Nghiên cứu định lượng thuốc nhỏ mắt tobramycin 0,3 % bằng phương pháp HPLC với detector huỳnh quang tạo dẫn chất sau cột

NGUYEN THIANH TUYET NGHIÊN CtJXJ DINH LlTONG THUÔC NHÔ MÂT TOBRAMYCIN 0,3 % BANG PHI/ONG PHÂP HPLC VÔI DETECTOR HUŸNH QUANG, TAO DÂN CHAT SAU CÔT KHOÀ LUÂN TOT NGHIÊP DÜOC SŸ KHOA 2002

BÔ Y TÉ TRÜÔNG DAI HOC DlTOC HÀ NÔI

C8 8S f f l .Cî«BD

NGUYEN THIANH TUYET

NGHIÊN CtJXJ DINH LlTONG THUÔC NHÔ MÂT

TOBRAMYCIN 0,3 % BANG PHI/ONG PHÂP HPLC VÔI

DETECTOR HUŸNH QUANG, TAO DÂN CHAT SAU CÔT

(KHOÀ LUÂN TOT NGHIÊP DÜOC SŸ KHOA 2002- 2007)

Nguùi huâng dân: PGS.TS Thâi Phan Quÿnh Nhu

PGS.TS Thâi Duy Thîn

Nai thuc hiên: Phông hoâ lÿ I - Viên kiêm nghiêm thuôc trung uang

Bô mon Hoâ duçfc - Tnrcmg Dai hoc Dirac Hà Nôi

Thâi gian thuc hiên : Tûr thâng 10/2006 dén thâng 5/2007

Hà Nôi, Thâng 5 -2007

Loi dàu tiên tôi xin bày tô long biet on sâu sac toi:

• PGS.TS THÂI DUY THÎN

• PGS.TS THÂI PHAN QUŸNH NHlT

Dâ giüp dô tôi nhüng tài liêu và hucfng dân nhùng kÿ nâng cân thiët trong quâ trînh thuc hiên khoâ luân

Tôi xin câm an su giüp dô cüa câc thày, câc cô, câc kÿ thuât viên trong

bô mon Hoâ duac và câc cân bô phong Hoâ lÿ I Viên kiëm nghiêm thuôc trung uong dâ giüp dô tôi hoàn thành tôt khoâ luân tôt nghiêp cüa minh

Tôi xin câm an su quan tâm cüa Ban giâm hiêu, phông dào tao Nhà truàng và câc thây giâo, cô giâo dâ truyên dat kiên thuc cho tôi trong suôt thôi gian tôi hoc tâp tai trucmg

Cuôi cüng tôi xin tô long biét an tôi gia dînh, ban bè và nhüng nguôi thân luôn sât cânh bên tôi trong suôt quâ trînh hoc tâp cüng nhu thuc hiên dê tài

Hà Nôi ngày 20 thâng 5 nâm 2007

Sinh viên

Nguyên Thi Ânh Tuyet

MUC LUC

Trang

DAT VAN DÊ 1»

PHAN 1: TÔNG QUAN 3

1.1 Tong quan vé Tobramycin 3

1.2 Mot so phirang phâp duac âp dung de djnh luong Tobramycin 4

1.2.1 Phirang phâp vi sinh vât 4

1.2.2 Phirang phâp HPLC 6

1.3 Tong quan vè phirong phâp HPLC 8

1.3.1 Khâi quât chung 8

1.3.2 Nguyên tâc câu tao cûa hê thong mây HPLC 8

1.3.3 Câc dai luçrng dâc trung 9

1.4 Co sô lÿ thuyët ve huÿnh quang 11

1.4.1 Su hinh thành quang pho huÿnh quang 11

1.4.2 Üng dung cûa phép do huÿnh quang 13

1.5 Phirong phâp HPLC vol Detector huÿnh quang - tao dân xuât sau côt 13 1.5.1 Phuong phâp HPLC voti detector huÿnh quang 13

1.5.2 Tao dân xuât sau cô t 14

1.5.3 Phân üng tao dân xuât phât huÿnh quang cüa Tobramycin 16

PHAN 2: THlTC NGHIÊM VÀ KÉT QUÂ 17

2.1 Nguyên vât lieu và phuong phâp thuc nghiêm 17

2.2.1 Doi tuong nghiên cüu 17

2.2.2 Thiét bj và hoâ chât 17

2.2.3 Nôi dung và phirang phâp nghiên ciru 18

2.2 Kët quâ thuc nghiêm và nhân x é t 20

2.2.1 Lira chon dieu kiên sâc k ÿ 20

2.2.2 Dânh giâ phirong phâp 28

2.2.3 Üng dung dinh luçmg Tobramycin trong chë phâm 36

2.2.4 Bàn luân 38

KÉT LUÂN 41

TÀI LIEU THAM KHÂO

PHU LUC

NHÜNG CHÜ VIÊT TÂT

Em : Birôc song bure xa (Emission)

Ex : Birôc song kfch thfch (Excitation)

EP : Duac diën Châu Âu

HPLC : Sâc kÿ long hiêu nâng cao

NSX : Ngày sân xuât

RSD : Dô lêch chuân tuang dôi

SKS : So kiëm soât

TCCS : Tiêu chuân ca sa

UV - VIS : Quang ph6 tu ngoai - khâ kiën.VSV : Vi sinh vât

* Câc don vi do lircmg diroc viët tât nhu sau:

- Dan vi do chiêu dài:

|imnm

gmgHg

LmL

^L

DAT VAN DE

Hiên nay trên thi truông thuôc, câc chë phâm khâng sinh rât phong phu và da dang Aminoglycosid là nhôm khâng sinh 1cm, rât cô hiêu quâ trong dièu tri, dâc biêt vôi câc nhiêm khuân nàng Là mot khâng sinh trong nhôm này, Tobramycin duoc chî dinh trong câc truông hop: nhiêm khuân tiët niêu, nhiêm trùng mâu, viêm màng nâo, viêm phoi, nhiêm khuân mât, do câc chung vi khuân nhay câm

Công ty co phàn Duoc phâm Hà Tây dâ sân xuât và liru hành trên thi truông sân phâm “Thuôc nhô mât Tobramycin 0,3%” vôi tiêu chuân co sô dinh luong bâng phirong phâp vi sinh vât

Cüng nhir câc khâng sinh khâc trong nhôm aminoglycosid, Tobramycin không cô hâp thu quang ô vùng tü ngoai - khâ kiën, vi vây phirong phâp dinh luong ph6 biên vân là phirong phâp vi sinh vât Phirong phâp này mât nhiêu thôi gian, dô chrnh xâc chira thât cao và không cô khâ nàng dinh tmh Vi vây, chat lirong sân phâm không diroc dânh giâ mot câch on dinh De giüp cho công ty co phàn Diroc phâm Hà Tây cô môt phirong phâp dinh lirong sân phâm chfnh xâc, on dinh và nhanh chông hon, chüng tôi nhân thây râng:

Diroc diën Mÿ USP 28 [26] dâ âp dung phirong phâp sâc kÿ long hiêu nâng cao vôi detector UV - VIS, tao dân xuât tnrôc côt dë dinh lirong Tobramycin, nhimg qui trînh tao dân xuât này rât phüc tap Gân dây trong EP

2003 [22] hay BP 2005 [18], phirong phâp sâc kÿ long hiêu nàng cao vôi detector diên hôa (detector do dong) dâ duoc dira vào sü dung dë thay thé phuong phâp vi sinh vât Phirong phâp này tiên hành nhanh, kêt quâ tin cây, song hàu hët câc co sô kiëm nghiêm trong nirôc hiên nay không dâp üng diroc câc dieu kiên dinh lirong Mât khâc dë dinh luong câc chë phâm cô chüa hoat chât vôi lirong nhô hoac không cô hâp thu quang ô vùng tü ngoai - khâ kiën thi phirong phâp sâc kÿ long hiêu nàng cao vôi detector UV - VIS lai không âp dung duoc

Detector huÿnh quang hiên nay cüng dâ diroc dùng phë bien düng thü hai sau detector UV- VIS tai câc co sô kiêm nghiêm trong kÿ thuât HPLC No duoc âp dung dë phât hiên tôt nhiêu chat phât huÿnh quang tu nhiên cüng nhu câc dân chat co huÿnh quang Tobramycin là hop chat aminoglycosid, tuong

tu nhu câc hop chat amin khâc no cüng cô khâ nàng tao dân chat phât huÿnh quang vôi mot sô thuôc thü Viêc phât hiên câc chat bàng quang phô huÿnh quang lai cô tmh dâc hiêu cao và rât nhay

Do dô, chüng tôi dâ tien hành nghiên cüu dê tài:

“Nghiên cûu dinh luong thuôc nhô mât Tobramycin 0,3% bàng phuong phâp HPLC vâi detector huynh quang, tao dân chat sau côt” vôi

câc mue tiêu sau:

- Xây dung duoc mot phuong phâp dinh luong Tobramycin bàng HPLC vôi Detector huÿnh quang - tao dân chât sau côt và dânh giâ phuong phâp vùa xây dung

- Üng dung phuong phâp vùa xây dung dë dinh luong Tobramycin trong chë phâm, tien tôi tiêu chuân hôa lai “Thuôc nhô mat Tobramycin 0,3%” cüa công ty co phân Duoc phâm Hà Tây

PHAN 1 TONG QUAN

1.1 TONG QUAN VE TOBRAMYCIN

Tobramycin là môt khâng sinh nhôm aminoglycosid thu duoc tir môi

truông nuôi cây Streptomyces tenebrarius hoàc cô thé bân tong hop tir

Kanamycin

Tên khoa hoc: 4-0-(3-Amino-3-deoxy-a-D-glucopyranosyl)-2-deoxy-6-

0-(2,6-diamino-2,3,6-trideoxy-a-D-ribo-hexopyranosyl)-L-streptamine [1]

Tinh chat: [1], [18]

+ Bôt tràng hoàc tràng ngà Dë tan trong nuôc, rât khô tan trong ethanol 96%, thuc të không tan trong cloroform và ether

+ Gôc quay eue riêng [a]D20 tir +138° dën +148°

Duoc lÿ và co che tac dung: [1], [4]

+ Tobramycin là môt khâng sinh nhôm aminoglycosid cô tâc dung vôi nhiêu vi khuân Gram (-) hiëu khi và môt sô vi khuân Gram (+) hiëu khi

Thuôc không cô tâc dung vôi Chlamydia, nam, virus và da sô vi khuân yëm khi.

+ Tobramycin rât giông Gentamycin vê tfnh chat vi sinh hoc và dôc tfnh: tâc dung manh trên vi khuân Gr(-) dâc biêt trên truc khuân mü xanh; gây dôc vôi thînh giâc và thàn, tuy nhiên dàc diëm quan trong nhâ't cûa Tobramycin là

cô hoat tfnh manh hon Gentamycin dôi vôi phàn lôn câc chüng Pseudomonas

aeruginosa và ît dôc vôi thàn hon so vôi Gentamycin.

+ Co ché tâc dung cüa Tobramycin: Lie ché su tong hop protein à câc vi

khuân nhay câm bàng câch gàn không thuàn nghich vôi câc tiëu don vi 30S cüa Ribosom

Chïdinh: [4]

Duoc chî dinh trong câc bênh nhiêm khuân nàng de doa tôi tmh mang, dàc biêt vôi câc bênh mà nguyên nhân chua rô ràng hoàc bi nhiêm khuân huyét do vi khuân Gram (-)

Dang thuôc và hàm luçfng: [4]

Thuôc không hâp thu qua duông uong, thuông duoc dùng duôi câc dang:

Lo 5 mL 0,3% dë nhô mat Tuÿp 3,5 g mô tra mât 0,3%

Thuôc tiêm: Lo 20 mg/2 mL; 60 mg/6 mL; 80 mg/8 mL; 80 mg/2 mL; 1,2 g/30 mL

1.2 MOT SÔ PHÜGNG PHÂP DlTOC ÂP DUNG DE DINH LlTONG TOBRAMYCIN

1.2.1 PHUONG PHÂP VI SINH VÂT

Nguyên tâc: Tobramycin khuyêch tân vào môi truông dung dich dac dâ

cây vi sinh vât chï thi, tao ra câc vông üc ché vi sinh vât cô duông kinh tÿ lê thuân vôi logarit nông dô tuong üng Hoat lue cüa chat thü duoc so sânh vôi chat chuân theo phuong phâp thông kê

+ Xâc dinh hoat lue khâng sinh cüa Tobramycin bàng phuong phâp vi sinh vât theo JP 14 [25]

Chüng vi khuân: Bacillus subtilis ACTT 6633

+ Dinh luçmg Tobramycin bâng phirong phâp vi sinh vât theo tiêu chuân

co sô cüa mot sô ché phâm sân xuât trong nirôc: [5], [6]

a Chüng vi khuân: Bacillus pumilus NCTC 8241.

b Dung dich dêm phosphat pH 8,0 ± 0,1 :

c Môi trudng dinh litong:

pH sau khi tiêt trùng 8,2 ± 0,2

d Chuân bi dung dich chuân và dung dich thü:

+ Dung dich chuân: Cân chmh xâc khoâng 25,0 mg Tobramycin chuân, hôa

tan và pha loâng trong dung dich dêm phosphat 8,0 dë diroc câc dung dich chuân

cô nông dô Tobramycin chmh xâc khoâng 10 IU/mL, 20 IU/mL và 40 IU/mL.+ Dung dich thü (ché phâm): Hüt chmh xâc 5,0 mL ché phâm (tuong üng vôi khoâng 3 mg Tobramycin), pha loâng vôi dung dich dêm phosphat pH 8,0

dë diroc câc dung dich thü cô nông dô Tobramycin khoâng 10 IU/mL, 20 IU/mL

và 40 IU/mL

+ Tien hành thü và trnh toân két quâ theo phirong phâp xâc dinh hoat lue khâng sinh - Duoc diën Viêt nam III [3]

1.2.2 PHUONG PHÂP HPLC

1.2.2.1 Chirong trînh HPLC 1: [181, [22]

* Dieu kiên sac ky:

- Côt styren-divinylbenzen copolymer (4,6 x 250 mm, 8 |um).

- Nhiêt dô côt: 55°C

- Pha dông: Hôn hop pha trong nuôc dâ loai carbon dioxyd chüa: 52 g/L natri sulfat khan; 1,5 g/L natri octansulfonat; 3 mL/L tetrahydrofuran và 50 mL/L dung dich kali dihydrophosphat 0,2 M dâ duoc chînh pH vè 3,0 bâng acid phosphoric loâng

- Toc dô dông: 1 mL/phüt

- Dung dich tao dân xuât sau côt: Dung dich natri hydroxyd 2% pha trong nuôc dâ loai carbon dioxyd Toc dô 0,3 mL/phüt

- Detector: Detector diên hôa (detector do dông) hoàc câc thiê't bi tuong

tu Nhiêt dô detector dât ô 35°C

- Thë tich tiêm: 20 (aL

- Nông dô dung dich chuân và thü: khoâng 0,1 mg/mL trong nuôc

1.2.2.2 Chirong trinh HPLC 2: [14]

* Dieu kiên sac ky:

- Côt Purospher® STAR RP-18e (4 x 55 mm, 3 |um, Merck).

- Pha dông: Acetonitril - nuôc (50 : 50)

- Toc dô dông: 1,3 mL/phüt

- Dung dich tao dân xuât: Dung dich 1-naphthyl isothiocyanat (NITC) trong pyridin

- Detector UV-VIS: 230 nm

- Thë tich tiêm: 10 ^iL

- Nông dô dung dich chuân và thü: khoâng 5 |ng/mL trong nuôc

- Toc dô dông: 2,5 mL/phüt.

- Dung dich thuôc thü acid 2,4,6 trinitrobenzensulfonic: Hôa tan 2,5 g acid 2,4,6 trinitrobenzensulfonic trong vùa dû 10 mL hôn hop (Acetonitril - nuôc) (80 :20)

- Detector UV-VIS: 340 nm

- Thë tich tiêm: 20 (ixL

- Nông dô dung dich chuan và thü: khoâng 0,02 mg/mL trong dêm phosphat pH 7,4

Ngoài câc phirong phâp trên, ngirôi ta cüng dâ nghiên cüu phirong phâp dinh luong Tobramycin bàng sac kÿ long trao dôi anion vôi detector diên hôa (detector do dông) [27] Câc phirong phâp dinh lirong Tobramycin nêu trên thuông mât nhiêu thôi gian (phirong phâp vi sinh vât) hoàc tien hành phüc tap

và dôi hôi phâi cô thuôc thü, trang thiê't bi dâc biêt (phirong phâp HPLC)

Mât khâc do Tobramycin cô câu trüc cüa môt aminoglycosid, không hâp thu quang ô vùng tü ngoai - khâ kién, nên khô cô thë dinh luong bàng phuong phâp hoâ hoc hoàc phât hiên bàng quang phô UV- VIS Môt trong câc biên phâp thuông duoc sü dung dë phât hiên ra câc chat không cô khâ nàng hâp thu quang ô vùng tü ngoai - khâ kiên bàng câc detector quang phô là cho no phân üng vôi môt thuôc thü dë tao thành dân xuât cô khâ nàng dâp üng vôi câc detector thich hop Tobramycin là hop chat aminoglycosid, tuong tu nhu câc hop chat amin khâc nô cüng cô khâ nàng tao dân xuât phât huÿnh quang vôi môt sô thuôc thü Viêc phât hiên câc chât bàng quang phô huÿnh quang cô

tfnh dàc hiêu cao và rât nhay, do dô chüng tôi dâ chon huông nghiên cüu là dinh lirong Tobramycin bàng sàc kÿ long hiêu nàng cao vôi detector huÿnh quang.

1.3 TONG QUAN VE PHlTONG PHAP HPLC [2], [8], [10]

1.3.1 KHÂI QUÂT CHUNG

Sàc kÿ long hiêu nàng cao (HPLC) là mot phirong phâp phân tich hoâ lÿ, dùng dë tâch và dinh luong câc thành phàn trong hôn hop dua vào âi lue khâc nhau cüa câc chât vôi hai pha luôn tiép xüc và không dông tan vcfi nhau Pha dông là chât long chây qua côt vôi môt toc dô nhât dinh duôi âp suât cao, côn pha tînh chûa trong côt hiêu nàng cao (hat nhôi) Khi dung dich cûa hôn hop câc chât cân phân tich dua vào côt, chüng së duoc hâp thu hoàc phân bô' vào pha tînh tuÿ thuôc vào bân chât cüa côt và cüa chât cân phân tich dua vào côt Khi ta bom pha dông vôi âp suât cao thi tuÿ thuôc vào âi lue cüa câc chât vôi hai pha, chüng së di chuyën qua côt vôi toc dô khâc nhau dân dén su phân tâch Câc chât sau khi ra khôi côt duoc nhân biêt bôi bô phàn phât hiên goi là detector, két quâ xü lÿ cuô'i cüng duoc hiën thi trên màn hinh mây vi tfnh

1.3.2 NGUYÊN TÂC CAU TAO CÜA HÊ THONG MÂY HPLC

Hê thông kÿ thuàt HPLC bao gôm câc bô phân chmh:

thép không rî Dung môi chay sàc kÿ duoc loc qua màng loc (thuông màng loc

cô 0,45 (im) và duéi khi hoà tan

-Bom cao âp: Bom này cô chüc nàng bom dung môi vào côt dë thuc hiên

quâ trînh tâch Bom này duoc dieu chînh âp suât dë tao ra duoc nhüng toc dô

on dinh nhât cüa câc chât cho phù hop vôi quâ trînh sàc kÿ

-Van bom mâu: Van này dë bom mâu phân tich vào côt tâch theo nhüng

luçfng nhât dinh không doi trong mot quâ trînh sàc kÿ Câc van này cô dung tich tü 5-500 jil, thuông dùng 20, 50, 100 [il

-Côt tâch: Là côt chüa pha tînh, quyét dinh hiêu quâ cüa su tâch mot

hôn hop mâu Côt tâch thucmg làm bàng thép không rî, dàc biêt tro vôi hoâ châ't và chiu duoc âp suât cao, cô chiêu dài khoâng 10- 30 cm, duông ki'nhtrong 4- 10 mm, hat chât nhôi cô (J> =5- 10 (im Thông thucmg chât nhôi côt là Silicagel hoàc Silicagel dâ duoc silan hoâ hoàc duoc bao mot lôp mông hüu

co, ngoài ra con dùng câc hat khâc: Nhôm oxit, châ't trao doi ion

-Hê thong phât hiên chât phân tich ( detector): Là bô phân phât hiên câc

chât khi chüng ra khôi côt Tuÿ theo tfnh chât cüa câc chât cân phân tich mà nguôi ta sü dung câc detector khâc nhau nhu:

> Detector hâp thu UV-VIS: 190- 900 nm dë phât hiên câc chât hâp thu quang Dây là loai thông dung nhât

> Detector huÿnh quang: Dë phât hiên câc châ't hüu co phât huÿnh quang tu nhiên cüng nhu câc dân chât cô huÿnh quang Dây là loai detector

cô dô chon loc cao nhât

> Detector diên hoâ (do dông, dô dân, eue pho, diên luong )

> Detector khôi pho

> Detector tân xa ânh sang bay hoi

> Detector chiê't xuât vi sai: Detector khüc xa

> Detector do dô dân nhiêt, hiêu üng nhiêt

detector truyên sang

1.3.3 CÂC DAI LUONG DÀC TRUNG

• Thâi gian liûi ( tR )

Thôi gian luu cüa môt châ't là thôti gian tfnh tù lüc tiêm mâu dê'n lüc xuâ't hiên dinh cûa pic trên sàc dô

Thôi gian luu dàc trung cho toc dô di chuyën cüa mot châ't, no là hàng dinh và câc chât khâc nhau thi thcfi gian luu sê khâc nhau trong cüng mot diêu kiên HPLC dâ chon Do dô no là dai luong dùng dë dinh tînh mot chât

• Hê so dung litçfng (k ’):

B là chât bi luu giü manh hon A

Dê tâch hai chât cân co a >1, thuàng dùng trong khoâng 1,05-2,0 Nêu a quâ Ion thi thoi gian phân tich kéo dài

•Sô âîa lÿ thuyêt N và chiêu cao âïa lÿ thuyêt H:

Côt sâc kÿ duoc coi nhu cô N lôp mông, ô môi lôp su phân bô châttan vào hai pha duoc coi là dat dên mot trang thâi cân bàng Nhüng lôp môngnày duoc goi là dïa lÿ thuyêt H là chiêu cao dïa lÿ thuyêt

W: chiêu rông do ô dây pic

W0 5: chiêu rông do ô nüa chiêu cao pic

Côt cô N lôn hay H nhô là côt cô hiêu lue cao, khi dô dô doâng pic nhô Trong thuc té N nam trong khoâng 2500 dén 5500 là vùa dü

•Dô phân giâi R:

Dô phân giâi là dai luçmg biêu thi dô tâch cûa câc chât ra khôi nhau trên mot diêu kiên sàc kÿ dâ cho

Hê sô bât dôi xüng cho biêt mue dô không dôi xüng cüa pic trên sâc

dô thu duoc

2 a

T nam trong khoâng 0,5-2,5 thî phép dinh luçmg duoc châp nhân

1.4 CO SÔ LŸ THUYÊT VE HUŸNH QUANG

1.4.1 SUHÎNH THÀNH QUANG PHO HUŸNH QUANG [2], [3], [7], [9]

Hiên tuçmg huÿnh quang là quâ trînh phât xa quan trong cüa nguyên tü, ion hay phân tü duoc kfch thfch nho hâp thu büc xa diên tü

Theo thuyêt luong tü, môi hat so câ'p (nguyên tü, ion, phân tü) co mot hê thong duy nhât câc trang thâi nàng luçmg Trang thâi nàng luçmg thâp nhât goi

là trang thâi co bân (S0) Khi bi kfch thich, nhu duoc hâp thu photon ânh sang thî nàng luçmg cüa photon sê duoc truyên sang hat và hat së duoc chuyén sang mot nàng luçmg cao hon goi là trang thâi kfch thich Sf, S2 (ô môi trang thâi

phân tü cô thë ton tai à câc phân müc nàng luçmg khâc nhau 0; 1; 2; 3 ) Hiên

tuong huÿnh quang xây ra khi: Câc nguyên tü tü müc thâp nhât cûa trang thâi kfch thfch vê trang thâi co bân giâi phông ra nàng luçmg bàng câch büc xa câc photon ânh sâng, goi là su phuc hôi cô büc xa, và ânh sâng büc xa này chmh

là huÿnh quang (kéo dài 10'9 —» 10'6 giây) So phân tü co khâ nàng huÿnh quang tuong dôi ft bôi vî huÿnh quang yêu câu câc dàc diëm vê câu trüc sao cho quâ trînh phuc hôi không büc xa xây ra vôi toc dô thâp và tâng cuong toc

dô phât huÿnh quang Nhiêu phân tü không co câc dâc diëm này và toc dô quâ trînh hôi phuc không büc xa vè müc nàng luong co bân lôn hon dâng kë so vôi quâ trînh hôi phuc co büc xa Vî thé mà quâ trînh huÿnh quang không xây ra.Trong hiên tuong phât quang, mot phàn nàng luong cüa ânh sâng kfch thich bi tiêu tôn chuyën thành nhiêt nàng do va cham, vi vây nàng luong ânh sâng kfch thich bao gicf cüng lôn hon nàng luong ânh sâng büc xa, hay nôi câch khâc, buôc song ânh sâng büc xa luôn dài hon buôc song cüa ânh sâng kfch thfch.

Trong phô huÿnh quang thuông dùng 2 khâi niêm:

a) Pho kich thich: Excitation spectrum (Ex)

Là duông biëu diên su phu thuôc cûa cuong dô phât quang tuong dôi (relative intensity) theo buôc song cûa ânh sâng kfch thfch

Buôc song eue dai cüa phô kfch thfch cüng chmh là buôc song eue dai hâp thu cüa chât duoc kfch thfch (duoc hoat hôa) vî vây phô kfch thfch cüng chmh là duông biëu diên môi quan hê giüa cuông dô hâp thu cüa chât dô và buôc song büc xa hâp thu

Là duông biëu diên su phu thuôc cüa cuông dô huÿnh quang cüa chât

dâ duoc hoat hoâ theo buôc song cüa ânh sâng phât ra (bûc xa huÿnh quang)

c) Vi du:

Pho kich thich Pho birc xa

Histamin dihydroclorid 1 |ig/ml

""T

300 nm 400 nm 400 nm 500 nm 6Ô0 nm

Hïnh 1 Pho kich thich và pho bûc xa cüa Histamin (Dung dich 1 /JglmL, eue dai Ex = 350 nm, eue dai Em = 440 nm)

1.4.2 ÜNG DUNG CÛA PHÉP DO HUŸNH QUANG [7], [9].

1.4.2.1 Dinh tînh

Dua vào câp buôc song eue dai Ex/Ei n dë dinh tfnh vî vôi mot châ't nhât

dinh duoc kich thfch bàng mot tia cô buôc song nào dô thî së cho mot tia cô buôc song huÿnh quang nhât dinh

1.5 PHlTCNG PHÂP HPLC VÔI DETECTOR HUŸNH QUANG - TAO DÂN XUÂT SAU CÔT

1.5.1 PHUONG PHÂP HPLC VÔI DETECTOR HUŸNH QUANG

Quang pho huÿnh quang ngoài viêc âp dung dë dinh tfnh, dinh luong câc châ't trên mây do quang pho huÿnh quang thî nô côn duoc âp dung dë chê' tao

bô phân phât hiên cûa mây sàc kÿ long hiêu nàng cao: Detector huÿnh quang

Vê nguyên tâc câu tao detector huÿnh quang gôm hai bô don sâc hoâ, mot bô cung câ'p chùm tia kfch thfch, mot bô thu nhân chùm tia phât xa huÿnh quang Hai bô phân này bô' tri truôc và sau buông do Trong detector huÿnh quang, dèn nguôn tao chùm tia kfch thfch thuông dùng là dèn xénon cô khâ nàng phât

ra bure xa trong khoâng rông 200 - 800 nm

Detector huÿnh quang dông vai trô nhu mot mây quang pho huÿnh quang kê't nô'i vôi sâc kÿ long dë phât hiên vê dinh tfnh và dinh luong câc chât sau khi ra khôi côt sâc kÿ Nô duoc âp dung dë phât hiên tôt nhiêu châ't hüu co phât huÿnh quang tu nhiên cüng nhu câc dân chât cô huÿnh quang Nguyên

tâc cüa phép do huÿnh quang là: Khi chiéu môt chùm tia sâng kich thfch cô buôc song xâc dinh vào châ't mâu, châ't này phât ra chùm tia phât xa huÿnh quang cô buôc song xâc dinh tuÿ thuôc tùng chât và cô cuông dô phu thuôc vào hàm luong cüa chüng.[9], [20], [21], [24]

Hinh 2 Sa âô câu tao cüa môt detector huÿnh quang

1.5.2 TAO DÂN XUAT SAU CÔT

Tùy theo câc chât cân dinh luong cô khâ nàng phât quang hay không mà nguôi ta tien hành dinh luçmg truc tiê'p hay giân tiê'p thông qua dân chât cüa

nô Cô nhüng hop châ't bînh thuông thi không phât quang hoàc phât quang yê'u, nhung khi chuyën sang câc dân châ't khâc thî phât quang rât manh

(VD: môt sô câc amino acid, duông, ion vô c o , ) [7], [9]

Trong truông hçrp dô, nguôi ta cô thë cho châ't cân phân tfch phân üng vôi câc thuôc thü dë tao dân xuâ't phât huÿnh quang manh truôc khi di dê'n detector huÿnh quang Nê'u chât cân phân tfch duoc phân üng vôi thuôc thü truôc khi qua côt thî kÿ thuât này goi là tao dân xuât truôc côt (pre-column) Nê'u châ't cân phân tfch duoc phân üng vôi thuôc thü sau khi dâ di qua khôi côt

và truôc khi dê'n detector, thî duoc goi là tao dân xuât sau côt (post-column)

Kÿ thuât tao dân xuât tnrôc côt không doi hôi phâi cô thiét bô phân üng di kèm theo mây HPLC nhir kÿ thuât tao dân xuât sau côt Nhung tao dân xuât trirôc côt doi hôi dân xuât tao thành phài turong dôi bên, on dinh và luçfng thuôc thCr du cô thé gây ânh hiïông trong qüa trînh tâch trên côt Sir dung kÿ thuât tao dân xuât sau côt cô thé khàc phuc dirçfc câc nhuoc diêm này nên pham vi ûng dung cua no rât 1dm [7], [21], [24].

Viêc tao dân xuât sau côt doi hôi phâi cô bô phân tao dân xuât hay côn goi là buông phân iïng sau côt thich hop Buông phân rïng sau côt cô thé cô nhiêu kiêu thiét ké khâc nhau, nhung dêu dira trên nguyên lÿ hoat dông là: câc thuôc thü së diroc bam vào buông phân irng theo mot hê thông bofm riêng, Dông thdi chat cân phân tfch sau khi ra khôi côt cüng duoc di qua buông phân ûng tao dân xuât vôi thuôc thü Dân xuât duoc tao thành së duoc dua dén detector dé phât hiên

B otti thuoc thû

Hîtih 3 Sa âô eau tao cüa mot mây HPLC Vâi detector huynh quang và bô tao dân xuât sau côt

Phân ufng tao dân xuât sau côt cân duoc thuc hiên trong thdi gian ngàn à

nhiêt dô thfch hop Nên chon thuôc thur mà trong diêu kiên tao dân xuât, thuôc thü du không bi phât hiên bcfi detector [24]

Câc thuôc thir tao dân xuât sau côt thirdng duac su dung vôi detector huÿnh quang [24]:

thuôc thur

Detector phât hiên chât dân xuât

Fluorescamin Câc horp chât chüa nhôm amin bâc

nhât: Câc amin, acid amin, peptid

Ex = 390 nm

Em = 470 nmDansyl clorid Câc protein, amin, acid amin, hçfp

chât phénol

Ex = 335 nm - 365 nm

Em = 520 nmO-

Phucfng trinh phân rïng tao dân xuât phât huÿnh quang cüa hop chât chüa nhôm amin vôi thuôc thu ortho-phthalaldehyd:

Hdp chât phât huÿnh quang

Trong phân ung tao dân xuât phât huÿnh quang vôi ortho-phthaldehyd phâi cô thêm mot chât cô nhôm mercapto (-SH), thucfng sü dung là mercaptoethanol hoac mercaptoacetic

PHAN 2 THl/C NGHIÊM VÀ KÊT QUÂ

2.1 NGUYÊN VÂT LIÊU VÀ PHI/ONG PHÂP THIIC NGHIÊM

2.1.1 DÜI TlTONG NGHIÊN CTJtJ

• Thuoc nhô mât Tobramycin 0,3 % cüa công ty co phân Duoc phâm Hà Tây (HATAPHAR)

Vd 1,0 mL

• Chât chuân Tobramycin (C18H37N50 9); SKS: 0103167, duoc sân xuât tai Viên kiëm nghiêm thuôc Trung uong (Hàm luong nguyên trang: 949,64 )ig/mg).2.1.2 THIÊT BI VÀ HOÂ CHAT

2.I.2.I Dung môi, hoâ chât

+ Methanol tinh khiét HPLC

+ Natri pentansulfonat tinh khiét HPLC

2.I.2.2 Thiet bi, dung eu

+ Mây HPLC vôi detector huÿnh quang và bô phàn üng tao dân xuàt sau côt

+ Mây lac siêu âm

+ Mây do pH

+ Bô loc dung môi, loc mâu vol màng loc 0,45 jim

+ Cân phân tfch co dô chmh xâc ±0,1 mg

+ Câc dung eu thuÿ tinh chrnh xâc: binh dinh mire, pipet chmh xâc, ong dong

2.1.3 NÔI DUNG VÀ PHI/ÛNG PHÂP NGHIÊN CÜU

2.I.3.I Nôi dung

Khâo sât lua chon dieu kiên sac kÿ

Tobramycin là chat htfu co phân eue, tan nhiêu trong nirôc Vi vây de

phân tfch và dinh ltfông tôt, chüng tôi chon phuong phâp HPLC pha dâo: Tien hành trên mây sàc kÿ long hiêu nâng cao detector huÿnh quang cô bô tao dân xuât sau côt

Và trên ca sô cô sân côt RP-18 Brava ODS (150 x 4,6 mm; 5 fj,m), chuong trînh sàc kÿ duoc xây dung trên chuân Tobramycin cùng vôi viêc phân

tfch mâu nghiên cûu nhâm khâo sât chon diêu kiên sâc kÿ thfch hop:

❖ Khâo sât chon càp biréc song kfch thfch và buôc song phât xa cho detector huÿnh quang

♦♦♦ Khâo sât chon thành phàn pha dông thfch hçfp cho phép phân tfch Tobramycin

♦♦♦ Khâo sât chon dung dich thuôc thû tao dân xuât sau côt

♦♦♦ Khâo sât chon toc dô dong pha dông và toc dô bom thuôc thü’

Tir câc diêu kiên dâ lua chon chüng tôi tien hành dânh giâ tfnh thfch hop cüa hê thông sàc kÿ

Dânh giâ phuong phâp: [13]

Phircfng phâp phân tfch cân diroc dânh giâ theo câc tiêu chf sau :

o Tfnh dàc hiêu cûa phirong phâp

o Dô tuyén tfnh giüa nông dô Tobramycin và diên tfch pic

o Dô lap lai cüa phirong phâp

o Dô düng cûa phirong phâp

2.1.3.2 Phirong phâp nghiên cuu

- Phirong phâp thuc nghiêm dë tîm ra diëu kiên sàc kÿ tôi iru, thu thâp sô lieu và xü lÿ thông kê (sü dung công eu hô tro là phân mêm thông kê SPSS)

dë dânh giâ két quâ

- Phirong phâp eu thë : HPLC vôi detector huÿnh quang- tao dân chât sau côt dua trên phân üng cüa Tobramycin vôi thuôc thü tao dân xuât cô khâ nàng phâp huÿnh quang

2.1.3.3 Câc dâc trimg thông kê dë xur lÿ két quâ phân tich.

Giâ tri trung binh :

Dô lêch chuân:

Dô lêch chuân tuong dôi :

RSD (%) = ^ 1 0 0

Trong dô : Xj là két quâ cüa lân xâc dinh thü i

n là sô lân xâc dinh

2.2.1 LUÂ CHON DIEU KIÊN SAC KŸ

2.2.I.I Chon cap btïôc sông kîch thich và phât xa

Nhu dâ dè câp à phân tong quan, Tobramycin là môt chât hâp thu UV -

VIS rât thâp, dô hâp thu UV - VIS cüa Tobramycin không thfch hop de phât hiên bàng detector UV - VIS

Vôi mot detetor cô dô nhay rât cao là detector huÿnh quang, chüng ta cô

thé phât hiên duoc nhiêu chât à nông dô rât thâp.

+ De chon câp buôc sông kfch thfch và birc xa eue dai cho detector huÿnh quang, chüng tôi tien hành quét pho nhu sau:

- Cô dinh buôc sông kfch thfch (Ex) (dat ô 1 sô buôc sông khâc nhau), quét pho buôc sông büc xa dé tim buôc sông büc xa eue dai

- Co dinh burôc song büc xa (Em), quét pho buôc song kich thich dê tim

buôc song kfch thich eue dai Duoc X(Ex)max = 338 nm (Hinh 5.).

Hinh 5 Pho kich thich huÿnh quang cüa dân chât Tobramycin vôi thuôc thü o-phthalaldehyd.

+ Két quâ, lua chon duoc cap buôc song eue dai Ex/Em = 338 nm /455 nm.

2.2.I.2 Khâo sât lira chon thành phàn và tÿ le pha dông

Qua nghiên cüu tfnh châ't lÿ hoâ cüa Tobramycin và dua trên mot sô' tài lieu tham khâo [15] [16] [23], chüng tôi dâ tiê'n hành khâo sât so bô vôi nhiêu pha dông khâc nhau Tü két quâ khâo sât so bô, chüng tôi chon pha dông pha trong nuôc vôi thành phàn gôm natri sulfat, natri pentansulfonat và acid acetic

dë tiép tue khâo sât lua chon nông dô tôi Uu cho câc thành phàn trong pha dông

• Ânh huông cüa nông dô natri sulfat trong pha dông

Khâo sât câc pha dông chüaO,l% acid acetic và 0,02 M natri pentansulfonat vôi nông dô natri sulfat thay doi làn luot là: 0,1 M; 0,125 M; 0,15 M và 0,2 M

Két quâ khâo sât cho thâ'y khi tàng nông dô natri sulfat trong pha dông,

thôi gian luu cüa Tobramycin së giâm di và pic së gon hon (Xem Hinh 6).