Nghiên cứu thu hồi hỗn hợp caroten protein từ đầu tôm bằng phương pháp kết hợp acid lactic và flavourzyme

----o0o---- HUỲNH THỊ LOAN NGHIÊN CỨU THU HỒI HỖN HỢP CAROTEN-PROTEIN TỪ ĐẦU TÔM BẰNG PHƯƠNG PHÁP KẾT HỢP ACID LACTIC VÀ FLAVOURZYME ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ T

o0o

HUỲNH THỊ LOAN

NGHIÊN CỨU THU HỒI HỖN HỢP CAROTEN-PROTEIN

TỪ ĐẦU TÔM BẰNG PHƯƠNG PHÁP KẾT HỢP ACID

LACTIC VÀ FLAVOURZYME

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Nha Trang, tháng 07 năm 2015

o0o

HUỲNH THỊ LOAN

NGHIÊN CỨU THU HỒI HỖN HỢP CAROTEN-PROTEIN

TỪ ĐẦU TÔM BẰNG PHƯƠNG PHÁP KẾT HỢP ACID

LACTIC VÀ FLAVOURZYME

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

GVHD: ThS PHẠM THỊ ĐAN PHƯỢNG

Nha Trang, tháng 07 năm 2015

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và nghiên cứu để thực hiện đề tài tốt nghiệp, tôi đã nhận được sự quan tâm tận tình của quý thầy cô hướng dẫn khoa học, Khoa công nghệ Thực phẩm và các cá nhân trong trường Đại học Nha Trang đã giúp tôi hoàn thành báo cáo này

Tôi xin chân thành gởi lời cảm ơn sâu sắc tới giáo viên hướng dẫn Ths Phạm Thị Đan Phượng, PCS- TS Trang Sĩ Trung đã hết lòng chỉ bảo, tạo điều kiện, hỗ trợ kinh phí thuộc đề tài Nghị định thư Việt- Đức: ˝Nghiên cứu sản xuất các sản phẩm giá trị gia tăng từ phế liệu tôm để ứng dụng trong nông nghiệp˝ và hướng dẫn tận tình, thường xuyên theo dõi quá trình thực hiện đề tài

Cảm ơn sự giúp đỡ của ThS Nguyễn Công Minh, ThS Nguyễn Thị Như Thường đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu

Xin chân thành cám ơn Ban Giám hiệu, Khoa Công nghệ Thực phẩm Trường Đại học Nha Trang đã tạo điều kiện cho tôi thuận lợi trong quá trình học tập, nghiên cứu đề tài

Xin chân thành cảm ơn gia đình, tất cả bạn bè đã bên cạnh ủng hộ tôi trong suốt quá trình làm đề tài

Trong quá trình nghiên cứu và tiến hành thực hiện đề tài cũng như quá trình hoàn thành báo cáo thì do kinh nghiệm thực tiễn, vốn kiến thức khoa học chưa sâu nên khả năng lập luận còn nhiều thiếu sót Mong thầy cô và các bạn đóng góp ý kiến để bài báo cáo được hoàn thiện

Nha trang, tháng 6 năm 2015 Sinh viên thực hiện

Huỳnh Thị Loan

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC BẢNG iv

DANH MỤC HÌNH v

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 4

1.1 Các nghiên cứu trong nước liên quan đến đề tài 4

1.2 Các nghiên cứu ngoài nước liên quan đến đề tài 5

1.3 Tổng quan về phế liệu 6

1.3.1 Giới thiệu chung về phế liệu tôm 6

1.3.2 Thành phần tính chất của phế liệu tôm 6

1.4 Tìm hiểu về caroten-protein 9

1.4.1 Bản chất của caroten-protein 9

1.4.2 Carotenoid 10

1.4.3 Ứng dụng của caroten-protein 12

1.5 Các tác nhân thủy phân hỗn hợp caroten-protein 15

1.5.1 Acid lactic 15

1.5.2 Flavourzyme 16

1.6 Phương pháp thu hồi caroten-protein 17

1.6.1 Phương pháp thu hồi bằng pH đẳng điện (pI) 17

1.6.2 Phương pháp thu hồi bằng xử lý nhiệt 17

1.6.3 Phương pháp thu hồi bằng polymer (chitosan) 18

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Đối tượng 19

2.1.1 Đầu tôm thẻ chân trắng 19

2.1.2 Các hóa chất, máy móc và dụng cụ sử dụng phân tích trong đề tài 20

2.2 Phương pháp nghiên cứu 20

2.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 20

2.2.2 Xác định nồng độ acid lactic 22

2.2.3 Xác định thời gian xử lý acid lactic 23

2.2.4 Xác định tỷ lệ Flavourzyme/đầu tôm 24

2.2.5 Xác định thời gian xử lý Flavourzyme 26

2.3 Các phương pháp phân tích và kiểm tra 28

2.4 Phương pháp phân tích số liệu 28

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Thành phần hóa học cơ bản của nguyên liệu đầu tôm 29

3.2 Điều kiện xử lý đầu tôm thích hợp bằng phương pháp kết hợp acid lactic và Flavourzyme để thu nhân hỗn hợp caroten-protein 30

3.2.1 Điều kiện thủy phân thích hợp của acid lacic trong công đoạn đầu của quá trình thu nhận hỗn hợp caroten-protein từ đầu tôm 30

3.2.2 Điều kiện thủy phân thích hợp của Flavourzyme trong công đoạn sau của quá trình thu nhận hỗn hợp caroten-protein từ đầu tôm 34

3.2.3 Đánh giá hiệu suất thu hồi và hàm lượng astaxanthin của hỗn hợp caroten-protein từ đầu tôm bằng phương pháp kết hợp acid lactic với Flavourzyme 39

3.3 Thành phần hóa học của hỗn hợp caroten-protein 39

3.4 Đề xuất quy trình thu nhận hỗn hợp caroten-protein bằng phương pháp kết hợp acid lactic và Flavourzyme 40

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO 43

PHỤ LỤC 47

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần hóa học cơ bản của đầu tôm thẻ chân trắng 8 Bảng 1.2 Các ứng dụng chính của hỗn hợp protein và carotenoid 14 Bảng 3.1 Thành phần hóa học cơ bản của đầu tôm thẻ chân trắng 29 Bảng 3.2 Đánh giá cảm quan của hỗn hợp caroten-protein thu nhận từ đầu tôm 39

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Các liên kết hóa học của astaxanthin trong tôm 9

Hình 1.2 Cấu tạo của astaxanthin 11

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của một số astaxanthin 12

Hình 2.1 Đầu tôm thẻ chân trắng 19

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 20

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ acid lactic 22

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian xử lý acid lactic 24

Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ Flavourzyme/đầu tôm 25

Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian xử lý Flavourzyme 27

Hình 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ acid lactic sử dụng đến hiệu suất thu hồi và hàm lượng astaxanthin của hỗn hợp caroten-protein từ đầu tôm 31

Hình 3.2 Ảnh hưởng của thời gian xử lý bằng acid lactic đến hiệu suất thu hồi và hàm lượng astaxanthin của chế phẩm caroten-protein từ đầu tôm 33

Hình 3.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ Flavourzyme sử dụng đến hiệu suất thu hồi và hàm lượng astaxanthin trong hỗn hợp caroten-protein từ đầu tôm 35

Hình 3.4 Ảnh hưởng của thời gian xử lý bằng Flavourzyme đến hiệu suất thu hồi và hàm lượng astaxanthin của hỗn hợp caroten- protein từ đầu tôm 37

Hình 3.5 Mẫu tách astaxanthin sau khi cô quay 38

Hình 3.6 Quy trình thu nhận hỗn hợp caroten-protein 40

Hình 3.7 Hỗn hợp caroten-protein tối ưu 41

Hình 3.8 Mẫu đối chứng 41

MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của đề tài:

Trong thời gian gần đây ngành công nghệ thực phẩm đang được mọi người quan tâm, đặc biệt là chế biến thủy sản là ngành mũi nhọn của nước ta Công nghiệp chế biến tôm ở Việt Nam đang phát triển mạnh đã đem lại nguồn ngoại tệ quan trọng, mặt khác cũng tạo ra một lượng phế liệu tôm rất lớn, ước khoảng 200 000 tấn/năm trong đó có khoảng 120 000 tấn đầu tôm [4] Mặt khác trong thành phần phế liệu tôm có nhiều thành phần có giá trị như chitin, protein, carotenoid, khoáng chất, vì vậy, việc tận thu các phế thải, phế liệu từ các nhà máy thủy sản để sản xuất ra các sản phẩm phụ có giá trị sử dụng cao hơn, góp phần tạo ra giá trị kinh tế cho doanh nghiệp, đất nước, đồng thời giảm thiểu ô nhiễm môi trường là điều thiết yếu Đặc biệt protein chiếm khoảng 50% trong đầu tôm và có một lượng nhỏ carotenoid mang tính chất chức năng rất quan trọng không nên lãng phí được thu hồi ở dạng carotenoprotein [10] Cho nên trong quá trình sản xuất chitin, chitosan cần chú ý quan tâm đến chất lượng carotenoid

Hiện nay đa số các cơ sở sản xuất chitin-chitosan đều sử dụng công nghệ chế biến hóa học, sử dụng nhiều hóa chất và chưa có một hệ thống xử lý nước thải đạt tiêu chuẩn, dẫn đến nhiều cơ sở sản xuất gây ô nhiễm ngày càng trầm trọng bên cạnh đó chất lượng sản phẩm thu được có chất lượng không cao, đặc biệt là hỗn hợp caroten-protein dễ bị oxi hóa có mùi hôi, có chất lượng thấp chỉ có thể sử dụng trong sản xuất thức ăn gia súc hay động vật thủy sản Hầu hết các nghiên cứu sử dụng một hoặc kết hợp hai loại enzyme trong quá trình thủy phân nhưng vẫn có nhiều nhược điểm khác nhau Khi ủ xilô bằng acid thì thời gian thủy phân kéo dài nên sản phẩm thu được có mùi ít thơm và có màu sậm Khi sử dụng một Alcalase thì hiệu suất thu hồi cao hơn Flavourzyme nhưng cho vị đắng, màu sậm hơn Bên cạnh đó, khi sử dụng đơn lẽ Flavourzyme thì hiệu suất thu hồi thấp hơn nhưng cho

vị ngọt, màu đậm hơn khi sử dụng acid nhưng chất lượng hỗn hợp caroten-protein vẫn không bằng phương pháp kết hợp hai enzyme với nhau Mặt khác, khi sử dụng hai enzyme cho sản phẩm có chất lượng cao nhưng chi phí cao và khó ứng dụng do

khó kiểm soát được hoạt độ của enzyme Vì vậy, việc nghiên cứu thu nhập hỗn hợp caroten-protein bằng phương pháp xử lý kết hợp acid hữu cơ và một enzyme trong quá trình thủy phân là hướng đi mới, tạo sản phẩm có giá trị cao, đem lại hiệu quả kinh tế đồng thời giảm thiểu ô nhiễm môi trường và có thể áp dụng cao trong công nghiệp

Nhận thấy được tính cấp thiết và tầm quan trọng của vấn đề, đồng thời giúp sinh viên làm quen với công tác nghiên cứu khoa học Tôi đã được Khoa Công nghệ thực phẩm giao cho đề tài: “Nghiên cứu thu hồi hỗn hợp caroten-protein từ đầu tôm bằng phương pháp kết hợp acid lactic và Flavourzyme” để làm đề tài tốt nghiệp dưới sự hướng dẫn tận tình của ThS Phạm Thị Đan Phượng

Tên đề tài: Nghiên cứu quá trình tách chiết hỗn hợp caroten-protein

từ đầu tôm bằng phương pháp kết hợp acid lactic và Flavourzyme

Nội dung:

1 Xác định thành phần hóa học của đầu tôm

2 Xác định điều kiện thủy phân bằng acid lactic (nồng độ acid, thời gian ủ)

ở giai đoạn đầu

3 Xác định điều kiện thủy phân bằng Flavourzyme (tỷ lệ enzyme/đầu tôm, thời gian ủ) ở giai đoạn sau

4 Đề xuất quy trình thu hồi hỗn hợp caroten-protein bằng phương pháp xử

lý kết hợp acid lactic và Flavourzyme từ đầu tôm

5 Đánh giá chất lượng sản phẩm thu hồi từ quy trình đề xuất

Mục tiêu: Xây dựng quy trình thu nhận hỗn hợp caroten-protein bằng

phương pháp hợp acid lactic và Flavourzyme từ đầu tôm thẻ chân trắng

Ý nghĩa khoa học: Phương pháp kết hợp xử lý acid lactic với enzyme, dùng

acid để tách khoáng trong đầu tôm, tạo điều kiện cho enzyme dễ dàng tiếp xúc với

cơ chất, từ đó tăng hiệu quả của quá trình thủy phân, giảm thời gian xử lý, tăng

hàm lượng astaxanthin trong hỗn hợp caroten-protein

Ý nghĩa thực tiễn: Sự thành công của đề tài trên quy mô phòng thí nghiệm

sẽ là cơ sở để triển khai thực nghiệm với quy mô lớn tại nhà máy chế biến thủy sản

với mục đích tận dụng nguồn caroten-protein từ đầu tôm Khả năng áp dụng của những nghiên cứu trong đề tài vào thực tiễn rất cao do tận dụng được nguồn phế liệu thải ra từ nhà máy, quá trình sản xuất đơn giản hơn, hóa chất sử dụng ít và thời gian được rút ngắn nên phù hợp với quy mô sản xuất công nghiệp Việc tận dụng phế liệu đầu tôm sẽ mang lại lợi ích to lớn cho các nhà máy chế biến thủy sản, đem lại hiệu quả kinh tế cao vì tận thu được hỗn hợp caroten-protein giàu astaxanthin để

bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, sử dụng hóa chất ít, hạn chế tác động đến môi trường do nguyên liệu và hóa chất gây ra

Phạm vi nghiên cứu: Đầu tôm thẻ chân trắng thu nhận tại công ty cổ phần

Nha Trang seafood (F17) Sử dụng acid lactic và Flavourzyme

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Các nghiên cứu trong nước liên quan đến đề tài

Đầu tôm và vỏ tôm hiện nay được các nhà khoa học chú trọng rất nhiều, dùng để sản xuất chitin-chitosan, chiết rút các chất màu, chất mùi phục vụ cho ngành công nghệ phẩm, đặc biệt trong thời gian gần đây để tận dụng được protein

và carotenoid trong quá trình sản xuất chitin-chitosan thì cũng đã có nhiều nghiên cứu thu hồi hỗn hợp caroten-protein bằng phương pháp sinh học, vừa giảm thiểu được ô nhiễm môi trường, vừa mang lại hiệu quả kinh tế Hỗn hợp caroten-protein

có thể được bổ sung vào thức ăn thủy sản nhằm làm tăng màu sắc cho cá hồi, các loài giáp xác nhờ hàm lượng astaxanthin, đồng thời tăng hệ miễn dịch cho vật nuôi Astaxanthin được Hoàng Thị Huệ An [1] nghiên cứu chiết xuất từ phế liệu vỏ tôm bằng dung môi Ngoài ra, Vũ Ngọc Bội và cộng sự (2004) đã nghiên cứu tiến hành sử dụng protease từ đầu tôm sú để cải thiện khả năng chiết tách chất mùi từ phế liệu tôm, ghẹ trước khi xử lý bằng các loại dung môi khác nhau (dung dịch NaCl 0,9%; glycerin; sorbitol) Kết quả cho thấy dịch chiết chất mùi thu được có cường độ mùi cao hơn so với khi không xử lý enzyme Ngô Thanh Lĩnh (2009) cũng đã nghiên cứu sử dụng acid hữu cơ ở nồng độ thấp trong quy trình sản xuất chitin-chitosan để khử protein, khoáng nhưng đồng thời tận thu được dịch ủ [5] Phương pháp này thì tiết kiệm được chi phí nhưng tốn nhiều thời gian

Trang Sĩ Trung và Trần Thị Luyến (2010) cũng đã có nhiều nghiên cứu về sử dụng enzyme protese như papain, Flavourzyme, Alcalase để khử protein [14] Trong các quy trình này, quá trình khử protein được thực hiện bằng enzyme protease để thay thế xử lý bằng NaOH Việc sử dụng papain cho phép hạn chế ô nhiễm môi trường và sử dụng có hiệu quả lượng papain dồi dào thu nhận từ thực vật Ngoài ra, protein trong dịch thủy phân có thể sử dụng bổ sung vào thức ăn động vật thủy sản [14]

Đồng thời Phạm Thị Đan Phượng và (2012) sử dụng Flavourzyme, Alcalase để thu nhận carotein-protein từ đầu tôm thẻ chân trắng và chế biến chế phẩm bột nêm [10] Tuy sản phẩm có chất lượng cao nhưng khó ứng dụng vào thực tế bởi vì việc

kiểm soát hoạt độ enzyme gặp nhiều khó khăn và sử dụng enzyme protease thương mại thì chi phí cao nên khó có thể mang lại nguồn lợi khi áp dụng vào công nghiệp Năm 2011, Nguyễn Lệ Hà đã nghiên cứu tách chiết và ứng dụng chế phẩm enzyme protease từ đầu tôm sú vào mục đích thủy phân phế liệu đầu và vỏ tôm sú

để thu nhận bột caroten-protein với hàm lượng protein (70,7%) và carotenoid cao (0,706 mg/g) Bột caroten-protein giàu đạm, giàu acid amin mà còn chứa hàm lượng carotenoid – astaxanthin, hợp chất chống oxy hóa từ thiên nhiên mang lại lợi ích về sức khỏe con người [3]

1.2 Các nghiên cứu ngoài nước liên quan đến đề tài

Trên thế giới, việc nghiên cứu sản xuất các sản phẩm giá trị gia tăng từ phế liệu thủy sản đã thu hút được sự quan tâm của rất nhiều nhà nghiên cứu ở các nước

có công nghiệp chế biến thủy sản phát triển Phần lớn các nghiên cứu tập trung thu nhận chitin và chitosan từ phế liệu tôm Bên cạnh đó, việc thu nhận bột đạm giàu carotenoid cũng được quan tâm nghiên cứu, các sản phẩm protein thu được có thể ứng dụng trong chế biến thức ăn cho người hoặc gia súc ở dạng đạm giàu carotenoid hoặc chất mùi tôm Các nghiên cứu này chủ yếu tập trung vào phế liệu của tôm sú hay các loại tôm đặc thù ở khu vực Châu Âu hay Bắc Mỹ, các nghiên cứu trên phế liệu tôm thẻ chân trắng thì còn rất hạn chế

Một số nghiên cứu tiêu biểu như sau: Higuera-Ciapara và cộng sự (2006) nghiên cứu tính chất chống oxy hóa của carotenoid Carotenoid cũng có thể

chống lại Hecolybacter pylori gây bệnh viêm loét dạ dày, sử dụng thức ăn có chứa

carotenoid thường xuyên có khả năng bảo vệ tế bào và ngăn ngừa được nhiều loại bệnh trong đó có cả bệnh ung thư và bệnh tim mạch [26] Cao và cộng sự (2009) đã

sử dụng phương pháp tự thủy phân sử dụng enzyme nội tại kết hợp với sự tăng dần nhiệt độ (nửa giờ tăng 5oC từ 40-70oC) đã cho thấy sự hiệu quả trong việc thu hồi protein trong đầu tôm thẻ chân trắng Hàm lượng protein của đầu tôm và dịch tự thủy phân bằng phương pháp tăng dần nhiệt độ đạt 60,6% và 88,8% [21] Armenta

và cộng sự (2002) đã cho thấy một hàm lượng amino acid cao của caroten-protein trong quá trình lên men, có thể được sử dụng trong chế độ ăn của con người và

động vật do nồng độ acid amin thiết yếu cao [18] Armenta và cộng sự (2009) đã nghiên cứu về tác động của các tác nhân gây oxi hóa như nhiệt độ, oxi, ánh sáng lên astaxanthin tự do được chiết tách từ đầu tôm bằng phương pháp lên men [19]

Tóm lại: Những nghiên cứu trước đây đã thu nhận hỗn hợp caroten-protein

theo phương pháp ủ xilô bằng acid hữu cơ hoặc acid vô cơ hay kết hợp cả hai loại aicd mà chưa có công đoạn tiền xử lý bằng acid trước khi ủ Ngoài ra, việc thu nhận hỗn hợp caroten-protein cũng chỉ dùng một loại enzyme hoặc 2 loại enzyme khác nhau Vì vậy, trong đề tài sẽ tiến hành xử lý bằng acid lactic kết hợp với Flavourzyme nên sẽ rút ngắn được thời gian ủ, tạo điều kiện cho acid hữu cơ hoạt động tốt hơn, duy trì pH thích hợp cho vi khuẩn lactic phát triển, ức chế vi sinh vật gây thối hoạt động và hạn chế sự hư hỏng astaxanthin trong hỗn hợp caroten-protein Đồng thời, nghiên cứu thu nhận caroten-protein giàu astaxanthin bằng phương pháp kết hợp xử lý bằng acid với enzyme nhằm tăng hiệu suất thu hồi và nâng cao chất lượng hỗn hợp caroten-protein và thu được nhiều astaxanthin

1.3 Tổng quan về phế liệu

1.3.1 Giới thiệu chung về phế liệu tôm

Đầu tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei hoặc Penaeus vannamei)

Ở nước ta, tôm là mặt hàng chủ lực của ngành thủy sản, sản phẩm từ tôm rất phong phú và đa dạng Đặc biệt đa số các sản phẩm đông lạnh làm từ tôm đều loại

bỏ phần vỏ và đầu vì thế việc tận dụng phế phẩm để tạo ra các sản phẩm có chất lượng có giá trị sử dụng là vấn đề được khuyến khích và đẩy mạnh để tăng nguồn lợi đồng thời góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trường

1.3.2 Thành phần tính chất của phế liệu tôm

Trong thành phần phế liệu tôm, phần đầu thường chiếm khoảng 35 ÷ 45% trọng

lượng của tôm nguyên liệu, phần vỏ chiếm 10 ÷ 15% Tuy vậy, tỷ lệ này còn phụ thuộc vào giống loài, giai đoạn sinh trưởng [4]

Thành phần chiếm tỷ lệ đáng kể trong đầu tôm là protein, chitin, canxi cacbonate, sắc tố mà có thể được phục hồi [4] Tỷ lệ các thành phần này không ổn định vì chúng thay đổi theo giống, đặc điểm sinh thái, sinh lý,… Thành phần chitin

và protein trong vỏ tươi tương ứng là 4,50% và 8,05%, trong vỏ tôm khô là 11 –27,50% và 23,25 – 53% Hàm lượng chitin, protein, khoáng và carotenoid trong phế liệu vỏ tôm thay đổi rất rộng phụ thuộc vào điều kiện bảo quản cũng như phụ thuộc vào loài, trạng thái dinh dưỡng, chu kỳ sinh sản Vỏ giáp xác chứa chủ yếu là

protein (30 – 40%), khoáng (30 – 50%), chitin (13 – 42%) [6]

Thành phần hóa học của phế liệu tôm thẻ chân trắng đông lạnh [6]:

Protein: protein trong phế liệu tôm thường là loại protein không hoà tan do đó

khó tách ly ra khỏi vỏ, tồn tại dưới 2 dạng:

- Dạng tự do: Dạng này tồn tại trong cơ quan nội tạng và trong các cơ gắn phần

vỏ

- Dạng phức tạp: Dạng này liên kết với chitin, CaCO3, như một phần thống nhất của vỏ tôm

Chitin: Tồn tại dưới dạng liên kết với protein, khoáng và nhiều hợp chất hữu

cơ khác, chính sự liên kết này là nguyên nhân gây khó khăn cho việc tách và tinh chế chúng

Canxi: Trong thành phần của vỏ tôm có chứa một lượng lớn muối vô cơ mà

chủ yếu là cacbonat canxi (CaCO3)

Astaxanthin: Là sắc tố chủ yếu trong vỏ tôm, astaxanthin là dẫn xuất của

caroten, thường ở dạng liên kết với acid béo (ester hóa) hay với protein tạo nên một phức hợp chặt chẽ có màu xanh đặc trưng cho tôm Khi liên kết này bị phá vỡ thì astaxanthin dễ dàng bị oxy hóa thành astaxin Trong đầu tôm có chứa một lượng nhỏ sắc tố nhưng nó cực kỳ có giá trị vì vậy người ta đã có nhiều nghiên cứu nhằm thu hồi sắc tố một cách triệt để nhất trong phế liệu tôm và đi kèm với nó là việc thu hồi protein để từ đó làm tăng giá trị sản phẩm, tạo sản phẩm mới và cải thiện môi trường đáng kể

Hệ enzyme: Hệ enzyme của tôm thường có hoạt độ mạnh hơn đặc biệt ở cơ

quan nội tạng thuộc phần đầu tôm do đó bộ phận này rất dễ bị hư hỏng Hệ enzyme của tôm bao gồm: Protease là enzyme chủ yếu trong đầu tôm, chủ yếu phân giải protein thành acid amin Lipase phân giải lipid thành glyxeryl và acid béo Đối với

Tyrozinaza thì khi có mặt của oxi không khí thì sẽ biến đổi tyrozin thành melanin

có màu đen ảnh hưởng đến giá trị cảm quan và chất lượng của sản phẩm Hoạt độ enzyme protease của đầu tôm khoảng 6,5 đơn vị hoạt độ/g tươi Qua nhiều nghiên cứu bằng phương pháp sắc ký qua Coat Sephadex G 75 đã tách được ở đầu tôm 2 loại protease có khối lượng phân tử khác nhau Ngoài ra còn có một số khoáng chất như P, K, Mg, Mn và Fe (Trang Sĩ Trung và cộng sự, 2010) [14]

Bảng 1.1 Thành phần hóa học cơ bản của đầu tôm thẻ chân trắng [10]

*Kết quả tính theo hàm lượng chất khô tuyệt đối

Lipid: Chứa một lượng đáng kể, chủ yếu gồm các acid béo chưa no bão hòa như

EPA, DHA Đây là những acid béo rất có lợi cho sức khỏe con người và có nhiều ứng dụng khác trong y học

Chất ngấm ra ở đầu tôm: Trymethylamin (TMA), Trymethinlaminoyt

(TMAO), Betain, bazo purin, các acid amin tự do, ure…

Từ thành phần, tính chất nguồn phế liệu đầu, vỏ tôm, nhận thấy đây là nguồn nguyên liệu phong phú không chỉ sản xuất chitin-chitosan mà còn chứa một lượng protein, astaxanthin và các acid béo không no có lợi cho cơ thể cần được thu hồi Vậy trong phế liệu tôm có chứa rất nhiều thành phần giá trị nên cần có chế độ xử lý thích hợp đối với nguồn phế liệu tôm bao gồm đầu và vỏ nhằm thu được thành phẩm có chất lượng cao Việc tách phần lớn protein, khoáng, chất màu đặc biệt là astaxanthin trước khi sản xuất chitin, chitosan bằng cách sử dụng kết hợp giữa acid lactic và Flavourzyme đang được quan tâm nhằm góp phần nâng cao hiệu quả kinh

tế, vừa giảm được sự ô nhiễm môi trường do nguồn phế liệu tôm thải ra, bảo vệ môi trường đưa ngành thủy sản phát triển bền vững

1.4 Tìm hiểu về caroten-protein

1.4.1 Bản chất của caroten-protein

Caroten-protein đa dạng trong tự nhiên và là phức hợp liên kết hóa trị giữa protein và carotenoid Ở động vật giáp xác như tôm, cua , ghẹ… chúng thường tồn tại ở lớp ngoại bì, trong vỏ, các bộ phận cơ quan như trứng, dạ dày hay bạch huyết Ngoài ra chúng còn tìm thấy 1 lượng lớn của grana của lục lạp ở 1 số loài thực vật [34]

Caroten-protein chia thành 2 nhóm chính: (1) carotenoprotein thật: có sự liên kết giữa carotenoid với protein đơn giản hoặc glycoprotein, (2) carotenolipoprotein: carotenoid liên kết với một lipo(glyco)protein [34] Phản ứng giữa các nhóm 4 và 4’ keto trong các vòng mang điện của β-astaxanthin là điều kiện tiên quyết cho phản ứng giữa nhóm carbonyl trong carotenoid với các gốc amin để hình thành carotenoprotein

Hình 1.1 Các liên kết hóa học của astaxanthin trong tôm [19]

Tất cả các carotenoprotein đều được tách ra thành carotenoid và apoprotein bằng aceton hoặc ethanol Crustacyanin và ovorudin là những carotenoprotein có thể được khôi phục lại dạng tự nhiên khi trộn hỗn hợp dung dịch aceton của carotenoid với dung dịch protein, pha loãng với nước, tách aceton ra Các carotenoid có liên quan đến protein thì ít bị oxi hóa hơn các carotenoid khác ở dạng

tự do [19]

Armenta và Guerrero-Legarreta cho biết trong phế liệu tôm, carotenoid chủ yếu là astaxanthin (trên 95%) [19] Astaxanthin là một carotenoid, thuộc nhóm chất phytochemical tecpen, là chất sắc tố màu vàng đỏ Giống như nhiều carotenoid, astaxanthin là một chất màu hòa tan trong mỡ hoặc dầu

1.4.2 Carotenoid

Chất màu mang nguồn gốc tự nhiên như carotenoid ngày càng được ứng dụng nhiều trong ngành công nghệ thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm để thay thế các chất màu hóa học có mối nguy về sức khỏe cho người tiêu dùng Sắc tố sử dụng rộng rãi nhất là carotenoid màu đỏ cam được tìm thấy chủ yếu trong tôm, cua, cá hồi, cá hồng là astaxanthin [18] Astaxanthin có vai trò quan trọng để loại trừ hoặc ngăn chặn một số bệnh: chứng xơ vữa động mạch, ung thư, thoái hóa cơ thể và các bệnh về mắt Carotenoid chiết tách từ các loài giáp xác xem như là một tiền tố vitamin A quan trọng và là nhóm chất chống oxy hóa [30] có hoạt tính sinh học mạnh, có hiệu quả đối với người và động vật có vú Có khả năng nâng cao khả năng miễn dịch, ngăn ngừa triệu chứng lão hóa, bệnh thái hóa võng mạc bệnh Alzheimer, Parkinson, các bệnh có liên quan đến sự thừa cholesterol, một số căn bệnh ung thư Trong phế liệu của các loại giáp xác thì carotenoid chủ yếu là astaxanthin (trên 95%) theo Amenta và Guerrore-Legarreta [19] Vì vậy trích ly carotenoid như trích

ly astaxanthin

Astaxanthin cũng giống như các carotenoid khác tan trong lipid, có khối lượng phân tử là 596,8 Da, chủ yếu tập trung ở phần vỏ, thường tồn tại ở dạng tự do, dạng mono- hay ester với các acid béo không no mạch dài, hoặc dưới các phức hợp

caroten-protein của đồng phân quang học Hàm lượng astaxanthin trong tôm khác nhau tùy theo loài

Do cấu trúc có nhiều nối đôi nên astaxanthin là một chất chống oxy hóa hiệu quả, có khả năng bảo vệ màng tế bào và các mô khỏi bị tổn thương Đặc tính chống oxy hóa thể hiện ở sự ngăn cản hình thành các gôc tự do bằng cách loại bỏ oxy tự

do, trong trường hợp gốc tự do đã hình thành thì astaxanthin có thể liên kết với các gốc tự do đó để vô hoạt chúng, nhờ đó astaxanthin bảo vệ lipid khỏi oxy hóa Các nghiên cứu cho thấy: đặc tính chống oxy hóa của astaxanthin là cao nhất trong các hợp chất carotenoid, gấp 10 lần so với beta-caroten [26] gấp 100-500 lần so với Vitamin E

Astaxanthin là dẫn xuất của caroten và có tên gọi là 3,3’ -dihydroxy – 4,4 – dixeto -β–caroten và có công thức cấu tạo như Hình 1.2

Hình 1.2 Cấu tạo của astaxanthin [22]

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của một số astaxanthin [22]

1.4.3 Ứng dụng của caroten-protein

Astaxanthin là chất chống oxy hóa rất hiệu quả, có khả năng bảo vệ phospholipid của màng tế bào khỏi sự peroxid hóa, hoạt tính chống oxy hóa của astaxanthin lớn hơn gấp 10 lần các carotenoid khác như zeaxanhin, lutein, canthaxanthin và β-caroten và lớn hơn gấp 100 lần so với vitamin E [30] Khả năng chống oxi hóa của astaxanthin dựa trên chiều dài của phân tử và cấu trúc vòng ở hai đầu Astaxanthin có tiềm năng đầy hứa hẹn đối với sức khỏe con người và ứng dụng vào thực phẩm chức năng [27] Astaxanthin có thể nâng cao khả năng miễn dịch, ngăn ngừa triệu chứng lão hóa, bệnh thái hóa võng mạc bệnh Alzheimer, Parkinson, các bệnh có liên quan đến sự thừa cholesterol, một số căn bệnh ung thư… [27] Đặc tính kháng viêm của astaxanthin có mối liên hệ chặt chẽ với hoạt

động chống oxy hóa Astaxanthin là chất chống oxy hóa nên cũng là một rất hiệu quả chống viêm [22]

Astaxanthin là một chất dinh dưỡng cần thiết cho nhiều loài cá và động vật giáp xác Astaxanthin được sử dụng rộng rãi cho cá do khả năng tạo màu sắc, tăng tốc thành thục sinh dục, tăng khả năng thụ tinh và tăng khả năng sống sót, phát triển của phôi Một nghiên cứu về ảnh hưởng của astaxanthin về sự sống còn và tăng trưởng cá hồi Đại Tây Dương cho thấy rằng khi không bổ sung astaxanthin vào thức

ăn cho cá thì chỉ có 17% con cá nhỏ sống sót đến khi trưởng thành Khi các tăng số lượng astaxanthin trong chế độ ăn uống từ cách 0,4 ppm, đến 1,0 ppm và cuối cùng lên đến 13,7 ppm, tỷ lệ phần trăm của chiên mà sống sót tăng lên từ 17% tất cả con đường lên đến 87% Và khi đạt đến mức tối đa được sử dụng trong nghiên cứu này 13,7ppm, tỷ lệ sống tăng lên đến hơn 98% [22] Astaxanthin làm tăng khả năng sống sót cho cá con, khả năng phát triển của cá nhanh hơn nhiều, giúp nâng cao chất lượng của trứng, cải thiện khả năng miễn dịch bệnh cho cá [29] Astaxanthin giảm

tỷ lệ mắc của đục thủy tinh trong cá hồi [35] Astaxanthin có thể lưu trong cơ bắp, trên da nhờ được hấp thụ tốt trong đường tiêu hóa [33] Vì vậy, thịt cá hồi và vỏ giáp xác có màu đỏ hồng Màu hồng này là một thuộc tính cảm quan, có liên quan chặt chẽ đến chất lượng và giá trị của sản phẩm Bên cạnh việc tạo màu sắc, astaxanthin còn có tác dụng bảo vệ chất béo của cá hồi tránh sự oxi hóa trong suốt quá trình bảo quản đông Bổ sung astaxanthin vào trong thức ăn chăn nuôi để điều trị các bệnh cơ bắp hay tăng khả năng phát triển của vật nuôi [28] Chế độ ăn uống

có astaxanthin làm tăng khả năng sinh sản, cải thiện tình trạng sức khỏe tổng thể của các loài động vật, và giảm tỷ lệ tử vong gà, màu vàng của lòng đỏ cũng tăng lên, trong khi việc nhiễm Salmonella giảm đáng kể [28] Astaxanthin cũng tạo màu sắc tốt hơn cho cơ thịt gà, một thuộc tính mong muốn cho một số người tiêu dùng [16]

Trong ngành thực phẩm và dinh dưỡng, astaxanthin được quan tâm nhiều vì được xem như chất màu tự nhiên (là vốn có thành phần hoặc là phụ gia), có vai trò trong quá trình oxy hóa chất béo, tạo nên màu sắc hương vi cho từng loại thực

phẩm Astaxanthin có thể được bổ sung vào bơ thực vật, nước sốt bơ, mì ống, salad trộn, salad dầu, pho mát, kem, sữa chua, sản phẩm thịt và cá, gelatin và món tráng miệng Chức năng sinh học mới bao gồm kích hoạt gen mã hóa để sản xuất protein

và điều chế hoạt động của enzyme lipoxygenases Astxanthin được bổ sung làm thực phẩm chức năng để giảm sự tiến triển của bệnh tim mạch, một số loại bệnh ung thư, nguy cơ bị đục thủy tinh và các rối loạn ánh sáng và tăng cường miễn dịch ở những bệnh nhân nhiễm HIV [20] Astaxanthin cũng được xem là một chất màu thực phẩm Một lượng rất nhỏ astaxanthin có thể làm tăng màu sắc cho cá hồi khi được phối trộn phù hợp

Astaxanthin được bổ sung trong nhiều sản phẩm mỹ phẩm khác nhau Vitamin

E là một chất chống oxy hóa đầu tiên được sử dụng và vẫn còn có thể rộng rãi Nhưng từ khi Astaxanthin được biết đến là chất chống oxi hóa mạnh hơn so với vitamin E thì astaxanthin được bổ sung vào một loạt các sản phẩm mỹ phẩm như các loại son môi và sản phẩm kem chống nắng Trong kem chống nắng, astaxanthin

sẽ giúp bảo vệ da tốt hơn do bị cháy nắng và tổn hại do tia UV và nhờ có các thuộc tính chất chống oxy hoá nên sẽ giúp chữa lành da bị hư hại [17]

Bảng 1.2 Các ứng dụng chính của hỗn hợp protein và carotenoid [26]

Y dược Tăng hệ miễn dịch, chống lão hóa, ngăn chặn

khả năng gây ung thư, tim mạch, bệnh về mắt…

Mỹ phẩm Hạn chế và giảm nếp nhăn, chống lão hóa

Như vậy, astaxanthin có rất nhiều ứng dụng quan trọng trong nhiều lĩnh vực: y dược, mỹ phẩm, công nghệ thực phẩm, thức ăn chăn nuôi cho thủy sản…

1.5 Các tác nhân thủy phân hỗn hợp caroten-protein

Trong công nghiệp, quá trình lên men acid lactic được thực hiện bởi vi khuẩn

- Acid lactic có khối lượng phân tử là 98,08; là chất hữu cơ không màu, mùi nhẹ

- Acid lactic là một chất có độ hút ẩm cao là chất lỏng sánh đặc có sẵn trên thị trường ở những dạng khác nhau về chất lượng, và phụ thuộc vào độ tinh sạch có nhiều tiêu chuẩn khác nhau: acid lactic kỹ thuật, thực phẩm, dược phẩm và acid lactic plastic

- Chú ý là ở dạng đồng phần D-acid lactic hoặc L-acid lactic lần lượt có nhiệt

độ nóng chảy là nhiệt độ sôi là 28 và 103 (0C)

- Một tiêu chuẩn chất lượng quan trọng của acid lactic tinh sạch cao là sự bền nhiệt, ví dụ: không màu tạo thành khi làm nóng dung dịch 80% acid lactic đến 1800C Acid lactic sử dụng trong thí nghiệm là acid lactic được sản xuất tại Hubei Green Home Fine Chemical, được phân phối bởi công ty Trách Nhiệm Hữu Hạn Hóa chất Long H có độ tinh khiết 85-90%

1.5.2 Flavourzyme

Flavourzyme là enzyme protease (peptidase) mang cả 2 hoạt tính endoprotease và exoprotease, trong đó tính exoprotease thì chiếm ưu thế nên thường

được xem là một exoprotease Flavourzyme được chiết xuất từ Aspergillus oryzae

bằng kỹ thuật lên men chìm, hòa tan tốt trong nước Enzyme này hoạt động thủy phân protein trong điều kiện trung tính hoặc acid yếu Điều kiện hoạt động tối ưu của Flavourzyme 500L là pH 5,0-7,0 ở nhiệt độ khoảng 55 Flavourzyme 500L có hoạt tính 500 LAPU/g Đơn vị LAPU là lượng enzyme cần thiết để thủy phân 1 của L-Leucine-p-nitroanilide thành L-Leucin

Enzyme là chất xúc tác mang bản chất protein, enzyme có khả năng tương tác lên các liên kết nhị dương và làm thay đổi các liên kết thủy phân trong phân tử

cơ chất, làm cho các liên kết này bị suy yếu và dễ dàng bị đứt ra khi có yếu tố nước tham gia

Đặc điểm của chất xúc tác enzyme: Tính đặc hiệu cao, điều kiện nhẹ nhàng,

dễ bị ảnh hưởng của các yếu tố môi trường, pH, to, kim loại nặng, nồng độ enzyme [E], nồng độ cơ chất [S], chất hoạt hóa và chất ức chế, hoạt lực của enzyme được xác định giá trị hoạt động của nó và mỗi enzyme yêu cầu có những điều kiện hoạt động riêng [6.]

Cơ chế tác dụng của enzyme lên cơ chất trải qua 3 giai đoạn theo sơ đồ sau:

Trong đó:

E: Enzyme S: Cơ chất

ES: phức hợp của enzyme-cơ chất P: Sản phẩm

Giai đoạn 1: Phức E – S tồn tại tạm thời bằng các liên kết hydro (H…O, H…N) và liên kết Vander wall (tương tác giữa các nhóm nguyên tử, nhóm phân tử), ngoài ra còn có tương tác yếu giữa các nhóm phân cực và các nhóm không phân

cực Phản ứng này xảy ra nhanh và đòi hỏi năng lượng hoạt hóa thấp

Giai đoạn thứ hai: Xảy ra sự biến đổi trong phức E-S dẫn đến sự kéo căng và

phá vỡ các liên kết, sự chuyển biến, phản ứng giữa E và S trong phức hết sức quyết liệt, rất đặc hiệu và rất nhanh

Giai đoạn thứ ba: Các liên kết giứa E và S bị phá vỡ hoàn toàn giải phóng E

tự do và tạo thành sản phẩm

1.6 Phương pháp thu hồi caroten-protein

Khi hòa tan, protein tạo thành dung dịch keo Trên bề mặt phân tử protein có các nhóm phân cực khi hòa tan vào nước, các phân tử nước lưỡng cực được hấp thụ bởi các nhóm này tạo thành màng nước bao quanh phân tử protein gọi là lớp vỏ hydrat Độ bền của dung dịch keo protein phụ thuộc vào nhiều yếu tố, ví dụ: sự tích điện của phân tử protein, mức độ hydrat hóa, nhiệt độ Khi thay đổi các yếu tố này như làm trung hòa về điện phân tử protein, loại bỏ lớp vỏ hydrat các phân tử protein

sẽ kết tụ lại với nhau tạo thành khối lớn tách khỏi dung dịch, thường gọi là kết tủa protein [2]

1.6.1 Phương pháp thu hồi bằng pH đẳng điện (pI)

Giá trị pH mà tại đó phân tử protein trung hòa điện gọi là điểm đẳng điện của protein (pI), ở giá trị pH = pI phân tử protein trung hòa điện, điện tích của protein bằng không, tương tác tĩnh điện giữa các phân tử protein và các phân tử nước bị giảm Các phân tử protein tập hợp lại với nhau do lớp vỏ hydrat bên ngoài bị phá

vỡ Người ta lợi dụng tính chất này để kết tủa protein Do không có sự thay đổi cấu trúc phân tử nên sau khi loại bỏ tác nhân gây kết tủa ra khỏi dung dịch thì các phân

tử protein có thể hòa tan trở lại [6] Cơ chế kết tủa bằng pH đẳng điện có thể mang tính thuận nghịch nên áp dụng để tách hợp chất protein có hoạt tính sinh học ra khỏi hỗn hợp mà vẫn đảm bảo giữ được hoạt tính và cấu trúc phân tử Tuy nhiên thời gian tủa thường xảy ra rất lâu, hiệu suất thu hồi lại thấp và chi phí cao nên hiệu quả kinh tế không cao

1.6.2 Phương pháp thu hồi bằng xử lý nhiệt

Với phương pháp thu hồi protein bằng xử lý nhiệt thì với nhiệt độ cao sẽ loại

bỏ được lớp vỏ hydrat của protein, làm giảm khả năng hấp thụ của nước Các phân

tử protein kết tụ lại với nhau thành khối Do mỗi loại protein khác nhau thì có độ

biến tính khác nhau vì vậy độ biến tính của protein tỷ lệ thuận vào cường độ và thời gian khác nhau Đa số protein biến tính ở nhiệt độ 45 – 500C Protein khi được gia nhiệt ở điểm đẳng điện sẽ cho kết tủa nhanh hơn

Kết tủa protein bằng nhiệt có rất nhiều ưu điểm trong việc tách protein từ dung dịch mà khi chúng ta ít quan tâm đến hoạt tính hay cấu trúc của nó Phương pháp kết tủa này xảy ra nhanh, triệt để, ít gây ô nhiễm môi trường Tuy nhiên, chi phí năng lượng cho quá trình gia nhiệt quá lớn khi thực hiện ở quy mô công nghiệp

1.6.3 Phương pháp thu hồi bằng polymer (chitosan)

Vì tính chất đặc trưng mang điện tích dương nên chitosan có thể tương tác với phần lớn các chất hữu cơ mang điện tích âm Chitosan thể hiện là một chất keo tụ, tạo bông tốt, có hiệu quả trong việc thu hồi các chất hữu cơ trong nước, đặc biệt là protein Phân tử chitosan cũng có khả năng hấp phụ, tạo cầu nối để liên kết các hạt keo protein đã kết tủa thành các phân tử có kích thước lớn hơn và lắng Ngoài ra, chitosan có độ deacetyl cao thì trong dung dịch có chứa nhiều gốc amin tích điện dương sẽ trung hòa điện tích của các phân tử protein tích điện âm trong dung dịch nước rửa, giảm khả năng hydrat hóa, tập hợp lại và kết tụ [14] Nồng độ chitosan cũng ảnh hưởng lớn đến hiệu quả thu hồi, cần sử dụng chitosan ở một nồng độ hợp

lý vì khi tăng nồng độ chitosan làm tăng số điện tích cùng dấu và đẩy nhau tạo nên một mạng lưới keo cản trở quá trình keo tụ lắng xuống của các phân tử protein Chitosan có độ deacetyl hóa càng cao thì các nhóm tích điện dương trên mạch chitosan càng nhiều, thuận lợi trong tương tác ion để thu hồi protein hòa tan

Ưu điểm của phương pháp này là không gây biến tính protein, không độc hại

và hiệu quả thu nhận cao Do đó phương pháp này áp dụng để tận thu các chế phẩm enzyme và các hợp chất có hoạt tính sinh học khác

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng

2.1.1 Đầu tôm thẻ chân trắng

Đầu tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei hoặc Penaeus vannamei) được thu nhận công ty cổ phần Nha Trang seafood (F17) Chất lượng đầu tôm tươi, không bị biến đổi màu sắc như đen đầu hay đỏ đầu, không bẩn nhiễm rác và tạp chất, được lưu giữ lạnh bằng thùng xốp cách nhiệt (<50C) với đá khô khi đưa về phòng thí nghiệm Phế liệu tôm trước khi sử dụng được rửa sạch, để ráo Trong trường hợp chưa thí nghiệm ngay thì bao gói bảo quản đông trong điều kiện nhiệt

2.1.2 Các hóa chất, máy móc và dụng cụ sử dụng phân tích trong đề tài

*Cụ thể hóa chất, máy móc và dụng cụ sẽ được trình bày rõ ở phần Phụ lục

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Thu mẫu và xử lý: Phế liệu tôm thẻ chân trắng phải đảm bảo độ tươi, không

hư hỏng được thu nhận đem về phòng thí nghiệm và được duy trì ở nhiệt độ lạnh, sau đó loại bỏ rác bẩn, rửa sạch tạp chất và để ráo nước Để đảm bảo sự đồng nhất của nguyên liệu trong quá trình nghiên cứu, phế liệu tôm tươi được thu mỗi đợt 10

kg, sau khi xử lý loại bỏ tạp chất và để ráo, cân thành những lượng nhỏ đảm bảo một lần lấy mẫu làm thí nghiệm, tiến hành thí nghiệm ngay hoặc trữ đông ở -20OC cho đến khi sử dụng, thời gian bảo quản tối đa là 1 tháng

2.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

Đầu tôm

Đánh giá hiệu quả thu hồi, xác định hàm lượng astaxanthin

Đề xuất quy trình tách chiết hỗn hợp caroten-protein hiệu quả

Xác định nồng độ acid lactic bổ sung và thời gian xử lý

Xử lý sơ bộ Đầu tôm

Thuyết minh sơ đồ:

Đầu tôm thẻ chân trắng sau khi rửa và loại bỏ tạp chất, đế ráo nước, cân mỗi

mẫu thí nghiệm 100g đồng thời bổ sung thêm 100ml nước theo tỷ lệ 1:1, sau đó nghiền mẫu với kích thước 2-3 mm để tăng diện tích tiếp xúc với enzyme nội tại của đầu tôm trong quá trình thủy phân

Hỗn hợp caroten-protein được tách chiết ra khỏi đầu tôm bằng phương pháp thủy phân dung kết hợp acid lactic và Flavourzyme Việc lựa chọn acid lactic và Flavourzyme này dựa vào nghiên cứu hiệu quả thủy phân phế liệu tôm theo kết quả của Trang Sĩ Trung [13] và Phạm Thị Đan Phượng [10] Thứ tự xử lý acid lactic trước làm nền tảng cho quá trình thủy phân diễn ra mạnh mẽ hơn khi bổ sung Flavourzyme giai đoạn sau (ở nhiệt độ tối thích của enzyme này là 55OC) Sau đó cho mẫu vào hệ thống có nhiệt độ 70OC trong 15 phút để bất hoạt enzyme rồi làm nguội

Tiến hành ép (lọc) để tách riêng phần dịch và phần bã Phần bã được rửa bằng nước ấm, nước rửa được thu hồi cùng với phần dịch Phần bã được đưa sang công đoạn sản xuất chitin, chitosan còn phần dịch được tiếp tục thu hồi chế phẩm caroten-protein

Các yếu tố như nồng độ, thời gian xử lý acid lactic tối ưu và tỷ lệ, thời gian xử

lý Flavourzyme tối ưu của quá trình thủy phân được xác định thông qua hiệu suất

thu hồi chế phẩm caroten-protein và hàm lượng astaxanthin

Quá trình thu hồi caroten-protein được thực hiện bằng phương pháp kết hợp giữa kết tủa protein bằng phương pháp điểm đẳng điện và xử lý nhiệt, đồng thời có thể bất hoạt được enzyme để kết thúc quá trình thủy phân, ngoài ra trong quá trình này có sử dụng chitosan đóng vai trò là chất tạo tủa và keo tụ để tăng hiệu quả quá trình kết tủa protein dựa theo nghiên cứu của Trang Sĩ Trung [13] Cụ thể: dịch thủy phân chứa caroten-protein được điều chỉnh pH về pH 4,3-4,5 bằng HCl 10% để kết tủa protein, gia nhiệt 70OC/10 phút, bổ sung chitosan ở nồng độ 100 ppm, sau cùng

để lắng qua đêm ở 4OC

Sau đó ly tâm bằng máy ly tâm thể tích lớn trong 15 phút với tốc độ 3500 vòng Thu hồi hỗn hợp caroten-protein và đánh giá hiệu suất thu hồi, hàm lượng astaxanthin của hỗn hợp

2.2.2 Xác định nồng độ acid lactic

Mục đích thí nghiệm: Xác định nồng độ acid lactic (v/w) thích hợp để thu hồi hỗn hợp caroten-protein đạt hiệu quả cao

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ acid lactic

Thuyết minh quy trình: Đầu tôm thẻ chân trắng được rửa sạch, loại bỏ tạp

chất, để ráo Cân 100g mẫu cho vào cốc 250 ml rồi cho vào 100ml nước theo tỷ lệ 1:1, trộn đều nghiền mẫu với kích thước 2-3mm để tạo điều kiện tiếp xúc với cơ

Thu hồi hỗn hợp caroten-protein

Đánh giá hiệu suất thu hồi hỗn hợp caroten-protein và xác định hàm lượng astaxanthin

Xử lý sơ bộ Đầu tôm

Chọn nồng độ acid lactic thích hợp

Bổ sung acid lactic vào mẫu với nồng độ acid lactic (v/w) khác nhau: 0%; 0,1%; 0,2%; 0,3%; 0,4%; 0,5%; 0,6%; 0,7% xử lý trong 2h ở điều kiện nhiêt độ thường, tiếp tục bổ sung Flavourzyme/đầu tôm với tỷ lệ là 0,2% (w/w), sau đó tiến hành ủ ở 55OC cho đến 2h Tiếp theo cho mẫu vào trong hệ thống có nhiệt độ 70OC trong 15 phút để bất hoạt enzyme rồi làm nguội Tiến hành ép (lọc) để tách riêng phần dịch và phần bã Thu hồi caroten-protein từ phần dịch bằng cách kết hợp cả ba phương pháp (điều chỉnh pH 4,3 - 4,5; gia nhiệt 70OC/10 phút và bổ sung chitosan 100ppm), để lắng qua đêm ở 4OC Sau đó ly tâm bằng máy ly tâm thể tích lớn trong

15 phút với tốc độ 3500 vòng [14]

Xác định hiệu suất thu hồi và hàm lượng astaxanthin có trong hỗn hợp caroten-protein và từ đó chọn ra nồng độ acid lactic thích hợp

Chỉ tiêu đánh giá: Hiệu suất thu hồi, hàm lượng astaxanthin

Kết quả mong đợi: Chọn nồng độ acid lactic để đạt hiệu suất thu hồi cao và

chất lượng hỗn hợp caroten-protein thích hợp

2.2.3 Xác định thời gian xử lý acid lactic

Mục đích thí nghiệm: Xác định thời gian thích hợp cho công đoạn thủy phân

trong quá trình thu hồi caroten-protenin đạt hiệu quả cao nhất

Thuyết minh quy trình:

Đầu tôm thẻ chân trắng được rửa sạch, loại bỏ tạp chất, để ráo Cân 100g mẫu cho vào cốc 250 ml rồi cho vào 100ml nước theo tỷ lệ 1:1, trộn đều nghiền

mẫu với kích thước 2-3mm để tạo điều kiện tiếp xúc với cơ chất

Bổ sung acid lactic vào mẫu với nồng độ acid lactic (v/w) được xác định ở thí nghiệm 2.2.2 vào các mẫu để xử lý theo thời gian khác nhau như sau: 0h; 1h; 2h; 3h; 4h; 5h ở nhiệt độ thường Tiếp theo, bổ sung Flavourzyme/đầu tôm (w/w) với tỷ

lệ 0,2% vào bình đựng mẫu và sau đó tiến hành ủ ở 55OC cho đến 2h Sau đó cho mẫu vào trong hệ thống có nhiệt độ 70OC trong 15 phút để bất hoạt enzyme rồi làm nguội Tiến hành ép (lọc) để tách riêng phần dịch và phần bã Thu hồi caroten-protein từ phần dịch bằng cách kết hợp cả ba phương pháp (điều chỉnh pH 4,3 - 4,5; gia nhiệt 70OC/10 phút và bổ sung chitosan 100ppm), để lắng qua đêm ở 4OC Sau

đó ly tâm bằng máy ly tâm thể tích lớn trong 15 phút với tốc độ 3500 vòng [14]

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian xử lý acid lactic

Xác định hiệu suất thu hồi và hàm lượng astaxanthin có trong hỗn hợp caroten-protein và từ đó chọn ra thời gian xử lý acid lactic thích hợp

Chỉ tiêu đánh giá: Hiệu suất thu hồi, hàm lượng astaxanthin

Kết quả mong đợi: Chọn thời gian xử lý acid lactic thích hợp để đạt hiệu

suất thu hồi cao và chất lượng hỗn hợp caroten-protein cao nhất

2.2.4 Xác định tỷ lệ Flavourzyme/đầu tôm

Mục đích thí nghiệm: Xác định tỷ lệ Flavourzyme/đầu tôm (w/w) thích hợp

để thu hồi hỗn hợp caroten-protein đạt hiệu quả cao

Thu hồi hỗn hợp caroten-protein

Đánh giá hiệu suất thu hồi hỗn hợp caroten-protein và xác định hàm lượng

astaxanthin Chọn thời gian xử lý thích hợp