Khoá luận tốt nghiệp nghiên cứu phản ứng điều chế chitosan khối lượng phân tử thấp

Đe góp phần mở rộng ứng dụng của chitin/chitosan và các dẫn xuất, góp phần bảo vệ môi trường, tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu phản Ú7tg điều chế chỉtosan khối lượng phân

TRƯỜNG ĐẠI HỌC s u PHẠM HÀ NỘI 2

C h u yên n gàn h: H óa côn g n gh ệ m ôi trư ờ n g

Người hướng dẫn khoa học

TS TRẰN THỊ Ý NHI

L Ờ I C Ả M Ơ N

Trước tiên em xin cảm ơn thầy giáo ThS Lê Cao Khải, cùng toàn thể

các thầy cô giáo trong khoa Hóa Học - Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2,

đã tạo điều kiện cho em được tiếp thu những kiến thức chuyên môn về hóa học hữu cơ và công nghệ môi trường

Em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS.Trần Thị Ý Nhi - Viện Hóa Học - Viện Hàn ỉâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam đã tận

tình hướng dẫn và truyền đạt cho em các phương pháp nghiên cứu khoa học

và những kinh nghiệm học thuật quý báu trong quá trình thực hiện khóa luận

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô, các anh chị tại Viện Hóa Học - Viện Hàn lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam đã tận tình giảng dạy, chỉ bảo và dìu dắt em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận

Hà Nội, tháng 05 năm 2015

Sinh viên

Đỉnh Thị Hạnh

DANH MỤC HÌNH

Hình 3.1: Phổ hồng ngoại của (3-chitin 29

Hình 3.2: Phổ hồng ngoại của (3-chitosan 31

Hình 3.3: Giản đồ nhiễu xạ tia X của chitosan 32

Hình 3.4: Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa n / c và nồng độ chitosan 33

Hình 3.5: Phổ FT-IR của P-chitosan theo phương pháp phá kết tinh 33

Hình 3.6: Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa n / c và c 35

Hình 3.7: Phổ FT-IR của chitosan khối lượng phân tử thấp 39

Hình 3.8: Phổ nhiễu xạ tia X của chitosan khối lượng phân tử th ấp 40

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Thành phần chính của một số nguyên liệu chứa chitin 24Bảng 3.1: Hàm lượng P-chitin trong mai mực ố n g 29Bảng 3.2: Ket quả đo áp suất thẩm thấu của chitosan tại các nồng độ

khác n h au 32Bảng 3.3: Kêt quả đo áp suất thẩm thấu của chitosan DA~0 34Bảng 3.4: Kết quả xác định khối lượng phân tử khi sử dụng nồng độ axit

khác nhau 36Bảng 3.5: Ket quả xác định khối lượng phân tử khi phản ứng thực hiện ở

nhiệt độ khác nhau 37Bảng 3.6: Mối quan hệ giữa độ tan và khối lượng phân tử trung bình của

các mẫu L W C 38

DANH MỤC CÁC S ơ ĐỒ

Sơ đồ 1.1: Cấu tạo của Xenluloza, Chitin, Chitosan 3

Sơ đồ 1.2: Điều chế chitosan 9

Sơ đồ 1.3: Quá trình sản xuất chitin/chitosan truyền thống 10

Sơ đồ 1.4: Công thức cấu tạo của chitin/chitosan 10

Sơ dồ 1.5: Phản ứng đeaxetyl hóa chitin .11

Sơ đồ 1.6: Quá trình thủy phân bằng enzym 14

Sơ đồ 1.7: Thủy phân chitosan bang axit HC1 loãng 15

Sơ đồ 1.8: Sơ đồ cơ chế thủy phân axit liên kết glucozit của chitosan Cơ chế được chấp nhận của quá trình thủy phân liên kết glucozit 17

Sơ đồ 1.9: Cơ chế thủy phân liên kết N -axetyl 17

Sơ đồ 1.10: Quy trình điều chế chitosan khối lượng phân tử thấp 27

Sơ đồ 1.11: Phản ứng đeaxetyl hóa chitin 30

BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẤT TRONG KHÓA LUẬN

Ac : C H 3C O

CTS : Chitosan

DDA : Độ đề axetyl hóa

DA : Độ axetyl hóa

DMAc : N,N-đimetyl axetamit

DP : Độ polymer hóa trung bình

GlcN : D-glucosamin

GlcNAc : N-axetyl-D-glucosamin

IR : Hồng ngoại

LAB : Lactic axit bacterial

M n : Khối lượng phân tử trung bình

NMR : Nuclear Magnetic Resonance - Cộng hưởng từ hạt nhânLWC : Chitosan khối lượng phân tử thấp

MỤC LỤC

MỞ ĐÀU 1

1 Lí do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cún 2

3 Nhiệm vụ nghiên cún 2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Giới thiệu chung về chitin/chitosan 3

1.1.1 Cấu trúc tinh th ế 4

1.1.2 Tính ta n 4

1.1.3 Khối lượỉĩg phân tử 5

1.1.4 Độ axetyl hóa - Xác định độ axetyl/đeaxetyl h ó a 6

1.2 Phương pháp điều chế chitin/chitosan 7

1.2.1 Tách chitỉn từ vỏ phế thải thủy hải sản 8

1.2.2 Điều chế chỉtosan 9

1.3 Tính chất hóa học 10

ỉ 3.1 Phản ứng ở nhóm - O H 11

1.3.2 Phản ứng ở nhóm axetamit 11

1.3.3 Phản ứng ở nhóm -N H 2 12

1.3.4 Phản ứìĩg cắt mạch chitosan 12

1.4 Một số ứng dụng của chitin/chitosan và dẫn x u ất 21

1.4.1 ứng dụng trong xử lý nước th ả i 21

1.4.2 ứng dụng trongy dược 23

1.4.3 ứng dụng trong nông nghiệp 23

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 25

2.1 Nguycn liệu, hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghicn cún 25

2.1.1 Nguyên liệu, hóa chất 25

2.1.2 Dụng cụ, thiêt bị nghiên cứu 25

2.2 Thực nghiệm 26

2.2.1 Điều chế Chitin/chitosan 26

2.2.2 Điều chế chitosan khối lưọng phân tử thấp (LWC) 29

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 Điều chế chitin/chitosan 31

3.1.1 Điều chế chitin 31

3.1.2 Điều chế chitosan từ chitin theo phương pháp kiềm đặc kết hợp nhiệt độ cao 32

3.1.3.Điều chế chitosan có DA thấp 35

3.2 Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến phản ứng điều chế chitosan khối lượng phân tử thấp 37

3.2 1 Anh hưởng của nồng độ axỉt HCl đến khối lượng phân tử trung bình ( Mn) sảnphấm phản ứng đềpolyme hoả chitosan 37

3.2.2 Anh hưởng của nhiệt độ đến khối lượng phần tử trung bình ( M n) sản phắm phản ứng đềpoỉyme hoả chitosan 39

3.2.3 Đảnh giả độ tan trong nước của các mâu chỉtosan trọng lượng phân tử thấp 40

3.3 Xác định cấu trúc của chitosan khối lượng phân tủ’ thấp 40

KẾT LUẬN CHUNG 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Chitin [poly-P-(1^4)-2-axetamiđo-2-đeoxy-D-glucopyranozơ], một polysaccarit với hàm lượng đứng hàng thứ hai trong tự nhiên sau xenlulozơ,

là thành phần chính của vỏ các loài động vật giáp xác như: vỏ tôm, mai cua, mai mực

Chitin/chitosan là một polyme có nhiều tính chất đặc biệt: Tính hòa hợp sinh học, phân hủy sinh học, tính kháng khuẩn, kháng nấm, chống độc Do

đó được sử dụng nhiều trong các lĩnh vực y học, dược phẩm, nông nghiệp, mỹ phẩm, công nghệ môi trường Mặc dù vậy khả năng ứng dụng này còn hạn chế bởi chitin rất ít tan trong các dung môi hữu cơ và không tan trong nước do cấu trúc tinh thể chặt chẽ Vì vậy rất nhiều nghiên cứu đã được tiến hành nhằm cải thiện tính tan của chitin/chitosan như kỹ thuật biến tính hóa học, tạo

ra các dẫn xuất tan trong nước với các nhóm chức có tính năng đặc biệt, hay

kỹ thuật đề polyme hóa làm giảm đáng kể trọng lượng của chitosan

Chitin/chitosan oligome (LMC) là sản phẩm thu được trong quá trình phân huỷ hoặc thuỷ phân chitin/chitosan Phân tử chitin/chitosan có độ trùng họp n ~ 20 (n = 20-40) được gọi là chitin/chitosan khối lượng phân tử thấp Ngoài các tính chất chung của chitin/chitosan, chitin/chitosan oligome còn có tính chất đặc biệt là tan trong nước ở dải pH rộng (pH = 5h-8)

Chitin/chitosan khối lượng phân tử thấp (chitooligome) là một vật liệu

có hoạt tính sinh học cao Chúng có khả năng ngăn cản sự phát triển của khối

u, kích thích hệ thống miễn dịch, tăng cường hoạt động của lysozym và có khả năng kháng khuẩn cao hon cả của chitosan Nói chung, chitin/chitosan khối lượng phân tử thấp điều hoà sự lớn lên và phát triến của thực vật bằng chức năng của các gen bảo vệ, vì thế làm tăng các quá trình sinh trưởng phát

triển của cây, đồng thời ngăn cản sự lây nhiễm và phát triển của các loại nấm bệnh, do đó làm tăng năng suất cây trồng.

Việt Nam là một nước có 32000 km bờ biến, với nguồn nguyên liệu thủy hải sản dồi dào, việc phát triển nghiên cứu về chitin/chitosan cũng như các dẫn xuất của nó nhằm mở rộng hơn nữa khả năng ứng dụng của loại vật liệu sinh học này được các nhà khoa học quan tâm nghiên cún

Đe góp phần mở rộng ứng dụng của chitin/chitosan và các dẫn xuất,

góp phần bảo vệ môi trường, tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu

phản Ú7tg điều chế chỉtosan khối lượng phân tử thấp”.

2 Mục đích nghiên cứu

Chế tạo ra được chitosan khối lượng phân tử thấp có khả năng hòa tan trong nước

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Điều chế chitin, chitosan từ mai mực ống;

- Khảo sát các điều kiện phản ứng để điều chế oligochitosan (LMC): ảnh hưởng của nồng độ axit, nhiệt độ phản ứng

- Khảo sát một số tính chất hóa lý của sản phẩm

CHƯƠNG 1: TỎNG QUAN

1.1 Giới thiệu chung về chitin/chitosan [1,2,4,15,21]

Trong số các polysaccarit thì xenlulozo và chitin là nguồn tài nguyên sinh học tự nhiên phong phú nhất Xenlulozo được tổng họp từ thực vật còn chitin được tổng họp chủ yếu từ động vật bậc thấp Chitin có cấu trúc tương

tự như xenlulozo, tên gọi “chitin” xuất phát từ tiếng Hilap “chiton” nghĩa là

vỏ của các loài giáp xác như cua, tôm, mai mực

Chitin được đánh giá là loại vật liệu có tiềm năng lớn nhưng cho đến này việc ứng dụng chitin vẫn chưa được rộng rãi như xenlulozo Chitin không chỉ là nguồn tài nguyên sẵn có mà nó còn là một loại vật liệu chức năng do chitin là một polyme sinh học với nhiều tính chất quý báu như khả năng phân hủy sinh học và đặc biệt là có hoạt tính sinh học

Xenlulozo

Chitin

Chitosan

Sơ đồ 1.1: Cấu tạo của xenlulozo, Chitin, Chitosan

Trong thực tế chitin và chitosan cùng tồn tại trong một phân tử polyme vì vậy khái niệm chitin, chitosan chỉ là tương đối Khi polyme có tỷ

lệ mắt xích ß (l—>4)-D-glucozamin lớn hơn 50% (DDA > 50%) thì được gọi

là chitosan và ngược lại là chitin

1.1.1 Cấu trúc tinh thể [1,2,4,30]

Chitin là một loại polisaccarit mạch thẳng với khối lượng phân tử lớn được tạo bới mắt xích N-axetyl-D-glucozamin theo liên kết ß (l—>4)glucozit như kiểu liên kết các mắt xích D-glucozo ở xenlulozo Bằng phương pháp nhiễu xạ tia X đã phát hiện chitin có 3 kiểu đa hình là: a, ß, y-chitin được mô

tả theo hình sau:

\ s I 1s t / ^ / ^ í \ í \ i \ t \ J^ \ t ế\ t \

a - Chitin ß - Chitin y - Chitin

- a-chitin: cấu trúc tinh thể mạng ghép đôi song song (một mạng lên một mạng xuống liền nhau), a-chitin thường được tách từ vỏ cua

- ß-chitin: các mạch ghép trong tinh thế theo cách ghép song song cùng chiều, ß-chitin chủ yếu có trong mai mực nang sừng

- y-chitin: có mạch ghép trong tinh thể theo 2 cách, cứ 2 mạch song song lại có 1 mạch đối song, y-chitin được tách từ sợi kén của bọ cánh cứng,

dạ dày của mực ống, là loại có trữ lượng ít nhất

1.1.2 Tính tan [21,27]

Chitin thể hiện ái lực hạn chế với phần lớn các dung môi vì có liên kết hidro chặt chẽ giữa các phân tử Chitin thường (a-chitin) không tan và hầu

như không trương trong dung môi thông dụng mà chỉ tan trong một số dung môi đặc biệt, ví dụ: N,N-dimetylaxetamit (DMAC) có chứa 5-10% LiCl.

Chitosan là một polyamin không tan trong nước cũng như trong dung môi hữu cơ nhưng tan trong môi trường axit loãng Độ tan của chitosan phụ thuộc vào độ axetyl hóa, loại axit và nồng độ axit trong dung dịch Khi xử lý chitin/chitosan trong môi trường axit mạnh với nồng độ lớn thường xảy ra phản ứng depolyme hóa (cắt mạch) làm giảm khối lượng phân tử polyme

1.1.3 Khối lượng phần tử [21]

Khối lượng phân tử chitin/chitosan là thông số quan trọng nhưng khó

có thể xác định được chính xác do tính tan kém của chúng và sự đa dạng về kiểu phân bố các nhóm axetyl cũng như mức độ axetyl hóa Độ dài mạch chính của chitin/chitosan có thể giảm trong quá trình xử lý với axit và kiềm Khối lượng phân tử chitin sau khi tách khỏi protein cũng như các chất khác được tính toán theo các phương pháp đo độ nhớt, sắc ký thẩm thấu gel (GPC- Gel Permeation Chromatography) hoặc sắc ký loại trù’ theo độ lớn phân tử (SEC -Size Exclusion Chromatography) trong dung môi DMAc/LiCl Ket họp các phương pháp SEC, tán xạ ánh sáng và đo độ nhớt thì có thể xác định được chính xác khối lượng phân tử trung bình và độ phân bố của khối lượng phân tử Từ các số liệu thu được từ phương pháp GPC đã khẳng định các mẫu chitin tách từ mai cua, vỏ tôm và mai mực ống có độ polyme hóa (degree of polymeizaion - DP) nằm trong khoảng 2000 - 4000 Chitosan tan được trong dung dịch axit loãng và khối lượng phân tử có thể xác định theo phương pháp sắc ký lỏng cao áp ghép nối với cột loại trừ theo độ lớn phân tử (SE-HPLC- size exlusion high performance liquid chromatography) GPC-HPLC, GPC, phương pháp đo độ nhớt cũng có thể chuyển hóa chitosan thành chitin qua phản ứng N-axetyl hóa và khối lượng phân từ được tính theo phương pháp GPC trong hệ dung môi DMAc/LiCl Trong đó phương pháp đơn giản nhất để

xác định khối lượng phân tử polyme là xác định theo phương pháp gián tiếp qua phép đo độ nhớt Phép đo độ nhớt không phải là phương pháp tuyệt đối để xác định khối lượng phân tử mà chỉ là phương pháp tương đối dựa trên cơ sở

độ nhớt của dung dịch polyme tăng tỉ lệ với số lượng các phân tử thêm vào.Phương pháp đo áp suất thẩm thấu là phương pháp dựa trên định luật Vant-Hoff Theo định luật này, sự phụ thuộc giữa áp suất thấm thấu p, thế tích V và nhiệt độ tuyệt đối T và số gam phân tử của vật chất trong dung dịch pha loãng được biểu diễn bằng phương trình trùng với dạng phương trình của dạng khí lí tưởng:

PV = nRT = (g/M)RT

p = (g/V)(RT)/M ->M = (RTC)/PTrong đó:

g: khối lượng của chất hòa tan (g)

M: khối lượng phân tử của chất (g/mol)

C: nồng độ của dung dịch

R: hằng số

T: nhiệt độ tuyệt đối

1.1.4 Độ axetyl hóa - Xác định độ axetyl/đeaxetyl hóa [9,15,18]

Độ axetyl hóa là hàm lượng nhóm (-N H C O C H 3) còn độ đeaxetyl hóa là hàm lượng nhóm (-NH2) trong chitin và chitosan Mắt xích cơ sở của chitin là N-axetyl-D-glucosamin (GlcNAc) Mặc dù hầu hết các nhóm amino gắn với

c 2 đã bị axetyl hóa, nhưng trong tự nhiên chitin vẫn tồn tại một số nhóm amino tự do Hơn nữa, phản ứng đeaxetyl hóa chitin còn xảy ra trong quá trình tách loại protein bằng kiềm Vì vậy, các mẫu chitin trên thực tế có DDA khác nhau (khoảng 5 - 15%) phụ thuộc vào nguồn gốc và cách điều chế chúng Để thu được chitin có cấu trúc thuần nhất (chỉ gồm các mắt xích GlcNAc) thì phải tiến hành N-axetyl hóa chọn lọc các nhóm amino tự do Khi

chitin bị đeaxetyl hóa đáng kể thì trở nên tan trong dung dịch axit axetic loãng

và được gọi là chitosan

Trong đó, DDA = 100-DA Đối với chitin thì DA > DDA, đối với chitosan thì DA < DDA Khi DA = DDA thì có chitin tan trong nước

Tính chất của chitin cũng như chitosan phụ thuộc rất nhiều vào độ đeaxetyl hóa (DDA) - một thông số quan trọng nhất để chỉ ra là chitin hay chitosan Vì vậy, việc tìm ra phương pháp xác định DDA (hay DA) một cách chính xác và đơn giản là vấn đề rất quan trọng và cần thiết Có rất nhiều phương pháp đã được áp dụng để xác định DDA của chitin/chitosan như: phân tích nguyên tố, các phương pháp phổ như phổ hồng ngoại (IR), phổ tử ngoại (ƯV), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NRM): 'H-NRM, l3C-NRM, và

l5N-NRM ở trạng thái rắn, cho phép đo lưỡng sắc cầu, phổ khối, chuẩn độ điện thế, chuẩn độ nitrat (phương pháp chuẩn độ sử dụng bạc nitrat), chuẩn độ với axit picric, chuẩn độ độ dẫn, sắc ký lỏng cao áp, sắc ký khí - lỏng, sắc ký thẩm thấu gel, nhiệt phân - sắc ký khí, sắc ký khí

Trong các phương pháp xác định DA đã được áp dụng thì phổ IR là phương pháp thuận tiện đặc biệt trong trường họp mẫu ở trạng thái rắn, không hòa tan trong các dung môi Đối với chitosan (tan trong môi trường axit loãng) thì phổ 'H-NRM là phương pháp nhanh, chính xác và có độ nhạy cao

Đo trong dung môi D20 , C D 3C O O D /D 2O hoặc DCI/D2O

1.2 Phưoiig pháp điều chế chitin/chitosan [8,18]

Chitin có ở nhiều loài khác nhau, từ các loài nấm đến các động vật bậc thấp Vỏ của các loài động vật chân đốt là nguồn nguyên liệu chính để điều

chế chitin, trong thành phần của vỏ các loài động vật này có chứa 20 - 50% chitin tính theo khối lượng khô v ỏ tôm, mai cua là nguồn nguyên liệu phế thải từ công nghiệp chế biến thủy sản, hải sản được sử dụng đế sản xuất chitin thương mại Các nguồn nguyên liệu khác để sản xuất chitin là: mai mực, sâu

bọ, tảo, nấm Thành tế bào một số loại nấm chứa cả chitin cũng như chitosan và được coi là nguồn chitosan tự nhiên Chitosan được điều chế bằng cách thực hiện phản ứng deaxetyl hóa chitin trong môi trường kiềm

1.2.1 Tách chitin từ vỏ phế thải thủy hải sản [1,4,18,19]

Nguyên tắc chung để điều chế chitin là loại bỏ muối khoáng (chủ yếu là canxicacbonat), protein và các chất màu khỏi phế liệu thủy, hải sản Hai phương pháp chủ yếu được áp dụng để tách chitin/chitosan là phương pháp hóa học và phương pháp lên men vi sinh vật

Theo phương pháp hóa học: Quá trình điều chế chitin được thực hiện

theo các bước: tách khoáng - tách protein - khử màu Muối khoáng thường được tách ra bằng cách xử lý nguyên liệu với dung dịch axit HC1, protein bị thủy phân trong môi trường kiềm, chất màu được loại bỏ bằng dung môi hoặc tác nhân oxi hóa Trong quá trình xử lý, một số nhóm axetamit trong các mạch đại phân tử chitin bị thay thế bởi nhóm amino do phản ứng deaxetyl hóa

Điều chế chitin theo phương pháp hóa học có một số mặt hạn chế như phải sử dụng một lượng lớn kiềm, axit, nước rửa do đó chi phí lớn và gây ô nhiễm môi trường Việc sử dụng axit và kiềm nóng dẫn đến việc cắt giảm mạch chitin tạo ra nhiều sản phẩm khác nhau

Theo phương pháp x ử lý vi sinh vật: Protein được tách khỏi vỏ các

loài giáp xác bằng cách xử lý với enzim hay vi sinh vật theo nguyên tắc: vi khuẩn sinh ra lactic (LAB: lactic acid bacterial) tự có trong phủ tạng của vỏ phế thải (vỏ tôm, cua, mai m ực ) với một lượng rất nhỏ cùng với nguồn LAB thuần chủng được bổ sung có tác dụng bảo quản và thủy phân phế

thải.Hỗn họp lên men bao gồm: vỏ phế thải, LAB, dung dịch glucozo Trong quá trình lên men, LAB sản sinh ra axit lactic làm giảm pH của môi trường, tạo điều kiện cho quá trình thủy phân protein, thủy phân khoáng tạo thành các lactat canxi, magie là các muối tan được trong nước Bằng phương pháp ly tâm, phần dung dịch lỏng chứa protein và các muối khoáng hòa tan được loại

bỏ thu được phần chitin không hòa tan Đe có chitin sạch, có thể xử lý tiếp bằng dung dịch axit và kiềm loãng

Phương pháp điều chế chitin bằng phương pháp lên men vi sinh vật có một số ưu điểm như chi phí thấp, cấu trúc sản phấm không bị thay đổi nhiều

và đặc biệt là ít gây ô nhiễm môi trường

(3-chitin được sản xuất chủ yếu từ mai mực ống theo cách đơn giản hơn

vì thành phần của mai mực ống chủ yếu là chitin, hàm lượng protein và muối khoáng thường rất thấp Hơn nữa, do sự sắp xếp các mạch đại phân tử trong

p-chitin khác hẳn với a-chitin nên a-chitin có cấc liên kết hidro chặt chẽ hơn,

vì vậy khi xử lý mai mực ống với axit và kiềm thường ở điều kiện êm dịu hơnnhiều so với xử lý vỏ tôm để thu được P-chitin

1.2.2 Điều chế chitosan [1,2,4,19]

Chitosan là sản phẩm deaxetyl hóa của chitin Chitosan thương mại có nhiều loại với độ deaxetyl hóa khác nhau nhung thường được điều chế bằng cách deaxetyl hóa chitin trong môi trường kiềm nồng độ 40 - 50% ở 100 -

130°c trong 24 giờ Phản ứng deaxetyl hóa xảy ra như sau:

Chitosan thu được theo phương pháp này có DDA lên tới 90%

Đe thu được chitosan có độ deaxetyl hóa cao hơn phải tiến hành phản ứng lặp đi lặp lại nhiều lần Phản ứng deaxetyl hóa ß-chitin diễn ra dễ dàng hơn nhiều so với a-chitin: Từ các mẫu a-chitin, ß-chitin có DDA tương đương nhau tiến hành phản ứng deaxetyl hóa trong NaOH 30% ở 100°c với thời gian như nhau (2 giờ) thu được ß-chitosan với DDA ~ 70% trong khi đó đối với a-chitin giá trị đó là -20% Tuy nhiên khi sử dụng dung dịch kiềm đặc thì bên cạnh phản ứng deaxetyl hóa còn xảy ra phản ứng thủy phân mạch chitin/chitosan làm giảm đáng kể khối lượng phân tử của chitin/chitosan.

Ta có thể mô tả quá trình điều chế chitosan từ vỏ mai mực ống qua

sơ đồ 1.3:

Vỏ phế thải thủy hải sản

ịXay nghiền ịKhử khoáng bằng axit loãng (axit HC1)

ịTách loại protein bằng kiềm loãng (NaOH loãng)

ịChitinịDeaxetyl hóa (bằng NaOH 50%, trong vòng 2h ở 100°C)

ịChitosan

S ơ đo 1.3: Quá trình sản xuất chitin/chitosan truyền thong

1.3 Tính chất hóa học [1,2,5]

Công thức tổng quát của chitin là: (CgH^NOs),!

>OH ,OH

^ 0

NHAc

S ơ đồ 1.4: Công thức cấu tạo của chitin/chitosan

Ta thấy trong mỗi mắt xích của chitin/chitosan vừa có nhóm chức (-OH) vừa có nhóm chức amin (-NHCOCH3/NH2) nên có ba trung tâm phản ứng chính, vì vậy nó vừa có tính chất của ancol lại vừa có tính chất của amin

1.3.1 Phản ứng ở nhóm -O H

Phản ứng với axit, anhidric axetic hay HC1 thu được sản phẩm ở dạngeste

[Chit(OH)2]n + 2nHCl [C hit(O C l)2]n + 2nH20 Phản ứng với ankyl sunfat trong ankyl halogenua thu được các este.Phản ứng với các họp chất vinyl tạo este

Trong mỗi mắt xích của chitin có 2 nhóm (-OH) ở C3 và c 6, đều có khả

năng tham gia phản ứng Do cấu trúc phân tử, nhóm (-OH) bậc 2 ở C3 bị ánngữ không gian nên phản ứng kém hơn nhóm (-OH) bậc 1 ở c 6

Phản ứng trên thường được thực hiện với NaOH 40% ở 120 °c trong 1—>3h Hiệu suất đeaxetyl hóa chỉ đạt 70% Điều này có nghĩa là sản phẩm phản ứng là chuỗi polyme vẫn có cả mắt xích N-axetyl-D-glucozamin đan xen với p (1—>4) glucozamin.

Đẻ đánh giá mức độ đeaxetyl hóa của chitin người ta đưa ra khái niệm

độ đeaxetyl hóa (DDA) được tính theo công thức sau:

có khả năng phản ứng cao với các tác nhân ái lực electron để tạo ra các dẫn xuất tương ứng

Phản úng gắn với các nhóm -O H tại C3 (hoặc c 6) hay gắn polietylenglycol vào nhóm -N H2 thu được các dẫn xuất có cấu trúc hóa học cồng kềnh nhằm cản trở không gian, làm giảm các liên kết cầu hidro giữa các mạch và trong mạch phân tử của chitin/chitosan như lúc ban đầu, để tạo ra các dẫn xuất tan trong nước

1.3.4 Phản ửng cắt mạch chitosan

Do quá trình chuyển hóa trong động thực vật chủ yếu xảy ra trong môi trường nước nên chitosan với khả năng tan kém trong nước đã làm hạn chế

phần nào hiệu quả và phạm vi ứng dụng Vì vậy, để tăng khả năng ứng dụng của chitosan chúng ta phải cải thiện khả năng tan trong nước của chitosan.Hiện nay, trên thế giới, các nhà khoa học đã nghiên cún và tìm ra rất nhiều phương pháp để cải thiện khả năng tan trong nước của chitosan, trong

đó phương pháp đề polyme hóa được coi là phương pháp đơn giản và hiệu quả nhất

Quá trình depolyme hóa là quá trình phả hủy các liên kết glucozit trong mạch đại phân tử dưới các tác nhân cắt mạch như: enzym, hóa chất chiếu xạ Các tác nhân cắt mạch phá hủy liên kết glucozit, chuyển hóa chitosan thành oligome có khả năng tan trong nước cao hơn so với chitosan đại phân tử

Có nhiều phương pháp cắt mạch chitosan như: cắt mạch bằng enzym, cắt mạch bằng chiếu xạ, cắt mạch bằng phản ứng hóa học Trong đó cắt mạch bằng phản ứng hóa học là phương pháp đơn giản và được sử dụng rộng rãi nhất

1.3.4.1 Phương pháp chiếu xạ

Quy trình chiếu xạ để thủy phân chitosan:

Chitosan bột, đóng gói bằng polyetylen, được chiếu xạ với nguồn tia y

Co60(coban), tốc độ chiếu 1,4 kGy.h'1, liều chiếu xạ từ 10-500 kGy Chitosan sau khi chiếu xạ được làm trương nở trong nước (lOOg chitosan/1 lít H20 ) trong 30 phút Sau đó cho thêm axit axetic IN, khuấy trong 4 giờ cho tan hoàn toàn Tiến hành trung hòa bằng 0,5M natribicacbonat, pH của dung dịch

là 6 Dùng H202 để khử màu của sản phẩm và các sản phẩm khác trong quá trình chiếu xạ Tiến hành phân tách: Ket tủa bằng dung dịch etanol, sau đó lọc thu được hai dạng sản phẩm, phần kết tủa, phần nước lọc Phần kết tủa được rửa bằng MeOH và làm khô.Phần nước trong được cô đặc lại, kết tủa và đem

lọc thu hồi sản phẩm.Tiến hành đo độ nhớt (r|) đồng thời xác định khối lượngphân tử trung bình ( A / „) của sản phẩm Cơ chế của quá trình chiếu xạ:

R - H ^ > R ’(Ct +Ct )+ H ’

R - H + H ' ->R'(C , +C6)+ H 2

r -( c ^ c 4) ^ f ; + f 2

R - NH2 + / / • - > R '(C 2)+ NH 3

Trong đó R-H và R-NH2 là các phân tử chitosan có khối lượng phân tử

lớn, R*{c„) là gốc chitosan khối lượng phân tử lớn nằm trong nguyên tử

cacbon c n, F*,F2 là phần của chuỗi chính Sau khi bị bẻ gãy, độ nhạy chiếu

xạ của phân tử polyme cho trước có thể được đánh giá từ hiệu suất depolyme chiếu xạ của nó

Phương trình của Charlesby Pnner:

y M n M noJ

= G ứfx1,04x10'7 x Đ

Trong đó Mn là khối lượng phân tử trung bình số của chitosan ở liều lượng hấp thụ được; D và Mno là khối lượng phân tử trung bình số của chitosan ban đầu Ket quả thu được cho thấy chitosan 8B (DDA=99%) thì nhạy cảm hơn phương trình chiếu xạ so với 10B (DDA=90%)

Ưu điểm của phương pháp là không có dư lượng hóa chất nên có độ tinh khiết cao Nhược điểm là yêu cầu có thiết bị đặc biệt, hiệu quả cắt mạch kém hơn so với phương pháp hóa học Phương pháp chiếu xạ phù họp cho sự phân hủy các loại polyme khác nhau

1.3.4.2 Phương pháp thủy phân bang enzym

Sơ đồ tổng quát quá trình thủy phân bằng enzym:

R = N H C O C H 3; N H 2

S ơ đồ 1.6: Quá trình thủy phân bang enzym

Có tới hơn 30 loại enzym có thế sử dụng được để phân hủy chitin/chitosan: chitosanaza, aminaza, hemicellulaza, cellulaza, papain,

lysozyme, pepsin Trong dó pepsin, papain, pectinaza, có tác nhân lytic tot

hon các loại enzym khác và hiệu quả cắt mạch polyme cao nhất là sử dụng

pectinaza Phương pháp thủy phân bang enzym cho phép thu được sản phẩm

có dư ít lượng hóa chất, nên rất phù hợp với mục đích sử dụng trong y học Tuy nhiên vấn đề mở rộng quy trình sản xuất còn có nhiều khó khăn Trong

số các loại enzym được sử dụng loại hemicellulaza có giá thành 1'ẻ hơn cả

Quá trình thủy phân bang enzym: Chitosan được hòa tan trong dung

dịch axit axetic 1% -ỉ- 2% khuấy sau 3 giờ, điều chỉnh pH= 5,5 Đe qua đêm,

sau đó đặt vào bể ổn nhiệt (50°c với hemixenlluloza) hay tủ ấm (37°c với

pectinaza) Cho dung dịch enzym vào, lượng enzym được tính theo lượng chất

tan (chitosan) Dừng phản ứng cắt mạch sau 3^-30 giờ (tùy từng loại enzym) bằng cách đun sôi dung dịch phản ứng trong 10 phút để tách bỏ enzym Tiến

hành lọc, dung dịch sau khi lọc được trung hòa bằng NaOH10%, pH đạt giá trị pH=9 Tiến hành ly tâm thu được phần kết tủa, rủa sản phẩm kết tủa bằng etanol nhiều lần Sản phẩm lại được tách bằng sắc ký lỏng cao áp HPLC để phân đoạn

Quá trình thủy phân khi có mặt pectinaza (chiết từ nấm cúc màu nâu

sẫm) ở pH=3, nhiệt độ 37°c làm cho độ nhớt của dung dich giảm nhanh Oligome thu được trong quá trình này có khối lượng phân tử dao động trong

khoảng 20,000-ỉ-5000 Da Chitosan khối lượng phân tử thấp có độ kết tinh cao hơn và đa dạng hình hơn chitosan.

Sơ đồ 1.7: Thủy phân chỉtosan bằng axit HCl loãng

Một số tác giả thủy phân chitosan bằng cách hòa tan chitosan trong axit HC1 (0,5%) với nồng độ polyme 1%H- 1,5% khuấy ở 65°C-ỉ-100oC trong 3 giờ Sau đó để nguội đến nhiệt độ thường Dùng NaOH để trung hòa (đến pH~8) Tiến hành lọc, phần kết tủa được rủa nhiều lần bằng etanol, sau đó làm khô bằng axeton Phần nước trong được tách muối bằng MeOH, sau đó cô đặc lại

và kết tủa trong etanol để thu phần sản phẩm tan trong nước Các nghiên cún cho thấy độ polyme hóa DP phụ thuộc vào nồng độ axit HC1 Khi dùng axit HC1 đặc nóng thu được sản phẩm có DP =2-r5, khi dùng axit HC1 loãng (0,5%) thu được sản phẩm có D P -3 0

Các loại axit vô cơ đã được sử dụng như: Axit clohydric (HC1), axit sunfuric (H2SO4), axit photphoric (H3PO 4), axit nitric (HNO3) Trong đó axit clohydric được nghiên cún nhiều hơn cả Do giá thành HC1 và khi trung hòa bằng NaOH, sản phẩm phụ là NaCl không độc, dễ tách

Ưu điểm của phương pháp là: Phản ứng cắt mạch xảy ra mạnh nhanh, nhưng các bước tách sản phẩm và dư lượng hoá chất thường khó triệt để

Sự thủy phân của liên kết glucozit (depolyme hóa) và liên kết N-axetyl của chitosan được nghiên cứu trong HC1 đặc, HC1 loãng Các kết quả nghiên cứu cho thấy, tốc độ thủy phân của kiên kết glucozit tương đương với tốc độ

đề N-axetyl hóa trong axit loãng Trong khi đó thì liên kết glycozit được thủy phân nhanh hơn 10 lần so với liên kết N-axetyl trong HC1 đặc Điều này có thể giải thích bằng cách giả sử rằng, quá trình thủy phân của liên kết N-axetyl

là phản ứng Sn2, trong khi thủy phân của liên kết glucozit là phản ứng SN1, với bước làm giảm vận tốc là sự hình thành cacbocation

Toe do toi han

So’ do 1.9: Ca che thuy phdn lien ket N-axetyl (phdn ung S/^2)

Tren day la sa do mo ta co che thuy phan lien ket N-axetyl va lien ket glucozit cua chitosan bang axit

- Thuy phan lien ket N-axetyl (phan ung SN2)

- Thuy phan lien ket glucozit (phan ung SN1)