Nghiên cứu biểu hiện, tối ưu lên men và tinh chế interleukin 2 người tái tổ hợp dạng cải biến trong escherichia coli

Trước đây để có được IL-2 tinh khiết sử dụng trong điệu trị, sản phẩm này thường được tách chiết từ các dòng tế bào T tự nhiên hay bằng việc nuôi cấy các tế bào động vật, ví dụ như tế bà

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

-*** -

Lê Phương Hoàng Anh

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN, TỐI ƯU LÊN MEN VÀ TINH CHẾ INTERLEUKIN-2 NGƯỜI TÁI TỔ HỢP DẠNG CẢI

BIẾN TRONG ESCHERICHIA COLI

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới GS TS Trương Nam Hải – Trưởng phòng Phòng Kỹ thuật di truyền, Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học đã tận tình hướng dẫn và dìu dắt tôi trong suốt thời gian tôi hoàn thành khóa luận

Tiếp đến tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy, cô của trường Đại học Thái Nguyên, Viện Sinh thái và Tài Nguyên sinh vật, các thầy, cô của Viện Công nghệ sinh học đã nhiệt tình giảng dạy cho tôi trong suốt thời gian tham gia khóa học

Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể các cán bộ nghiên cứu, nhân viên của phòng Kỹ thuật di truyền - Viện Công nghệ sinh học và Công ty TNHH Vắc xin và Sinh phẩm số 1(Vabiotech) trực thuộc Bộ Y Tế-Việt Nam đã tận tình chỉ bảo động viên và cho tôi những lời khuyên quý giá trong công việc cũng như cuộc sống

Và sau cùng, bằng tình cảm chân thành tôi xin được gửi lời cảm ơn tới người thân và gia đình, những người đã hết lòng ủng hộ và động viên tôi trong suốt thời gian tôi học tập và công tác

Hà Nội, ngày 02 tháng 12 năm 2013

Học viên cao học

Lê Phương Hoàng Anh

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về ung thư 3

1.1.1 Ung thư 3

1.1.2 Tình hình ung thư ở Việt Nam và trên thế giới 7

1.1.3 Các phương pháp điều trị ung thư 10

1.1.4 Liệu pháp chữa trị ung thư bằng miễn dịch 11

1.2 Interleukin 2 12

1.2.1 Cấu trúc gene và protein của Interleukin 2 12

1.2.2 Hoạt tính sinh học 13

1.2.3 Interleukin trong chữa trị ung thư 15

1.3 Hệ biểu hiện E coli 16

1.3.1 Hệ biểu hiện E coli BL21 17

1.3.2 Vector biểu hiện pET22b(+) 18

1.4 Sắc ký và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 20

1.5 Tối ưu hóa nuôi cấy tăng sản lượng IL-2 bằng phần mềm thiết kế thí nghiệm Design Expert 7.0 23

Chương 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 25

2.1 Vật liệu 25

2.1.1 Các chủng vi sinh vật, plasmid 25

2.1.2 Hóa chất, enzyme, phần mềm 25

2.1.3 Máy móc 25

2.2 Phương pháp 25

2.2.1 Tách chiết DNA plasmid từ E coli 26

2.2.2 Điện di DNA trên gel agarose 27

2.2.3 Lên men tạo sản phẩm IL-2 với dòng tế bào vi khuẩn tái tổ hợp E coli BL21 27 2.2.4 Phương pháp giải trình tự gene 28

2.2.5 Tối ưu hóa điều kiện lên men bằng phần mềm Design expert 7.0 28

2.2.6 Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide 30

2.2.7 Phương pháp kiểm tra protein bằng phản ứng đặc hiệu kháng nguyên kháng thể Western Blot 31

2.2.8 Phá tế bào bằng phương pháp siêu âm và xử lý mẫu protein IL-2 trước khi tinh chế 32

2.2.9 Tinh chế protein bằng hệ sắc ký đảo pha RP-HPLC 33

2.2.10 Xác định độ tinh khiết của sản phẩm IL-2 tái tổ hợp sau khi tinh sạch 33 2.2.11 Phương pháp xác định hàm lượng IL-2 bằng ELISA 34

Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

3.1 Giải trình tự gene mã hóa cho IL-2 đã được cải biến 36

3.2 Biểu hiện gene il2 trong chủng vi khuẩn tái tổ hợp E coli BL21 38

3.3 Tối ưu điều kiện lên men E coli sản xuất IL-2 tái tổ hợp dạng cải biến bằng phần mềm design expert 39

a Khảo sát các yếu tố 40

b Tối ưu bằng phần mềm 41

3.4 Tinh sạch IL-2 từ dòng tế bào E coli 46

3.5 Xác định độ sạch của mẫu IL-2 sau tinh chế bằng phần mềm Quantity One… 48

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Bp base pair (cặp bazơ)

IARC International Agency for Research on Cancer (Cơ quan nghiên

cứu Quốc tế về Ung thƣ)

TNF tumor neucrosis factor (là một cytokine tham gia vào quá trình

làm chết tế bào ung thƣ)

DNA Deoxyribonucleic acid

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

IPTG Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside

MCS Multiple cloning site

PCR Polymerase Chain Reaction

SDS Sodium dodecyl sulphate

BSA Bovine serum albumin (Huyết thanh bò)

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1 1 Hình ảnh hiển vi biểu thị tế bào ung thư vú và tế bào vú thường 6

Hình 1 2 Mẫu ung thư tế bào thận RCC giải phẫu Nhiều tế bào thận bị thay thế bởi tế bào ung thư 8

Hình 1 3: Ung thư hắc tố da 8

Hình 1 4 Hai mươi loại ung thư phổ biến 9

Hình 1 5 Cấu trúc không gian của Interleukin 2 12

Hình 1 6: Sự kích thích tăng sinh và biệt hóa của IL-2 lên tế bào T 14

Hình 1 7: Cơ chế hoạt động của Interleukin 2 15

Hình 1 8: Sơ đồ cấu trúc vector pET22b+ 19

Hình 1 9: Cơ chế kiểm soát biểu hiện gene nhờ chất cảm ứng IPTG 20

Hình 1 10: Mô hình một hệ thống HPLC 21

Hình 1 11: Mô hình mô tả sự hấp thụ và thôi một đoạn peptide ở pha tĩnh của sắc ký đảo pha 22

Hình 2 1: Công cụ RSM-CCD của phần mềm thiết kế thí nghiệm Design Expert 7.0……… 29

Hình 3 1: Kết quả điện di kiểm tra plasmid trên gel Agarose……… 37

Hình 3 2: Kết quả kiểm tra khả năng biểu hiện IL-2 của một số dòng tế bào vi khuẩn tái tổ hợp mang plasmid pET22-IL-2 39

Hình 3 3: Sơ đồ tối ưu lên men vi khuẩn tái E coli tái tổ hợp sản xuất IL-2 40

Hình 3.4: Sơ đồ biểu thị kết quả khảo sát ảnh hưởng của từng nhân tố riêng rẽ (nhiệt độ biểu hiện, thời gian biểu hiện, nồng độ chất cảm ứng IPTG) của dòng tế bào tái tổ hợp E coli Bl21 mang vector biểu hiện pET22b-IL-2 41

Hình 3 5: Chi tiết thiết kế và hàm lượng IL-2 của sau khi thực hiện 20 thí nghiệm 42

Hình 3 6: Kết quả tiến hành 20 thí nghiệm đánh giá bằng phương pháp ELISA và điện di SDS– PAGE 43

Hình 3 7: Đồ thị mô hình 20 thí nghiệm của phần mềm Design Expert 7.0 44

Hình 3 8: Kết quả biểu hiện các dự đoán mà phầm mềm đưa ra 45

Hình 3 9: Kết quả tiền xử lý tinh chế phá tế bào thu dịch thô IL-2 47

Hình 3 10: Kết quả tinh chế IL-2 bằng hệ thống sắc ký lỏng cao áp HPLC 48

Hình 3 11: Xác định thành phần độ tinh khiết của protein 49

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 1 Một số oncogene và tumor suppressor genes liên quan đến ung thư ở người 4 Bảng 2.1 Công thức chế 1 bản gel acrylamide……… ………… 30 Bảng 3 1: Điều kiện biểu hiện của các giải pháp mà phần mềm đưa ra nhằm tìm ra điều kiện tối ưu cho lên men 45 Bảng 3 2: Thông số phân tích băng protein xác định độ tinh khiết của sản phẩm bằng phần mềm Quantity One 49

MỞ ĐẦU

Cytokine là một sản phẩm trong hệ miễn dịch, được nhiều loại tế bào tiết ra

Về chức năng chúng có tác dụng đa hướng, đa năng và tác dụng ngược trở lại chính

tế bào tiết ra chúng Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng cytokine có sự liên quan không chỉ với nguyên nhân gây ra ung thư mà còn liên quan tới khả năng chữa trị các bệnh ung thư này Việc lựa chọn đúng các yếu tố liên quan đến quá trình hình thành và phát triển ung thư mang tính quyết định đến việc sử dụng cytokine trong điều trị bệnh Hiện nay có nhiều loại cytokine được phát triển thành các dược phẩm thương mại Trong số đó Interleukin-2 người tái tổ hợp là một trong những loại cytokine được thương mại hóa sớm nhất và được cấp phép sử dụng bởi cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm Hoa Kỳ (US Food and Drug Administration-FDA) cấp phép sử dụng trong điều trị (1992) IL-2 có khả năng chữa trị ung thư vú, ung thư phổi,… và đặc biệt là hai loại ung thư hắc tố da và ung thư biểu mô tế bào thận

Trước đây để có được IL-2 tinh khiết sử dụng trong điệu trị, sản phẩm này thường được tách chiết từ các dòng tế bào T tự nhiên hay bằng việc nuôi cấy các tế bào động vật, ví dụ như tế bào ung thư hạc bạch huyết dòng Daudi Mặc dù vậy IL-

2 sản xuất theo con đường này có một số hạn chế đó là lượng IL-2 tách chiết ra thấp không đáp ứng đủ nhu cầu, hoạt tính sinh học riêng khá thấp (105 đến 106 U/mg), và thường tạo thành sản phẩm có dạng glycosyl hóa cao, tạo hiệu ứng không mong muốn tới sản phẩm khi sử dụng trong điều trị Do vậy hướng tạo IL-2 người bằng công nghệ mới hơn là Công nghệ DNA tái tổ hợp đã được mở ra nhằm tạo ra được lượng lớn IL-2

Trên thế giới, sản phẩm IL-2 thương mại chủ yếu được sản xuất dựa trên công nghệ DNA tái tổ hợp Sản phẩm thương mại Proleukin (Aldesleukin) của công ty

Chiron (Hoa Kỳ) sản xuất nhờ biểu hiện trong vi khuẩn Escherichia coli là một ví

dụ Trong quá trình sản xuất nhằm tăng hoạt tính và tăng tính an toàn cho sản phẩm trình tự amino acid của IL-2 đã được cải biến Tên hóa học của sản phẩm là des-alanyl-1, serein-125 human interleukin-2 mang ý nghĩa đột biến mất alanine ở vị trí

amino acid số 1, thay thế Cysteine ở vị trí 125 bằng Serine Hiện nay công ty Chiron đang bán IL-2 tái tổ hợp với giá 680 USD/mg

Tại Việt Nam, việc sử dụng IL-2 tái tổ hợp nói riêng và sản phẩm protein tái tổ hợp sử dụng trong điều trị nói chung vẫn còn đang bị bỏ ngỏ Mặc dù việc nghiên cứu về DNA tái tổ hợp đã được phát triển từ hơn 10 năm trở lại đây song vẫn chưa

có sản phẩm tái tổ hợp nào được triển khai áp dụng hoàn toàn quá trình nghiên cứu đến quá trình sản xuất Ngoài ra sản phẩm Proleukin đã hết hạn bảo hộ độc quyền,

do đó đây là một cơ hội để chúng tôi có thể nghiên cứu và tạo được sản phẩm Interleukin-2 người tái tổ hợp của Việt Nam, dùng trong điều trị ung thư với hi vọng sản phẩm đạt chất lượng tốt và giá thành rẻ hơn so với sản phẩm nhập khẩu

Chính vì vậy trong nghiên cứu của mình chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu biểu hiện, tối ưu lên men và tinh chế IL-2 người tái tổ hợp dạng cải biến trong

E coli” nhằm tạo ra được một sản phẩm Interleukin-2 có trình tự amino acid giống

với sản phẩm Proleukin đã được FDA Hoa Kỳ công nhận, có khả năng chữa ung thư Mục tiêu của đề tài là nâng cao năng suất tổng hợp cũng như tinh sạch IL-2 dạng cải biến với chi phí thấp để có thể đưa sản phẩm IL-2 người tái tổ hợp tiêu thụ

trên thị Nghiên cứu này được thực hiện nhờ sự hỗ trợ kinh phí của Dự án: “Hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất Interleukin-2 người tái tổ hợp trên dòng tế

bào E coli” Mã số KC.04.DA02/11-15, và được ứng dụng kết quả thu được từ

nghiên cứu và triển khai của các đề tài:

(1) Đề tài khoa học công nghệ cấp Nhà nước: “Nghiên cứu tạo Interleukin-2 tái

tổ hợp dùng cho điều trị ung thư” (Mã số: KC.04.33) do Viện Công nghệ

sinh học chủ trì, giai đoạn 2005-2007

(2) Đề tài khoa học công nghệ cấp Nhà nước: “Nghiên cứu đánh giá hiệu lực

của Interleukin-2 tái tổ hợp sản xuất tại Việt Nam dùng trong hỗ trợ điều trị ung thư” (Mã số: KC.04.21/06-10) do Viện Công nghệ sinh học chủ trì, giai

đoạn 2009-2010

Chương 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về ung thư

1.1.1 Ung thư

Ung thư từ lúc bắt đầu hình thành đến lúc xuất hiện trải qua nhiều bước, nhiều chu trình trao đổi chất và hoạt động bất thường Các khối u ác tính hay còn gọi là ung thư được biểu thị bởi các đặc tính: phát triển không ngừng, không theo mục đích, không theo mong muốn, không kiểm soát và phá hoại, ức chế quá trình sinh trưởng của các tế bào thường17

[17]

Tất cả sinh vật đều được tạo ra từ các tế bào sống, các tế bào này cần phải được phân chia và tăng sinh về số lượng trong thời kỳ sinh trưởng và phát triển cũng như để thay thế các tế bào đã chết hoặc bị phá hủy Quá trình đó người ta gọi

là chu trình tế bào (hay còn gọi là sự phân chia tế bào và sự sinh trưởng của tế bào) Quá trình này thường được điểu khiển bởi các gene nằm trong DNA trong nhân tế bào Những gene này được di truyền từ bố mẹ và tế bào được thừa hưởng những đặc tính riêng biệt bao gồm kích thước, màu sắc, trọng lượng và những kiểu hình Khi ở trạng thái bình thường các quá trình phát triển của tế bào trong mô được kiểm soát rất cân bằng Dạng ung thư sẽ được tạo thành khi sự kiểm soát bằng di truyền

bị mất hoặc bị phá hủy trong một hoặc nhiều tế bào, từ đó các tế bào dạng ung thư tiếp tục phân chia nhiều lần và phát triển Lượng lớn các tế bào phân chia không theo chu trình đó sẽ gây hại đến các tế bào và mô bình thường của cơ thể, mất kiểm soát dừng phân chia, đó chính là ung thư Nguyên nhân gây ra ung thư mà chúng ta biết đến bây giờ bao gồm nguyên nhân trực tiếp hoặc gián tiếp ảnh hưởng đến các gene điểu khiển quá trình phân chia tế bào37[37] Những tế bào bình thường có cơ chế giúp dừng quá trình phân chia Tế bào ở những mô như mô da, máu hoặc dòng

tế bào ở miệng, cổ họng hay ở dạ dày có thời gian sống ngắn nên việc phân chia xảy

ra thường xuyên và luôn luôn phải được thay thế mới Tương tự như vậy, sau khi bị chấn thương, hay bệnh tật thì có một số tế bào bị chết, các tế bào xung quanh chỗ bị

thương sẽ phân chia sản xuất ra tế bào mới thay thế cho tế bào hỏng, tuy nhiên quá trình phân chia đó nằm trong kiểm soát

Bảng 1 1 Một số oncogene và tumor suppressor genes liên quan đến ung thư ở

KRAS Liên quan đến ung thư phổi, buồng trứng, ruột, tuyến tụy

NRAS Liên quan đến ung thư máu

MYC1 Liên quan đến ung thư vú, máu, dạ dày và phổi

BCL2 Mã hóa cho protein bất hoạt quá trình tự chết của tế bào, liên quan đến ung

thư lympho

CTNB1 Mã hóa cho beta-catenin, liên quan đến ung thư gan

TUMOUR SUPPRESSOR GENES

APC Liên quan đến ung thư ruột và ung thư dạ dày

DPC4 Mã cho phân tử tín hiệu kích hoạt quá trình ức chế phân chia tế bào, liên

quan đến ung thư tuyến tụy

P53 Mã hóa cho protein p53, là gene điều khiển quá trình dừng phân chia và kích

thích tế bào bất thường tự chết Liên quan đến rất nhiều loại ung thư

BRCA1 Liên quan đến ung thư vú và ung thư tử cung

BRCA2 Liên quan đến ung thư vú

VHL Liên quan đến ung thư thận

WT1 Liên quan đến ung thư thận Wilms’ tumor

Quá trình “bật” và “tắt” chế độ phân chia là nhờ hai loại gene, có chức năng đẩy mạnh hoặc ngăn chặn quá trình phân chia tế bào Ngày nay người ta đã nghiên cứu và phân loại được 2 loại gene đó, đặt tên là Proto-oncogenes và Tumour suppressor genes Proto-oncogenes đảm trách nhận các tín hiệu yêu cầu phân chia, phát triển, từ đó kích thích điều hòa dương trong chu trình tế bào Tumor suppressor genes có chức năng ngược lại, đây là một gene điều hòa âm của sự sinh trưởng tế bào, chúng sẽ hoạt động khi không có tín hiệu sinh trưởng đặc biệt Như vậy tế bào bình thường có cả hai cơ chế là điều hòa âm và điều hòa dương Cơ chế “tắt” sinh trưởng vẫn chưa hoàn toàn được hiểu rõ tuy nhiên có thể khẳng định đây là một quá trình quan trọng và được điều khiển dưới sự chỉ đạo của các nhân tố di truyền, mà

cụ thể ở đây là các gene trong DNA22[22]

Trong trường hợp ung thư, không có cơ chế “tắt” nghĩa là một số oncogenes bị đột biến gọi là Oncogene, làm tế bào phát triển khi chưa nhận được tín hiệu yêu cầu phân chia, một vài gene tumor suppressor bị bất hoạt vì vậy việc phân chia không theo yêu cầu không bị ức chế Các tế bào này được nhân lên và mang đột biến sẽ tiếp tục phát triển lan ra và đi vào máu hoặc mạch bạch huyết từ đó di căn ra khắp nơi trên cơ thể10

Proto-[10]

Đặc tính của ung thư:

Các tế bào ung thư rất khác nhau về tính chất có kiểu hình rất khác biệt so với các tế bào mà chúng tồn tại ở xung quanh Tế bào ung thư có thể có hình dạng rất quái dị, kích thước lớn Nhân tế bào ung thư bất thường, chúng to và sẫm mầu hơn,

tế bào chất nhỏ hơn tế bào thường ví dụ như tế bào ung thư vú và tế bào vú bình thường (Hình 1 1)

Hình 1 1 Hình ảnh hiển vi biểu thị tế bào ung thư vú và tế bào vú thường

a) tế bào vú bình thường và b) cụm tế bào bao gồm cả tế bào thường và tế bào ung thư vú lây từ bệnh nhân ung thư vú giai đoạn cuối (độ phóng đại 400 lần)37

[37]

Nguyên nhân gây ung thư:

Các nhà nghiên cứu về ung thu đang cố gắng tìm kiếm nguyên nhân cho các bệnh ung thư và giải quyết từng nguyên nhân một Quá trình chuyển từ tế bào bình thường sang tế bào ác tính (yếu tố ung thư) có thể diễn ra trong thời gian từ một vài tuần đến vài năm Sự biến đổi đó có thể do di truyền hoặc do nguyên nhân bên ngoài Dù là nguyên nhân nào thì hầu hết các trường hợp ung thư đều là do sự đột biến từ tế bào soma, do đột biến các oncogene và tumor suppressor, hoặc đột biến với gene sửa sai DNA trong chu trình tế bào Ngày nay người ta tin rằng ung thư xảy ra trong một tế bào bình thường khi xuất hiện khoảng 6-12 đột biến ở các gene quan trọng nói trên Các tác nhân gây ung thư có thể đươc phân loại như: sai hỏng quá trình chết tự nhiên apotosis, sử dụng nhiều thuốc lá rượu bia, ảnh hưởng từ các chất hóa học gây ung thư, hấp thụ quá nhiều tia UV, bị nhiễm phóng xạ, hoặc liên quan đến hormones4[4]

Ung thư có thể được phân loại dựa trên dạng tế bào khởi nguồn Ví dụ như: ung thư bắt nguồn từ máu thì gọi là ung thư máu, bắt nguồn từ mạch bạch huyết gọi

là ung thư mạch bạch huyết,… Ngoài ra, ung thư cũng có thể phân loại dựa trên dạng khối u, ví dụ như ung thư thể rắn (ung thư phổi, ung thu vú) hoặc dạng bệnh máu ác tính như ung thư bạch huyết, ung thư tủy xương38[38]

1.1.2 Tình hình ung thư ở Việt Nam và trên thế giới

Tình hình ung thư trên thế giới

Theo điều tra của Tổ chức Y tế thế giới WHO, trong năm 2008 có khoảng 12,7 triệu ca ung thư mới Khoảng 7,6 triệu người đã tử vong vì ung thư (cùng với các bệnh lý về tim mạch, ung thư là nguyên nhân hang đầu chiếm khoảng 13% tổng số

tử vong trên toàn thế giới) Hiện nay dân số thế giới vào khoảng 7 tỷ người, ước tính đến năm 2030 sẽ tăng lên thành 8,3 tỷ, khả năng mắc ung thư mới mỗi năm khoảng 27 triệu người, 17 triệu người chết vì ung thư38[38]

Theo tổ chức nghiên cứu thế giới về ung thư IARC, trong các trường hợp mắc bệnh và tử vong vì ung thư trên thế giới, ước tính khoảng hơn một nửa số ca có liên quan và hơn hai phần ba trường hợp ung thư sẽ gia tăng ở những nước có thu nhập thấp và trung bình Ung thư chủ yếu tập trung vào các dạng như: ung thư phổi, ung thư vú, ung thư tiền liệt tuyến, ung thư buồng trứng, ung thư gan, ung thư máu, ung thư thận, ung thư da,… Trong đó ung thư da và ung thư tế bào thận chiếm tỷ lệ khoảng 2% tổng số ca ung thư8[8]

Ung thư tế bào thận (Renal Cell Carcinoma) và ung thư hắc tố da (melanoma):

Theo tổ chức Y tế Thế giới WHO, ung thư thận đứng thứ 14 trong bảng xếp hạng những loại ung thư thường gặp nhất trên thế giới, với khoảng 274.000 ca mắc mới được phát hiện vào năm 2008, Ung thư tế bào thận (renal cell carcinoma-RCC)

là dạng phổ biến nhất của ung thư thận Cứ khoảng 10 người mắc ung thư thận thì trong đó 9 người là ung thư tế bào thận RCC28[28]

Hình 1 2 Mẫu ung thư tế bào thận RCC giải phẫu Nhiều tế bào thận bị thay thế bởi

tế bào ung thư8[8]

Ung thư da bao gồm non-melanoma và melanoma ngày càng gia tăng về số lượng người mắc trong một thập kỷ trở lại đây Cụ thể có từ 2 đến 3 triệu người mắc chứng ung thư da non-melanoma và khoảng 132.000 người mắc chứng ung thư da melanoma mỗi năm Tầng ozone bị thủng là môt trong những nguyên nhân chính gia tăng số lượng bệnh này, ước tính cứ mỗi 10% mức ozone bị mất đi sẽ làm xuất hiện 300.000 bệnh ung thư da253[3][25] Trong nhiều trường hợp nguyên nhân gây ung thư tế bào thận và hắc tố da không xác định được Trong một số trường hợp khác ví dụ như ung thư do yếu tố di truyền), thì nguyên nhân gây ung thư là xác định được và có thể phòng ngừa, chữa trị

Hình 1 3: Ung thư hắc tố da 8[8]

Cũng như các loại ung thư khác, ung thư tế bào thận và ung thư da chủ yếu được chữa trị dựa vào các phương pháp, phẫu-hóa-xạ trị, và liệu pháp sinh học Mục tiêu của liệu pháp sinh học là giúp hệ miễn dịch chiến đấu và phá hủy tế bào ung thư hiệu quả và mạnh mẽ hơn Loại thuốc được sử dụng hiệu quả nhất cho ung thư thận và ung thư hắc tố da là một loại cytokine (protein hoạt hóa hệ miễn dịch

chủ) có tên là Aldesleukin của hãng Chiron Mỹ, bản chất là interleukin-2 của người dưới dạng tái tổ hợp Khả năng chữa trị cho hai loại ung thư này có thể lên đến 18% đối với ung thư hắc tố ác tính và 37% đối với ung thư tế bào thận20

[20]

Hình 1 4 Hai mươi loại ung thư phổ biến 40[40]

Tình hình ung thư ở Việt Nam

Việt Nam là một nước đang phát triển, thu nhập bình quân đầu người thấp, có đời sống chưa cao, khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, chủ yếu bệnh tật là các bệnh truyền nhiễm và suy dinh dưỡng Xã hội ngày càng phát triển kéo theo đó là sự thay đổi về kinh tế, đời sống được nâng cao, các bệnh truyền nhiễm và suy dinh dưỡng giảm mạnh thay vào đó các bệnh như ung thư, tim mạch, tiểu đường tăng nhanh Kinh tế phát triển nhanh đồng nghĩa với vấn đề ô nhiễm môi trường, chất lượng thức ăn,…

Chính vì vậy tỷ lệ ung thư ngày càng gia tăng Theo bác sỹ Mai Trọng Khoa giám đốc bệnh viện Bạch Mai Hà Nội khẳng định khi trả lời phỏng vấn tờ báo Tuổi Trẻ, hiện nay tại Việt Nam có khoảng 110.000 người mắc ung thư mới trong đó khoảng 82.000 người tử vong do ung thư mỗi năm, chiếm tới 73,5% tổng số bệnh nhân ung thư Đây là tỷ lệ tử vong thuộc hàng cao nhất thế giới, so với tỷ lệ tử vong trên tổng

số bệnh nhân ung thư toàn cầu là 59,7% (đối với các nước đang phát triển là 67,8%

và nước phát triển là 49,4%) Theo số liệu thống kê của bệnh viện K-Hà Nội và Trung tâm U bướu Thành phố Hồ Chí Minh, hằng năm số lượng bệnh nhân mắc ung thư tăng thêm khoảng 20-30% (Tiến sỹ Trần Văn Thuận, giám đốc bệnh viện K

Hà Nội) Mười loại ung thư phổ biến nhất là phổi, dạ dày, gan, đại tràng, vòm họng, thận, da, vú, tiền liệt tuyến, cổ tử cung27[27]

1.1.3 Các phương pháp điều trị ung thư

Mặc dù ung thư là một căn bệnh nan y nhưng nếu được phát hiện ở giai đoạn sớm và chữa trị kịp thời, bệnh hoàn toàn có thể được chữa khỏi Hiện nay, phẫu trị,

xạ trị và hóa trị là ba liệu pháp chuẩn trong điều trị bệnh ung thư Phẫu trị ung thư được Halsted hệ thống vào cuối thế kỷ 19, là phương pháp cắt bỏ khối u và một số

mô, một số hạch bạch huyết xung quanh Tuy nhiên phương pháp này phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm kích thước khối u, vị trí khối u, cách phẫu thuật và tình trạng của bệnh nhân

Phương pháp xạ trị bắt đầu với Henri Becquerel, Marie Curie vào đầu thế kỷ

20, phương pháp này sử dụng một dạng năng lượng là phóng xạ ion hóa để làm teo nhỏ và tiêu diệt khối u bằng cách làm tổn thương tế bào, khiến chúng không thể phát triển và phân chia Ngoài việc tiêu diệt tế bào thường thì phương pháp này còn làm tổn thương cả tế bào bình thường

Phương pháp hóa trị mới bắt đầu sau Thế chiến thứ II, là phương pháp điều trị dựa vào hóa chất có khả năng tiêu diệt tế bào ung thư Chúng can thiệp vào quá trình phân bào theo các con đường như quá trình phân chia nhiễm sắc thể tạo thành

Phương pháp này ngoài tác động đến tế bào ung thư còn ảnh hưởng đến tế bào thường Ba liệu pháp này được sử dụng chủ yếu cho người bệnh ung thư Nguyên lý kết hợp nhuần nhuyễn phẫu-xạ-hóa trị liệu là liệu pháp đa mô thức được vận dụng cho kết quả tối ưu1[1] Để khắc phục nhược điểm của các phương pháp nói trên, liệu pháp sinh học như hormone trị liệu hay liệu pháp miễn dịch, được áp dụng để phối hợp điều trị một số loại ung thư Điểm nổi trội của liệu pháp điều trị mới này là khả năng điều trị ngăn chặn chính xác ung thư mà không cần phá hủy (ví dụ các vaccine phòng ung thư), có thể giúp đưa tế bào trở lại bình thường (liệu pháp gene, gene therapy), hay có thể điều trị ức chế ung thư mà không gây nhiều phản ứng phụ như

sử dụng các protein hòa tan kích thích miễn dịch

1.1.4 Liệu pháp chữa trị ung thư bằng miễn dịch

Trên thế giới liệu pháp cytokine từ hơn 30 năm trước và được coi là hướng điều trị tích cực với bệnh nhân ung thư14

[14] Ở Việt Nam việc sử dụng cytokine vẫn còn khá mới mẻ Rất nhiều cytokine đang được nghiên cứu cũng như thử nghiệm trong điều trị lâm sàng, tuy nhiên hiện tại chỉ có một số loại cytokine được công nhận để điều trị ung thư chỉ gồm: IL-2, IFN-α, IL-11, G-CSF, GM-CSF Một

số cytokine khác cũng được phép sử dụng nhưng vẫn còn hạn chế do chưa kiểm soát được khả năng loại thải cũng như các hiệu ứng phụ khác như TNF-α, IL-12

Ưu điểm của cytokine trong điều trị ung thư so với các phương pháp khác là việc kiểm soát ung thư và các ảnh hưởng của ung thư Bệnh thiếu máu liên quan đến ung thư có thể được hỗ trợ bằng cách sử dụng EPO (erythropoietin)24[24] IL-

11 và IL-3 kích thích sự tạo thành tiểu cầu, sử dụng để chữa bệnh thrombocytopenia sau khi đã được hóa trị liệu35[35] IL-2 được công nhận và cấp phép để điều trị một

số bệnh ung thư như ung thư biểu mô, ung thư mạch bạch huyết, đặc biệt là ung thư

tế bào thận và ung thư da Việc sử dụng GM-CSF và G-CSF tiếp sau hóa trị liệu và cấy ghép tủy xương có thể thúc đẩy nhau quá trình phục hồi của các tế bào myeloid, giảm rủi ro lây nhiễm

Hiệu quả sử dụng cytokine để điều trị bệnh ung thư là chưa vượt trội, tuy nhiên có sự kết hợp và bổ trợ với các phương pháp khác thì hiệu quả sẽ tăng gấp nhiều lần Ngoài ra các cytokine có thể kết hợp với kháng thể đơn dòng để tạo hiệu quả miễn dịch cao sử dụng cho mục đích khác, như làm tá dược cho các loại vaccine44[44]

1.2 Interleukin 2

Interleukin-2 của người là một loại cytokine quan trọng trong hệ thống miễn dịch, gene mã hóa cho IL-2 được tách từ tế bào lách người, tế bào lympho T,…29[29]

1.2.1 Cấu trúc gene và protein của Interleukin 2

Gene mã hóa cho IL-2 nằm trên nhiễm sắc thể số 4 Khung đọc mở suy diễn từ trình tự cDNA mã hóa cho phân tử IL-2 hoàn chỉnh gồm 153 amino acid, trong đó

20 amino acid mở đầu là tín hiệu tiết Trong cấu trúc DNA, gene mã hóa cho IL-2 cũng bao gồm hộp TATA, vị trí khởi đầu sao mã, phiên mã, bốn vị trí exon và ba vị trí intron Protein hIL-2 sau quá trình biến đổi hậu dịch mã sẽ bị cắt đi 20 amino acid tín hiệu tiết và tạo thành IL-2 hoàn chỉnh gồm 133 amino acid

Hình 1 5 Cấu trúc không gian của Interleukin 2

Các kết quả nghiên cứu trước đây cho thấy phân tử IL-2 có 3 vùng đóng vai

trò quan trọng trong hoạt tính sinh học của IL-2 đó là: <i> Tận cùng đầu N (từ amino acid 1 đến amino acid 20) <ii> Vùng tận cùng đầu C (từ amino acid 121 đến 133) và <iii> cầu disulfide giữa các gốc Cys58 và Cys105 Đột biến mất 20 amino acid ở đầu N và 10 amino acid ở đầu C làm mất 99% hoạt tính của IL-2 và khả năng bám vào các thụ thể của IL-2 Trình tự amino acid của IL-2 người tự nhiên chứa 3 gốc Cystein ở các vị trí 58, 105, 125 Đột biến Cys105 làm giảm 8-10 lần hoạt tính, đột biến Cys58

làm giảm hoạt tính 250 lần Đột biến Cys125 ảnh hưởng rất ít tới hoạt tính IL-221[21], đặc biệt nếu thay Cys125 bằng Ser125 thì hoạt tính của IL-2 không bị ảnh hưởng Nhờ đó nếu thay đổi Cys125 bằng Ser125 thì sẽ ngăn cản việc tạo thành cầu disulfide không mong muốn Tại đầu N của protein IL-2 có điểm glycosyl hóa được nhận biết bởi trình tự Ala-Pro-Thr ở vị trí 3 amino acid đầu tiên Trong tự nhiên IL-2 tồn tại ở trạng thái glycosyl hóa có tính thấm cao với màng tế bào do vây, nếu sử dụng IL-2 liều lượng lớn IL-2 sẽ gây nên tạo thành tính độc trong cơ thể Vì vậy IL-2 dạng thương phẩm dùng làm thuốc tiêm không được mang các gốc đường ở đầu N IL-2 thương phẩm đã được FDA công nhận để chữa ung thư là Proleukin (Aldesleukin) của Chiron Hoa kỳ có trình tự amino acid loại bỏ alanine ở đầu N, thay thế cysteine ở vị trí 125 bằng serine12[12]

1.2.2 Hoạt tính sinh học

Trong tự nhiên , IL-2 là một glycoprotein, có khả năng hoạt hóa tế bào giết tự nhiên (natural killer-NK) và tế bào gây độc (Cytoxic T lymphocyte - CTL), biệt hóa tế bào lympho giết tự nhiên (Lymphokine activated killer-LAK cells) Có rất nhiều nghiên cứu về IL-2 trên thế giới và các nghiên cứu đó tập trung nhiều nhất vào chức năng quan trọng của IL-2 trong hệ miễn dịch IL-2 chủ yếu được sinh ra từ

tế bào T CD4+ (tế bào trợ giúp T helper TH) ngoài ra IL-2 còn được sinh ra bởi tế bào T CD8+ và tế bào T giết tự nhiên (natural killer T-NKT cells), ở một số điều kiện đặc biệt, lượng nhỏ IL-2 cũng có thể được tạo ra từ các tế bào dendritic hoạt hóa (activated dendritic cells)9[9]

Hình 1 6: Sự kích thích tăng sinh và biệt hóa của IL-2 lên tế bào T

Tế bào T hoạt hóa biểu hiện thụ thể bề mặt cùng với sự tiết IL-2, IL-2 bám vào thụ thể trên tế bào và kích thích sự phân chia tế bào Khi tế bào T không còn được kích thích bởi kháng nguyên thì thụ thể IL-2 sẽ tự tiêu biến

Nhờ khả năng kích thích làm tăng các loại tế bào có khả năng diệt khối u, khi chạm trán tế bào bất thường, tế bào NKT đã hoạt hóa tấn công và tiêm những hạt tế bào chất làm phân hủy tế bào đích Cho dù nhỏ hơn tế bào ung thư hay thể virus, tế bào NKT thường có thể tiêu diệt cùng lúc 2 hoặc nhiều tế bào ung thư Ngoài ra IL-

2 còn kích thích tăng sinh một số tế bào khác như tế bào T gây độc CTL, NK và LAK,… Điều này giúp cho cơ thể chống lại bệnh ung thư

Hình 1 7: Cơ chế hoạt động của Interleukin 2

IL-2 có thể gây độc, gây sốt và sốc trong điều trị Nguyên nhân gây độc được xác định là do 2 nguyên nhân Thứ nhất, IL-2 có điểm glycosyl hóa đươc nhận biết bởi trình tự Ala-Pro-Thr ở 3 vị trí amino acid đầu tiên Do vậy IL-2 tự nhiên có tính thấm cao với màng tế bào gây đọc với cơ thể bệnh nhân điều trị bằng IL-2 Thứ hai, độc tính của protein này là do IL-2 gián tiếp tác động lên các tế bào làm tăng quá trình tiết TNF, INFγ và chất độc lymphotoxin Chính vì vậy, nhờ kỹ thuật di truyền, IL-2 có thể được cải biến theo hướng giảm độc tính bằng cách mất vị trí glycosyl hóa mà vẫn giữ nguyên được hoạt tính sinh học vốn có

1.2.3 Interleukin trong chữa trị ung thư

Cho đến nay, IL-2 đã được công nhận là có hiệu quả trong việc điều trị ung thư, như ung thư bạch cầu, ung thư phổi, ung thu buồng trứng, ung thư vú,… đặc biệt là ung thư hắc tố và ung thư tế bào thận39[39] Từ năm 1992, tổ chức FDA của Hoa kỳ đã chính thức cho phép sử dụng IL-2 cho việc chữa trị ung thư tế bào thận (renal cell carcinoma) và ung thư hắc tố da ác tính (malignant melanoma)32

[32]

Tuy nhiên điều trị ung thư sử dụng liệu pháp IL-2 liều cao gây độc với cơ thể bệnh nhân Hiệu ứng này gây nên những tác dụng phụ không mong muốn như chảy máu trong, phát ban, phù nề, thậm chí tử vong Chính vì vậy sản phẩm IL-2 sản xuất bằng công nghệ tái tổ hợp thương phẩm đã được phân chia vào danh mục thuốc độc bảng A19[19] Mặc dù vậy trong quá trình điều trị, các tác dụng phụ được khắc phục bằng nhiều biện pháp khác nhau Nhiều công trình nghiên cứu, thử nghiệm đã được

công bố trên nhiều tạp chí khoa học, trong đó có Viện Ung thư quốc gia Hoa Kỳ, đã tiến hành thử nghiệm IL-2 liều cao với hơn một ngàn bệnh nhân trong vòng hơn mười năm và xác định phương pháp giảm bớt độc tính của cytokine này với người bệnh34[34] Như vậy việc sử dụng IL-2 liều cao một cách an toàn trong điều trị là hoàn toàn khả thi

Hiện nay ở Việt Nam, phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn Lâm khoa học và công nghệ Việt Nam là đơn vị duy nhất nghiên cứu và chế tạo thành công sinh phẩm Interleukin -2 tái tổ hợp của người nhằm điều trị ung thư

1.3 Hệ biểu hiện E coli

E coli là một hệ biểu hiện lý tưởng, dễ thao tác, có thể sản xuất dạng protein

tái tổ hợp từ nhiều nguồn gốc khác nhau cũng như có khả năng thu nhận các vector

bản chất là plasmid Vi khuẩn E coli đáp ứng được hầu hết các yêu cầu của một hệ biểu hiện, thực tế trên thế giới rất nhiều phòng thí nghiệm sử dụng vi khuẩn E coli

làm tế bào chủ để biểu hiện protein tái tổ hợp

E coli là vi khuẩn gram âm, mỗi tế bào chỉ tồn tại một nhiễm sắc thể duy nhất

hay còn gọi là nucleoid Kích thước genome của E coli khoảng 4,6 x 106 base pairs

Hệ biểu hiện vi khuẩn là sự lựa chọn hàng đầu để sản xuất các protein tái tổ hợp Lý

do là chi phí để biểu hiện protein bằng hệ vi khuẩn thường khá rẻ Đặc biệt là với hệ

biểu hiện E coli, đây là hệ biểu hiện phổ biến nhất để sản xuất protein tái tổ hợp do

có thời gian sinh trưởng nhanh, có khả năng duy trì lên men và tạo sinh khối lớn bằng việc cung cấp thêm dinh dưỡng vào những thời điểm nhất định Nguyên liệu

sử dụng để nuôi E coli rẻ tiền và có hiệu suất biểu hiện cao43[43] Quá trình biểu hiện gene (bao gồm phiên mã và dịch mã) luôn tạo ra phân tử mRNA và protein nhanh chóng Toàn bộ trình tự của vi khuẩn này đã được giải mã bằng máy giải trình tự thế hệ mới36[36] Hầu hết các phòng thí nghiệm đều sử dụng, với nhiều

chủng khác nhau dùng cho các mục đích riêng biệt, như tách dòng (E coli DH10B,

E Coli DH5α,…) chủng biểu hiện ( E coli BL21 DE3, E coli rossetta, …)

Hạn chế lớn nhất của hệ biểu hiện E coli chính là việc thiếu các quá trình cải

biến sau dịch mã như glycosyl hóa, phosphoryl hóa,… do đó các protein tái tổ hợp

có nguồn gốc từ sinh vật nhân chuẩn không cuộn xoắn đúng cấu trúc, protein tái tổ hợp thường tạo thành dạng không tan inclusion body, theo đó là hoạt tính sinh học cũng bị giảm đi đáng kể Tuy nhiên đã có nhiều giải pháp để khắc phục những những nhược điểm trên1613[13][16], do vậy cùng với những ưu điểm vượt trội E

coli vẫn là một trong những chủng biểu hiện rộng rãi nhất trong công nghệ DNA tái

tổ hợp

1.3.1 Hệ biểu hiện E coli BL21

E coli BL21 là chủng thương mại được sử dụng nhiều làm vật chủ biểu hiện.

Hệ gene của chủng E coli BL21 đã được cải biến một số gene là ompT, hsdS, gal,

dcm,λDE3 Ý nghĩa của việc đột biến các gene đó như sau:

- Gene ompT: là một gene mã cho protease nằm trên màng ngoài tế bào, chủng khuyết gene ompT giúp tránh việc các protein tái tổ hợp bị phá hủy ngay

trong tế bào15[15]

- Gene hsdS: là một gene có chức năng phân giải plasmid ngoại lai xâm nhập

tế bào chủ23[23], chủng BL21 khuyết hsdS để quá trình biến nạp vector tái tổ

hợp được hiệu quả hơn

- Gene gal: chủng BL21 (DE3) khuyết gene gal giúp tránh việc tế bào sử dụng

galactose làm nguồn carbon cho sinh trưởng33[33]

- Gen dcm: là gene methyl hóa trình tự (CCAGG và CCTGG), chủng khuyết gene dcm tránh việc trình tự gene ngoại lai bị methyl hóa dẫn đến sai khác

trong việc biểu hiện protein tái tổ hợp5[5]

- T7 RNA Polymerase (λDE3 và lacUV5): BL21 (DE3) có hệ promoter

lacUV5 dùng để điều khiển quá trình biểu hiện, đây là một promoter đã được

đột biến và được tạo ra từ phage λ, promoter này mạnh hơn bất kỳ promoter của hệ biểu hiện vi khuẩn tự nhiên nào26[26]

Ngoài ra chủng E coli BL21 (DE3) còn một dạng thương mại nữa là dạng có

tích hợp thêm plasmis pLysS, plasmid này mang gene mã cho T7 lysozyme làm một

loại protein có 2 chức năng: (i) phân giải thành tế bào vi khuẩn, (ii) là khóa sự hoạt

động của T7 RNA polymerase, sự có mặt của protein này giúp quá trình biểu hiện

nhờ promoter T7 (hay còn gọi là promoter lacUV5) không được kích hoạt cho đến

khi cảm ứng IPTG, lúc đó số lượng T7 RNA Polymerase tăng nhanh chóng, vượt quá khả năng ức chế của T7 lysozyme

1.3.2 Vector biểu hiện pET22b(+)

Để biểu hiện gene trong E coli BL21 vector được sử dụng có thể là các

plasmid, phage, cosmid Vector là một plasmid được thiết kế nhằm mục đích giúp sản xuất lượng lớn protein khi được kích thích bằng chất cảm ứng (lactose hoặc IPTG) Cấu trúc của vector pET22b(+) được biểu thị trên Hình 1 8 Plasmid này

chứa một vài yếu tố quan trọng như gene lacI mã hóa cho protein ức chế biểu hiện

gene ngoại lai, promoter T7 đặc hiệu với RNA polymerase, operator, vị trí đa điểm cắt multicloning site, điểm khởi đầu tái bản f1, gene chọn lọc (gene kháng kháng sinh ampicillin)

Gene của protein tái tổ hợp cần sản xuất được chèn vào vị trí đa điểm cắt trong vector Promoter T7 và lac operator đều nằm ở đầu 5’ của gene Bình thường T7

RNA polymerase bị ức chế bởi sự kiểm soát của sản phẩm gene lacI là lac

repressor, khi có mặt chất cảm ứng IPTG, chất này sẽ làm thay đổi cấu trúc của lac

repressor và T7 RNA polymerase được tạo thành từ genome của chủng E coli DE3,

nhờ đó gene ngoại lai được phiên mã và dịch mã để tổng hợp protein Cơ chế kiểm soát biểu hiện gene bằng chất cảm ứng IPTG được thể hiện ở sơ đồ Hình 1 9

Trong vector pET22b+ còn có trình tự tiết pelB giúp protein ngoại lai tiết ra khoang chu chất Sau khi đi vào khoang chu chất thì đoạn peptide tín hiệu này sẽ bị cắt bởi một protease xác định

Hình 1 8: Sơ đồ cấu trúc vector pET22b+

Hình 1 9: Cơ chế kiểm soát biểu hiện gene nhờ chất cảm ứng IPTG

1.4 Sắc ký và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Sắc ký là một kỹ thuật thường được sử dụng trong các phòng thí nghiệm, với mục đích nhằm phân tách một hỗn hợp và định lượng các chất trong hỗn hợp đó Hỗn hợp cần phân tích được pha với dung dịch gọi là pha động, nhờ đó chúng có thể đi vào những chất giá có cấu trúc giúp mang giữ và phân tách các chất tùy theo mục đích phân tách (theo khối lượng, theo ái lực, theo độ kỵ nước,…) gọi là pha tĩnh Các chất khác nhau có tốc độ di chuyển trong pha tĩnh khác nhau, điều đó tạo nên sự phân tách giữa các chất trong hỗn hợp pha động Phương pháp sắc ký thường chỉ cần một lượng nhỏ hỗn hợp để phân tích Có nhiều loại sắc ký đã được nghiên cứu và sử dụng trên thế giới bao gồm: sắc ký lỏng, sắc ký khí, sắc ký ái lực, sắc ký giấy, sắc ký bản mỏng, sắc ký cột …

Sắc ký hiệu năng cao HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC - (High-performance liquid chromatography) hay còn gọi là sắc ký lỏng cao áp (High-pressure liquid chromatography) là kỹ thuật thường sử dụng trong hóa học, sinh học để phân tích đặc tính của các chất hóa học

hoặc các đoạn peptide ngắn theo khối lượng, độ kỵ nước 31[31], Cấu trúc của một

hệ thống sắc ký HPLC các thành phần chính như sau: Một loại cột được nhồi chất giá có bản chất khác nhau tùy mục đích phân tách: thường được làm bằng thép không rỉ, chịu được áp suất cao Chất giá nhồi trong cột thường là các hạt silicagel

có bọc hoặc gắn hóa học một màng mỏng chất hữu cơ có kích thước từ 3 đến 10

µm Một hệ thống bơm chuyển pha động vào cột Một detector làm nhiệm vụ phát hiện tín hiệu vào ra (Hình 1 10)

Hình 1 10: Mô hình một hệ thống HPLC

Mẫu cần phân tích chỉ cần đưa vào pha động bằng một thể tích nhỏ, sau đó pha động (bao gồm đệm và mẫu) sẽ đi qua pha tĩnh, nhờ ái lực mà mẫu được giữ lại, chỉ phân tách ở các thời điểm khác nhau khi có các hóa chất thích hợp ở nồng

độ xác định

Với sự phát triển của các kỹ thuật về sắc ký trong những năm gần đây, sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC trở thành phương pháp ưa thích cho việc tách và phân tích định lượng nhiều loại mẫu Phân tích HPLC nhanh, hiệu quả và có thể dò tìm lượng mẫu có lượng nhỏ đến 200 pg30[30] Các loại sắc ký cột mở, sắc ký bản mỏng, sắc ký giấy được sử dụng trong những trường hợp tách đơn giản các chất,

còn HPLC là kỹ thuật tách những hỗn hợp phức tạp và có khả năng tách với độ phân giải cao với tốc độ nhanh và chất lượng tốt hơn

Có nhiều loại sắc ký HPLC tùy vào mục đích sử dụng cũng như tính chất của các chất cần phân tách mà người ta có thể sử dụng các loại sắc ký HPLC sắc ký pha thường (normal phase HPLC), sắc ký đảo pha (Reverse Phase-RP-HPLC), sắc ký lọc gel, sắc ký ái lực…Sắc ký đảo pha là một kỹ thuật được sử dụng nhiều trong hệ thống HPLC để phân tách và tinh sạch các mảnh polypeptide nhỏ Trong sắc ký đảo pha, protein được phân tách nhờ đặc tính phân cực của chúng Pha tĩnh không phân cực, thường cấu tạo bởi một hydrocarbon, pha động thường phân cực ví dụ như nước, methanol, propanol hoặc acetolnitrile trộn với mẫu cần phân tách Hỗn hợp protein và các đoạn peptide không phân cực hoặc phân cực thấp sẽ lần lượt phân tách ra ngoài trong hoặc ngay sau khi đưa mẫu lên pha tĩnh Khi bắt đầu tăng nồng

độ chất phân cực trong đệm (chất cạnh tranh), phân tử có độ phân cực thấp bắt đầu

đi ra trước, sau đó dần dần, những chất có độ phân cực cao hơn bắt nối tiếp theo sau

Hình 1 11: Mô hình mô tả sự hấp thụ và thôi một đoạn peptide ở pha tĩnh

của sắc ký đảo pha Polypeptide nằm trong pha động đi vào cột, các “chân” kỵ nước của bề mặt vật liệu trong pha đảo sẽ giữ các polypeptide lại, cho đến lúc nồng độ của chất cạnh tranh trong pha động đạt được giá trị tới hạn thì các polypeptide sẽ được thôi ra41[41]

Đoạn polypeptide đi vào pha

tĩnh của cột sắc ký đảo pha

Polypeptide được hấp thụ vào bề mặt của chất giá

Polypeptide được thôi ra khỏi pha tĩnh khi nồng độ của chất cạnh tranh đạt đến khoảng tới hạn

1.5 Tối ưu hóa nuôi cấy tăng sản lượng IL-2 bằng phần mềm thiết kế thí nghiệm Design Expert 7.0

Trước đây thông thường để tăng sản lượng protein tái tổ hợp các nhà nghiên cứu sử dụng kỹ thuật khảo sát điểm tối ưu của từng điều kiện Đây là phương pháp

áp dụng cho từng yếu tố ảnh hưởng đến sản lượng, nói chung nếu đánh giá với yếu

tố riêng rẽ thì kỹ thuật này cho kết quả khả quan, tiến hành đơn giản ít thí nghiệm, tuy nhiên không thể đánh giá một cách chính xác ảnh hưởng của các yếu tố cần tối

ưu với nhau Nếu muốn tìm ra điểm tối ưu (giao điểm giá trị của các nhân tố tại đó sản lượng protein tái tổ hợp cao nhất) thông thường phải làm rất nhiều thí nghiệm

và khi kết hợp các điểm tối ưu riêng rẽ với nhau thì hiệu quả chưa phải đã là tốt nhất11[11] Một phương pháp khác mới (phương pháp đáp ứng bề mặt Respone surface methodology RSM), sử dụng thống kê toán học kết hợp với tin học7[7] sẽ

mô hình hóa thí nghiệm, phương pháp này cho phép khảo sát nhanh từng yếu tố cũng như tìm được điểm tối ưu cho thí nghiệm tương đối chính xác với số lượng thí nghiệm tiến hành ít hơn rất nhiều so với phương pháp thông thường, nhờ đó giảm chi phí cũng như công sức cho việc thực hiện thí nghiệm đi rất nhiều2[2] Tuy nhiên muốn mô hình thí nghiệm có ý nghĩa, và không phải lặp lại thí nghiệm nhiều lần thì thí nghiệm tiến hành cần phải rất cẩn thận, khoa học, các phương pháp đo kết quả phải đảm bảo tin cậy và có độ chính xác cao

Phần mềm Design Expert:

Đây là một phần mềm được phát triển bởi hãng Stat-Ease (Hoa Kỳ) Là phần mềm tổng hợp sử dụng nhiều thuật toán và phương pháp quy hoạch khác nhau để thiết kế các thí nghiệm sử dụng trong các ngành khoa học cơ bản như toán học, vật

lý, hóa học và sinh học,… Một ưu điểm của phần mềm này là có thể sử dụng phối hợp các phương pháp để đánh giá và thiết kế thí nghiệm một cách tốt nhất Phần mềm cũng cung cấp những công cụ mạnh mẽ để phân tích kết quả như công cụ ANOVA (sử dụng để phân tích giá trị thực nghiệm, tóm tắt thống kê: đưa ra thống

kê phương sai, phương trình hồi quy, giúp đánh giá khả năng đúng của lý thuyết với

thực nghiệm,…) công cụ DIANOSTICS giúp phân tích và chọn lựa đúng mô hình

và sự phu thuộc của các giá trị theo từng mô hình, công cụ MODEL GRAPHS giúp đánh giá mô hình một cách trực quan các yếu tố theo dạng biểu đồ hình ảnh,…

Thiết kế tối ưu phức hợp trung tâm-đáp ứng bề mặt (CCD-RSM)

CCD-RSM là một thiết kế nằm trong phần mềm Design Expert, được Biles và Swain phát mình vào năm 1980, sau đó phát triển dùng để tối ưu các đại lượng biểu thị bằng số dựa trên thống kê và thực nghiệm6[6] Để thực hiện phương pháp này cần xác định ba đại lượng là: thừa số (các yếu tố cần khảo sát, mỗi yếu tố cần xác định 2 mức cao và thấp), điểm trung tâm (là điểm giữa của các đại lượng khảo sát)

và điểm sao (là giá trị phản hồi của các đại lượng số bên trên) Sau khi đã có các đại lượng, ma trận được thiết lập tính toán sử dụng hồi quy tuyến tính để tìm ra phương trình hồi quy có dạng

Yi=βixi1 + …+ βpxip + εi= xiT β + εi , i= 1,…n,

Trong đề tài này chúng tôi sử dụng phần mềm Design Expert 7 của hãng Ease, trong đó có sử dụng phương pháp đáp ứng bề mặt-phương án cấu trúc có tâm

Stat-để thiết kế quy hoạch thực nghiệm nhằm thu được sản lượng IL-2 cực đại từ dịch

nuôi cấy tế bào vi khuẩn E coli BL21 tái tổ hợp ở quy mô bình tam giác