Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ tới thành phần hóa học và tác dụng dược lý của vị thuốc hoàng liên

Câc phuong phâp sao khâc nhau thi nhiêt dô tâc dông khâc nhau làm cho thành phân hôa hoc sê bién doi khâc nhau dân toi tâc dung sinh hoc khâc nhau.. Vi vây, chüng tôi nghiên cüu dê tài n

BÔ Y TÉ TRlTÔNG DAI HOC DÜ0C HÀ NÔI

m

N G U Y Ê N A N H LY

NGHIÊN CtJU ÂNH HUÔNG CÜA NHIÊT DÔ TÔI

LŸ CÜA VITHUOC HOÀNG LIÊN

(KHÔA LUÂN TÔT NGHIÊP DLiüc SÏKHOÂ 1990 - 2003)

DS NGUYÊN THE MINH

Nai thirc hiên: Bô mon Diïçfc hoc co truyên

Phong Vi sinh - Bô mon Công

nghiêp duac Phong nghiên cuu trung tâm Phong Duac lÿ Viên Duoc lieu Thôi gian thuc hiên: 3/2003 - 5/2003

LÙl CfiM ON!

Trong quâ trinh thuc hiên dê tài này, em dâ nhân duoc su nhiêt tînh giüp do cüa câc thây cô giâo

Dâc b iê t, nhô cô su hctng dân tân tînh, chu dâo cüa thây:

TS Phùng Hôa Binh , em dâ hoàn thành dê tài này Em xin bày

tô long kmh trong và biêt on sâu sàc tcti thây

Em xin chân thành câm on câc thây cô giâo trong bô mon Duoc co truyên, DS Nguyén Thé Minh, thây: TS Cao Van Thu bô môn Công nghiêp Duoc - phong Vi sinh, thây: TS Dô Ngoc Thanh, TS Nguyên Dâng Hoà phông nghiên curu Trung tâm dâ tao diêu kiên giüp dô em hoàn thành dê tài này

Hà Nôi, thâng 5 nam 2003

Sinh viên

Nguyên Anh Ly

MUC LUC

2.2.1 - Théo doi ânh huông cüa nhiêt dô dén si/ doi màu cüa

2.2.2 - Nghiên cüu su bien doi alcaloid ô câc MNC 16

2.2.3 - Nghiên cûu mot so tâc dung sinh hoc 31

2.3.1 - Phicong phâp dinh hcçfng alcaloid trong Hoàng lien 36

2.3.2 - Ânh huông nhiêt dô tâi thành phàn hoâ hoc 37

3.1.1 -Nhiêt dô ânh huông tâi màu sac vi thuô'c 39

CAC KŸ HIÊU VIÉT TÂT.

g(mg)/KgT.T : g(mg) duoc liêu/Kg thé trong suc vât thf nghiêm

DÂT VAN DE

Vi thuôc Hoàng liên chân gà (Rhizoma Coptidis) là thân rë cüa nhiêu loài

Hoàng liên thuôc chi Coptis ho Hoàng liên (Ranunculaceae) Thành phân hôa

hoc chinh cüa vi thuôc Hoàng liên là alcaloid, trong dô chû yéu là Ber và Pal

Hoàng liên cô vi dàng tmh hàn, cô tâc dung khâng khuan [3, 7, 12], chông viêm

[22], lai mât [1], ha huyét âp [3, 6]

Théo y hoc co truyên, truôc khi sü dung, câc vi thuôc duçfc ché bién nhàm tâng tâc dung diêu tri giâm tâc dung không mong muôn, tâng dô an toàn Vi

thuôc Hoàng liên duçfc ché bién theo nhiêu phuofng phâp khâc nhau, trong dô cô

phuong phâp sao Phuong phâp sao thuc chat là su tâc dông cüa nhiêt dô dén vi thuôc Câc phuong phâp sao khâc nhau thi nhiêt dô tâc dông khâc nhau làm cho thành phân hôa hoc sê bién doi khâc nhau dân toi tâc dung sinh hoc khâc nhau

Vi vây, chüng tôi nghiên cüu dê tài này vôi mue dîch tîm hiëu su ânh huông

cüa nhiêt dô (â mûc dô nhiêt dô khâc nhau trong khoâng thdi gian khâc nhau) dén Alcaloid cüa vi thuôc Hoàng liên

Nôi dung nghiên cüu gôm:

+ Dinh tïnh Alcaloid bàng phân ûng voi thuôc thü chung

+ Phân tich su bién doi Alcaloid bàng SKLM

+ Dinh luong Berberin, Palmatin

+ Thü mot sô tâc dung sinh hoc: khâng khuan, an thân

PHAN 1: TÔNG QUAN

1.1- DÂC DIÊM THÜC VÂT: • • •

C6 nhiêu loài Hoàng liên chân gà:

Coptis chinensis Franch, Coptis teeta Wall, Coptis teetoides C.Y Cheng,

Coptis deltoidea C.Y Cheng et Hsiao Ho Hoàng liên (Ranunculaceae).

Hoàng liên là cây thâo sô'ng nhiêu nâm cao chùng 1 5 - 3 5 cm, thân moc

thang phfa trên phân nhânh, co nhiêu rê nhô La moc so le tir thân rê lên, cuong

la dài 6 - 12 cm Phién la gôm 3 - 5 la chét, môi la chét lai chia thành nhiêu thùy mép cô nhüng rang ara [3, 2, 6, 7, 9, 12]

Cây thuông ra hoa vào mùa xuân Hoa co 5 la dài màu vàng lue, cânh hoa hïnh müi mâc dài bàng 1/2 la dài, co nhiêu nhi dài bàng cânh hoa Quâ dai co cuong trong chtra 7 - 8 hat màu xâm

Hoàng liên thucmg moc à vùng nui cao 1500 - 2500 m Cây ua noi mât am

thâ'p nhiêt dô 20 - 25 °C, dât dê thâo nuôc [3, 7, 9] Hoàng liên trong bàng hat,

thucmg trong vào mùa xuân [2, 7]

Thu hâi Hoàng liên vào cuôi mùa thu dàu mùa dông thâng 9 - 1 0 [3, 7, 12,

17, 24], néu là cây trong thï thu hâi sau 4 - 5 nâm Hoàng liên moc hoang và trong nhiêu à Trung Quôc (TûXuyên, Hô Bac) Ô Viêt Nam, Hoàng liên moc hoang trên dây nui Hoàng liên Son (Sapa cô Coptis quinquesecta Wang, ô Quang

Ba- Hà Giang cô Coptis chinensis Franch) [3,2,12].

- Bô phân dùng:

Bô phân dùng cüa Hoàng liên là thân rê, dô là nhüng mâu cong queo dài tù

3 cm trô lên, rông 0,2 - 0,5 cm Cô nhiêu dot khüc khuÿu, phân nhânh nhiêu

giông hînh chân gà nên côn goi là Hoàng liên chân gà Mât ngoài thân rê màu

vàng nâu côn vêt tich cûa rê phu và cuô'ng lâ The chat ctfng rân, bê ngang không phâng, phàn gô màu vàng tuai, phân vô và ruôt màu vàng dô [3, 24], không mùi,

vi rat dâng, ton tai lâu trong miêng

9 X

Anh 1.1 : Mâu Hoàng liên lây tai SaPa

1.2- THÀNH PHAN HÔA HOC:

Thành phàn hoa hoc chmh cüa thân rê là Alcaloid (5 -8 %), trong do chü

yéu là Berberin, Palmatin, ngoài ra là Worenin, Coptisin, Jatrorizin, Magnoflorin, Columbamin [3,6, 9, 12]

Hàm lirong Alcaloid trong cây thay doi theo mùa và thcfi kÿ sinh truang cüa cây Hàm luong Ber trong thân rê cao nhât vào thâng 9 - 1 0 , thâp nhât vào thofi kÿ

cây ra hoa Trong la cüng cô Ber, à la già hàm luçmg Ber cao nhât vào thâng 7 -

10 khoâng 2,5 - 2,8 % [3, 20] Ô hoa và hat cüng chüa 1 luong nhô Ber: hoa 0,56

%, hat 0,23 %.

Ngoài Alcaloid trong thân rê Hoàng liên côn cô tinh bot, acid hùu co nhu

Công thuc eau tao cüa mot so Alcaloid trong Hoàng liên:

Bàng 1.1: Mot sô tmh chat vât lÿ cüa câc Alcaloid

UV X max (nm)

♦♦♦ Tâc dung khâng khudn:

Hoàng liên cô tâc dung khâng khuân manh dâc biêt là trên vi khuân Gram (-)

Trong dô cô nhiêu vi khuân duông ruôt Nuôc sâc Hoàng liên cô tâc dung rïc ché

mot sô' vi khuân: Shigellashiga, Shigella dysenteriae, Vitrio cholerae, Streptococus virideus Bacilhis proteus, Bacillus typhi, Bacillus pyocyaneus, Staphylococus aureus [3,12]

chi tü trong bài Hoàng liên giâi dôc thang dê giâi dôc li truc khuân, tiêu chây

cap, viêm màng nâo [4, 16]

Tâc dung khâng khuân cüa Hoàng liên theo co ché: Ber ûc ché sinh tong

hop ARN, ADN và protein cüa té bào vi khuân [ 20 ,22 ] Ngoài ra Ber côn tàng cucmg chiïc nàng thuc bào vi khuân cüa câc té bào miên dich bach câu [4]

Mot sô vi khuân Staphylococus aureus, Streptococus hemolyticus dê khâng

thuoc vôi Ber sulfat nhung vôi bài Hoàng liên giâi dôc thang lai khô sinh ra tînh

chat khâng thuôc [4, 20]

❖ Tâc dung chong viêm:

Do Ber cô tâc dung \xc ché giâi phông acid arachidonic tir màng té bào, giâm

luong prostaglandin (PGI2) trong huyét tUdng [22], ûc ché hïnh thành u hat trên suc vât thuc nghiêm

❖ Tâc dung trên tim:

Ber làm giâm su co that cüa tim, làm giâm nhip tim trên chuôt thuc nghiêm [22] Fang cho ràng vôi liêu lmg/kg trên mèo thî nghiêm, Ber làm giâm co co tâm thât Ber cô tâc dung chông loan nhip tim, duoc xép vào nhôm thuôc dô'i khâng canh tranh vôi hê a , , a 2 adrenergic [20]

*X* Tâc dung ha huyét âp :

1.3- TAC DUNG:

Do làm dân mach [3,6] thuông dùng dé phong ngùa xü vûa dông mach, do Ber làm giâm luçmg cholesterol trong huyét tuong [20].

♦♦♦ Vôi dudng tiêu hoa:

Hoàng liên vôi liêu nhô kich thich giûp su tiêu hoa tàng co bôp da dày, ruôt,

chûa viêm da dày [3,6,12]

♦♦♦ Tâc dung khâng virût cûm [4,6,20] :

Nuôc sàc Hoàng liên vôi nông dô 50% nghiên cûu trên phôi gà cô tâc dung ûc

chê su phât triën cua virût cüm chung PR8, 56S8 P.M [20]

❖ Ba Protoberberin alcaloid tù dich chiét Hoàng liên cô tâc dung ûc ché monoamino oxydase (MAO), riêng Jatrorrhizin ûc chê' không canh tranh câ

MAOA và MAOB (ô ti lap thé nâo chuôt công trâng) vôi giâ tri IC50 là 4pM và

62 (J.M Côn Ber chî ûc ché canh tranh vôi MAOA vôi IC50 là 126 p,M trong khi Pal vôi IC5() = 200jiM cüng không ûc ché 2 enzim này [23]

❖ Nhüng hop chat protoBer làm giâm hàm luçmg seretonin vôi IC50 cüa Ber là 3,0(xM cüa Pal là 16,5pM Câc hop chat protoBer vôi liêu toi da 20(j,M không dôc hai vôi té bào P815 két quâ là Ber và Pal ûc ché hoat tmh enzim

tryptophan hydroxylase do dô làm giâm hàm luong seretonin à té bào P8i5 [13].

♦♦♦ Ber ûc ché su két tâp tiëu eau, làm giâm luong Thromboxan (TXB2),

do dô cô tâc dung chông thiéu mâu nâo eue bô [22]

♦> Dich chiét tù Hoàng liên cô tâc dung ûc ché su phât triën cüa té bào ung thu, Hoàng liên dâ ûc ché su phât triën khôi u và su hinh thành trong quàn

thë dông té bào ung thu da dày, ruôt két, vü, phu thuôc vào liêu và thôi gian dùng Su phât triën cüa té bào bi ûc ché hoàn toàn sau 3 ngày chiu tâc dung cüa

thuôc à 10|ag/ml duoc thâo Tâc dung ûc ché phât triën khôi u cüa Hoàng liên là

do giân tiép ûc ché hoat tmh cüa CDC2 kinase Tâc dung này nôi bât lên nhu môt mue tiêu diêu tri ung thu bàng hoa liêu phâp [18]

Thuc nghiêm tiê'n hành trên té bào u thân kinh dêm cüa chuôt, Chen choràng Ber ûc ché sinh t6ng hop ARN, ADN và protein và làm giâm nàng luong lase dë tiêu diêt té bào u thân kinh dêm [22]

♦♦♦ Ber co tâc dung vôi dan bào (leihsmania), diêt kÿ sinh trùng sot rét

[2 0 , 21]

❖ Pal rïc ché epinephrine, co tâc dung khâng khuan, hoat hoâ

acetylcholin esterase, hoat hoâ câ enzim anticholin esterase [21]

❖ Dôc tmh cüa Hoàng liên :Ber co LD50 =25 mg/Kg T T , LD50 cüa

hoàng liên sông = 6,875 ± 0,904 g/Kg T.T 0 ].

1.4- CÔNG DUNG:

*Theo y hoc co truyên, Hoàng liên cô tâc dung thanh nhiêt tâo thâp, thanh

nhiêt tâ hôa [2,4]

*Hoàng liên cô vi dàng, tmh hàn, quy vào nàm kinh: tâm, tÿ, vi, can, dai

tràng [4, 5 ,7, 20]

* Công nâng chü tri:

■ Thanh nhiêt tâo thâ'p:diêu tri li, viêm ruôt Hoàng liên cô tmh khâng

khuan manh phé rông nên dùng dé tri li amip, li truc khuan [3,4, 24]

■ Thanh tâm trùphiên: dùng dë diêu tri chùïïg tâm hôa thinh gây ra hôi

hôp mât ngü, bon chôn, niêm mac luôi miêng phông dôp [4,24]

■ - Thanh can sang mât: tri chiïng can hôa gây ra dau mât dô , sot cao

xuât huyét hoàng dân , diên cuông phâ phâch ( can hoâ vuang ) [2, 7 ]

■ Chi huyêt: dùng cho truông hap huyét nhiêt dân dén chây mâu cam,

non ra mâu [4, 6]

■ Gidi dôc ha hôa: diêu tri ung nhot dôc bên trong, sot cao mê sâng

phât cuông [4, 6]

Trong dân gian thuàng dùng dich nuôc sàc Hoàng liên dë tri chûng dau mat

dô, dùng ngoài dë tri nam ngoài da, eczema, viêm tai giûa cô mü [3,24] bôi ngoài diêu tri trê em tua luôi ,sung luôi ,viêm miêng , lô môi [7]

Can chu y; Hoàng liên vi rat dàng không nên dùng liêu cao kéo dài dë gây

1.5- DINH LÜONG ALCALOID:

De dinh luçmg Alcaloid trong Hoàng liên cô nhiêu phuong phâp:

• Dinh luong bàng phiïüng phâp cân [3,5,11 ]

Nguyên tâc: Chiét alcaloid trong duoc lieu bàng côn, két tüa Ber bàng dung

dich Kl, thêm aceton, kiêm hoa bàng amoniac de tao tüa phüc Loc lày tüa sày khô dem cân

lg tüa tuong duong 898,2 mg Berberin

lml dich loc tuong ûng 0,0272 mg Berberin

Duoc diën Viêt Nam I quy djnh duoc lieu phâi cô ft nhât 4% Berberin

• Phtfcfng phâp acid base [3,11]

Nguyên tac: Chiét alcaloid trong duoc lieu duôi dang base bàng dung môi

hüu co ft phân eue, acid hoa dich chiét chuyën alcaloid sang dang muôi tan duoc trong nuôc Gan lây lôp nuôc, kiêm hoa bàng NaOH, làc vôi dung môi hüu co ft phân eue de chuyën hét alcaloid base sang pha dung môi Thêm chmh xâc mot luong acid HC1 Chuân dô HC1 du bàng NaOH, chî thi dô Methyl, tù dô trnh luong alcaloid

• Phtfong phâp dùng sac kÿ chê'hoâ de tâch roi do quang [11,24]

Nguyên tâc: dùng SKLM dë tâch riêng câc alcaloid khôi hôn hop, cao lày

riêng câc vét, phân hâp phu bàng dung môi thich hop, do quang ô buôc sôngthïch hop Mât dô quang tî le vôi nông dô dung dich alcaloid

• Phtfcfng phâp sâc kÿ long hiêu nâng cao (HPLC) [15]

Nguyên tac: Dich chiét alcaloid duoc tiêm vào côt sâc kÿ pha dông

duoc bom liên tue qua côt tâch riêng câc alcaloid khôi hôn hop Môi alcaloid khi ra khôi côt duoc detector UV nhân biét, biéu hiên ra bàng 1 pic Diên tich pic tuong ung vôi nông dô alcaloid trong dung dich tiêm vào côt

1.6 CHÉ BIEN:

1.6.1 Mue dîch che bién thuôc co truyên:

> Loai bô nhüng thành phân không can thiét làm vi thuôc tôt hon lên Giâm dôc tmh cüa vi thuôc vî du Ban ha ngâm trong nirôc vôi giâm hét vi ngüa, ché phu tu thành bach phu diêm phu dë giâm dôc tmh cüa aconitin [4, 12 , 14]

> Giâm tâc dung không mong muôn, thay doi tâc dung cüa thuôc, vî du: Hà thü ô ché vôi dàu den dë giâm anthranoid, giâm tâc dung nhuân tay [4,

12].

> Giüp bâo quân thuôc tôt hon: làm on dinh duoc lieu trânh nam môc,

vî du Hoè hoa trong diêu kiên am, men rutinase phân huÿ rutin thành queexetin làm hoè bi xâm di [4, 12]

> Làm thay doi tmh vi quy kinh cüa thuôc tù dô làm thay doi tâc dung cüa thuôc, vî du: Sinh dia vi dang tmh hàn, tâc dung thanh nhiêt luong huyét, sau khi ché vôi sa nhân, gùng, ruou duôi tâc dung cüa nhiêt trü thành thuc dia vi ngot tînh ôn cô tâc dung bo huyét ; hoàng kÿ trîch mât tàng quy kinh tÿ , tâng tâc dung bo khî [4, 7, 12]

> Làm tâng tâc dung cüa thuôc do làm giâm dô bên co hoc, tâng khânâng giâi phông hoat chat, làm mât mot sô thành phân không can thiét, sinh ra mot sô thành phân moi cô tâc dung diêu tri bênh Vî du thâo quyét minh vi sao

cô tâc dung nhuàn tây , sao vàng cô tâc dung nhuân ha, ha âp, sao chây cô tâc dung an thân [4]

1.6.2 Câc phuong phâp ché bién thuoc co truyên:

Cô ba phuong phâp co bân ché bién thuôc co truyên: hoâ ché, thuÿ ché, thuÿ hoâ hop ché [4, 12]

♦> Hoâ che: là phuong phâp ché bién chî dùng lüa, nhàm mue dîch:

- Giâm dôc tînh, giâm tâc dung quâ manh cüa vi thuôc

- On dinh hoat chât trong vi thuôc

- Giâm dô bên co hoc cüa vi thuôc

Câc phuong phâp hoâ ché duoc ghi à bâng 1.2

Bàng 1.2: câc phuong phâp hoâ ché.

Câc phirang phâp hoâ

che

Nhiêt dô (°C) '

Màu sac vi thuôc

Tàng tâc dung tiêu thuc giâm tmh mânh liêt cüa vi thuôc

Mât ngoài màu den, bên trong màu nâu den

Tàng tâc dung câm mâu

Truyên nhiêt dô dông dèu vào vi thuôc.

Sao câch câm

Tàng tâc dung kiên tÿ, giâm tmh khô tâo cüa vi thuôc

Sao câch hoat thach hoac van câp

Tinh ché thuôc cô nguôn khoâng vât,

à nhiêt dô cao câc hoat chat thàng hoa

tâch ra khôi tap

giâm tmh kich ufng cüa vi thuôc

thuôc Hoâ phi

Làm thay doi tmh chat vi thuôc loai trîr nuôc trong câu truc phân tu tàng khâ nàng hüt nuôc làm sàn se

Mot so công trinh nghiên cuu vê ânh huông cüa nhiêt dô tôi thành phàn hoâ hoc cüa duoc liêu cho thày : ô mue t° < 80° C ( tuong duong phuong phâp sao qua cüa YHCT ) thành phàn hoâ hoc cüa vi thuôc ft thay dôi : diosgenin trong

thân rê mot sô loài thuôc chi Dioscorea L ft thay doi à mire t° 50-60°C[ 10] Ô

mûc t° cao (180 -200° C) tuong duong sao chây cüa YHCT thành phàn hoâ hoc thay doi rat lôn

1.6.3 Câc phuong phâp ché bién Hoàng liên:

• Hoàng liên dé sông dùng dé tâ tâm hoâ, tri chüng phât ban diên

cuông phiên khât

• Hoàng liên trich ruçru sao qua tâc dung tâp trung à nüa nguôi phia

trên, tri viêm mât, lô miêng luôi [20 , 24]

• Hoàng liên trich nuôc gùng tâng tâc dung à trung tiêu dùng trong

truông hop dày bung, buôn non, non do câm mao phong nhiêt [20 , 24]

• Hoàng liên trich nuôc ngô thù du cô tâc dung thanh can, diêu hoà

truông vi, chông non, o chua [24]

• Hoàng liên tâm giâm tri can hu hoâ [1]

• Hoàng liên sao vôi hoàng thé cô tâc dung tiêu thuc chûa bênh cam ô

trê con

• Hoàng liên trich mât lçm tri can dôm thuc hoâ.

Mot sô công trînh dâ nghiên cüu vê ché bién Hoàng liên cho thây: Hoàng

liên trich gùng cô tâc dung loi mât, ha sot tôt hon Hoàng liên sông Hoàng liên

ché giâm cô tâc dung loi mât tôt hon câ Hoàng liên trich gùng [1]

1.7 NHÂN XÉT CHUNG:

Viêc ché bién làm ânh huông râ't nhiêu tôi tfnh chat cûa vi thuoc, qua ché bién tâc dung cüa vi thuoc cüng thay doi Do dô cân nàm chàc duoc quy

luât cüa ché bién dé tao ra nhüng tâc dung diêu tri bênh theo y muôn chü

quan De tâng giâ tri su dung cüa vi thuoc cân lua chon nhüng phuong phâp ché bién phù hop

Tuÿ theo mue dich sir dung mà ta lua chon phuong phâp ché bién khâc

PHAN 2: THÜC NGHIÊM VÀ KÊT QUÂ

2.1- NGUYÊN LIÊU PHI/ÛNG TIÊN, PHI/ONG PHÂP NGHIÊN CÜU: 2.1.1 Doi ttrong nghiên cuti:

Chüng tôi tien hành nghiên cüu trên thân rê cây Hoàng liên (Rhizoma

Coptidis) thuôc chi Coptis ho Ranunculaceae Mâu lây tai Sapa thâng 9/2002.

2.1.2 Thiét b i , hoâ chat ,suc vât thî nghiêm

- Tü sây: Memmert, SHELLAB

- May xâc dinh dô âm Précisa HA60 (Thuy Sï)

- Cân phân tîch

- Bô Shoxhlet 150 ml

- May sâc kÿ long (HPLC) Thermo Finnigan.

- Dung eu thüy tinh

- Chat chuân: Ber clorid, Pal sulfat do Viên Duçfc lieu cap

Rotundin do khoa Duoc Hoc viên Quân y cap

- Bân mông Silicagel GF254 Merck

Hôa chat dat tiêu chuân phân tich (P.A): Methanol, Buthanol, acid

clorydric, acid acetic dàc, Natrilauryl sulfat, Kalidihydrophosphat

- Chüng vi khuan do phông vi sinh, Bô mon công nghiêp duçfc cap

2.1.3 Phirong phâp nghiên cuti:

2.1.3.1 Chê bien:

- Sây câc mâu Hoàng liên à câc müc nhiêt dô khâc nhau (tù 100° C dén 220

°C ) trong khoâng thefi gian 10’, 20’, 30’.

- Nhân xét câm quan trên co sô màu cüa câc mâu nghiên cüu

- So bô dânh giâ mâu cô nhiêt dô và thôi gian cho sân phâm tuong duong sao vàng, sao chây

2.1.3.2 - Nghiên cüu su: bien doi thành phân hôa hoc

* Chiê't xuâ't: chiét bàng acid loâng trong MeOH [15]

* Nguyên tâc: trong môi truông acid alcaloid trong duoc liêu chuyën sang

dang muôi dê tan trong MeOH Dùng MeOH de chiét alcaloid

* Dinh tinh câc mâu nghiên cüu:

- Dinh tinh bàng phân ûng vôi TT chung Alcaloid: Mayer, Dragendorff,

Bouchardat

- Dinh tinh bàng SKLM: so sânh thành phân Alcaloid cüa câc mâu sây vôi

nhau, vôi mâu sông, vôi chat chuân Ber, Pal, Rotundin Dânh giâ so bô su bien doi thành phàn hoa hoc

* Dinh luong Alcaloid:

Dinh luong Ber và Pal bàng HPLC dâ duoc TS Pham Thanh Kÿ, Trinh Vàn Lâu nghiên ctru [15]

X: hàm luong hoat chat (%)

Cc: nông dô hoat chat dich chuân tiêm sàc kÿ (mg/ml) (Berberin , Palmatin) Vc: thë tfch tiêm mâu chuân (|j,l)

VT: thë tich tiêm mâu thü (|j.l)

V : thë tich dich chiét thu duoc (ml)

Sc: diên tich pic chat chuân

Sj' diên tfch pic chat thü

m: khôi luong duoc liêu chiét (g)

a: hàm âm cüa duoc lieu (%)

So sânh diên tich pic cüa Ber, Pal trong mâu thü vôi diên tich Ber, Pal trong mâu chuân tù dô suy ra hàm luong Ber, Pal trong duoc liêu theo công thüc (1)

2.3.2.4 - Thütâc dung sinh hoc:

* Nguyên tac chon mâu:Trên co sa phân tich dinh tînh, dinh luong , chüng

tôi chon mâu dé thü tâc dung sinh hoc : mâu sông, mâu cô su thay dôî nhiêu vê thành phân hoâ hoc , hàm luong Ber , Pal

* Tâc dung khâng khudn: dùng phuong phâp khuyêch tan trên môi truông

thach [19]

Nguyên tac:

Dua trên su khuyêch tân cüa dich thü vào môi truông thach, üc ché su phât triên cüa vi khuân chï thi, tao ra câc vông vô khuân cô duông kmh tî le vôi hoat lue khâng khuân cüa thuoc

Chî tiêu theo dôi: so sânh duông kînh vèng vô khuân cüa MNC vôi khâng sinh dôi chüng và cüa câc MNC vôi nhau

* Tâc dung an thân: Thü tâc dung hiêp dông vôi thuôc ngü barbituric [25]

(Viên Duoc lieu dâ chînh lÿ )

Nguyên tac: Chuôt duoc uông thuôc (cao long câc MNC) sau môt thôi

gian, gây ngü bàng thiopentan Tâc dung tàng cuông thôi gian ngü cüa chuôt duoc dânh giâ bàng su kéo dài thôi gian ngü ô lô dùng thuôc so vôi lô chüng ( chî dùng thiopentan )

Chî tiêu theo dôi: thôi gian ngü cüa chuôt ô tu thé nàm ngüa, dén khi chuôt lât mînh trô dây trên bon chân So sânh thôi gian ngü cüa câc lô dùng thuôc vôi

lô chüng và câc lô dùng thuôc vôi nhau

Két qua: duoc xü lÿ theo phuong phâp thông kê âp dung cho sinh, y hoc [8]

ô nguông 5%

■ Xü lÿ sai s6 thô : loai sai sô nghi ngô (b) ra khôi mâu

t = L ? L ztL (2)

J n -1

So sânh t vôi ta n tra trong bàng

+ Néu t > ta n : so b là sai so thô , loai bô

+ Nëu t < ta n : so b không phâi sai s6 thô , giù l a i

■ Thôi gian ngü cüa chuôt duoc tmh theo công thuc:

y/n

Trong dô:

X : khoâng tin cây

X : trung bînh công thôi gian ngü cüa lô thü.

S: dô lêch chuân:

t0: thay doi tuÿ theo bâc tu do cüa mâu phu thuôc vào xâc suât p cüa

phép tînh à dây ta xü lÿ két quâ vôi p = 0,95 (95%)

■ Dë kiëm tra hai mâu thü cô thuc su khâc nhau cô ÿ nghîa thông kê không, phâi dùng chi tiêu kiëm dinh Test t, tînh theo công thuc:

_ |AT, - X ,

s J 1 +

Trong dô:

X { là trung bînh cüa mâu 1 cô n, con chuôt

X 2 là trung bînh cüa mâu 2 cô n2 con chuôt

S2C là phuong sai chung cüa hai mâu

s, =

«, +n2 -2

x^: thofi gian ngü cüa chuôt à mâu 1 x2i: thôi gian ngü cüa chuôt à mâu 2

Giâ tri t0 duorc tra trong bâng Student vôi bac tu do chung cüa hai mâu là:

itj + n2 - 2.

> Néu:

t > t0 thi hai mâu khâc nhau cô ÿ nghîa thông kê à nguông 5%

t < t0 thî hai mâu khâc nhau không cô ÿ nghîa thông kê à nguông 5%.

2.2 K É T QUA THlTC NGHIÊM VÀ NHÂN XÉT.

2.2.1.Theo dôi ânh huông cüa nhiêt dô den sir doi màu cüa vi thuôc.

Thân rë Hoàng liên duoc tâch nhô, bô rê con, rüa sach phüi khô thâi phiên

chéo dây 2 - 4 mm, tan thành bôt thô

Sây bôt thô duoc liêu ô câc müc t° khâc nhau trong khoâng thôi gian khâc

nhau ( 10 20 30 ’) Su dôi màu cüa vi thuôc duoc ghi à bâng 2.3.

Bàng 2.3: Su chuyén màu cüa vi thuoc Hoàng liên khi sây â nhiêt dô khâc nhau.

t sây t°

Nhân xét:

> Câc mâu 100°C/30’, 110°C /10’, 20’, 30’, 130° / 10’, 20’, 30’,

140°C / 10 ; 20 ; màu câc mâu tuong duong nhau dêu cô màu vàng giông duoc liêu sông

> Câc mâu 140°C / 30 ; 150° / 10’, 20, 30 : câc mâu cô màu vàn

dâm, tuong duong vôi sao vàng

> Câc mâu 200°C / 10’, 20, 30 ; 220°C / 10’, 20, 30 cô màu den

tuong duong sao chây

2.2.2 Nghiên cûu sir bien doi alcaloid à câc MNC

2.2.2.I Chiét xuât alcaloid

Dùng phuong phâp chiét bàng acid loâng trong MeOH [13]

So dô chiét alcaloid duoc mô tâ à hînh 2.1

Hinh 2.1: Sa dô chiét xuât alcaloid trong câc MNC

Cân chmh xâc 1 luong MNC theo bàng 2.7 Chiét bàng shoxhlet vôi dung

môi MeOH: HCl ( 100 : 1 ), chiét tôi khi dich chiét không côn tua vôi thuôc thü

Mayer, Dragendorff Cât thu hôi MeOH trên nôi câch thuÿ Cân alcaloid duoc chiét bàng nuôc nông 3 lân, môi lân vôi 20 ml Loc Cô câch thuÿ dich loc tôi can Cân duoc hoà vào MeOH, chuyën vào binh dinh miic 50 ml, thêm MeOH tôi

vach Duoc dich alcaloid (A).

2.2.2.2 Dinh tînh alcaloid

*t* Dinh tinh bàng thuoc thü chung:

Chiét xuât alcaloid cüa câc MNC theo mue 2.2.2.1

Dich (A) duoc dinh tmh bàng câc TT: Mayer, Dragendorff, Bouchardat.

Lây 1 ml dich (A) cho lân luot vào câc ông nghiêm, nhô vào môi ông nghiêm 1

- 2 giot TT

TT Mayer: phân rïng duong tmh (+) khi xuât hiên tüa trang.

TT Dragendorff: phân ûng duong tmh (+) khi xuât hiên tüa vàng cam.

TT Bouchardat: phân ûng duong tînh (+) khi xuât hiên tüa nâu.

♦♦♦ Dinh tînh alcaloid bàng SKLM:

So sânh mâu sô'ng vôi câc MNC (ô t° và thdi gian khâc nhau) cô chat

chuân Ber, Pal, Rotundin

■ Dich châm sâc kÿ:

* MNC: Lây 1 ml dich (A) ô mue 2.2.2.1, cô can kiêm hoâ bàng amoniac

10%, chiét alcaloid base bàng cloroform, gan lây lôp cloroform, bôc hoi cloroform duoc cân Hoâ tan cân trong 1 ml MeOH duoc dich châm MNC

* Alcaloid chuân: Ber clorid, Pal sulfat, rotundin; kiêm hôa bàng amoniac

10%, chiët alcaloid base bàng cloroform, bôc hoi cloroform dén cân Hoà tan can trong 1 ml MeOH duoc dich châm chât chuân

■ Chât hâp phu: silicagen GF254 (hâng Merck) kfch thuôc 10 cm x 10

cm, hoat hoâ ô 110°C trong 30 phüt

■ Hê dung môi khai triën:

n Butanol: acid acetic bàng: nuôc [ 7 : 1 : 2 ]

*TT Dragendorff

Két quâ phân tfch duoc ghi ô bàng 2.4 ,2.5, ânh 2 2 , 2 3

Anh 2.2: Két quâ phân tich alcaloid trong câc MNC bàng SKLM

( hiên màu bàng TT Dragendorff)

\

lU V IIW '

Anh 2.3: Két qua phân tich alcaloid trong câc MNC bàng SKLM

( hiên màu bàng ânh sâng tü ngoai  = 366 nm )

x

3

21

100 110 110 110 130 130 130 30' 10’ 20’ 30' 10' 20' 30’

B P R 140° 140° 140° 150° 150° 150° 160° 160° 160°

10’ 20' 30’ 10’ 20' 30' 10' 20' 30'

B P R 180° 180° 180° 200° 200° 200° 220° 220° 220°

10’ 20' 30’ 10' 20' 30' 10' 20’ 30’

Ghi chu : B : Ber chuân R : Rotundin chuân

Bàng 2.4 : Két qua phân tich alcaloid bàng SKLM

(hiên màu diroi dèn tur ngoai A = 366 nm)

Bàng 2.5: Két quâ phân tich alcaloid bàng SKLM

( hiên màu bàng TT dragendorff )

Nhân xét:

> Hiên màu bàng dèn tü ngoai.

• Vét Ber chuân cô màu xanh , Pal chuân & vët sô 1 cô màu xanh

vàng , vét môi X cô màu nâu vàng cô Rf lân lugt là : 0,61 ; 0,52 ; 0,42 ; 0,68

• Rotundin chuân không phât quang duôi ânh dèn tu: ngoai ô buôc sông

366 nm

• Câc màu sông; 100°C/30’; 110°C /10’, 20’, 30’; 130°C /10’, 20 , 30’,140°C / 10’, 20’, 30’; 150°C / 10’, 20’, 30’; 160°C / 10’, 20’ tuong duong nhau cô 3vét cô Rf lân luot là: 0,42 ; 0,52 ; 0,61

Trong dô: Vét 2 tuong duong Pal chuân

Vét 3 tuong duong Ber chuân Câc mâu 160°C / 30 mât vét 1

• Mâu 180°C / 10 : cô 4 vét ; xuât hiên thêm vét X cô Rfx = 0,68,

• Mâu 180°C / 20’, 30’; 200°C / 10’, 20’, 30’; 220°C / 10’, 20’, 30’ xuât hiên thêm vét X cô Rf = 0,68 Vét 1 côn rat mô

> Hiên màu bàng TT Dragendorff.

• Tât câ câc vét dêu cô màu dô cam.

• Vét Ber chuân , Pal chuân , Rotundin chuân cô Rf lân luot là :0,61 ; 0,52 ; 0,70

• Câc mâu: sông, 100°C / 30’, 110°C - 150°C / 10’, 20’, 30’ tuong duong nhau: cô 3 vét cô Rf lân luot là: 0,42 ; 0,52 ; 0,61

Trong dô : Vét 2 tuong duong Pal chuân

Vét 3 tuong duong Ber chuân

• Câc mâu 160°C / 30’; 180°C / 20’, 30’; 200°C - 220°C / 10’, 20’, 30’tuong duong nhau dêu cô 3 vét trong dô xuât hiên thêm vét X cô Rfx=0,68, mâtvét cô Rf = 0,42 ( câc vét tuong duong Ber ,Pal chuân vân côn ) Nhu vây ônhüng mâu sây ô t° cao , câcMNC tuong duong sao chây (160°C/30 ; 180°C/20,

30 ; 200°C - 220°C/10, 20, 30 ) dâ cô su biêh doi vê thành phàn hoâ hoc: vêt cü mât di, xuât hiên thêm vêt môi, câc vêt cô Rf = 0,52; 0,61 turong dirong vôi Ber, Pal vân côn.

2.2.23 Dinh luong Ber, Pal trong câc MNC

* Xâc dinh dô dm cüa duac liêu: bàng mây précisa HA60

Két quâ sau 3 lân xâc dinh ghi à bâng 2.6

Bâng 2.6: Dô dm cüa duoc liêu

m sau sây (g)

m dinh luong (g)

mDL sông (g)

m sau sây (g)

m dinh luçmg (g)

mDL sông (g)

m sau sây (g)

m dinh lirong (g)

- Cân chmh xâc khoâng 0,7g duoc lieu sông: mDL sông = 0,704(g) Câc MNC khâc cân 1 luçmg tuong duong 0,7g duoc lieu sông khôi luong câc MNC

dem dinh luong ( duoc ghi ô bàng 2.7) Chiét bàng shoxhlet theo quy trînh chiét

xuât à mue 2.2.2.1

* Chuan bi mâu:

+ MNC: lây 1 ml dich A cho vào bînh dinh mire 10 ml thêm MeOH vira du.

+ Mâu chuan: là dung dich chuan chira hôn hop Ber và Pal.

Cân 0,1216 Ber chuan, cho vào bînh dinh mire 100ml thêm MeOH tôi vach, pha

loâng 2 lân duoc dung dich Ber cô nông dô 0,608 mg/ml (dung dich 1 ).

Cân 0,0318g Pal chuan, cho vào bînh dinh mire 100ml thêm MeOH tôi vach, pha

loâng 2 lân duoc dung dich Pal cô nông dô 0,159 mg/ml (dung dich 2).

Lây 1 ml dung dich 1 và 1 ml dung dich 2 cho vào bînh dinh mrïc 10ml

thêm MeOH tôi vach duoc dung dich chuan hôn hop

* Diêu kiên sac kÿ:

+ Côt Thermo hypersil Flow

Hypurity C18 (150 x 4,6 mm, 5 p )Nhiêt dô côt 35°C

+ Bom P4ooo+ Bô phân tiêm mâu tu dông và ôn dinh côt AS 3000

Natrilaurylsulfat trong 1000 ml hôn hop dung môi nuôc - acetonitril (1: 1), loc

qua màng loc 0,45 p m, duôi khi bàng siêu âm

+ Detector UV 6000 LP ô duôi sông 345 nm + Toc dô dông 1,2 ml/phüt

+ Diëu khiën bàng hê thông phân mêm Chrom Quest 2.51

* Tiénhành:

+ Xâc dinh thài gian li(u cüa Ber và Pal:

Tiêm 20 p 1 lân luot dung dich chuan Ber và Pal vào côt Bom liên tue pha

dông qua côt

Thôi gian luu cüa Ber : tluu = 8,9 ± 0,3 (phüt)

Pal : tluu= 8,2 ±0,3 (phüt)+ Khâo sât khoâng tuyén tmh cüa Ber và Pal Pha dung dich chuân Ber cô nông dô 0,03 dën 0,09 mg/ml, dung dich Pal chuân tù 0,007 - 0,0025 mg/ml chay sâc kÿ Tmh phuong trinh hôi quy và hê sô tuong quan tuyê'n tmh giûa diên tich pic và nông dô.

Kët quâ duoc ghi a bàng 2.8, hinh 2.1

Bàng 2 8: Tirong quan nông dô và diên tich pic cua Ber

Nông dô mg/ml Diên tîch pic

Bâng 2.9 : Tuong quan nông dô và diên tich pic cüa Pal

Nông dô mg/ml Diên tîch pic

Câc MNC dinh luçmg cô nông dô hoat chât nâm trong khoâng dâ khâo sât

cô su liên quan tuyê'n tmh giûa diên tich pic và nông dô câc chât nghiên cùu

+ Hàm luong Ber và Pal trong câc MNC duoc tmh theo công thuc (1) o

mue 2.1.