránh né ngập, khô hạn, mặn, độ độc

nhôm Những hiểu biết về cơ chế chống chịu cho từng đối tượng còn quá hạn chế

Chính vì vậy, đến khoảng đầu những năm 1990, chưa có giống lúa nào thực sự

chống chịu ngập hoàn toàn, ngoại trừ một số giống lúa nổi vốn là những giống lúa

cổ truyền của Việt Nam là giống Móng chim và Nếp Vằn Hai giống này được thu

thập tại Thuận hải và Đồng Nai trên vùng canh tác lúa nước trời, thường bị ngập đột

ngột trong mùa lũ, thời gian ngập từ 7 – 10 ngày

Ngoài ra, Viện Cây Lương thực và Cây Thực phẩm (Hải Dương), Viện Lúa

ĐBSCL (Cần Thơ) và một số các viện nghiên cứu khác đã tham gia tích cực vào

chương trình nghiên cứu lúa chống ngập ―IRRI-JAPAN Submergence Tolerant Rice

project in SE Asia‖ hợp tác với IRRI về gene chống ngập Sub1 Tháng 11 năm

2007, Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm đã tiến hành một cuộc khảo sát nhanh

những người nông dân sống ở những vùng đất thấp thuộc 5 tỉnh ĐBSH là Hải

Dương, Hưng Yên, Nam Định, Ninh Bình và Thái Bình Kết quả cho thấy những

người nông dân nơi đây đang tìm kiếm một giống lúa có thể tồn tại được trong điều

kiện ngập lụt Tháng 9 năm 2007, Viện Lúa ĐBSCL thử nghiệm hai giống lúa chịu

ngập là IR64Sub1 và SwanaSub1 và một giống địa phương không chịu ngập là

OM4900 được đánh giá ở thị trấn Thạch An và Vĩnh Thạch Hai giống này cũng

được trồng thử nghiệm ở Trung tâm Đồng Tháp Mười - Mộc Hóa, tỉnh Long An

Tuy nhiên so với các quốc gia trong khu vực, hình như chúng ta vẫn còn đi khá

chậm trong việc triển khai và trồng rộng rãi các giống lúa chống chịu

Đại học Nông nghiệp Hà Nội được cả hai Đại học California Davis (UCD)

và California Riverside (UCR) đồng ý cho tham gia vào chương trình nghiên cứu

lúa chống chịu ngập/chống mặn của các GS Ronald (UCD) và Bailey-Serres

(UCR) Việc hợp tác này đối với Đại học Nông nghiệp Hà Nội là một bước phát

triển rất tích cực không những cho bản thân Đại học Nông nghiệp Hà Nội mà còn

cho cả ngành lúa nước Việt Nam

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1 Các giống lúa nghiên cứu

- Giống lúa cho gen: IR64Sub1 là giống chịu ngập chìm là Giống lúa chống

chịu ngập đầu tiên tại Philippines đã được công nhận trong cuộc Họp Hội đồng thư

ký lần thứ 27 ngày 7 tháng 7 năm 2009

- Giống lúa nhận gen: AS996 là giống lúa chất lượng cao được bộ Bộ môn

Di truyền chọn giống Viện nghiên cứu Lúa ĐBSCL, chọn lọc từ tổ hợp lai IR

64/Oryza rufipugon AS996 có tên gốc là OM2431-996 được công nhận giống

chính thức theo Quyết định số 5310 QĐ/BNN-KHCN, ngày 29 tháng 11 năm 2002

của Bộ Nông Nghiệp & PTNT Giống có thời gian sinh trưởng 90-95 ngày, chiều

cao cây 95 - 100 cm, thân cây cứng, đẻ nhánh khá, chịu phèn tốt, kháng vừa với

bệnh đạo ôn, nhiễm nhẹ với bệnh khô vằn và rầy nâu Năng suất: vụ Đông Xuân 6-8

tấn/ha, vụ Hè Thu 4-5 tấn/ha Là một trong những giống lúa chủ lực trong cơ cấu

giống của ĐBSCL với diện tích gieo trồng 30.000ha/vụ

- Một số giống lúa đang được trồng phổ biến ở Việt Nam như Q5c, Q5l, OM5472,

FL478, IR64SUB1, AS996, KDDB, BT

2.1.2 Hóa chất và thiết bị thí nghiệm

- 372 chỉ thị SSR phân bố rải rác trên12 NST (phụ lục 1)

- Các vật tư, hóa chất sinh học phân tử chuyên dụng (phụ lục 2)

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Phương pháp lai hữu tính đối với các giống lúa cho và nhận gen kháng Kết

hợp với phương pháp lai trở lại để chọn lọc và làm thuần nhanh những dòng mang

gen kháng và nền gen tối đa của giống nhận gen

- Tách chiết và tinh sạch ADN theo phương pháp CTAB cải tiến (của phòng

thí nghiệm Di truyền học, Trường đại học Gent, Vương Quốc Bỉ)

- Chọn lọc cây con mang gen kháng thông qua phương pháp PCR đối với các

chỉ thị SSR liên kết với QTL quy định tính chịu ngập chìm (Sub1) Chọn lọc nền

gen thông qua phương pháp PCR đối với các chỉ thị phân bố trên 12 NST lúa

- Điện di trên gel agarose 0,8% nhuộm Ethidium Bromide

- Điện di trên gel polyacrylamide biến tính 4,5% nhuộm bạc

- Điện di trên gel polyacrylamide không biến tính 6% nhuộm Syber safe

- Phân tích dữ liệu trên chương trình Graphical Genotyper (Van Berloo,

2008)[89]

2.2.1 Phương pháp lai hữu tính - lai trở lại giữa giống cho và nhận gen chịu

ngập

AS996 được chọn làm cây mẹ và IR64Sub1 được chọn làm cây bố để lai tạo

con lai F1, sử dụng phương pháp lai hữu tính (thụ phấn bằng tay) Hoa lúa chưa tung

phấn của cây AS996 được khử đực bằng cách cắt bỏ 6 bao phấn của mỗi hoa, sau

đó lấy hạt phấn của cây IR64Sub1 thụ phấn cho cây AS996 Sau 30 ngày thu hạt lai

F1

Các hạt lai F1 được trồng đến khi được 20 ngày tuổi thì tiến hành tách chiết

ADN, kiểm tra sự có mặt của gen chịu ngập bằng chỉ thị phân tử Chọn lọc các cá

thể dị hợp tử mang gen chịu ngập để lai trở lại với giống AS996 (làm bố) tạo quần

thể BC1F1 Các cá thể BC1F1 được trồng, tách chiết ADN, kiểm tra sự có mặt của

gen chịu ngập và chọn lọc nền gen của cây mẹ bằng chỉ thị phân tử Chọn những cá

thể mang gen chịu ngập và có nền di truyền lớn nhất của giống AS996 để lai trở lại

với dòng nhận gen tạo BC2F1

Tiếp tục các công việc như từ thế hệ BC1F1 đến thế hệ BC3F1 có thể lai thêm

1 thế hệ nữa hoặc cho tự thụ để chọn cá thể đồng hợp tử mang gen kháng, chọn

được dòng mang gen chịu ngập chìm và mang phần trăm lớn nhất nền gen của cây

mẹ

2.2.2 Phương pháp tách chiết ADN tổng số

ADN lúa được tách chiết và tinh sạch theo phương pháp CTAB cải tiến (của

phòng thí nghiệm Di truyền học, Trường đại học Gent, Vương Quốc Bỉ)