Nghiên cứu tính đa hình của gen OsHKT1 mã hóa cho protein vận chuyển ion liên quan đến tính chịu mặn ở cây lúa

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------ Nguyễn Thị Nha Trang NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH CỦA GEN OsHKT1 MÃ HÓA CHO PROTEIN VẬN CHUYỂN ION LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

- -

Nguyễn Thị Nha Trang

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH CỦA GEN OsHKT1

MÃ HÓA CHO PROTEIN VẬN CHUYỂN ION LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU MẶN Ở CÂY LÚA

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2014

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

- -

Nguyễn Thị Nha Trang

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH CỦA GEN OsHKT1

MÃ HÓA CHO PROTEIN VẬN CHUYỂN ION LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU MẶN Ở CÂY LÚA

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện luận văn này, ngoài sự cố gắng của bản thân tôi đã nhận được sự quan tâm, động viên giúp đỡ rất nhiệt tình của các thầy cô,

gia đình và bạn bè

Lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới: TS Đỗ Thị Phúc

- người đã trực tiếp hướng dẫn tôi, chỉ dạy tận tình trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu và hoàn thành khóa luận

Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới tập thể các thầy cô trong bộ môn Di truyền học- Khoa Sinh học- Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên Hà Nội đã hết lòng giúp đỡ và hỗ trợ tôi trong thời gian học tập và nghiên cứu Cuối cùng, tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè thân thiết đã luôn góp ý, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2014

Học viên

Nguyễn Thị Nha Trang

i

BẢNG KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT

Kí hiệu Tiếng Anh TiếngViệt

DNA Deoxyribonucleic Acid deoxyribonucleic

Bp Base pair Cặp bazơ nitơ

CDS Coding sequence Trình tự mã hóa cho protein CTAB Cetyl trimethylamoni bromide

dNTP Deoxyribonucleotide Triphosphate

EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Ethylen diamin tetraacetic acid

Kb Kilobase

PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp TAE Tris-acetate-EDTA

TE Tris-EDTA

IRRI International Rice Research Institute Viện nghiên cứu lúa Quốc tế

ii

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1.Vài nét sơ lược về cây lúa 3

1.2.Đất mặn và cơ chế chống chịu mặn ở Thực vật 5

1.2.1.Đất mặn 5

1.2.2.Cơ chế thích nghi stress mặn ở Thực vật 6

1.2.3.Phản ứng chống chịu mặn của cây lúa 7

1.3.Protein vận chuyển ion liên quan đến tính chịu mặn ở Thực vật 9

1.4 Protein HKT ở thực vật 10

1.4.1 Vai trò, chức năng của protein HKT ở thực vật 10

1.4.2 Họ protein HKT ở lúa 12

1.5 Các phương pháp nghiên cứu, vai trò của nghiên cứu đa hình gen 13

1.6.Tình hình nghiên cứu liên quan đến gen OsHKT1 14

1.7.Mục tiêu và các nội dung nghiên cứu của đề tài 15

1.7.1.Mục tiêu 15

1.7.2 Nội dung nghiên cứu 15

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 VẬT LIỆU 16

2.1.1 Mẫu vật nghiên cứu 16

2.1.2 Mồi phản ứng PCR 16

2.1.3 Hóa chất 17

2.1.3.1.Các hóa chất được sử dụng để tách DNA tổng số 18

2.1.3.2.Môi trường trồng thủy canh 18

2.1.3.3.Phản ứng PCR được thực hiện cùng với Taq DNA polymerase 2.1.3.4.Sản phẩm phản ứng PCR 19

2.1.4 Thiết bị 19

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.2.1.Trồng lúa sử dụng phương pháp thuỷ canh và thí nghiệm xử lý mặn 19

2.2.1.1.Trồng lúa sử dụng phương pháp thủy canh…… 20

2.2.1.2.Thí nghiệm xử lý mặn 20

iii

2.2.2 Tách chiết DNA tổng số 21

2.2.3 Phương pháp PCR 22

2.2.4 Tinh sạch 23

2.2.5 Phần mềm sử dụng để phân tích số liệu 24

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

3.1 Đánh giá khả năng chịu mặn của các giống lúa 25

3.2.Đánh giá ảnh hưởng của điều kiện mặn lên một số đặc điểm sinh lý của cây lúa 27

3.2.1 Kết quả đánh giá về chiều dài thân sau khi xử lý mặn 27

3.2.2 Kết quả đánh giá chiều dài rễ sau khi xử lý mặn 30

3.2.3.Kết quả đánh giá khối lượng thân sau khi xử lý mặn 31

3.2.4.Kết quả đánh giá khối lượng rễ sau khi xử lý mặn 32

3.3 Tách chiết DNA tổng số từ lá lúa 33

3.4 Nhân bản gen OsHKT1 34

3.5.Giải trình tự gen OsHKT1 ở 8 giống lúa 36

3.6 Phân tích trình tự gen ở 8 giống lúa 36

3.7.Phân tích trình tự acid amin suy diễn của protein mã hóa bởi gen OsHKT1 từ 8 giống lúa 40

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42

Kết luận 42

Kiến nghị 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO 43

iv

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Phân loại chi Oryza[85]. 4

Bảng 1.2 Đặc trưng hình thái và sinh lý tổng quát của 3 nhóm giống lúa 5

Bảng 1.3 Danh sách các protein thuộc họ protein HKT ở lúa 12

Bảng 2.1 Danh sách các giống lúa nghiên cứu 16

Bảng 2.2 Các cặp mồi phản ứng PCR được sử dụng trong nghiên cứu 17

Bảng 2.3 Môi trường đa lượng 18

Bảng 2.4 Môi trường vi lượng 18

Bảng 2.5 Bố trí thí nghiệm đánh giá khả năng chịu mặn của các giống lúa 20

Bảng 2.6 Tiêu chuẩn đánh giá (SES) ở giai đoạn tăng trưởng và phát triển 21

Bảng 2.7 Thành phần phản ứng PCR 23

Bảng 2.8 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 23

Bảng 3.1Vị trí sai khác acid amin 41

Bảng 3.2.Bảng số liệu sau 3 ngày xử lý mặn 60

Bảng 3.3.Bảng số liệu sau 7 ngày xử lý mặn 62

Bảng 3.4.Bảng số liệu sau 14 ngày xử lý mặn 64

v

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 Cây lúa (Oryza sativa L.) 3

Hình 2 Cơ chế thích nghi stress chung ở Thực vật 7

Hình 3 Điều hòa K+/Na+ ở thực vật bậc cao 9

Hình 4.Chức năng vận chuyển của protein HKT 11

Hình 5 Sơ đồ biểu thị vị trí và kích thước các đoạn exon, intron của chín gen OsHKT ở lúa 13

Hình 6 Vị trí bắt cặp mồi trên gen OsHKT1 16

Hình 7 Lúa trồng trước khi xử lý mặn 25

Hình 8 Lúa sau 3 ngày xử lý mặn 25

Hình 9 Lúa sau 7 ngày xử lý mặn 25

Hình 10 Lúa sau 14 ngày xử lý mặn 25

Hình 11 Đồ thị đánh giá ảnh hưởng của điều kiện mặn lên đặc điểm hình thái của cây lúa sau 3 ngày 26

Hình 12 Đồ thị đánh giá ảnh hưởng của điều kiện mặn lên đặc điểm hình thái của cây lúa sau 7 ngày 26

Hình 13 Đồ thị đánh giá ảnh hưởng của điều kiện mặn lên đặc điểm hình thái của cây lúa sau 14 ngày 27

Hình 14 Đồ thị biểu diễn chiều dài thân lúa sau 3 ngày xử lý mặn 28

Hình 15.Đồ thị biểu diễn chiều dài thân lúa sau 7 ngày xử lý mặn 29

Hình 16.Đồ thị biểu diễn chiều dài thân lúa sau 14 ngày xử lý mặn 29

Hình 17 Đồ thị biểu diễn chiều dài rễ lúa sau 3 ngày xử lý mặn 30

Hình 18 Đồ thị biểu diễn chiều dài rễ lúa sau 7 ngày xử lý mặn 31

Hình 19.Đồ thị biểu diễn chiều dài rễ lúa sau 14 ngày xử lý mặn 31

Hình 20 Đồ thị biểu diễn khối lượng thân 32

Hình 21.Đồ thị biểu diễn khối lượng rễ 33

Hình 22.DNA tổng số tách từ lá lúa 33

Hình 23 Điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi 1 34

vi

Hình 24 Điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi 2 34 Hình 25 Điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi 3 35 Hình 26 Điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi 4 36 Hình 27 Hình ảnh cho thấy một phần kết quả giải trình tự đối với mẫu nếp nõn tre sử dụng cặp mồi 3 36 Hình 28 So sánh trình tự vùng mã hoá của gen giữa các giống lúa 38 Hình 29 So sánh trình tự vùng không mã hoá của gen giữa các giống lúa 39 Hình 30 So sánh trình tự acid amin suy diễn từ trình tự nucleotide thu đƣợc giữa các giống lúa 40 Hình 31 Cấu trúc protein xuyên màng 41

1

MỞ ĐẦU

Lúa là một trong năm loại cây lương thực chính trên thế giới, diện tích trồng lúa và lượng tiêu thụ chủ yếu ở Đông Nam Á và Châu Phi Hiện nay, lúa được trồng trong những điều kiện sinh thái và khí hậu rất khác nhau ở cả ba vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và ôn đới trên tất cả các châu lục [4, 61 ]

Việt Nam là một nước nông nghiệp với truyền thống trồng cây lúa với nền văn minh lúa nước có trên 4000 năm lịch sử Việt Nam còn được xếp vào hàng những nước xuất khẩu gạo hàng đầu thế giới Sản lượng gạo xuất khẩu năm 2014 lên tới 44,5 triệu tấn lúa (27,8 triệu tấn gạo). Lúa gạo cung cấp nguồn lương thực chính cho chúng ta, tạo việc làm cho hàng triệu nông dân và đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển kinh tế của Việt Nam

Tuy nhiên, thế giới sẽ phải đối mặt với nguy cơ thiếu lương thực, sự khan hiếm về nước tưới phục vụ cho nông nghiệp đã được báo động trong nhiều hội nghị khoa học của thế giới gần đây Lũ lụt và sự xâm nhập mặn sẽ trở thành vấn đề then chốt trong những năm tới Với tầm quan trọng như vậy, người ta đã hoạch định một thứ tự ưu tiên trong đầu tư nghiên cứu tính chống chịu mặn và chống chịu hạn trên toàn thế giới, trong lĩnh vực cải tiến giống cây trồng, sau đó là tính chống chịu lạnh, chống chịu ngập úng, chống chịu đất có vấn đề (acid, thiếu P, ngộ độc Fe, ngộ độc Al, thiếu Zn, Mg, Mn và một

số chất vi lượng khác như Cu,…) Do đó, việc hạn chế mức độ gây hại của sự nhiễm mặn đến năng suất lúa gạo là một vấn đề cần được quan tâm nghiên cứu

Cây trồng trên đất nhiễm mặn bị ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển và năng suất Khả năng điều hòa cân bằng hàm lượng ion Na+ trong tế bào là một trong những cơ chế quan trọng giúp cây sinh trưởng, phát triển trong điều kiện đất nhiễm mặn Cơ chế điều hòa được thực hiện thông qua việc: Hạn chế lượng ion Na+ đưa vào tế bào; khu trú ion Na+ vào không bào; thải loại ion Na+ ra ngoài môi trường

Gen OsHKT1 mã hóa cho protein có vai trò vận chuyển Na+ vào tế

2

bào ở cây lúa Nghiên cứu cấu trúc, chức năng của gen OsHKT1 giúp làm

sáng tỏ cơ chế chịu mặn của cây lúa Do đó, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên

cứu “Nghiên cứu tính đa hình của gen OsHKT1 mã hóa cho protein vận

chuyển ion liên quan đến tính chịu mặn ở cây lúa” nhằm nghiên cứu tính

đa hình của gen OsHKT1 ở lúa

3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Vài nét sơ lược về cây lúa

Cây lúa (Oryza sativa L.) là một trong những cây lương thực chính

của nước ta và nhiều nước trên thế giới Sản xuất lúa gạo chủ yếu tập trung ở các nước Châu Á với mức tiêu dùng hàng năm khoảng 180 - 200 kg/người, ở Châu Mỹ, Châu Âu khoảng 100 kg/người [6]

Hình 1 Cây lúa (Oryza sativa L.)[6]

Cây lúa trồng thuộc họ Poaceae, trước đây gọi là họ Hoà thảo (Gramineae), họ phụ Pryzoideae, tộc Oryzae, chi Oryza, loài Oryza sativa và

Oryza glaberrima Loài Oryza sativa là lúa trồng ở Châu Á và Oryza glaberrima là lúa trồng ở Châu Phi Năm 1753, Lineaeus là người đầu tiên đã

mô tả và xếp loài lúa sativa thuộc chi Oryza Dựa vào dạng hạt tác giả đã phân chi

Oryza thành bốn nhóm là sativa, granulata, coarctala, rhynchoryza và chi Oryza gồm tất cả 19 loài

Hội nghị di truyền lúa Quốc tế đã tổ chức họp tại Viện nghiên cứu lúa

Quốc tế, Philippines năm 1994 khẳng định chi Oryza có 22 loài trong đó có

20 loài lúa dại và hai loài lúa trồng[61]

4

Sau này, Vaughan phát hiện thêm một loài lúa dại mới ở Papua New

Ginea là loài Oryza rhizomatis, đưa số loài của chi Oryza lên 23 loài và chia

thành bốn nhóm genome [61] Danh sách các loài, số lượng nhiễm sắc thể, bộ gen của từng loài được ghi ở Bảng 1.1

Bảng 1.1 Phân loại chi Oryza[61]

Ngày nay, các nhà phân loại học đều thống nhất là chi Oryza có 23 loài, trong đó 21 loài hoang dại và hai loài lúa trồng là Oryza sativa và Oryza

glaberrima thuộc loại nhị bội 2n = 24 có bộ gen AA [3,6] Loài Oryza glaberrima phân bố chủ yếu ở Tây và Trung Phi còn loài Oryza sativa được

gieo trồng khắp thế giới và được chia thành hai loài phụ là Indica và Japonica Trong quá trình tiến hoá của cây lúa, ngoài hai loài phụ Indica và Japonica còn có nhiều loại hình trung gian như Javanica v.v

Nghiên cứu biến đổi trình tự DNA của gen bằng phương pháp địa lý - thực vật để khảo sát quá trình thuần hoá lúa trồng [2,7,8] Kết quả cho thấy, cây lúa trồng đã được thuần hóa ít nhất là hai lần từ các quần thể khác nhau

5

của loài Oryza rufipogon và sản phẩm của hai lần biến đổi này đã tạo ra hai loài phụ là Indica và Japonica Và đặc trưng hình thái và sinh lý tổng quát

của 3 nhóm lúa được trình bày ở bảng 1.2

Bảng 1.2 Đặc trưng hình thái và sinh lý tổng quát của 3 nhóm giống lúa[61]

Thân -Thân cao -Thân cao trung bình Thân thấp

có đuôi dài -Trấu có lông dài -Ít rụng hạt

-Hạt tròn, ngắn -Hạt không đuôi tới

có đuôi dài -Trấu có lông dài và dầy

-Ít rụng hạt

Sinh học -Tính quang cảm rất

thay đổi -Tính quang cảm rất yếu

-Tính quang cảm rất thay đổi

1.2 Đất mặn và cơ chế chống chịu mặn ở Thực vật

1.2.1 Đất mặn

Tất cả các loại đất đều có chứa một lượng muối tan nào dó Trong số đó

có nhiều loại muối là các chất dinh dưỡng cần thiết cho cây trồng Tuy nhiên, khi số lượng các muối trong đất vuợt quá giá trị cho phép, thì sự phát triển, năng suất, chất luợng của hầu hết các loại cây đều bị ảnh hưởng xấu, mức độ ảnh hưởng tuỳ thuộc vào loại và số lượng muối có mặt trong đất, tuỳ thuộc vào giai đoạn sinh trưởng, vào loại thực vật và các yếu tố môi trường Do đó khi đất chứa một lượng muối gây cản trở và ảnh hưởng đến chức năng cần thiết để cây sinh trưởng, thì đất đó được gọi là đất bị ảnh hưởng bởi mặn (salt affected soil) Tóm lại, rất khó có thể định nghĩa đất mặn một cách chính xác

và đầy đủ, vì vậy dựa vào chỉ tiêu độ dẫn điện EC, hoặc phần trăm Na+ trao

6

đổi (EPS) hoặc tỉ lệ hấp thu Na+ (SAR) và độ pH của đất bão hòa nước [19]

đa số các nhà khoa học đã định nghĩa đất mặn là đất có độ dẫn điện EC cao hơn 4 dS/m ở nhiệt độ 250C, phần trăm Na+ trao đổi (ESP) thấp hơn 15, và pH nhỏ hơn 8,5 [1,62]

Ðất mặn được chia làm 2 dạng: đất mặn duyên hải và đất mặn nội địa:

- Ðất mặn duyên hải: xuất hiện ở vùng ven biển, tính mặn chủ yếu do tràn ngập của nước biển và nước thường có pH thấp, đất mặn ven biển thường

có tổng số muối tan lớn hơn 0.5% (tương đương với > 0,15% Cl-) và nếu đạt mức nhiễm mặn trung bình thì tổng số muối tan lớn hơn 0,25% (˜ 0.05 % Cl-)

- Ðất mặn nội địa: xuất hiện ở vùng khô và bán khô, tính mặn do nước dẫn thủy hoặc nuớc ngầm, sự bốc hơi cao dẫn đến muối tập trung ở vùng rễ

và đất thường có pH cao [32]

1.2.2 Cơ chế thích nghi stress mặn ở thực vật

Nồng độ muối cao trong đất là nguyên nhân gây ra 2 vấn đề chính đối

lý, sinh hóa và phân tử được kích hoạt bằng bộ gen để sống sót trong môi truờng muối (Hình 2) Cơ chế thích ứng sẽ thiết lập lại sự vận chuyển nước, giới hạn hấp thụ Na+ và Cl- hoặc làm giảm nồng độ của chúng trong tế bào chất và cho phép hấp thụ các ion cần thiết cho quá trình sinh trưởng Thực vật cảm nhận stress mặn là do điện thế nước trong môi trường thấp,cây không thể hút nước và dẫn đến bị mất nuớc, kết quả là sự sinh trưởng bị ức chế và dần bị chậm lại Vì thế, để có thể chống chịu với điều kiện điện thế nước thấp do stress mặn gây ra, thực vật phải điều chỉnh quá trình thoát hơi nước, từ đó có thể giới hạn sự mất nước hoặc là tiến hành điều chỉnh điện thế thẩm thấu [19]

7

Hình 2 Cơ chế thích nghi stress chung ở thực vật [19]

Ngoài ra, stress ion do cây hấp thụ chủ yếu các ion độc Na+ và Cl- vào trong tế bào và sự không cân bằng các ion (Ca+, K+, Mn2+, Mg2+, NO3+, PO42-,SO42- v.v.) sẽ gây rối loạn trao đổi chất của tế bào, ức chế hoạt động enzyme

và các chất kích thích sinh trưởng [19] Ðồng thời, các hoạt động sinh lý của

tế bào cũng bị ảnh huởng như: quá trình quang hợp giảm mạnh [57], quá trình tổng hợp sắc tố bị ức chế trong khi đó quá trình hô hấp lại tăng nhanh, các cơ chất bị phân hủy lớn nhưng hiệu quả năng lượng thấp, vì vậy thực vật không

bù đủ lượng vật chất do hô hấp phân hủy, chất dự trữ dần dần bị hao hụt, cây không sinh trưởng được, còi cọc, năng suất thấp, và nếu kéo dài sẽ dẫn đến bị chết Ðể có thể sinh trưởng trên đất mặn, và hạn chế ảnh huởng của Na+ và

Cl-, thực vật đã phát triển cơ chế điều hòa với chiến lược: giảm sự xâm nhập

và giảm nồng độ của Na+ trong tế bào chất bằng cách loại thải và khu trú ion

Na+ vào không bào, ưu tiên hấp thụ K+(là ion đóng vai trò quyết định trong việc đóng mở khí khổng, hoạt hóa enzyme, quang hợp và điều hòa áp suất thẩm thấu) để duy trì tỉ lệ K+/Na+ trong chất nền [19]

Stress

Mặn

Stress thẩm thấu

Stress ion

Tình trạng thiếu nước

Độc tính của Na+ và

Cl-

Sự không cân bằng ion /

Cơ chế chống chịu

8

1.2.3 Phản ứng chống chịu mặn của cây lúa

Tính chống chịu mặn là một tiến trình sinh lý phức tạp, thay đổi theo các giai đoạn sinh trưởng khác nhau đối với cây lúa Cơ chế chống chịu mặn của cây được biết thông qua nhiều công trình nghiên cứu rất nổi tiếng [55] Mặn ảnh hưởng đến hoạt động sinh trưởng của cây lúa dưới những mức độ thiệt hại khác nhau ở từng giai đoạn sinh trưởng phát triển khác nhau[56,57] Nhiều nghiên cứu ghi nhận rằng tính chống chịu mặn xảy ra ở giai đoạn hạt nẩy mầm, sau đó trở nên rất mẫn cảm trong giai đoạn mạ (tuổi lá 2-3), rồi trở nên chống chịu trong giai đoạn tăng trưởng, kế đến nhiễm trong thời kỳ thụ phấn và thụ tinh, cuối cùng thể hiện phản ứng chống chịu trong thời kỳ hạt chín[57,59].Tuy nhiên, một vài nghiên cứu ghi nhận ở giai đoạn lúa trổ, nó không mẫn cảm với stress do mặn Do đó, người ta phải chia ra nhiều giai đoạn để nghiên cứu một cách đầy đủ cơ chế chống chịu mặn của cây trồng Theo [62], những thay đổi sinh lý của cây lúa liên quan đến tính chống chịu mặn được tóm tắt như sau:

• Hiện tượng ngăn chặn muối - Cây không hấp thu một lượng muối dư thừa nhờ hiện tượng hấp thu có chọn lọc

• Hiện tượng tái hấp thu - Cây hấp thu một lượng muối thừa nhưng được tái hấp thu trong mô libe Na+ không chuyển vị đến chồi thân

• Chuyển vị từ rễ đến chồi – Tính trạng chống chịu mặn được phối hợp với một mức độ cao về điện phân ở rễ lúa, và mức độ thấp về điện phân ở chồi, làm cho sự chuyển vị Na+ trở nên ít hơn từ rễ đến chồi

• Hiện tượng ngăn cách từ lá đến lá - Lượng muối dư thừa được chuyển

từ lá non sang lá già, muối được định vị tại lá già không có chức năng, không thể chuyển ngược lại

• Chống chịu ở mô – Cây hấp thu muối và được ngăn cách trong các không bào (vacuoles) của lá, làm giảm ảnh hưởng độc hại của muối đối với hoạt động sinh trưởng của cây

9

• Ảnh hưởng pha loãng – Cây hấp thu muối nhưng sẽ làm loãng nồng độ muối nhờ tăng cường tốc độ phát triển nhanh và gia tăng hàm lượng nước trong chồi

Tỉ lệ Na+/K+ trong chồi được xem như là chỉ tiêu chọn lọc giống lúa chống chịu mặn [41,43].Tất cả những cơ chế này đều nhằm hạ thấp nồng độ

Na+ trong các mô chức năng, do đó làm giảm tỉ lệ Na+/K+ trong chồi (< 1) giúp cho cây sống được ở môi trường nhiễm mặn

1.3 Protein vận chuyển ion liên quan đến tính chịu mặn ở thực vật

Đến nay, một loạt các hệ thống vận chuyển đã được báo cáo là có khả năng giúp thực vật cải thiện khả năng chịu mặn bằng cách ức chế sự hấp thụ

Na+, hoặc vận chuyển Na+ vào không bào của tế bào (Hình 3) Mô hình đơn giản cho cơ chế hấp thụ K+ / Na+ , sự tuần hoàn và loại bỏ Na+ bởi các lớp khác nhau của Na+ channels/transporters được thể hiện trong (hình 3) Chẳng hạn như Kênh vận chuyển cation không chuyên biệt-Nonselective cation channels ( NSCCs ), kênh đồng vận chuyển cation- Cl- - cation-Cl−co-transporter (CCC), kênh vận chuyển cation ái lực thấp - low-affinity cation transporter (LCT) salt overly sensitive 1 (SOS1) , Na+ / H+ antiporter NHX1

và kênh vận chuyển K+ ái lực cao - high affinity potassium transporter (HKT / HAK) Tế bào rễ thực vật hấp thụ Na+ / K+ từ đất thông qua một vài kênh như (NSCCs, AKT1, LCT1 và CCC), transporter (KUP / HAK / KT và HKT)

và apoplastic Kênh thẩm thấu-Permeations Channel và apoplastic là những con đường chính để hấp thụ Na+ dưới tress muối Con đường SOS trung gian loại bỏ Na+ qua màng tế bào ra ngoài dung dịch đất hoặc apoplast NHX1 phân vùng Na+ trong không bào và điều hòa nồng độ Na+ trong cytosol

AtHKT1; 1, OsHKT1; 5, TaHKT1; 5 và TmHKT1; 4/5 được chứng minh có

vai trò lấy Na+ từ xylem vào các tế bào nhu mô xylem và ngăn chặn Na+ tích

lũy trong chồi Có giả thuyết cho rằng AtHKT1; 1 gián tiếp phục hồi Na+ từ chồi tới rễ thông qua việc loại bỏ các Na+ từ xylem và chuyên chở Na + vào Các quá trình này đảm bảo cân bằng K+ / Na+ nội bào và cũng duy trì tỉ lệ K+ /

Na+ cao để giúp thực vật duy trì sự sống khi bị stress muối[39]

10

Hình 3 Điều hòa K+/Na+ ở thực vật bậc cao[39]

1.4 Protein HKT ở thực vật

1.4.1 Vai trò, chức năng của protein HKT ở thực vật

Vai trò quan trọng của protein HKT trong việc giúp cho thực vật có thể tồn tại trong điều kiện đất nhiễm mặn đã đƣợc khẳng định trong các thí nghiệm loại gen trực tiếp làm cây mẫn cảm với muối và thông qua biểu hiện

biến đổi gen của các gen trong họ gen HKT ở các loài thực vật khác, ví dụ: biểu hiện của các gen: OsHKT1(hình bầu dục màu tím), OsHKT 8(hình bầu dục màu cam), AtHKT1(hình bầu dục màu hồng) ở thực vật cho phép chúng phát triển tốt hơn trong điều kiện mặn.(Hình 4)

11

Hình 4 Chức năng vận chuyển Na + của protein HKT [42,62]

Như chúng ta đã biết ion Na+ là một ion có hại đối với tế bào, Na+ ở nồng độ cao sẽ ức chế sự tăng trưởng của cây Vì vậy protein HKT có 2 chức năng quan trọng là:

 Chức năng vận chuyển ion qua màng tế bào: Protein HKT được

mã hóa bởi họ gen HKT có vai trò quan trọng trong việc hấp thu Na+ từ ngoài môi trường vào tế bào ở cả cây một lá mầm và cây hai lá mầm Tuy nhiên,

kích thước của họ gen HKT trong cây hai lá mầm là nhỏ hơn kích thước họ gen HKT trong cây một lá mầm [37,39]

 Chức năng cân bằng nồng độ Na+ và K+ khi cây gặp điều kiện mặn bằng cách: Ion Na+ có tác động phá vỡ và cản trở vai trò sinh học của tế bào chất trong cây Ion K+ có vai trò quan trọng làm kích hoạt enzyme và đóng mở khí khổng, tạo ra tính chống chịu mặn của cây Hơn nữa, sự mất cân bằng tỷ lệ Na-K trong cây sẽ làm giảm năng suất hạt Do vậy, cây chống chịu mặn bằng cơ chế ngăn chặn, giảm hấp thu Na+ và gia tăng hấp thu K+ để duy trì sự cân bằng Na+/K+ trong chồi [53]

12

chức năng mã hóa các protein có vai trò vận chuyển riêng biệt thể hiện trong

các mô / hoặc cơ quan khác nhau [54]cho rằng OsHKT1 mã hóa cho protein

vận chuyển Na+ và OsHKT2 mã hóa cho protein đồng vận chuyển Na+ /

K+ [34] cũng cho thấy OsHKT1 có ái lực cao với vận chuyển Na+ và

OsHKT4 có ái lực thấp với vận chuyển Na+ OsHKT8 gần đây đã được biết

đến là một gen mã hóa cho protein có vai trò vận chuyển Na+ , góp phần vào khả năng chịu mặn ở thực vật bằng cách duy trì cân bằng nồng độ K+ [60]

Do đó, họ gen HKT ở lúa có vai trò quan trọng đối với cân bằng nồng độ ion

ở thực vật nhờ việc hạn chế ion Na+ đưa vào tế bào trong điều kiện đất nhiễm mặn [13]

Bảng 1.3 Danh sách họ gen HKT ở lúa[34,42 ] TênProtein

HKT

Và vị trí, kích thước các đoạn exon , intron của 9 genesOsHKT được

biểu thị trên hình sau:

13

Hình 5 Sơ đồ biểu thị vị trí và kích thước các đoạn exon, intron của chín

gen OsHKT ở lúa[34,42,61 ]

Các thanh màu đen đại diện cho khung đọc mở, và các vị trí và độ dài của intron được quy định bởi các vết cắt và thanh màu xám Intron lớn được đưa ra khỏi cấu trúc mô hình gen và độ dài được ghi nhận Các đường chấm chấm nối hai mảnh màu đen của OsHKT2 không cho thấy sự tương đồng với gen HKT khác Đoạn này

nằm ngoài cấu trúc mô hình, và chiều dài được ghi nhận

1.5 Các phương pháp nghiên cứu, vai trò của nghiên cứu đa hình gen

Ngày nay, việc sử dụng các chỉ thị phân tử DNA về đa hình các đoạn DNA nhân bản ngẫu nhiên RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA),

đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), sự lặp lại các chuỗi đơn giản-SSR (Simple Sequence Repeats) hay còn gọi là tiểu vệ tinh (Microsatellite) để phân loại, nghiên cứu

đa dạng sinh học của động vật, thực vật và vi sinh vật ngày càng phổ biến trên thế giới và ở Việt Nam

Kỹ thuật PCR(polymerase Chain Reaction) này thực chất tạo dòng in vitro, không cần sự hiện diện của tế bào Điều kiện của phản ứng PCR: DNA,

hai đoạn mồi(mỗi mồi dài từ 18-24 nucleotide), Taq polymerase, dung dịch

14

Dựa vào những kết quả đã được công bố, nghiên cứu đa hình bằng chỉ thị phân tử cho kết quả có độ tin cậy cao, thời gian được rút gắn Với lý do đó các kỹ thuật nghiên cứu đa hình gen được ứng dụng rộng rãi trong các nghiên cứu

1.6 Tình hình nghiên cứu liên quan đến gen OsHKT1

Trên thế giới có rất nhiều công trình nghiên cứu về vai trò của gen mã hóa cho protein vận chuyển ion Na+ ở lúa Biểu hiện của OsHKT1, OsHKT2

và OsVHA đã được nghiên cứu nhờ kỹ thuật RT-PCR và insitu PCR

Gần đây, một gen OsHKT từ giống lúa chịu mặn Nona Bokra đã được

cô lập Gen này có vùng 5' tương ứng với gen OsHKT2, nhưng vùng 3' tương ứng với các OsHKT1 Gen mới này được gọi là OsHKT1-2 và nó là kết quả

của đột biến mất đoạn 15 kb trên nhiễm sắc thể số 6 của Nona Bokra, dẫn đến

một liên kết giữa đầu 5' gen OsHKT2 và đầu 3' gen OsHKT1 [54]

Biểu hiện của OsHKT1-2 trong tế bào trứng ếch hoặc tế bào nấm men cho thấy rằng OsHKT1-2 cho phép hấp thu cả Na+ và K+ qua màng tế bào ngay cả khi nồng độ Na+ bên ngoài cao Hoạt động của protein OsHKT1-

2 là tương tự với OsHKT2 Như OsHKT1 và OsHKT2, protein OsHKT1-2

được biểu hiện trong rễ cho phép vận chuyển ion K+ qua màng tế bào Trái

ngược với OsHKT1, biểu hiện của OsHKT1-2 giảm xuống trong điều kiện

mặn nhưng chức năng không bị mất đi Hơn nữa, mức giảm biểu hiện này

trong OsHKT1-2 là ít nghiêm trọng hơn so với việc giảm biểu hiện của gen

OsHKT1 và OsHKT2 Điều này cho thấy OsHKT1-2 đóng một vai trò quan

trọng trong việc vận chuyển ion K+ khi cây gặp điều kiện mặn [54]

Một nghiên cứu tiếp theo trên đối tượng gen OsHKT1 là nghiên cứu đột biến định hướng được thực hiện trên cDNA gen OsHKT1của giống lúa Nipponbare (Ni-OsHKT1) để xác định biến thể trên gen Gen Ni-OsHKT1

được biểu hiện trong tế bào trứng ếch và được nghiên cứu chức năng khi được

biểu hiện ở tế bào trứng Ni- OsHKT1, khi biểu hiện trong tế bào trứng, giống

như một Na+-K+ symport ở nồng độ Na+ và K+ rất thấp, và như là một Na+Uniport với nồng độ Na+ trong khoảng millimolar [19,20] Ni- OsHKT1 được

15

chứng minh vận chuyển cả Na+ và K+ ở nồng độ thấp khi thay đổi điện tích - điện áp (I- V) Ở nồng độ Na+ cao, OsHKT1không tiếp tục vận chuyển K+ nữa

Một đặc tính đặc trưng của OsHKT1 là có ái lực cao với K+ Các tính chất

chức năng của protein mã hóa bởi gen Ni- OsHKT1 ở lúa được so sánh với biến thể OsHKT1 biểu hiện trong tế bào trứng ếch và nhận thấy không có sự

khác biệt về tính thấm Na+ và K+ cũng như cho thấy tính chất chức năng

chính của Ni- OsHKT1 được bảo toàn trong 6 biến thể: G17/V, G17/V

D403/E, R21/K R32/K, R21/R32 K/ KD403/E, F61/ S và các biến thể D403/

E gen OsHKT1 trong tế bào trứng ếch [33]

1.7 Mục tiêu và các nội dung nghiên cứu của đề tài

1.7.1.Mục tiêu

Phát hiện sự sai khác trong trình tự nucleotide của gen OsHKT1 và trong trình tự acid amin suy diễn tương ứng của protein OsHKT1 ở một số giống lúa

có khả năng kháng mặn khác nhau

1.7.2 Nội dung nghiên cứu

 Đánh giá khả năng chịu mặn của các giống lúa

 Tách chiết DNA tổng số của các giống lúa

 Nhân bản gen OsHKT1 mã hóa cho protein vận chuyển ion ở một

số giống lúa

 Xác định trình tự gen OsHKT1ở một số giống lúa

 So sánh trình tự nucleotide của gen OsHKT1 và trình tự acid amin

suy diễn ở một số giống lúa nhằm phát hiện đa hình của gen

OsHKT1

16

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU

2.1.1 Mẫu vật nghiên cứu

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng 14 giống lúa khác nhau được cung cấp bởi Trung tâm Tài nguyên thực vật và Học viện Nông nghiệp Việt Nam như trình bày ở bảng 2.1

Bảng 2.1 Danh sách giống lúa nghiên cứu

Các cặp mồi được sử dụng trong nghiên cứu hình 6

Hình 6 Vị Trí bắt cặp mồi trên gen OsHKT1

Đoạn exon màu xanh lục, màu nâu tương ứng intron, hộp màu xanh lá cây là

vị trí mã khởi đầu và hộp màu đỏ là vị trí mã kết thúc

Gen OsHKT1 có độ dài là 2286 nucleotide mã hóa cho 530 amino acids, gồm

3 exon có tổng chiều dài là 1593 nucleotide

Để nhân bản gen OsHKT1 các cặp mồi đƣợc sử dụng trong Bảng 2.2

Bảng 2.2 Các cặp mồi phản ứng PCR đƣợc sử dụng trong nghiên cứu

18

 Tris 1M, pH = 8,0

 NaCl 5M

 EDTA 0,5M, pH 8,0

2.1.3.2 Môi trường trồng thủy canh

Bảng 2.3 Thành phần các nguyên tố đa lượng trong môi trường

thủy canh[44,56]

Nguyên

tố Hóa chất

Lượng cần pha trong 30ml dd thủy

canh

Lượng cần pha trong 1L dd thủy canh

19

2.1.3.3 Phản ứng PCR được thực hiện cùng với Taq DNA polymerase,

Taq buffer, dNTPs, mồi đặc hiệu

2.1.3.4 Sản phẩm phản ứng PCR được hiển thị bằng phương pháp điện

di, sử dụng các hóa chất : Agarose, Ethidium bromide; Tris base, EDTA, Maker 1kb và Dye 1X

Các hóa chất và dụng cụ dùng trong phòng thí nghiệm được cung cấp bởi các hãng có uy tín trên thế giới như: Sigma, Invitrogen, Bioneer, Fermentas, Merk, Promega, Corning, Prolabo, ICN và Labscan

Sản phẩm PCR được tinh sạch sử dụng bộ kit tinh sạch Gene JET PCR Purification Kit #0701 của hãng Thermo scientific

2.1.4 Thiết bị

Các thiết bị máy móc phục vụ cho nghiên cứu như : máy PCR nhân gen PCR 9700 Applied Biosystems-Mỹ, máy PCR Kyratec-Úc, máy ly tâm Mikro 22R Hettich-Đức, máy nghiền mẫu Retsch-Đức, máy soi gel Doc XR Biorad -

Mỹ, bể ổn nhiệt, bể điện di…thuộc Phòng thí nghiệm Bộ môn Di truyền học, Phòng sinh học thụ thể và phát triển thuốc - thuộc Phòng thí nghiệm Trọng Điểm Công nghệ Enzyme- Protein, Phòng phân tích di truyền-Trung tâm nghiên cứu Khoa học sự sống, Trường Đại học Khoa học tự nhiên- Đại học Quốc Gia Hà Nội

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1.Trồng lúa sử dụng phương pháp thủy canh và thí nghiệm xử lý mặn 2.2.1.1 Trồng lúa sử dụng phương pháp thủy canh

Tiến hành chọn lọc hạt lúa, ủ hạt Khi hạt lúa nảy mầm được đặt vào trong những ô trên tấm xốp có đan lưới, đặt lọt khít vào trong khay nhựa chứa 1l môi trường dinh dưỡng Mỗi tấm xốp gồm 13 ô, mỗi giống được gieo trên một ô, mỗi ô được gieo 3 hạt Các giống lúa được trồng trong 6 khay được trình bày ở bảng 2.5 Sau khi lúa được trồng 14 ngày tiến hành bổ sung NaCl

để đạt nồng độ 100mM ở các khay thuộc nhóm B bảng 2.5 Môi trường dinh dưỡng được thay 4 ngày/lần và điều chỉnh pH ở độ pH =5

20

Bảng 2.5 Bố trí thí nghiệm đánh giá khả năng chịu mặn của các giống lúa

NHÓM A: Đối chứng Khay 1

Nếp nõn tre Nước mặn dạng

Khay 2

dạng 2

Nếp nõn tre Nếp vải Nipponbare Pokkali Nếp ốc

Khay 3 Nếp ốc Pokkali Nipponbare Nếp vải Nếp nõn tre

Nước mặn

NHÓM B: Xử lý mặn Khay 1

Nếp nõn tre Nước mặn dạng

Khay 2

dạng 2

Nếp nõn tre Nếp vải Nipponbare Pokkali Nếp ốc

Khay 3 Nếp ốc Pokkali Nipponbare Nếp vải Nếp nõn tre

Nước mặn

2.2.1.2 Thí nghiệm xử lý mặn

Khi cây lúa trồng được 14 ngày trong môi trường thủy canh tiến hành

bổ sung 11,7g muối/1l môi trường thủy canh vào nhóm B như ở bảng 2.5, sau khi bổ sung NaCl được 3, 7, 14 ngày tiến hành đánh giá mức độ chịu mặn của cây lúa dựa vào đặc điểm hình thái sinh lý của cây theo tiêu chuẩn đánh

21

giá SES(Standar Evaluating Score) của IRRI, 1997.( bảng 2.6) Đồng thời đánh giá một số chỉ tiêu sinh lý như: chiều dài thân(cm), chiều dài rễ(cm), khối lượng thân(g), khối lượng rễ(g)

Bảng 2.6 Tiêu chuẩn đánh giá (SES) ở giai đoạn tăng trưởng và phát triển

1 Lá gần như bình thường, khô nhẹ ở đầu lá

2.2.2 Tách chiết DNA tổng số

Để thu DNA tổng số phục vụ cho nhân bản và giải trình tự gen, chúng tôi tiến hành tách chiết DNA tổng số theo phương pháp CTAB: là phương pháp sử dụng chất có hoạt tính bề mặt là cation CTAB Đây là phương pháp đơn giản nhất thường được sử dụng để tách chiết DNA từ thực vật dựa trên nguyên lý chung sau:

- Bước 1: Phá màng tế bào và màng nhân

Nghiền các mô, tế bào bằng biện pháp cơ học: nghiền trong đá khô, nitơ lỏng bằng cối, chày sứ để phá vỡ thành cellulose, giải phóng các thành phần trong tế bào Sử dụng đệm có chất tẩy (CTAB) để phá vỡ màng bào, giải phóng DNA Sử dụng các loại hóa chất (phổ biến là EDTA) để bảo vệ DNA khỏi sự phân hủy của các enzyme nuclease nội bào

- Bước 2: Loại tạp

Các hóa chất như: chloroform, isoamyl alcohol, phenol… được sử dụng

để biến tính protein Protein bị biến tính sau khi ly tâm tủa thành 1 lớp nằm giữa pha nước và pha hóa chất Pha nước chứa acid nucleic được thu nhận lại

22

- Bước 3: Tủa acid nucleic

Mục đích của việc tủa là nhằm thu nhận acid nucleic dưới dạng cô đặc để bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme và có thể hòa tan chúng lại theo nồng độ mong muốn Có thể tủa bằng ethanol hoặc isopropanol nhưng isopropanol phổ biến hơn Acid nucleic sẽ được thu nhận lại bằng ly tâm Sau

đó, cặn tủa được rửa trong ethanol 70% để loại muối hoặc isopropanol còn dính lại trên mẫu

7 Rửa tủa bằng 500µl EtOH 700 , ly tâm 14000rpm/5min, để khô

8 Bổ sung 50µl TE buffer và bảo quản ở -200C

Sau khi tách chiết DNA tổng số, DNA tổng số được kiểm tra chất lượng bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1% trong dung dịch đệm TAE (Tris base, acid acetic, EDTA) ở 90V trong 30 phút DNA tổng số được so sánh với maker 1kb và có thể quan sát được dưới tia UV khi nhuộm Ethidium Bromide

23

Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose, dung dich đệm TAE, ở 90V trong 30 phút Kích thước tương đối của sản phẩm được so sánh với maker 100bp và quan sát dưới tia UV khi nhuộm ethidium bromide

Bảng 2.7 Thành phần phản ứng PCR Thành phần phản

2.2.5.Phần mềm sử dụng để phân tích số liệu

Kết quả giải trình tự được so sánh và đối chiếu với ngân hàng dữ liệu gene lúa cũng như được so sánh giữa các giống lúa với nhau ở các cặp mồi tương ứng sử dụng công cụ tin sinh học:

http://www.cellbiol.com/scripts/complement/dna_sequence_reverse_compleme

nt.php

http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/

http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/