Nghiên cứu tạo que thử để phát hiện nhanh một số độc tố ruột của tụ cầu khuẩn trong thực phẩm

SỬ DỤNG QUE THỬ ĐỂ PHÁT HIỆN MỘT SỐ ĐỘC TỐ RUỘT TỤ CẦU TRÊN THỰC PHẨM ĐƢỢC GÂY NHIỄM THỰC NGHIỆM .... Sử dụng que thử để phát hiện một số độc tố ruột của tụ cầu SEA, SEB, SEC1, SED và SE

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của tập thể các nhà khoa học hướng dẫn luận án Các số liệu và kết quả thí nghiệm trình bày trong luận án là trung thực và chưa từng được công bố trong bất

kỳ công trình nào khác

Hà Nội, ngày tháng 05 năm 2015

NGHIÊN CỨU SINH

Trần Thị Sao Mai

LỜI CẢM ƠN

Hoàn thành Luận án này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới những người

thầy hướng dẫn: Thầy thuốc nhân dân, PGS.TS BS Nguyễn Thị Khánh Trâm, Cục An toàn Thực phẩm, Bộ Y tế, TS Lê Quang Hòa, Viện Công nghệ Sinh học và

Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội, đã tận tình định hướng, chỉ dẫn và tạo mọi điều kiện cho tôi trong quá trình nghiên cứu thực hiện Luận án

Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn tới PGS.TS Bùi Thị Việt Hà và các thầy cô giáo, các cán bộ của Bộ môn Vi sinh vật học, các thầy cô giáo của Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tận tình trang bị kiến thức cho tôi trong suốt những năm qua

Tôi xin được cảm ơn tới các thầy cô lãnh đạo và cán bộ, nghiên cứu viên Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã tạo điều kiện giúp tôi cơ sở vật chất để thực hiện các thí nghiệm cho Luận án này

Trong thời gian học tập và nghiên cứu, tôi đã nhận được sự hỗ trợ và động viên của các thầy cô giáo lãnh đạo và cán bộ viên chức của Trường Đại học Kỹ thuật Y tế Hải Dương, tạo điều kiện cho tôi về thời gian và vật chất, tinh thần để tôi hoàn thành khóa học, tôi xin được cảm ơn sự giúp đỡ quí báu này

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban Chủ nhiệm khoa Sinh học, Phòng Sau đại học và Ban Giám hiệu Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tận tình giúp tôi hoàn thành các hồ sơ trong suốt quá trình học tập và bảo vệ luận án

Trong suốt những năm qua, tôi luôn nhận được sự động viên, giúp đỡ về vật chất và tinh thần của gia đình, những người thân, sự đồng cảm của bạn bè, đồng nghiệp, đây là nguồn động lực lớn giúp tôi hoàn thành khóa học và Luận án này Tôi xin được trân trọng biết ơn sự giúp đỡ quí báu đó

Hà Nội, ngày tháng 04 năm 2015

NGHIÊN CỨU SINH

Trần Thị Sao Mai

MỤC LỤC

MỤC LỤC 1

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 5

DANH MỤC HÌNH ẢNH 7

DANH MỤC BẢNG 9

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 14

1.1.TỤ CẦU KHUẨN 14

1.1.1 Đặc điểm sinh học của tụ cầu vàng 14

1.1.2 Những yếu tố ảnh hưởng tới sản sinh độc tố ruột của tụ cầu 15

1.1.3 Tình hình ngộ độc thực phẩm do tụ cầu 17

1.1.3.1 Tình hình ngộ độc thực phẩm do độc tố ruột tụ cầu trên thế giới 17

1.1.3.2 Tình hình ngộ độc thực phẩm ở Việt Nam 18

1.2 ĐỘC TỐ RUỘT CỦA TỤ CẦU 20

1.2.1 Đặc điểm sinh hóa, hóa lý và di truyền của độc tố ruột của tụ cầu 20

1.2.2 Cấu trúc phân tử của độc tố ruột tụ cầu 23

1.2.3 Hoạt tính sinh học của các độc tố ruột tụ cầu 24

1.2.3.1 Hoạt tính siêu kháng nguyên 25

1.2.3.2 Hoạt tính gây nôn 26

1.2.3.3 Cơ chế gây viêm dạ dày - ruột do độc tố tụ cầu 27

1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN ĐỘC TỐ RUỘT TỤ CẦU 29

1.3.1 Phép thử sinh học 29

1.3.2 Phương pháp sinh học phân tử 29

1.3.3 Phương pháp miễn dịch 30

1.3.3.1 Phương pháp khuếch tán trên gel (Microslide Double Diffusion ) 30

1.3.3.2 Phương pháp miễn dịch phóng xạ - RIA (Radio Immunoassay) 30

1.3.3.3 Ngưng kết hạt latex (Reversed Passive Latex Aggulutination - RPLA) 31

1.3.3.4 Các phương pháp dựa trên kỹ thuật ELISA 31

1.4 KỸ THUẬT SẮC KÝ MIỄN DỊCH VÀ ỨNG DỤNG 33

1.4.1 Kỹ thuật sắc ký miễn dịch 33

1.4.1.1 Các hợp phần trong hệ thống sắc ký miễn dịch 34

1.4.1.2 Nguyên tắc của phương pháp sắc ký miễn dịch 37

1.4.1.3 Phân loại que thử nhanh ứng dụng kỹ thuật sắc ký miễn dịch 37

1.4.2 Một số nghiên cứu tạo que thử phát hiện độc tố ruột tụ cầu trong thực

phẩm 40

1.5 CHẾ TẠO KHÁNG THỂ LÒNG ĐỎ TRỨNG VÀ ỨNG DỤNG CỦA IGY 42

1.5.1 Kháng thể lòng đỏ trứng IgY 42

1.5.2 Sản xuất kháng thể IgY 45

1.5.3 Các phương pháp tinh chế kháng thể IgY 47

1.5.4 Ứng dụng của IgY trong chẩn đoán miễn dịch 48

1.6 CÁC PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT ĐỘC TỐ RUỘT TỤ CẦU 49

1.6.1 Sản xuất độc tố ruột tụ cầu trực tiếp từ S aureus 49

1.6.2 Sản xuất độc tố ruột tụ cầu bằng phương pháp tái tổ hợp 50

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 53 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 53

2.2 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 54

2.2.1 Vi sinh vật và plasmid Error! Bookmark not defined 2.2.2 Hóa chất và sinh phẩm 54

2.2.3 Máy, thiết bị 55

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 56

2.3.1 Phương pháp sản xuất độc tố ruột tụ cầu SEC1 tái tổ hợp 56

2.3.1.1 Tách chiết DNA tổng số từ vi khuẩn S aureus 56

2.3.1.2 Khuếch đại gen sec 1 bằng kỹ thuật PCR 57

2.3.1.3 Tinh sạch sản phẩm PCR 58

2.3.1.4 Xây dựng vector biểu hiện mang gen sec 1 58

2.3.1.5 Biến nạp plasmid pGS-21a-sec 1 vào tế bào E coli BL 21 59

2.3.1.6 Biểu hiện protein SEC 1 tái tổ hợp 60

2.3.1.7 Tinh sạch protein tái tổ hợp SEC 1 60

2.3.1.8 Phương pháp điện di biến tính protein (SDS-PAGE) 61

2.3.1.9 Phương pháp định lượng protein bằng đo mật độ quang 61

2.3.1.10 Kiểm tra tính kháng nguyên của protein SEC 1 tái tổ hợp bằng kỹ thuật Western blot 62

2.3.2 Phương pháp sản xuất kháng thể IgY kháng BSA và kháng thể IgY kháng 5 loại độc tố SE (A+B+C1+D+E) 62

2.3.2.1 Gây miễn dịch 63

2.3.2.2 Tinh sạch kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng 65

2.3.3 Chế tạo que thử phát hiện nhanh một số độc tố ruột tụ cầu 67

2.3.3.1 Thiết kế bộ que thử nhanh phát hiện một số độc tố ruột (SEA, SEB, SEC 1 , SED và SEE) của tụ cầu 67

2.3.3.2 Xác định giới hạn phát hiện và tính ổn định của que thử 70

2.3.4 Sử dụng que thử nhanh phát hiện độc tố ruột tụ cầu trên một số nhóm mẫu thực phẩm đã gây nhiễm độc tố SE Error! Bookmark not defined 2.3.5 PHƯƠNG PHÁP Xử LÝ Số LIệU 72

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 73

3.1 SẢN XUẤT VÀ TINH CHẾ ĐỘC TỐ RUỘT TỤ CẦU SEC1 TÁI TỔ HỢP 73

3.1.1 Tách chiết DNA tổng số từ S aureus 73

3.1.2 Khuếch đại gen sec1 bằng kỹ thuật PCR 74

3.1.3 Xây dựng vector biểu hiện pGS-21a mang gen sec 1 75

3.1.4 Kết quả biểu hiện gen mã hóa cho protein SEC1 tái tổ hợp 77

3.1.5 Xác định các điều kiện biểu hiện gen sec1 thích hợp trong E.coli 80

3.1.6 Tinh sạch protein SEC1 tái tổ hợp 83

3.1.7 Kiểm tra tính kháng nguyên của protein SEC1 tái tổ hợp bằng phản ứng Western Blot 85

3.2 CHẾ TẠO KHÁNG THỂ LÒNG ĐỎ TRỨNG IgY 86

3.2.1 Lựa chọn loài gà và cách chăm sóc gà 86

3.2.2 Cách gây miễn dịch và thu hoạch trứng 87

3.2.3 Kết quả tách chiết và tinh sạch kháng thể IgY 88

3.3 CHẾ TẠO QUE THỬ 90

3.3.1 Thiết kế bộ que thử nhanh phát hiện một số độc tố ruột của tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED và SEE) 90

3.3.3.1 Tối ưu hóa lượng kháng thể cần cố định lên vạch kiểm chứng 90

3.3.3.2 Tối ưu hóa lượng kháng thể cần cố định lên vạch thử nghiệm 91

3.3.3.3 Tối ưu hóa lượng kháng nguyên cộng hợp cần sử dụng 92

3.3.2 Xác định giới hạn phát hiện và tính ổn định của que thử 94

3.3.2.1 Xác định giới hạn phát hiện của que thử với các độc tố ruột SEA, SEB, SEC 1 , SED và SEE 94

3.3.2.2 Xác định tính ổn định của que thử 99

3.4 SỬ DỤNG QUE THỬ ĐỂ PHÁT HIỆN MỘT SỐ ĐỘC TỐ RUỘT TỤ CẦU TRÊN

THỰC PHẨM ĐƢỢC GÂY NHIỄM THỰC NGHIỆM 99

3.4.1 Sử dụng que thử để phát hiện một số độc tố ruột của tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED và SEE) trên sữa đƣợc gây nhiễm thực nghiệm 99

3.4.1.1 Xác định độ pha loãng sữa để thử nghiệm 99

3.4.1.2 Sử dụng que thử để phát hiện một số độc tố ruột (SEA, SEB, SEC 1 , SED và SEE) trên sữa được gây nhiễm thực nghiệm 100

3.4.2 Sử dụng que thử để phát hiện một số độc tố ruột của tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED và SEE) trên thịt đƣợc gây nhiễm thực nghiệm 104

3.4.2.1 Xác định độ pha loãng thịt để thử nghiệm 104

3.4.2.2 Kết quả phát hiện một số độc tố ruột (SEA, SEB, SEC 1 , SED và SEE) trên thịt được gây nhiễm thực nghiệm 105

KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 108

KẾT LUẬN 108

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU 110

LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 110

TÀI LIỆU THAM KHẢO 112

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT {tc "DANH M?C CÁC KÝ HI?U, CÁC CH? VI?T T?T" \f C \l 1}

- APC - Antigen Presenting Cell - Tế bào trình diện kháng nguyên

- CFU - Colony forming unit - Đơn vị hình thành khuẩn lạc

- CNS - Coagulase negative staphylococci - Tụ cầu không sinh coagulase

- ELISA - Enzyme Linked Immunosorbent Assay - Phương pháp miễn dịch hấp phụ

gắn enzym

- Fab - Fragment of antigen binding - Mảnh gắn kháng nguyên

- FCA - Freud’s Complete Adjuvant - Tá dược Freud hoàn toàn

- FIA - Freud’s Incomplete Adjuvant - Tá dược Freud không hoàn toàn

- GALT - Gut Associated Lymphoid Tisue - Mô limpho ở ruột

- kDa - Kilo Dalton

- MCP-1 - Monocyte Chemoattractant Protein 1

- MHC-II - Major histocompatibility complex - Phức hợp tương thích mô chính

- PBS - Phosphate Buffered Saline- - Muối đệm phosphate

- PCR - Polymerase Chain Reaction

- PEG - Polyetylen Glycol

- RPLA -Reversed Passive Latex Aggulutination - Kỹ thuật ngưng kết hạt latex

- SE - Staphylococcal Enterotoxin - Độc tố ruột tụ cầu

- SPA - Staphylococcus aureus Protein A - Protein A của tụ cầu

- TCR - T-Cell antigen Receptor - Thụ thể của tế bào T

- TNF - Tumor Necrosis Factor - Yếu tố hoại tử khối u

- TSST - Toxic Shock Syndrome Toxin

- TSST-1 - Toxic Shock Syndrome Toxin-1 - Độc tố gây hội chứng sốc do độc

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 S aureus dưới kính hiển vi 15

Hình 1.2 S aureus nuôi cấy trên môi trường Baird Parker 15

Hình 1.3 Tác nhân trong các vụ NĐTP từ năm 2007 đến năm 2012 20

Hình 1.4 Cấu trúc không gian của các độc tố ruột SEA, SEB, SEC2, SED 23

Hình 1.5 Mô hình tương tác của SE với thụ thể tế bào T và với phân tử MHC II 26

Hình 1.6 Cơ chế gây viêm dạ dày - ruột do độc tố tụ cầu 28

Hình 1.7 Các hợp phần trong hệ thống sắc ký miễn dịch 34

Hình 1.8 Sắc ký miễn dịch kẹp đôi 39

Hình 1.9 Sắc ký miễn dịch cạnh tranh 40

Hình 1.10 Sự hình thành kháng thể IgY 44

Hình 1.11 Cấu trúc phân tử của IgG thỏ và IgY gà 45

Hình 2.1 Sơ đồ vector biểu hiện pGS-21a 53

Hình 2.2 Sơ đồ que thử phát hiện nhanh các độc tố ruột tụ cầu 68

Hình 2.3 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát quy trình chế tạo que thử 72

Hình 3.1 Điện di đồ DNA tổng số tách từ S aureus 73

Hình 3.2 Điện di đồ sản phẩm PCR trên gel agarose 1, 2% 74

Hình 3.3 Điện di đồ sản phẩm gen sec1 sau tinh sạch 75

Hình 3.4 Ảnh điện di plasmid pGS-21a sau khi cắt bằng enzyme cắt giới hạn 76

Hình 3.5 Điện di đồ sản phẩm PCR nhân đoạn gen sec1 77

Hình 3.6 Điện di đồ so sánh protein tổng số của tế bào E.coli BL21 mang gen sec 1 tái tổ hợp 77

Hình 3.7 Điện di đồ so sánh khả năng sinh tổng hợp protein SEC1 của tế bào E coli BL21 mang gen sec 1 tái tổ hợp ở các nhiệt độ khác nhau 81

Hình 3.8 Điện di đồ so sánh khả năng sinh tổng hợp protein SEC1 của tế bào E coli BL21 mang gen sec 1 tái tổ hợp ở các điều kiện IPTG khác nhau 81

Hình 3.9 Điện di đồ so sánh khả năng sinh tổng hợp protein SEC1 của tế bào E coli BL21 mang gen sec 1 tái tổ hợp sau các khoảng thời gian nuôi cấy khác nhau 82

Hình 3 10 Điện di đồ khả năng sinh tổng hợp protein SEC1 tan của tế bào E coli BL21 mang gen sec 1 tái tổ hợp ở 30oC 84

Hình 3.11 Điện di đồ protein SEC1 tinh sạch ở các nồng độ imidazol khác nhau 84

Hình 3.12 Kết quả chất lượng protein SEC1 tái tổ hợp bằng kỹ thuật Western blot 86

Hình 3.13 Điện di đồ kháng thể IgY sau mỗi bước tinh sạch 88

Hình 3.14 Lựa chọn lượng kháng thể cố định lên vạch kiểm chứng 91

Hình 3.15 Lựa chọn lượng kháng thể cố định lên vạch thử nghiệm 92

Hình 3.16 Ảnh hưởng của lượng kháng nguyên cộng hợp đến cường đô ̣ tín hiê ̣u vạch thử nghiê ̣m 93

Hình 3.17 Độ nhạy của que thử phát hiện độc tố SEA 94

Hình 3.18 Độ nhạy của que thử phát hiện độc tố SEB 95

Hình 3.19 Độ nhạy của que thử phát hiện độc tố SEC1 96

Hình 3.20 Độ nhạy của que thử phát hiện độc tố SED 97

Hình 3.21 Độ nhạy của que thử phát hiện độc tố SEE 97

Hình 3.22 Lựa chọn nồng độ sữa pha loãng cần sử dụng 100

Hình 3.23 Độ nhạy của que thử phát hiện độc tố SEA trên sữa 101

Hình 3.24 Độ nhạy của que thử phát hiện độc tố SEB trên sữa 101

Hình 3.25 Độ nhạy của que thử phát hiện độc tố SEC1 trên sữa 102

Hình 3.26 Độ nhạy của que thử phát hiện độc tố SED trên sữa 103

Hình 3.27 Độ nhạy của que thử phát hiện độc tố SEE trên sữa 103

Hình 3.28 Lựa chọn nồng độ pha loãng thịt cho que thử 105

Hình 3.29 Độ nhạy của que thử phát hiện độc tố SEA trên thịt 105

Hình 3.30 Độ nhạy của que thử phát hiện độc tố SEB trên thịt 106

Hình 3.31 Độ nhạy của que thử phát hiện độc tố SEC1 trên thịt 106

Hình 3.32 Độ nhạy của que thử phát hiện độc tố SED trên thịt 107

Hình 3.33 Độ nhạy của que thử phát hiện độc tố SEE trên thịt 104

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Thống kê các vụ NĐTP từ năm 2009 đến năm 2013 ở Việt Nam 19

Bảng 1.2 Những đặc điểm và vị trí di truyền của các gen mã hóa của các SE 22

Bảng 1.3 Phân loại độc tố dựa vào việc so sánh trình tự axit amin 24

Bảng 1.4 Các bộ sinh phẩm thương ma ̣i được sử du ̣ng để phát hiện các SE 32

Bảng 1.5 So sánh kháng thể IgG ở thỏ và IgY ở gà 43

Bảng 2.1 Thành phần hỗn hợp kháng nguyên BSA 64

Bảng 2.2 Thành phần hỗn hợp kháng nguyên các SE 64

Bảng 3.1 Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEA 94

Bảng 3.2 Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEB 95

Bảng 3.3 Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEC1 96

Bảng 3.4 Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SED 96

Bảng 3.5 Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEE 97

Bảng 3.6 Tính ổn định của que thử phát hiện SE(A+B+C1+D+E) 99

Bảng 3.7 Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEA trên sữa 101

Bảng 3.8 Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEB trên sữa 101

Bảng 3.9 Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEC1 trên sữa 102

Bảng 3.10 Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SED trên sữa 102

Bảng 3.11 Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEE trên sữa 103

Bảng 3.12 Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEA trên thịt 105

Bảng 3.13 Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEB trên thịt 106

Bảng 3.14 Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEC1 trên thịt 106

Bảng 3.15 Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SED trên thịt 107

Bảng 3.16 Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEE trên thịt 107

MỞ ĐẦU

Việc đảm bảo chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm ảnh hưởng trực tiếp tới sức khỏe con người Ngộ độc thực phẩm (NĐTP) là một trong những mối lo ngại lớn trên toàn thế giới Theo cơ quan Quản lý thực phẩm và dược phẩm Mỹ ước tính mỗi năm tại Mỹ xảy ra khoảng 76 triệu ca NĐTP với 325 nghìn người phải nhập viện và khoảng

5 nghìn người chết Các tác nhân chính gây NĐTP bao gồm hóa chất, vi sinh vật, độc

tố tự nhiên, Tuy nhiên, ghi nhận từ thực tế các vụ NĐTP đã xảy ra cho thấy tác nhân

vi sinh vật khá phổ biến, trong đó Staphylococcus aureus là một trong những nguyên

nhân hàng đầu, cho đến nay vẫn còn là một vấn đề nan giải Nguyên nhân của NĐTP

do tụ cầu là người bị ngộ độc đã tiêu thụ các độc tố ruột tụ cầu (staphylococcal enterotoxin - SE) tồn tại sẵn trong thực phẩm, do các chủng tụ cầu có coagulase dương

tính, đặc biệt là S aureus tổng hợp nên Cho đến nay, 21 loại độc tố ruột tụ cầu (SE)

đã được thống kê, trong số đó, 5 loại SE bao gồm SEA, SEB, SEC, SED và SEE được biết là nguyên nhân chủ yếu gây ngộ độc thực phẩm

Các vụ NĐTP do độc tố tụ cầu là một trong những mối nguy cơ thường trực đối

với người tiêu dùng Các loại thực phẩm dễ bị nhiễm độc do S aureus bao gồm các

thực phẩm giàu đạm như thịt, sữa, thủy sản, trứng, phô mai, rau, củ, quả, bánh kẹo Theo các số liệu thống kê chưa đầy đủ của Cục An toàn vệ sinh thực phẩm, Bộ Y tế, trong những năm gần đây ở nước ta mỗi năm có hàng trăm vụ NĐTP với hàng nghìn người mắc, trong đó có nhiều ca nặng phải nhập viện và không ít các trường hợp đã tử vong Bên cạnh đó, còn nhiều trường hợp NĐTP không được thống kê vì những lý do khác nhau NĐTP có thể xảy ra ở tất cả các nước trên thế giới, các vùng miền trong mỗi nước Việt Nam là nước có khí hậu nhiệt đới, nóng, ẩm, nguồn thực phẩm lại dồi

dào nên là môi trường tốt cho vi khuẩn phát triển, trong đó có S aureus

Tính cấp thiết của đề tài

Hiện nay, để phát hiện độc tố ruột tụ cầu, người ta thư ờng sử dụng các sinh phẩm thương m ại dựa trên kỹ thuâ ̣t ELISA như RIDASCREEN SET (R-Biopharm, Darmstadt, Đức) và VIDAS (BioMérieux, Marcy L´Etoile, Pháp) Quy trình phân tích

khi sử dụng các bộ sinh phẩm này cũng khá phức tạp, chỉ phù hợp với các phân tích tại phòng thí nghiệm Những sinh phẩm này thường s ử dụng kháng thể đa dòng và kháng thể đơn dòng từ thỏ hoặc từ chuột Tuy nhiên, vùng Fc của kháng thể IgG từ thỏ và

chuột phản ứng mạnh và không đặc hiệu với protein A của S aureus nên có thể gây ra

hiê ̣n tượng dương tính gi ả khi sử du ̣ng các bô ̣ sinh phẩm này Mă ̣t khác, giá thành bộ sinh phẩm cao, thời gian xét nghiệm thường kéo dài từ 2 đến 3 giờ và yêu cầu kỹ thuật viên có trình đô ̣, đó cũng là các yếu tố hạn chế sự ứng dụng của các b ộ sinh phẩm này

ở Việt Nam

Do vâ ̣y, cần phát triển một phương pháp phân tích sàng lọc mới, có giá thành thấp, thời gian phân tích ngắn, thực hiện đơn giản và tránh được hiê ̣n tượng dương tính giả Sắc ký miễn dịch là một trong những kỹ thuật có triển vọng nhất để tạo ra những

bộ sinh phẩm đáp ứng được những yêu cầu trên Theo sự hiểu biết của chúng tôi, cho đến thời điểm này, trên thế giới vẫn chưa có que thử thương mại nào phát hiện nhanh

cả 5 loại độc tố ruột tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED và SEE) Vì thế, việc phát triển một hệ thống sắc ký miễn dịch có khả năng phát hiện nhanh các độc tố ruột tụ cầu trong thực phẩm là rất cấp thiết, giúp đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm cho các sản phẩm lưu hành trong nước và sản phẩm thực phẩm xuất khẩu Từ thực tế trên, tôi thực

hiện đề tài luận án: “Nghiên cứu tạo que thử để phát hiện nhanh một số độc tố ruột của tụ cầu khuẩn trong thực phẩm”

Mục tiêu của đề tài

Mục tiêu của đề tài luận án là phát triển một bộ sinh phẩm dựa trên kỹ thuật sắc

ký miễn dịch để phát hiện nhanh một số độc tố ruột của tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED

và SEE) trong thực phẩm

Nội dung nghiên cứu của đề tài

- Sản xuất và tinh sạch độc tố ruột tụ cầu tái tổ hợp SEC1 và ứng dụng để phát triển que thử;

- Sản xuất và tinh sạch kháng thể lòng đỏ trứng IgY kháng BSA và kháng thể lòng đỏ trứng IgY kháng một số độc tố ruột tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED và SEE) và ứng dụng để tạo que thử;

- Tối ưu hóa lượng kháng thể cần cố định lên vạch kiểm chứng, vạch thử nghiệm của que thử và lượng kháng nguyên cộng hợp cần sử dụng trên que thử;

- Xác định giới hạn phát hiện một số độc tố ruột tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED

và SEE) của que thử;

- Xây dựng quá trình chuẩn bị mẫu của một số nhóm thực phẩm (sữa, thịt);

- Xác định giới hạn phát hiện một số độc tố ruột tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED

và SEE) của que thử trên một số nhóm thực phẩm (sữa, thịt) được gây nhiễm thực nghiệm

Điểm mới của luận án

Đã có nhiều nghiên cứu về S.aureus và các độc tố của chúng nhưng việc nghiên cứu, chế tạo thành công que thử để phát hiện nhanh các độc tố của S.aureus trong thực

phẩm ở nước ta thì đây là một kết quả mới, cụ thể như sau:

- Sản xuất được kháng nguyên tái tổ hợp SEC1; sản xuất được kháng thể lòng đỏ trứng gà (IgY) kháng BSA và kháng thể IgY kháng các độc tố ruột tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED và SEE) làm nguyên liệu tạo que thử phát hiện các SE

- Đã xây dựng và hoàn thiện được quy trình tạo que thử dựa trên kỹ thuật sắc ký miễn dịch cạnh tranh để phát hiện nhanh 5 loại độc tố ruột tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED và SEE) trên một số nhóm thực phẩm (sữa và thịt) ở trong phòng thí nghiệm

Ý nghĩa khoa học, thực tiễn của đề tài

Việc xác định S aureus trong thực phẩm ở nước ta hiện nay chủ yếu dựa vào việc phát hiện và định lượng vi khuẩn S aureus có phản ứng coagulase dương tính

Phương pháp này cần nuôi cấy vi khuẩn trong phòng thí nghiệm với thời gian để trả

lời kết quả khoảng 3- 4 ngày nhưng chỉ cho thấy trong mẫu thực phẩm có vi khuẩn S aureus hay không mà không phát hiện được độc tố ruột tụ cầu do vi khuẩn này tiết ra,

là nguyên nhân gây NĐTP

Kết quả nghiên cứu của đề tài luận án giúp giải quyết hạn chế nói trên Sử dụng các que thử đã phát hiện được các độc tố ruột tụ cầu với thời gian phân tích ngắn, đơn giản, dễ

sử dụng, không cần các thiết bị phức tạp, đắt tiền Mặt khác, các nguyên liệu chính để sản suất que thử (kháng nguyên cộng hợp và các kháng thể) đều được nhóm nghiên cứu

chủ động tạo ra, do đó làm hạ giá thành sản phẩm nhiều lần so với giá thành các bộ kít nhập ngoại hiện nay Kết quả của đề tài luận án tạo sản phẩm mới, ứng dụng xác định

nhanh ô nhiễm độc tố staphylococcus trong thực phẩm, phục vụ trong kiểm soát an

toàn thực phẩm

Cấu trúc của luận án

Luận án ngoài phần mở đầu, kết luận, kiến nghị và phần phụ lục, phần chính gồm 3 chương với 23 bảng; 47 hình:

- Chương 1: Tổng quan tài liệu nghiên cứu

- Chương 2: Đối tượng, vật liệu và phương pháp nghiên cứu

- Chương 3: Kết quả nghiên cứu và bàn luận

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU

1.1.TỤ CẦU KHUẨN

Tụ cầu khuẩn (Staphylococci) là một trong những vi khuẩn gây bệnh được ghi

nhận sớm nhất, từ đầu những năm 1880 Tụ cầu phân bố rộng rãi trong tự nhiên và thường ký sinh trên da và các hốc tự nhiên của người, động vật (ở bò, cừu, gà, thỏ, chó, lợn, ) [2] Cho tới nay, đã có 50 loài tụ cầu được phát hiện [44] Trong đó nhiều loài là những tụ cầu khuẩn cộng sinh và một vài loài là những vi khuẩn gây bệnh giới hạn Trên phương diện gây bệnh, tụ cầu được chia thành hai nhóm chính: tụ cầu có coagulase và tụ cầu không có coagulase [113] Các đại diện quan trọng của tụ cầu có

coagulase là: tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) và Staphylococcus intermedius Trong các vi khuẩn Gram dương, S aureus là loài vi khuẩn gây bệnh thường gặp nhất

và kháng lại kháng sinh mạnh nhất, đặc biệt là gây nhiễm khuẩn huyết, gây ngộ độc thức ăn, gây nhiễm trùng bệnh viện, … Ngược lại, tụ cầu không có coagulase là thành phần của hệ vi khuẩn bình thường của da và niêm mạc Hai đại diện có vai trò quan

trọng trong y học của nhóm này là S epidermidis (tụ cầu da) gây nhiễm khuẩn cơ hội

và S saprophyticus gây nhiễm khuẩn tiết niệu [7]

1.1.1 Đặc điểm sinh học{tc "I.2.1.1 Đ?c đi?m sinh h?c" \f C \l 4} của tụ cầu vàng

* Hình dạng và kích thước: Tụ cầu vàng là những cầu khuẩn có đường kính từ

0,8 - 1,0 μm, xếp lại với nhau thành hình chùm nho, bắt màu Gram dương (Hình 1.1), không có lông, thường không có vỏ, không sinh bào tử [1]

* Nuôi cấy: Tụ cầu vàng thuộc loại dễ nuôi cấy, chúng phát triển được ở nhiệt

độ từ 7 - 48,5°C, (khoảng tối ưu từ 30-37°C), pH từ 4,2- 9,3, (khoảng tối ưu từ 7 - 7,5), thích hợp được ở cả điều kiện hiếu và kỵ khí, phát triển tốt ở nồng độ muối cao tới 10%, thậm chí ở nơi nồng độ muối tới 20% vi khuẩn vẫn có thể sinh trưởng chậm [44] Trên môi trường BP (Baird Parker), khuẩn lạc đặc trưng của tụ cầu vàng có màu đen nhánh, bóng, lồi, đường kính 1-1,5 mm, quanh khuẩn lạc có vòng sáng rộng

từ 2- 5 mm (Hình 1.2)

Hình 1.1 S aureus dưới kính hiển vi

(Nguồn:microbiologyinpictures.com)

Hình 1.2 S aureus nuôi cấy trên môi trường Baird Parker (Nguồn:glogster.com)

* Đặc tính sinh hóa: Tụ cầu vàng có hệ thống enzym phong phú, những enzym

được dùng trong chẩn đoán là coagulase, catalase, deoxyribonuclease, phosphatase [1, 7, 56] Trong đó coagulase có khả năng làm đông huyết tương người

và động vật khi đã được chống đông Đây là đặc tính quan trọng nhất để phân biệt tụ cầu vàng với các tụ cầu khác

1.1.2 Những yếu tố ảnh hưởng tới sản sinh độc tố ruột của tụ cầu

Sự sản sinh độc tố ruột của tụ cầu đã được nghiên cứu trong điều kiện thí nghiệm và trong nhiều loại thực phẩm khác nhau Những yếu tố ảnh hưởng tới sản sinh SE gồm: nhiệt

độ, hoạt độ nước (aw), nồng độ muối, độ pH, glucose, sự cạnh tranh của vi sinh vật, tùy

từng loại thực phẩm và sự biểu hiện của gen agr

Nhiệt độ tối thiểu cho sản sinh SE là 10oC và nhiệt độ tối đa là 48oC Khoảng nhiệt độ thích hợp cho sự sản xuất độc tố của tụ cầu là 35-40oC, nhiệt độ 37oC thường được sử dụng trong nuôi cấy [73]

Đối với hoạt độ nước, aw thích hợp cho tụ cầu sản sinh ra độc tố là từ 0,87 đến 0,99; tối ưu là 0,98 [73]

Nồng độ muối cũng là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và khả năng sản xuất độc tố của tụ cầu Độ thẩm thấu thấp là một trong những nguyên nhân làm tăng sự sản xuất độc tố Nồng độ muối tối đa cho sự sản xuất độc tố là dưới 12%, như vậy nếu nồng độ muối từ 12% trở lên thì sự sản xuất độc tố tụ cầu sẽ bị ức chế [73]

Nếu pH trung tính là điều kiện thích hợp nhất cho quá trình hình thành các SE thì ở điều kiện pH axit, sự hình thành SE sẽ bị giảm hay bị ức chế Khoảng pH để sản xuất độc tố từ 5,1 đến 9,0 và thông thường sự sản xuất SE bị ức chế ở pH nhỏ hơn 5 [70] Tại một pH nhất định, các chất được sử dụng để axit hóa môi trường có thể có tác dụng nhiều hơn hoặc ít hơn đến việc sản xuất độc tố của tụ cầu Ví dụ, axit axetic có tác dụng ức chế hơn so với axit lactic trong việc sản xuất SE [77] Ngoài ra, glucose cũng là một trong những thành phần ức chế sự tạo ra độc tố, đặc biệt là sự tạo độc tố SEB và SEC, do sự chuyển hóa glucose làm giảm độ pH [107 ]

S aureus rất nhạy với vi sinh vật cạnh tranh Khi trong thực phẩm có mặt các

sinh vật cạnh tranh khác, vi khuẩn này chỉ sinh trưởng mà không sinh độc tố Genigeorgis (1989) đã chứng minh rằng khi trong sữa có các vi sinh vật cạnh tranh với mật độ cao thì sẽ ức chế sự sinh trưởng cũng như tạo độc tố của tụ cầu [Trích theo 107] Sự cạnh tranh với các vi khuẩn sinh axit lactic cũng được nghiên cứu ở phomat, sữa và xúc xích lên men [81, 95] Điều này có thể liên quan tới sự hình thành axit lactic làm giảm độ pH, sự hình thành peroxide và đôi khi do sự tổng hợp một số kháng

sinh đã ức chế quá trình sinh trưởng của S aureus

Các độc tố thường được tụ cầu tạo ra nhiều hơn trong các thực phẩm giàu protein như thịt, sữa và các sản phẩm từ sữa [Trích theo 68] Những thực phẩm này đều có nhiều yếu tố tương đối phù hợp với sự sinh trưởng và phát triển của tụ cầu như

độ pH, các chất dinh dưỡng, muối, nồng độ ôxy và nhiệt độ môi trường Tụ cầu cần có những axit amin khác nhau cho quá trình sinh trưởng và sản sinh độc tố [107] Ví dụ:

Valine cần thiết cho quá trình sinh trưởng và phát triển của S aureus, Arginine và

Cystine cần cho cả quá trình sinh trưởng phát triển lẫn việc sản sinh độc tố [77, 107]

Gen agr điều hòa hầu hết các yếu tố độc lực của tụ cầu Khi nồng độ glucose và

độ pH thấp thì có tác dụng ức chế sự biểu hiện của gen agr Ngoài ra, ở điều kiện độ

pH kiềm cũng làm giảm biểu hiện của gen agr dẫn đến việc giảm sự sản sinh ra các

độc tố SEB, SEC và SED [74, 77, 89]

Khi các chủng vi khuẩn tụ cầu vốn mang gen mã hóa các độc tố ruột SE phát triển đến một số lượng nhất định trong thực phẩm (khoảng 106 CFU/g, ml), chúng có thể tiết ra một lượng độc tố đủ để gây ra hiện tượng ngộ độc cho người tiêu dùng [Theo 51, 107]

1.1.3 Tình hình ngộ độc thực phẩm do tụ cầu

1.1.3.1 Tình hình ngộ độc thực phẩm do độc tố ruột tụ cầu trên thế giới

Tính đến năm 2003, có khoảng 250 loại bệnh truyền qua thực phẩm đã được xác định và vi khuẩn là tác nhân gây ra 2/3 các vụ NĐTP [107] Trong số đó, tụ cầu là một trong những tác nhân gây ngộ độc phổ biến nhất Ngộ độc thực phẩm do tụ cầu được định nghĩa là sự tiêu thụ các SE, vốn đã tồn tại sẵn trong thực phẩm, do các

chủng tụ cầu có coagulase dương tính, đặc biệt là S aureus tổng hợp nên [78]

Một số vụ ngộ độc trên thế giới: vụ NĐTP lớn đầu tiên được ghi nhận do sử

dụng phomai bị nhiễm độc tố ruột tụ cầu, đã xảy ra vào năm 1884 ở Michigan, Mỹ [45] Sau đó là vụ NĐTP ở Pháp vào năm 1894 do dùng thức ăn là thịt bò bị nhiễm độc tố này Các thống kê về dịch tễ học tại Pháp trong hai năm 1999-2000 chỉ ra rằng

S aureus là tác nhân gây NĐTP đứng hàng thứ hai, chỉ sau Salmonella [42] Năm

2000, mô ̣t vụ ngộ độc thực phẩm do sử dụng thịt lợn và thịt hun khói nhiễm độc tố tụ cầu đã xảy ra ở Đức làm 297 người phải nhâ ̣p viê ̣n [16] Tại Nhật Bản, một vụ ngộ độc với quy mô lớn làm ảnh hưởng đến 13.420 người đã xảy ra do tiêu thụ sữa nước tách béo và sữa chua được chế biến từ sữa bột có nhiễm SEA vào tháng 6 năm 2000 [14] Theo thống kê năm 2011 của Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa dịch bệnh Mỹ ước tính hàng năm tại nước này có khoảng 240.000 trường hợp mắc bệnh với 1000 ca nhập viện và 6 trường hợp tử vong có liên quan đến NĐTP do tụ cầu [54] Ước tính mỗi ca NĐTP do tụ cầu tiêu tốn 695 USA, nâng tổng số thiệt hại ở Mỹ lên tới 167.597.860 USA mỗi năm do các vụ NĐTP [54]

Ngưỡng gây ngộ độc: Ngưỡng gây ngộ độc của các SE ở người hiện nay vẫn

chưa được xác định một cách chính xác Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng liều gây ngộ độc ở người của SEA là khoảng 1 µg, ở một số trường hợp chỉ cần 20 – 100ng cũng

đủ để gây ra hiện tượng ngộ độc [49] Đặc biệt, trong một vụ ngộ độc do uống sữa sôcôla có chứa SEA, lượng độc tố được xác định chỉ có 0,5 ng/ml [38]

Loại độc tố, 5 loại SE bao gồm SEA, SEB, SEC, SED và SEE được biết là

nguyên nhân chủ yếu gây NĐTP Theo thống kê ở Anh từ năm 1969 đến 1990, 79% các ca ngộ độc có nguyên nhân gây ngộ độc do SE: chỉ riêng độc tố SEA (56,9%), cả hai độc tố SEA và SED (15,4%), SEB (3,4%), SEC (2,5%), cả SEB và SED (1,1%) [111] Thống kê từ các nghiên cứu khác cũng cho thấy độc tố ruột SEA cũng là loại độc tố phổ biến nhất: Pháp (69,7%) [57], Mỹ (77,8%) [22] và Hàn Quốc (90%) [23]

Các loại thực phẩm liên quan đến ngộ độc: các loại thực phẩm liên quan tới các

vụ ngộ độc do S aureus bao gồm các sản phẩm thịt, cá, trứng và sữa vốn đều là các thực phẩm giàu đạm Tại Anh, 75% các vụ NĐTP do S aureus gây ra gắn liền với các

sản phẩm từ thịt; 8% do các sản phẩm từ sữa; 7% từ các sản phẩm cá và 3,5% từ trứng [107] Tại Pháp, các sản phẩm sữa lại là nguyên nhân chính gây ra ngộ độc, chiếm tới 32%; các loại thịt 31%; xúc xích và các loại bánh 15%; các sản phẩm cá và hải sản khác 11%; trứng 11% [107] Một nghiên cứu năm 2001 cho thấy 15% các trường hợp NĐTP tụ cầu tại 8 nước phát triển do đã sử dụng các sản phẩm từ sữa, đặc biệt, ở Pháp

tỷ lệ này là 85% [31] Tại Mỹ, 47% các vụ ngộ độc gắn liền với các sản phẩm thịt; 12% do các loại rau; 5% do mỳ ống và chỉ có 1,4% do các sản phẩm sữa và hải sản [69]

1.1.3.2 Tình hình ngộ độc thực phẩm ở Việt Nam

Theo các số liệu thống kê, các vụ NĐTP trong vòng 5 năm gần đây ở Việt Nam của Cục An toàn vệ sinh thực phẩm, Bộ Y tế (Bảng 1.1), số vụ NĐTP trên cả nước dao động từ 148-175 vụ, với 4700-5676 người mắc, từ 3663- 4700 người nhập viện,

số ca tử vong từ 27- 51 ca [112] Trong báo cáo sơ kết 6 tháng đầu năm 2014 vừa được

Bộ Y tế công bố, điều đáng chú ý là số người chết do NĐTP tăng cao Tính đến ngày 30/6/2014, toàn quốc ghi nhận có 90 vụ NĐTP với 2636 người mắc, 2035 người nhập

viện và 28 trường hợp tử vong Tuy nhiên, các số liệu này chỉ thống kê tới những vụ NĐTP với quy mô lớn hoặc những trường hợp ngộ độc nặng phải nhập viện Số ca NĐTP trong thực tế có thể lớn hơn nhiều lần số lượng trên

Bảng 1.1 Thống kê các vụ NĐTP từ năm 2009 đến năm 2013 ở Việt Nam

Năm Số vụ NĐTP Số người mắc Số người

Về các tác nhân gây NĐTP: theo thống kê của Cục An toàn Thực phẩm từ năm

2007 đến 2012, các tác nhân chính của các vụ NĐTP bao gồm: vi sinh vật (chiếm từ 7,8% đến 45,8%), hóa chất (chiếm từ 0,5% đến 10,8%), độc tố tự nhiên (19,1% đến

27,1%) và không rõ tác nhân (21,4% đến 71,1%) (Hình 1.3) Số liệu này cho thấy

trong các vụ NĐTP ở nước ta thì tác nhân do vi sinh vật chiếm gần một nửa Những

loại vi khuẩn thường gây ra các vụ ngộ độc ở nước ta bao gồm Salmonella, Streptococcus, E coli và S aureus [112]

Các vụ NĐTP xảy ra ở tất cả các vùng, chiếm tỷ lệ cao nhất là miền núi phía Bắc, với trung bình 19,8 -36,3% số vụ/năm, số vụ xảy ra tại bếp ăn gia đình là cao nhất với 48,6 - 60,6% số vụ/năm Những thức ăn là nguyên nhân gây NĐTP được xác định là: thực phẩm hỗn hợp, thịt và các sản phẩm từ thịt, thủy sản, rau, củ quả, bánh kẹo, … [112]

Hình 1.3 Tác nhân trong các vụ NĐTP từ năm 2007 đến năm 2012 [112]

Tuy chưa có một nghiên cứu có hệ thống nào về tình hình nhiễm các độc tố SE trong các thực phẩm ở nước ta nhưng với điều kiện khí hậu nóng ẩm và ý thức về vệ sinh an toàn thực phẩm của người dân chưa cao thì có thể một phần không nhỏ các trường hợp NĐTP là do nhiễm các SE Trước tình hình đó, bên cạnh các biện pháp tuyên truyền nhằm nâng cao ý thức của người dân về vệ sinh an toàn thực phẩm, việc kiểm tra phát hiện nhanh các mẫu thực phẩm nhiễm SE trên thị trường đóng vai trò rất quan trọng trong việc bảo vệ sức khỏe của người tiêu dùng

1.2 ĐỘC TỐ RUỘT CỦA TỤ CẦU

1.2.1 Đặc điểm sinh hóa, hóa lý và di truyền của độc tố ruột của tụ cầu

Cho đến nay, người ta đã thống kê được có ít nhất 21 loại SE, bao gồm: các SE

từ SEA đến SEE, SEG đến SEI, SER đến SET có hoạt tính gây nôn, các protein giống độc tố ruột của tụ cầu (Staphylococcus Enterotoxin like - SEl) không có hoạt tính gây nôn khi thử trên linh trưởng (SElL và SElQ) hoặc chưa được kiểm tra (SElJ, SElK, SElM đến SElP, SElU, SElU2 và SElV) Các SE và SEl được chia thành nhóm cổ điển (SEA đến SEE) và nhóm mới (SEG đến SElU2) [65]

Các SE có bản chất là những chuỗi protein đơn có khối lượng phân tử thấp (khoảng từ 22 đến 29 kDa) Mỗi loại SE đều có những yếu tố quyết định kháng nguyên chuyên biệt Các độc tố này dễ tan trong nước và trong các dung dịch muối Đặc biệt, các SE được mô tả hầu hết là có tính ổn định cao, chúng có tính chịu nhiệt và không bị protease thông thường như pepsin, trypsin, chymotrypsin, papain,… thủy phân, vì thế chúng giữ nguyên được cấu trúc trong đường tiêu hóa của người [107] Ví dụ: SEA có thể không bị bất hoạt ở 121°C trong 10 phút với nồng độ lớn (> 100 ng/g nấm ăn) [39] Khả năng chịu nhiệt cao này của các SE là một trong những tính chất đáng lưu ý nhất góp phần làm tăng nguy cơ gây ngộ độc thực phẩm Trong quá trình

chế biến thực phẩm, nếu nguyên liệu bị nhiễm một chủng S aureus có khả năng sinh

độc tố và các điều kiện chế biến có lợi cho sự sinh trưởng của vi khuẩn cũng như sự sản sinh độc tố của vi khuẩn này thì một lượng lớn SE sẽ được tích tụ trong thực phẩm

đó, ngay cả khi sản phẩm được xử lý với nhiệt độ để tiệt trùng trước khi sử dụng thì thực phẩm đó vẫn có nguy cơ gây ngộ độc

Các gen mã hóa SE có vị trí rất khác biệt trên thể gen của S aureus Bảng 1.2 dưới đây thể hiện điều này một cách chi tiết Tất cả các gen se và sel mã hóa lần lượt

các SE và SEl đều có đặc điểm quan trọng là nằm trên các yếu tố di truyền phụ, bao

gồm các plasmid, prophage và các vùng gây bệnh nhỏ của S aureus (SaPIs), vùng gen vSa hoặc bên cạnh các vùng nhiễm sắc của tụ cầu (Bảng 1.2) Hầu hết trong số chúng là

các yếu tố di truyền di động, do đó chúng có thể đóng một vai trò quan trọng trong sự

phát triển của tác nhân gây bệnh này Đối với S aureus, hai loại plasmid đặc trưng mang

se và sel đã được liệt kê (Bảng 1.2) là plasmid pIB485 và pF5 Các SaPI là những vùng

gây bệnh có kích thước từ 15-17 kb, ngoại trừ SaPIbov2 (27 kb) và một SaPI bị thoái hóa (3.14 kb) [65]

Bảng 1.2 Những đặc điểm và vị trí di truyền của các gen mã hóa của các SE

SaPI5

11 SElL 26,0 Nd -a sell S SaPImw2, SaPIbov1 SaPIn1, SaPIm1,

1

12 SElM 24,8 Nk Nd selm S egc1 (vSaß I); egc2 (vSaß III)

13 SElN 26,1 Nd Nd seln S (vSaß III); egc3; egc4 egc1 (vSaß I); egc2

16 SElQ 25,0 Nd - selq S SaPI1, SaPI3, SaPI5 FSa3ms, FSa3mw,

20 SElU 26,7-27,1 nd Nd selu S egc2 (vSaß III); egc3 egc4

Chú thích: +: có; - : không; nd: chưa xác định; a : hoạt động nôn xác định ở thỏ (SElL) hoặc ở chuột chù nhà (SElP) mà không phải ở linh trưởng; b : vị trí giả định [65]

1.2.2 Cấu trúc phân tử của độc tố ruột tụ cầu

Các nghiên cứu về cấu trúc của SE đã chỉ ra rằng phân tử của chúng có cấu trúc bậc 3 giống nhau [36] Hình 1.4 dưới đây minh họa cấu trúc của các độc tố tụ cầu SEA, SEB, SEC2 và SED Chúng có một đuôi nhỏ N, xoắn anpha kết nối với một nếp gấp β được gọi là miền B hoặc nếp gấp liên kết oligosaccharide (O/B) Nếp gấp O/B nối với nếp gấp β bởi một vùng A có dạng xoắn anpha chéo ở trung tâm [64] Tất cả các siêu kháng nguyên đều có đặc điểm này Tuy nhiên, một số siêu kháng nguyên có cấu trúc sai khác như có thêm các nếp gấp nhỏ Điều đáng chú ý nhất trong cấu trúc của độc tố là nếp gấp cystein được tìm thấy trong nhiều độc tố ruột cũng như trong độc

tố ruột A gây sốt của liên cầu (SPE A) Vai trò của nếp gấp cystein chưa được biết rõ nhưng người ta đã chứng minh được chính những nếp gấp cystein này giúp ổn định cấu trúc phân tử và có thể góp phần vào việc kháng sự phân giải protein [35, 47]

Hình 1.4 Cấu trúc không gian của các độc tố ruột SEA, SEB, SEC2, SED [36]

Trình tự các nucleic của gen seg của tụ cầu, gen ssa của độc tố liên cầu (siêu kháng nguyên liên cầu) và gen speA (độc tố A gây sốt liên cầu) có mức tương đồng

cao Sự tương đồng này chỉ ra rằng rất có thể độc tố của S aureus và của liên cầu đã

tiến hóa từ một gen độc tố tổ tiên chung, hoặc đã có sự trao đổi vật liệu di truyền giữa hai vi sinh vật này [40] Gần đây, các protein SEI, SElK, SElL, SElQ đã được xác định rằng đều có vòng cystein Chúng có các đặc điểm như các siêu kháng nguyên, nhưng hoạt tính gây nôn giảm đáng kể ở SEI và thiếu ở SElK và SElQ [64] Các độc tố SEA, SEB, SEC, SED, SEE và SEH có khả năng gây nôn ít hoặc nhiều, tùy thuộc vào loại độc tố

Các SE được phân loại thành 5 nhóm dựa vào việc so sánh trình tự axit amin giữa chúng (Bảng 1.3) Sự tương đồng giữa các SE thể hiện ở 15% axit amin được hoàn toàn bảo tồn và hầu hết chúng nằm trên vùng trung tâm và đầu C của các độc tố Nhóm 1 bao gồm: SEA, SED, SEE, SElJ, SElN, SElO, SElP và SES Nhóm 2 bao gồm SEB, SEC1, SEC2 và SEC3, SEG, SER, SelU và SelU2 Nhóm 3 bao gồm SEI, SElK, SElL, SElM, SElQ và SElV Nhóm 4 và nhóm 5, mỗi nhóm chỉ có duy nhất một độc tố, lần lượt là SET và SEH [65]

Bảng 1.3 Phân loại độc tố dựa vào việc so sánh trình tự axit amin [65]

Nhóm Các độc tố ruột của tụ cầu

Nhóm 1 SEA, SED, SEE SElJ, SElN, SElO, SElP, SES

Nhóm 2 SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SEG, SER , SElU, SElU2

Nhóm 3 SEI, SElK, SElL, SElM, SElQ, SElV

1.2.3 Hoạt tính sinh học của các độc tố ruột tụ cầu

Các SE thuộc họ độc tố gây sốt có nguồn gốc từ các loài tụ cầu và liên cầu Các độc tố gây sốt này bao gồm các SE và độc tố gây sốt liên cầu A và B [63] Mặc dù các độc tố này liên quan tới các tác nhân gây bệnh khác nhau nhưng chúng có chung hoạt tính sinh học: gây sốt, kích hoạt hệ miễn dịch và tăng nhanh số lượng tế bào T không chuyên biệt Những hoạt tính này được gọi là hoạt tính siêu kháng nguyên (superantigen) Bên cạnh những đặc điểm chung này, chỉ riêng các SE có hoạt tính gây

nôn [107] Hoạt tính siêu kháng nguyên và hoạt tính gây nôn đươ ̣c quyết đi ̣nh bởi 2 vùng protein ri êng biệt nhưng sự liên hệ giữa hai hoạt tính này vẫn chưa được làm rõ [43] Tuy nhiên, trong hầu hết trường hợp, hai hoạt tính này tồn tại song song nhau, những đột biến làm mất hoạt tính siêu kháng nguyên cũng làm mất hoạt tính gây nôn [53]

1.2.3.1 Hoạt tính siêu kháng nguyên

Năm 1960, Bergdoll và cộng sự là những người đầu tiên đã phát hiện được hoạt tính siêu kháng nguyên ở vi khuẩn [Trích theo35] Dựa vào các đặc tính của độc

tố ruột gồm hoạt tính siêu kháng nguyên và hoạt tính gây nôn, họ đã phân lập được

một độc tố tiết ra bởi S aureus và gọi là độc tố ruột tụ cầu A (SEA) [35] Tuy nhiên,

thuật ngữ siêu kháng nguyên chỉ được sử dụng từ năm 1989, khi Marrack và cộng sự quan sát, các tế bào T phát triển tràn lan khi các độc tố này được nhận diện bởi các chuỗi Vß chuyên biệt của thụ thể thuộc tế bào T [63] Các siêu kháng nguyên là những chất gây phân bào, nhất là đối với tế bào T [86] Với các kháng nguyên thông thường,

sự xuất hiện phức hợp MHC II (major histocompatibility complex- II) trên các tế bào trình diện kháng nguyên (antigen presenting cell - APC) cần được tạo ra bởi 5 yếu tố khác nhau của thụ thể tế bào T (T- cell receptor- TCR) là Vβ, Dβ, Jβ, Vα và Jα [10, 104] Ngược lại, các siêu kháng nguyên được nhận ra chủ yếu bởi phần Vβ của TCR Các

SE liên kết trực tiếp với các phân tử MHC II ở các rãnh liên kết kháng nguyên peptit bên ngoài các APC (Hình 1.5) Các SE liên kết với các MHC II, sau đó chúng có thể liên kết với các tế bào T thông qua TCR một cách "không đặc hiệu", chỉ qua vùng biến đổi Vβ trên TCR, chúng tạo một liên kết chéo giữa vùng biến đổi Vβ và protein MHC-

II Phức hợp này không phụ thuộc vào liên kết peptit với thụ thể tế bào T Sự tương tác giữa ba phân tử: MHCII - SE - TCR dẫn đến một sự giải phóng không kiểm soát các chất cytokine như: IFN- γ, TNF-α, IL-1ß, IL-6 và IL-8, là nguyên nhân chính gây viêm cấp tính và sốc [19, 104] Thông thường, các tế bào T chỉ được hoạt hóa một cách đặc hiệu với kháng nguyên nhưng khi các tế bào này tương tác với các SE thì đã xảy ra sự phát triển quá độ, chủ yếu là Th1 và Th17 [21, 102], cả hai đều có liên quan đến phản ứng viêm cấp tính Thêm vào đó là sự chết tế bào và thiếu hụt các đáp ứng từ

tế bào T [43], hệ quả là có một phản ứng miễn dịch yếu đối với độc tố Sự ức chế miễn dịch của tế bào T và tế bào B dẫn tới sự suy giảm đáp ứng miễn dịch với các tác nhân xâm nhập khác [18, 104] Do đó, cơ thể có thể sẽ không phản ứng với một chất hoặc yếu tố gây bệnh mà cơ thể đã có đáp ứng miễn dịch trước đó Các siêu kháng nguyên

có thể kích thích khoảng 20% tổng số các tế bào lympho T, trong khi kháng nguyên thông thường chỉ hoạt hóa 0,1% các tế bào này [13] Mặt khác, sự tổng hợp và giải phóng quá mức cytokin là phản ứng gây ra các hậu quả nghiêm trọng nhất của các siêu kháng nguyên, dẫn đến sốc, hạ huyết áp, ngừng hoạt động của các cơ quan khác nhau

và có thể dẫn đến tử vong [66, 67] Tử vong ở người lớn khỏe mạnh là hiếm (0,03%) nhưng tỷ lệ tử vong là cao hơn ở trẻ em, người già và người lớn suy giảm miễn dịch và cũng có thể phụ thuộc vào nồng độ của các độc tố tiêu hóa [36]

Hình 1.5 Mô hình tương tác của SE với thụ thể tế bào T và với phân tử MHC II

Ghi chú: SE một mặt gắn với V β của TCR, một mặt gắn với MHC-II nên có thể kích hoạt cả tế bào APC và tế bào T, dẫn tới việc sản xuất các cytokine của cả hai loại tế

bào [104]

1.2.3.2 Hoạt tính gây nôn

Hoạt tính gây nôn không được mô tả rõ như hoạt tính siêu kháng nguyên do thiếu mô hình động vật phù hợp Linh trưởng là động vật lý tưởng để nghiên cứu hiệu ứng nôn của các SE, nhưng do chi phí nghiên cứu là khá cao và tồn tại một số vấn đề

về đạo đức sinh học nên khó được thực hiện Trong một nghiên cứu về ảnh hưởng của

SE gây viêm ruột ở khỉ Macaca mulatta, người ta nhận thấy 0,9 μg độc tố/kg cơ thể đã

đạt được 50% liều gây độc dẫn tới nôn ở loài khỉ này [100] Bên cạnh đó, khi lợn sữa

sử dụng ống thông cho độc tố SEA vào ruột thì sau 90 đến 180 phút, lợn này xảy ra các triệu chứng như buồn ngủ, bồn chồn, mất tạm thời của các phản xạ thăng bằng, bỏ

ăn và nôn Liều gây nôn 50% là 40-50 μg cho lợn sữa 4,1 đến 9,1 kg và 20 μg cho lợn sữa từ 0,9 đến 2,3 kg [98] Ngoài ra, một loài động vật khác đã được sử dụng để nghiên cứu là chuột chù xạ hương (chuột chù nhà) Sau hai giờ cho chuột uống hoặc tiêm các độc tố ruột vào màng bụng thì chuột có phản ứng nôn [48] Các nghiên cứu của Hu và các cộng sự cho thấy: ruột non là vị trí kích thích nôn khi thí nghiệm với độc tố SEA và dường như liên quan đến hội chứng serotonin (hydroxytryptamine – 5, 5-HT) [49] Serotonin là một chất dẫn truyền thần kinh quan trọng, được tìm thấy trong đường tiêu hóa và có thể kích hoạt tế bào thần kinh ruột, tăng nhu động ruột và tăng sự bài tiết Một nghiên cứu gần đây cho thấy amino acid ở vị trí 227 (Aspartic) của SEA đóng vai trò quan trọng trong hoạt tính gây nôn Khi thay thế Aspartic bởi Alanine ở vị trí này thì SEA bị mất hoạt tính gây nôn [50]

1.2.3.3 Cơ chế gây viêm dạ dày - ruột do độc tố tụ cầu

Lớp tế bào biểu mô đường ruột tạo thành hàng rào bảo vệ cơ thể khỏi sự tác động của một lượng lớn các kháng nguyên từ thức ăn, vi khuẩn và virus Các phản ứng miễn dịch với các SE gây ra viêm dạ dày ruột Điều này dẫn đến sự tăng tính thấm của biểu mô đường ruột và giảm sự biểu hiện của các protein khác Các SE có thể vượt qua hàng rào biểu mô nguyên vẹn, tăng tiếp xúc với các tế bào T Đại thực bào (tế bào trình diện kháng nguyên chuyên biệt) cũng được kích hoạt bởi các SE để giải phóng các yếu tố hoạt hóa bạch cầu trung tính và các cytokine [32, 33]

Đối với các tế bào mô xơ hóa (tế bào trình diện kháng nguyên không chuyên biệt) trên biểu mô ruột, khi chúng được kích hoạt bởi các SE gắn trên MHC – II cũng sản xuất các cytokine tiền viêm như IL-6, IL-8 và TNF-α [85] Nghiên cứu của Victor E.Reyes năm 2010 đã cho rằng SEA có thể vượt qua một lớp đơn của các tế bào biểu

mô đường ruột và liên kết với MHC-II ở trên các mô xơ hóa của biểu mô ruột, sản xuất MCP-1 cùng với các cytokine tiền viêm đề cập ở trên [104] Các kết quả từ nghiên cứu

này cũng cho thấy rằng MCP-1 có thể được tham gia vào hóa hướng của tế bào lympho như minh họa trên Hình 1.6

Hình 1.6 Cơ chế gây viêm dạ dày - ruột do độc tố tụ cầu [104]

Cơ chế gây viêm dạ dày - ruột do độc tố tụ cầu thực hiện thông qua các hiệu ứng siêu kháng nguyên của SE khi chúng gắn trên MHC lớp II được trình diện bởi các

tế bào trình diện kháng nguyên, như các đại thực bào, các tế bào tua (các tế bào trình diện kháng nguyên chuyên biệt), các tế bào mô xơ hóa (tế bào trình diện kháng nguyên không chuyên biệt - myofibroblast) và TCR biểu hiện bởi các tế bào T CD4+ [104] Các SE có thể vượt qua hàng rào biểu mô đường ruột ở dạng nguyên vẹn và liên kết với các phân tử MHC lớp II ở trên myofibroblast Các quá trình này sẽ dẫn đến sự sản xuất mạnh mẽ của các cytokine tiền viêm và chemokine, bao gồm IL - 6, IL - 8 và MCP - 1, làm tăng tính hướng hóa của các tế bào miễn dịch chuyên biệt (CD4 +, tế bào

T, đại thực bào) từ mô bạch huyết ruột – GALT (gut asociated lymphoid tisue) tới các

vị trí viêm dạ dày - ruột (GI) do độc tố tụ cầu Sự tương tác với MHC lớp II của các

SE - TCR có thể gây kích hoạt mạnh đối với các APC và các tế bào T, dẫn đến sự gia

tăng quá mức của các tế bào T và sự giải phóng không kiểm soát các cytokine tiền viêm và các chemokine khác, gây ra viêm và sốc cấp tính [104, 18]

1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN ĐỘC TỐ RUỘT TỤ CẦU

Để phát hiện SE trong thực phẩm, có thể sử dụng phép thử sinh học, phương

pháp sinh học phân tử hoặc các phương pháp miễn dịch

1.3.1 Phép thử sinh học

Nguyên tắc của các phép thử sinh học dựa trên việc phân tích khả năng gây các triệu chứng điển hình như nôn , tiêu chảy trên các động vật thí nghiệm hoặc hoạt động siêu kháng nguyên trong nuôi cấy tế bào Thông thường, các SE sẽ được tách chiết từ thực phẩm bằng các dung dịch đệm thích hợp , trải qua bước tinh chế bằng phương pháp sắc ký, sau đó cho dịch chiết độc tố này vào dạ dày động vật hoặc tiêm vào màng bụng: cho vào dạ dày khỉ bằng đường ống thông , cho chuột chù nhà và mèo uống hoặc tiêm vào màng bụng chúng [48, 100] Tiếp theo, tiến hành theo dõi các triê ̣u chứng lâm sàng của động vật thí nghiệm Nếu thấy xuất hiện các biểu hiện điển hình như tiêu chảy, nôn thì có thể kết luâ ̣n là thực phẩm bi ̣ nhiễm các SE Tuy nhiên, liều lượng SE tối thiểu cần sử dụng trong các phép thử sinh học là khoảng 200 ng [104], cao hơn nhiều so với liều gây ngộ độc thực phẩm ở người (20 – 100ng) [51] Vì vậy, phương pháp phát hiện độc tố tụ cầu bằng phép thử sinh học không đủ nhạy để kiểm nghiệm thực phẩm đảm bảo an toàn cho người tiêu dùng Ngoài ra, vì lý do đạo đức sinh họ c, hiện nay việc sử dụng các động vật để thí nghiệm đang bị hạn chế

1.3.2 Phương pháp sinh học phân tử

Các phương pháp sinh học phân tử thường sử dụng kỹ thuật PCR để phát hiện các gen mã hóa các độc tố SE trong thực phẩm dựa trên các trình tự mồi chuyên biệt cho các gen mã hóa độc tố SE Các phản ứng PCR thường dùng là uniplex và multiplex PCR và gần đây là real-time PCR [25, 12, 110] Các phương pháp này có ưu

điểm là độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao, cho phép phát hiện nhanh Staphylococcus tạo

độc tố với một lượng mẫu nhỏ Hơn nữa, có thể phát hiện được cả những tế bào sinh độc tố đã chết, điều này rất quan trọng trong việc phân tích các mẫu thực phẩm đã xử

lí nhiệt liên quan đến những vụ ngộ độc thực phẩm Tuy nhiên, hạn chế cơ bản của loại phương pháp này là nó chỉ cho biết sự có mặt hay không của các gen mã hóa SE

trong thực phẩm mà không cho biết sự biểu hiện của các gen này

1.3.3 Phương pháp miễn dịch

Hiện nay, phương pháp thường được sử dụng nhất để phát hiện SE trong thực phẩm là các phương pháp miễn dịch , nhờ tương tác đă ̣c hiê ̣u giữa kháng nguyên và kháng thể

1.3.3.1 Phương pháp khuếch tán trên gel (Microslide Double Diffusion )

Phương pháp khuếch tán trên gel dựa vào các tương tác đặc hiệu kháng nguyên

- kháng thể là phương pháp đầu tiên trong phòng thí nghiệm có thể xác định các SE

Từ những năm 1950, các phương pháp khuếch tán trên gel được phát triển như phương pháp khuếch tán trên gel đơn [80], phương pháp ống khuếch tán gel khép [75], phương pháp đĩa [79] và phương pháp khuếch tán trên gel microslide [29] Phương pháp microslide là phương pháp nhạy nhất trong các phương pháp khuếch tán trên gel

Áp dụng kỹ thuật khuếch tán trên gel microslide để phát hiện các SE cần nồng độ độc

tố tối thiểu là 30-60 ng SE trong mỗi gam thực phẩm [90] Do đó, tinh sạch bằng sắc

ký và cô đặc mẫu phân tích được áp dụng để đạt được nồng độ SE có thể phát hiện được bởi kỹ thuật này Phương pháp khuếch tán trên gel được Hiệp hội các nhà phân tích (Asssociation of Analytical Communities - AOAC) coi là tiêu chuẩn cho việc đánh giá các phương pháp mới [90] Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là

ít nhạy khi lượng độc tố cần phát hiện ở mức tối thiểu và đòi hỏi người đọc kết quả phải có kinh nghiệm

1.3.3.2 Phương pháp miễn dịch phóng xạ - RIA (Radio Immunoassay)

Kĩ thuật miễn dịch phát phóng xạ (RIA) là phương pháp đầu tiên có độ nhạy cao (0,6 – 6 ng kháng thể/ml) được sử dụng để phát hiện độc tố trong thực phẩm Trong phương pháp này, độc tố được đánh dấu bằng 125I [91] Dịch chiết thực phẩm được cho vào cùng với kháng thể chuyên biệt trong một ống nhựa nhỏ trước khi thêm độc tố được đánh dấu Sau đó, xác định lượng độc tố trong dịch chiết thực phẩm bằng cách đo tính phóng xạ của chất kết tủa [103, 91] Hiện nay, phương pháp này không còn được sử dụng nữa vì đã có những phương pháp mới hơn không cần dùng những vật liệu có tính phóng xạ

1.3.3.3 Ngưng kết hạt latex (Reversed Passive Latex Aggulutination - RPLA)

Kỹ thuật ngưng kết hạt latex (RPLA) được ứng dụng để phát hiện độc tố trong thực phẩm cũng như phát hiện độc tố trong những dòng tụ cầu Trong kỹ thuật này, hạt nhựa được phủ kháng thể của độc tố trước khi cho vào giếng [87] Dịch chiết

mẫ u thực phẩm được cho vào giếng để tạo phản ứng Nếu có độc tố trong mẫu thì phản ứng giữa độc tố và kháng thể sẽ tạo ra sự ngưng kết, màng được tạo thành dưới đáy giếng, còn nếu không có độc tố thì không xảy ra ngưng kết, do đó phản ứng tạo thành giọt ở đáy giếng Lượng độc tố được xác định nhờ xác định hiệu giá kháng thể cao nhất mà ở đó còn xảy ra phản ứng ngưng kết Kỹ thuật này đủ nhạy để phát hiện độc tố trong hầu hết thực phẩm của các vụ ngộ độc, cũng như trong việc phát hiện

những dòng tụ cầu tạo ra lượng độc tố thấp (10-20 ng/ml) mà phương pháp khuếch

tán trên gel không phát hiện được Bộ kit thương mại SET-RPLA của công ty Denka Seiken, Tokyo, Nhật Bản đang được bán tại Mỹ phát hiện được các SE SEA, SEB, SEC và SED [44]

1.3.3.4 Các phương pháp dựa trên kỹ thuật ELISA

Nguyên lý của phương pháp miễn dịch hấp phụ gắn enzym (ELISA) là dựa trên

sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể vốn được cố định trên một phiến nhựa (giá đỡ pha rắn) và việc sử dụng phản ứng enzym - cơ chất sẽ gây chuyển màu, qua đó để phát hiện sự có mặt của kháng nguyên hoặc kháng thể cần phát hiện

Trên thị trường thế giới hiện nay có nhiều bộ sinh phẩm để phát hiện các SE trong thực phẩm (RIDASCREEN, TECRA, TRANSIA và VIDAS) Nguyên tắc hoạt động của các bộ sinh phẩm này đều dựa trên nguyên lý của kỹ thuật ELISA kẹp đôi Đầu tiên, mô ̣t kháng thể đă ̣c hiê ̣ u nhâ ̣n biết SE sẽ được cố đi ̣nh lên bề mă ̣t của mô ̣t giếng nhựa Sau quá trình rửa để loa ̣i bỏ các kháng thể không được cố đi ̣nh , mẫu phân tích sẽ được đưa vào giếng Nếu như trong mẫu phân tích có SE , khi đó sẽ xảy ra phản ứng giữa SE với kháng thể cố định ở giếng , tạo phức hợp kháng thể cố định - SE Sau quá trình rửa để loại bỏ các liên kết không đặc hiệu , mô ̣t kháng thể thứ hai gắn enzym

và cũng có khả năng nhận biết đặc hiệu SE được đưa vào giếng để ta ̣o ra mô ̣t phức hợp mới kháng thể cố đi ̣nh - SE - kháng thể gắn enzym Tiếp đó, lại thực hiện quá trình rửa

để loại bỏ phân tử kháng thể gắn enzym dư còn sót lại trong giếng Cuối cùng, cơ chất của en zym đươ ̣c đưa vào giếng Dưới tác du ̣ng của enzym , cơ chất sẽ chuyển hóa

thành sản phẩm có màu Như vâ ̣y, dựa vào viê ̣c xuất hiê ̣n màu có thể phát hiê ̣n được

SE trong mẫu phân tích Đối với một số bộ sinh phẩm , cường đô ̣ màu sẽ tỷ lệ thuận với nồng đô ̣ SE trong mẫu phân tích Do vâ ̣y, bằng cách lâ ̣p đường chuẩn , có thể định lươ ̣ng được SE trong thực phẩm Dưới đây là các bộ sinh phẩm thương mại trên thị trường thế giới đang dùng để phát hiện các SE

Bảng 1.4 Các bộ sinh phẩm thương mại được sử dụng để phát hiện các SE [97]

Tên bộ sinh phẩm Nguyên lý phân

tích

Độ nhạy(ng/ml)

Thời gian phân tích (giờ)

Nhà sản xuất

Ridasreen SET A, B, C, D, E3

ELISA kẹp đôi dùng các đĩa vi giếng chuẩn

Transia Tube Staphylococcal

Enterotoxins A, B, C, D, E

ELISA kẹp đôi dùng các ống như pha rắn

Transia Plate Staphylococcal

Enterotoxins A, B, C, D, E

ELISA kẹp đôi trong các đĩa vi giếng chuẩn

từ 0,1-1 ng/ml dịch mẫu phân tích, cho phép phát hiện được SE ở nồng độ rất thấp [60] Tuy nhiên , nhược điểm cơ bản của các bộ sinh phẩm này là cần một máy đọc ELISA chuyên dụng để phân tích kết quả , đồng thời, các bộ sinh phẩm này cũng cần các kỹ thuật viên có tay nghề cao khi sử dụng để tránh hiện tượng dương tính giả nên yêu cầu này hạn chế đáng kể khả năng phân tích tại hiện trường của các bộ sinh phẩm

Để đáp ứng nhu cầu phát hiện các SE trong các thực phẩm tại Việt Nam, đã có một số nghiên cứu chế tạo bộ sinh phẩm phát hiện nhanh SE Dựa trên nguyên tắc của

kỹ thuật ELISA, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Đỗ Phúc đã chế tạo kháng thể đa dòng kháng độc tố SEA từ thỏ và sử dụng kháng thể này để chế tạo bộ sinh phẩm ELISA nhằm phát hiện SEA trong thực phẩm [8] Khi so sánh với bộ sinh phẩm chuẩn của hãng TECRA, quy trình ELISA này cho độ tương đồng về mặt kết quả là 95,5% Năm

2008, Nguyễn Hoàng Minh và nhóm nghiên cứu đã phát triển một bộ sinh phẩm dựa trên kỹ thuật ELISA kẹp đôi để phát hiện SEA trong các sản phẩm thịt và sữa Về độ đặc hiệu, bộ sinh phẩm đã được chứng minh là không có các phản ứng chéo với các loại độc tố khác như SEB, SEC1, SED và SEE Về độ nhạy, bộ sinh phẩm có thể phát hiện được SEA với ngưỡng xác định khoảng 1 ng/ml sữa tiệt trùng, tương đương với các bộ sinh phẩm hiện đang được lưu hành trên thị trường [5] Một ưu điểm nổi bật khác của bộ sinh phẩm này là kết quả có thể được phân tích bằng mắt thường , không cần sử dụng các máy đọc ELISA chuyên dụng , nên có thể được ứng dụng tại hiện trường Năm 2011, các bộ sinh phẩm này đã được sản xuất thử nghiê ̣m ở quy mô phòng thí nghiệm và thử nghiê ̣m liên phòng ta ̣i ba phòng thí nghiê ̣m khác nhau Các kết quả thử nghiê ̣m cho thấy đối với mẫu nem chua , đô ̣ nha ̣y và đô ̣ đă ̣c hiê ̣u tương đối của bộ sinh phẩm đều đạt 100%, trong khi đó với các mẫu sữa tiê ̣t trùng có độ nhạy 100%, còn độ đặc hiệu là 83,3% Các kết quả thử nghiệm bước đầu này cho thấy tính chính xác của bộ sinh phẩm ELISA trong điều kiện phân tích tại hiện trường là phụ thuộc vào kỹ thuật viên và chất nền (sữa hay nem chua)

1.4 KỸ THUẬT SẮC KÝ MIỄN DỊCH VÀ ỨNG DỤNG

1.4.1 Kỹ thuật sắc ký miễn dịch

1.4.1.1 Các hợp phần trong hệ thống sắc ký miễn dịch

Hệ thống sắc ký miễn dịch (HTSKMD) thường có cấu trúc gồm các hợp phần được biểu diễn trong Hình 1.7 dưới đây [88]:

Hình 1.7 Các hợp phần trong hệ thống sắc ký miễn dịch

HTSKMD thiết kế theo kiểu truyền thống bao gồm một số vùng, thường được cấu thành bởi các phân đoạn làm từ các vật liệu khác nhau, gồm có: Điểm tra mẫu (sample pad), miếng giữ kháng thể cộng hợp (conjugate), màng nitrocellulose, giấy thấm (absorbent pad) và tấm lót plastic (Plastic adhesive backing card) Hệ thống này được tạo thành với các thành phần gối lên nhau: điểm tra mẫu được xếp gối lên miếng giữ kháng thể cộng hợp, rồi miếng này được xếp chồng dính với màng nitrocellulose, các hợp phần đó được đặt trên một tấm lót có chứa keo để gắn các hợp phần, chất keo

này nhạy cảm với áp suất

Điểm tra mẫu (Sample pad)

Điểm tra mẫu có chức năng là đưa chất cần phân tích vào hệ thống và lọc mẫu, loại bỏ các chất không tan, chỉ cho các chất hòa tan trong mẫu đi qua và thẩm thấu lên màng chứa chất cộng hợp màu Ngoài ra, điểm tra mẫu ở một số que thử còn chứa các chất như đệm ổn định mẫu, các chất hoạt động bề mặt, loại các muối, các chất có khả năng phong bế nhằm hạn chế sự tương tác không đặc hiệu của điểm tra mẫu hoặc của chất cộng hợp màu với chất cần phân tích Vật liệu làm miếng tra mẫu thường là cellulose, sợi thủy tinh hoặc polyetylen[88]

Miếng giữ kháng thể cộng hợp (conjugate)

Miếng giữ kháng thể cộng hợp là nơi chứa chất chỉ thị để nhận biết kết quả của phản ứng, thường là kháng thể đơn dòng, cộng hợp vàng, cộng hợp nanocarbon, và bảo quản, giải phóng kháng thể cộng hợp có màu khi thực hiện phép phân tích mẫu một cách

có hiệu quả Khi dòng dung dịch mẫu chảy qua, toàn bộ chất trong mẫu và cộng hợp màu đều bị rửa trôi hoàn toàn trên màng nitrocellulose Màng có tính trơ với các hóa chất và không có khả năng liên kết protein Màng chứa chất cộng hợp thường làm từ vật liệu là màng sợi thủy tinh hoặc polystyren không thấm nước

Giấy thấm

Giấy thấm có chức năng hút chất lỏng ra khỏi màng nitrocellulose, tạo dòng thẩm thấu một chiều, không cho dòng quay ngược trở lại, dung dịch đi từ điểm tra mẫu dọc theo chiều dài que thử đi lên phía giấy thấm, với tốc độ dòng thích hợp Dòng thẩm thấu chạy trong que thử chỉ dừng lại khi giấy thấm đã hút đầy dung dịch mẫu Vật liệu dùng làm giấy thấm thường là cellulose, polyester, các loại len, [76, 88]

Tấm lót plastic

Tấm lót plastic có tác dụng như một giá đỡ để dán các hợp phần lên trên, hình thành một tấm hoàn chỉnh có thể cắt thành que thử Nhiệm vụ của tấm lót plastic là để tăng tính bền, dễ thao tác đồng thời đảm bảo sự tiếp xúc chính xác giữa các hợp phần trong HTSKMD nhằm tạo ra dòng chuyển động thích hợp dưới tác dụng của lực mao dẫn Bề mặt tấm lót plastic được phủ một lớp keo rất đặc biệt, mỏng và đều Vật liệu chế tạo tấm lót phải là các vật liệu trơ về mặt hóa học với các hóa chất sử dụng trong que thử, có bản chất là cellulose cứng [88]

thước lỗ, mật độ lỗ, độ dày màng, đặc tính vật lý của màng Do màng nitrocellulose có

ái lực lớn với protein nên trong một số trường hợp phải phong bế màng (blocking trên màng ) để giảm thiểu các liên kết không đặc hiệu của mẫu phân tích và kháng thể cộng hợp đối với vạch thử nghiệm cũng như để giảm thiểu tín hiệu nền trên màng Quá trình phong bế thường được thực hiện bằng cách nhúng màng nitrocellulose vào các dung dịch protein hay các chất có hoạt tính bề mặt như: các loại protein (casein, gelatin, BSA, ) và đường cao phân tử [88]

Các thành phần tham gia

Có 3 loại kháng thể thường được sử dụng trong sắc ký miễn dịch:

- Kháng thể phát hiện hay kháng thể cộng hợp (conjugate antibody): là kháng thể kháng lại với một epitop của kháng nguyên cần phân tích; kháng thể phát hiện thường được gắn với các hạt nano vàng, nano carbon hay hạt cao su có màu Hiện nay, hạt vàng (colloidal gold particle) có màu đỏ hay được sử dụng nhất trong các hệ thống sắc ký miễn dịch [88] Tuy nhiên, giá thành của hạt vàng hiện vẫn rất cao Một giải pháp là có thể sử dụng hạt nano carbon để tạo kháng thể cộng hợp Ưu điểm chính của hạt nano carbon là có giá thành thấp, có màu đen, do vậy tạo tín hiệu có tính tương phản cao với màng nitrocellulose giúp làm tăng độ nhạy của phép phân tích

- Kháng thể vạch thử nghiệm (test line antibody hay capture line antibody): là kháng thể kháng lại một epitop khác của cùng kháng nguyên cần phân tích, được cố định lên màng nitrocellulose Độ nhạy của que thử và độ nét của vạch thử nghiệm phụ thuộc nhiều vào nồng độ, khả năng bắt giữ của kháng thể vạch thử nghiệm Trong trường hợp kháng thể vạch thử nghiệm liên kết với màng không tốt hoặc các liên kết không đặc hiệu trên màng không được phong bế thì vạch thử nghiệm sẽ không nét, bị phân tán

- Kháng thể vạch kiểm chứng (control line antibody): là kháng thể kháng lại kháng thể cộng hợp, có nguồn gốc khác loài với kháng thể cộng hợp Vạch kiểm chứng cho biết hoạt động của que thử bình thường Nếu không xuất hiện vạch kiểm chứng thì điều đó chứng tỏ que thử đã lỗi, kết quả không chính xác, cần phải tiến hành