So sánh hai phương pháp định lượng clarithromycin trong viên nén bằng HPLC trong viên nén bằng HPLC và bằng vi sinh vật

Câc Duac diën DD nuôc ngoài nhu DD Mÿ USP 28, DD Nhât JP2001, DD Anh BP2005 dinh luçmg Clarithromycin bâng HPLC; DD Trung Quô'c 2000 và mot sô tiêu chuân nhà sân xuâ't dinh luçmg Clarith

BÔ Y TÉ TRlTÔNG DAI HOC DÜOC HÀ NÔI

î a X s *

TRLfONG THj THU Hl/ÔNG

SO SANH HAI PHITONG PHÂP

TRONG VIÊN NÉN BÂNG HPLC VÀ

BÀNG VI SINH VÂT

(KHOÂ LUÂN TÔT NGHIÊP DUOC SÏ KHÔA 2004 - 2007)

Nguôi huomg dân: PGS - TS THÂI DUY THÎN

PGS - TS THÂI PHAN QUŸNH NHÜ

Noi thtfc hiên: Viên kiém nghiêm thuoc Trung uang

Trung tâm kiém nghiêm Dirac - Mÿ pham Binh Dinh

Thoi gian thuc hiên: 2/2007 - 5/2007 _ \

7 ô à Q I U , th â n g 5 - 2 0 0 7

Trircfc hét tôi xin bày tô long thành kmh và biét an sâu sâc nhât toi

PGS -TS Thâi Duy Thin, PGS -TS Thâi Phan Quÿnh Nhir và DSCKI Nguyen Duy Khang là nhüng nguôti thây dâ truc tiép huomg dân, dâ dành nhiêu thôi gian và tâm sire giüp dô tôi trong suot quâ trinh nghiên cuu

Tôi xin trân trong câm on Ban Giâm hiêu cùng câc thây cô giâo Trifàng Bai hoc Difdc Hà Nôi dâ nhiêt tînh giâng day, truyën dat kiên thirc vô cùng quÿ bâu cho tôi trong suô't quâ trînh hoc tâp tai truèng cüng nhu trong quâ trinh thuc hiên khôa luân này

Tôi xin bày tô long biét on Viên kiem nghiêm thuoc Trung ifdng

dâ tao moi dièu kiên thuân loi cho tôi trong quâ trînh thuc hiên dê tài

Tôi xin câm on Lânh dao Trung tâm Kiê’m nghiêm Dirçfc pham

- Mÿ pham tïnh Binh Djnh và câc dông nghiêp dâ tao diêu kiên giüp dô tôi trong thôi gian qua dé tôi hoàn thành tôt khôa hoc vàn bàng 2 - Dai hoc Duac

và trong quâ trinh thuc hiên dê tài khôa luân này

Cuôi cùng tôi xin câm cm nhüng nguôi thân trong gia dinh và ban bè dâ luôn dông viên quan tâm chia sê cùng tôi trong quâ trinh hoc tâp

Hà nôi, thâng 5 nâm 2007

Trufong Thi Thu Hufrng

MUC LUC

Trang

Dàt van dê 01

Phàn 1: TÔNG QUAN 1.1 Tong quan vê khâng sinh Clarithromycin 2

1.1.1 Câu truc 2

1.1.2 Công thtic câ'u tao cüa Clarithromycin 2

1.1.3.Tmh châ't hôa lÿ 2

1.1.4 Duçfc lÿ và ca ché tac dung 3

1.2 Tong quan câc phuong phâp dinh luçmg Clarithromycin trong viên n én 5

1.2.1 Phuong phâp sâc kî long hiêu nâng cao (HPLC) 5

1.2 2 Phucmg phâp Vi sinh vât dinh luçmg khâng sinh 11

Phàn 2: THUC NGHIÊM VÀ KÉT QUÂ 21

2.1 Nguyên vât lieu và phuong phâp thuc nghiêm 21

2.1.1 Nguyên vât liêu và thiê't bi 21

2.1.2 Phuong phâp nghiên cuti 22

2.2 Kê't quâ thuc nghiêm và nhân xét 23

2.2.1.Kêt quâ thuc nghiêm dinh luçmg Clarithromycin / viên nén bàng HPLC 23

2.2.2 Kê't quâ thuc nghiêm dinh luçmg Clarithromycin/viên nén bàng Vi sinh vât.31 2.2.3 So sânh hai phucmg phâp dinh luçmg Clarithromycin trong viên nén 35

2.2.4 Âp dung hai phuong phâp dinh luçmg trên de dinh luçmg mot so chê pham viên nén Clarithromycin 37

KÉT LUÂN 40 Tài liêu tham khâo.

Phu lue: Câch tînh toân dinh luçmg Clarithromycin bàng vi sinh vât ( bàng phàn mém tfnh toân theo phuong phâp ngâu nhiên)

DAT VAN DÊ

Van dë bâo dâm châ't luçmg thuô'c là rat quan trong, bol vï châ't luçmg thuô'c ành hirong lôn dê'n tmh mang, suc khoê ngudi bênh và hiêu quâ dieu t r i

Hiên nay thuô'c viên nén Clarithromycin liru hành trên thi truông Viêt Nam khâ pho bien do duac nhâp khâu và duac nhiêu doanh nghiêp duac pham trong nuôc sân xuâ't Thuô'c khâng sinh Clarithromycin thuôc nhôm khâng sinh macrolid, cô thcâ gian bân thâi kéo dài han Erythromycin và thâi trir mot phàn dâng kë qua nuôc tiëu cho nên cô loi cho nhiêm khuân tiê't niêu sinh duc han câc thuô'c khâc trong nhôm Clarithromycin tâc dông trên câc vi khuân Streptococcus, Staphylococcus,

Helicobacter pylori và câc vi khuân ca hôi manh han Erythromycin.

Nhung Duac diën môi nhâ't cüa Viêt Nam (DDVN III) chua cô chuyên luân kiém nghiêm chê' phâm viên nén Clarithromycin Câc Duac diën (DD) nuôc ngoài nhu DD Mÿ (USP 28), DD Nhât (JP2001), DD Anh (BP2005) dinh luçmg Clarithromycin bâng HPLC; DD Trung Quô'c 2000 và mot sô tiêu chuân nhà sân

xuâ't dinh luçmg Clarithromycin trong viên nén bàng vi sinh vât Dë cô ca sa lua

chon phuong phâp kiëm nghiêm dinh luçmg Clarithromycin trong viên nén phù hap vôi diéu kiên khoa hoc kÿ thuât, ca sà vât châ't và diéu kiên kinh te cüa câc Trung

tâm kiëm nghiêm duac phâm à câc dia phuong nhung vân dâm bâo dô chmh xâc, tin

cây; Phuc vu cho công tâc kiëm tra châ't luçmg thuô'c, dâm bâo chat luçmg thuô'c sân xuâ't và luu hành, an toàn cho ngucd su dung Chüng tôi tien hành nghiên cüu so sânh 2 phuong phâp dinh luçmg Clarithromycin bàng HPLC và bàng vi sinh vât

Mue tiêu dê tài:

• Dânh giâ phuong phâp dinh luçmg Clarithromycin trong viên nén bàng Sâc kÿ long hiêu nâng cao (HPLC)

• Dânh giâ phuong phâp dinh luang Clarithromycin trong viên nén bàng vi sinh vât

• So sânh 2 phuong phâp dinh luçmg Clarithromycin trong viên nén bàng HPLC và bàng Vi sinh vât

Phân 1 TÔNG QUAN

1.1 TÔNG QUAN VÊ CLARITHROMYCIN

1.1.1 Câu truc: Heterosid thân lipid [3],

Clarithromycin chüa vông lacton 14 câu tir là khâng sinh nhôm macrolid thé

hê II diroc bân tong hop tù Erythromycin A bàng câch thay -OH (à vi tri 6) bàng

nhôm -OCH3 (methoxy)

Phân genin là vông lacton lôn gôm alkyl và -OH Phân dircmg (ose) gôm câc dirông trung tmh và duông amin; dircmg amin dua lai tmh base cho phân t ü

1.1.2 Công thurc câu tao: [20 ], [22 ], [23 ], [24 ]

O

H3C II CH3

CH3

Công thurc: C38H69NOi3 Phân tir luçmg : 748

Tên khoa hoc: (37?,4S,55,6/?,7/?,9/?,ll/?,12/?,131S,14/?)-4-[(2,6-Dideoxy-3-C-methyl- 3-<9-methyl-a-L-n7?e>-hexopyranosyl)oxy]-14-ethyl-12,13-dihydroxy-7-methoxy-3,5,7,9,1 l,13-hexamethyl-6-[[3,4,6-trideoxy-3-(dimethylamino)-b-D-xy/o-

hexopyranosyl]oxy]oxacyclotetradecane-2,10-dione

Hoâc 6-O-methylerythromycin A

1.1.3 Tînh chat hôa lÿ:_[3 ], [ 20], [22 ], [23 ]

> Bôt két tînh màu trâng hoâc gân nhu không màu, vi rât dàng

> Không tan trong nuôc, tan nhiêu trong dung môi hüu cô (aceton, methylen clorid), tan ît trong methanol và ethanol

> Bên à pH acid.

> Vông lacton dê bi phâ vô à trong môi trirdng pH quâ kiëm hoâc quâ acid.

> Cho phàn ûng màu vôi acid sulfuric, acid clohydric dâm dâc - Câc phàn ûng hôa hoc dinh tmh Clarithromycin nhu sau: [22 ]

- Lâ'y mot luçmg ché phâm Wang üng 5mg Clarithromycin thêm 2mlH2S04 xuât hiên màu dô nâu

- Lâ'y mot luçmg chê' phâm tucmg lîng 3mg Clarithromycin thêm 2mlaceton và thêm 2ml HC1 xuât hiên màu cam rôi chuyën sang dô tfm

> Dinh tmh bàng phuong phâp sâc kÿ lôp mông: [22 ]

- Ban mông silicagel GF254

- Hê dung môi triën khai: Cloroform-Methanol-Amoniac tî lê (100:5:1)

- Dung dich chuân: 2,5mg Clarithromycin/4ml CHC13

- Dung dich thû: Lâ'y mot luçmg bôt chê' phâm tuong duong 12,5mg Clarithromycin hôa tan trong 20ml, loc lâ'y dung dich loc chàm sâc kÿ

- Chàm riêng biêt 5|il dung dich thü và chuân lên bân mông

- Triën khai trong pha dông 12cm, lâ'y ra dë khô trong không khi

- Hiên màu: Phun acid sunfuric dâm dâc, sâ'y 105°C trong lOphüt

> Dinh luçmg:

• Phuong phâp HPLC [10 ], [12], [20 ], [ 21], [ 22], [24]

• Phucmg phâp vi sinh vât [9 ], [11 ],[ 23]

1.1.4 Dirçrc lÿ và ca chê tâc dung: [2 ] ,[8 ]

> Ca chê tâc dung :

- Clarithromycin thuông cô tâc dung kim khuân, ngoài ra cô thë cô tâc

dung diêt khuân a liêu cao hoâc dô'i vôi nhîrng chüng nhay câm

- Clarithromycin ûc chê' su tong hop protein à vi khuân nhay câm bàng

câch gân vào tiëu dan vi 50S ribosom, làm cho câc acid amin không gân vào chuôi peptid dang thành lâp do dô không tong hap duac câc protein càn thiê't dân dê'n vi khuân bi tiêu diêt

- Clarithromycin tâc dông lên câc vi khuân Staphylococcus, Streptococcus, Helicobacter pylori và câc vi khuân ca hôi manh han Erythromycin

Ngoài ra Clarithromycin côn cô tâc dung rat manh dôi vôi Chlamydia spp, Ureaplasma, Mycobacterium spp.

> Duac dông hoc

- Clarithromycin bén vüng trong môi trirdng acid, hâ'p thu tôt qua diràng

tiêu hôa Thuoc chuyên hôa à gan và thâi ra phân qua duông mât, mot phân dâng kë

thâi qua nuôc tiëu Nira dcfi cüa Clarithromycin khoàng 3-4giô

> Chî dinh

- Clarithromycin duac chî dinh thay thê' cho penicillin khi bi nhiêm vi

khuân nhay câm nhu viêm amidan, viêm tai giûa, viêm xoang câ'p, viêm phé quân man cô dot cap, viêm phoi, da và câc mô mêm Dâc biêt dë diêu tri viêm phoi do Mycoplasma pneumoniae và Legionella, bênh bach hâu và giai doan dàu cüa ho gà

và nhiêm khuân co hôi do Mycobacterium

- Clarithromycin duac dùng dë diêt trùf Helicobacter pylori trong diéu tri bênh loét da dày-tâ tràng dang tiê'n triën

> Chong chî dinh:

- Ngirôi bi di iïng vôi câc macrolid

- Chông chî dinh tuyêt dôi dùng chung vôi terfenadin

> Lieu luang:

- Ngucfi lôn: 250-500mg, 21àn/ngày.

- Trê em: Liêu thông thuôfng : 7,5mg/kg thë trong, 2 làn/ngày

- Clarithromycin dùng phoi hop vôi chat trc chê bam proton và câc thuoc khâc vôi liêu 500mg, 3 làn/ngày dë diêt tân gô'c Helicobacter pylori

1.2 TÔNG QUAN CÂC PHUONG PHÂP DINH LlTONG CLARITHROMYCIN TRONG VIÊN NÉN:

1.2.1 Phuong phâp sâc kÿ long hiêu nâng cao : [6], [7], [17], [20], [24]

1.2.1.1.Khâi quât vé phuong phâp sâc kÿ long hiêu nâng cao (HPLC):

Phuong phâp sâc kÿ long hiêu nâng cao (HPLC) là mot phuong phâp phân tîch hôa lÿ dùng dë tâch, dinh tmh và dinh luang câc thành phàn trong hôn hop dua trên ai lue khâc nhau giûa câc châ't vôi hai pha luôn tiép xüc nhung không trôn lân vôi nhau: pha dông là châ't long và pha tînh chuta trong côt Quâ trinh sâc kÿ long dua trên ca chê' hâ'p phu, phân bô', trao doi ion hay phân loai theo kîch cô Ngày nay HPLC dâ và dang duac sur dung nhiêu trong ïïnh vire phân tîch hôa hoc nôi chung cüng nhu trong kiëm nghiêm thuô'c và phân tîch sinh duac hoc

Quâ trinh phân tâch trong kÿ thuât HPLC là do quâ trinh vân chuyën và phân bô' cüa câc chat tan giûa hai pha khâc nhau Dung dich câc chat phân tîch khi vào côt sê duac hâ'p phu hoâc liên két vôi pha tînh tùy thuôc vào bân châ't cüa côt và cüa châ't càn phân tîch Pha dông duac bam qua côt duôi âp suât cao sè di chuyën vôi mot toc dô nhâ't dinh khi qua côt sâc kÿ sê dây câc châ't tan bi pha tînh luu giû ra khôi côt Tùy theo bân chat pha tînh, bân châ't cüa châ't tan, bân chât dung môi mà quâ trinh rüa giâi tâch duac câc châ't ra khôi côt sâc kÿ Câc châ't sau khi ra khôi côt

sê duac phât hiên bôi detector ( tü ngoai, dô dân, huÿnh quang, chî sô khüc xa ) Tùy theo bân chât cüa chât càn phân tîch mà sü dung detertor thîch hop câc tîn hiêu duac chuyën qua bô xü lÿ kê't quâ Kê't quâ cuô'i cùng duac dua ra mây in hoâc hiën thi trên màn hinh Nêu ghi quâ trinh tâch sâc kÿ cüa hôn hap nhiêu thành phân, ta së

cô mot sâc dô gôm nhiêu pic Quâ trinh tâch sâc kÿ tôt thi hôn hop cô bao nhiêu thành phàn sê cô bâ'y nhiêu pic riêng biêt trên sâc kÿ dô

Két quâ cüa quâ trînh sâc kî duac detertor phât hiên, phông dai và ghi thành sâc kÿ dô (hinh 1):

Hinh 1: Sâc kÿ do cüa hai chât và câc thông so dâc trung

Trong dô:

to (thôi gian chét): Là thôi gian cân thiët dë pha dông chày qua côt tâch

tR (thôi gian luu): thôi gian kë tù khi chât càn phân tîch duac bam vào côt chodén khi xuât hiên dinh cüa pic châ't cân phân tîch

tR’(thôi gian luu thuc) = tR-t0

8: Dô rông nüa pic tai câc diëm uôn tuong ung

W0)5: Dô rông pîc à nüa chiêu cao = 2,354 8

W: Dô rông dây pic

a/ Thôi gian luu tR (Rétention time)

Thôi gian luu cüa mot chât là thôi gian tînh tù lue bam mâu vào côt dén khi chât dô ra khôi côt giâ tri eue dai

Thôi gian luu tR cüa môi chât là hâng dinh và câc chât khâc nhau thi thôi gian luu sê khâc nhau trên cùng mot dieu kiên HPLC dâ chon Vî vây, thôi gian luu chînh

là dai luçmg dë phât hiên dinh tînh câc chât

Trong mot phép phân tîch nê'u tR nhô quâ thî su tâch kém, côn lôn quâ (tR >20 phüt ) thi pic bi doâng và dô lâp lai kém, thôi gian phân tîch dài Dë thay dôi thôi gian luu ta thay dôi mot hoâc nhiêu yéu tô phu thuôc trên.

b/ Hê sô dung luçmg k ’ : Capacity factor

Hê sô dung luçmg cüa mot chat cho biét khâ nâng phân bô cüa chât dô trong 2 pha trên suc chüa cüa côt, tüc là tî sô giûa luçmg châ't tan trong pha tînh và luçmg

châ't tan trong pha dông ô thôi diëm cân bàng:

k' = —- = ~^° = — — 1

K t0 <o

Nê'u k’ nhô thi tR cüng nhô và su tâch kém, k’ lôn thi pic bi doâng, dô nhay kém, thôi gian luu kéo dài Trong thuc té k ’ tù 1 dén 5 là tôi uu

cl Dô chon loc a: Selectivity

Dô chon loc a cho biét hiêu quâ tâch cüa hê thô'ng sâc kÿ, khi hai châ't A, B

cô k ’A và k ’B khâc nhau thi môi cô khâ nâng tâch, müc dô tâch biëu thi à dô chon

loc : a = k \ I ra to vôi diêu kiên kA’> kR’

a khâc 1 càng nhiêu thî khâ nâng tâch càng rô ràng

d/ Sô dïa lÿ thuyê't N: Theoretical plates

Sô' dîa lÿ thuyê't là dai luçmg biëu thi hiêu nâng cüa côt trong mot diéu kiên sâc kÿ nhâ't dinh Môi dïa lÿ thuyê't trong côt sâc kÿ nhu là mot lôp pha tînh cô chieu cao là H, lôp này cô tfnh châ't dông,

Vi vây vôi mot diêu kiên sâc kÿ xâc dinh thi chiëu cao H cüng hàng dinh dôi vôi mot châ't và sô' dïa lÿ thuyê't cüa côt cüng duoc xâc dinh

Sô' dîa lÿ thuyê't N duac tfnh theo mot trong 3 công thuc sau:

jV = 16 JL hoâc 5,54 lR X2

w

v o.5 y

hoâc

e/ Dô phân giâi R: Resolution

Dô phân giâi là dai luçmg biëu thi dô tâch cüa câc chat ra khôi nhau trên mot diêu kiên sâc kÿ dà cho

hoâc hoâc a ~ l k'B ^

WA + W g W0 5 A + ^0,5B & ^ ^ B 4

Trong thuc té néu câc pic cân dôi (Gauss) thî dô phân giâi toi thiëu dë 2 pic

tâch là R=l, dinh luang R=l,5 là phù hop

* Néu R nhô thî câc pic chua tâch han, viêc tfnh diên tîch pic sê không chmh xâc, lue này phâi tim câch tâng R theo 3 câch sau dây:

Làm thay dôi k ’ bàng câch thay doi lue rüa giâi cüa pha dông

Làm tâng sô' dïa lÿ thuyét cüa côt bàng câch dùng côt dài han hoâc côt cô

kich thuôc hat nhô han

Làm tâng dô chon loc a bàng câch dùng côt khâc phù hçfp han vôi quâ trinh

tâch, hoâc thay dôi nông dô pha dông

Néu R lôn qua thi thôi gian phân tich sê lâu, ton nhiêu pha dông, dô nhay sê

kém Luc này thi phài tim câch làm giâm R bàng câch: tfng dung quâ trinh rüa giâi

Gradient dë cho chât thür hai ra nhanh han, néu thiët bi không cô khâ nâng này thî

phâi thay dôi thành phân pha dông

f/ Hê sô không doi xüng T: Tailing factor.

Hê sô không dôi xüng T cho biét mue dô không dôi xüng cüa pic trên sâc dô

W

thuduac.: T =

—■-2 A

Trong dô: Wx là dô rông cüa dây pic do à 1/20 chiêu cao cüa pic.

A là khoâng câch tù duông vuông gôc hKhi T nàm trong khoâng 0,5-2,5 thi phép dinh luçmg duac châ'p nhân, nê'u

T>2,5 thî diëm cuô'i cüa pic rât khô xâc dinh Vî vây cân thay dôi câc diêu kiên sâc

kÿ dë làm cho pic cân xûng han theo câc câch sau:

- Làm giâm thë tich chê't, tue là doan nô'i tù côt dén detector

- Thay dôi thành phàn pha dông sao cho khâ nâng rüa giâi tâng lên

- Giâm bôt luang mâu dua vào côt bàng câch pha loâng mâu phân tîch hoâc

giâm thë tich tiêm

Dô phân giâi cüa hai pic canh nhau duac tînh theo 1 trong 3 công thuc:

1.2.1.3 Nguyên tâc câu tao cüa mây sâc kÿ long hiêu nâng cao:

May HPLC gôm cô câc bô phân ca bân duac tôm tât trên sa dô (Hinh 2)

Hinh 2 : Sffdo mây sâc kÿ long hiêu nâng cao

Trong dô:

1 Bînh dung dung môi (pha dông) 4 Côt sâc kÿ (pha tînh)

Dê'n nay câc bô phân cüa mây HPLC dâ duac câi tiê'n, hiên dai hôa cao, ta cô

thë cô mot mây HPLC theo ÿ muô'n vôi câc câu hînh lua chon nhu sau:

a/ Binh dung dung môi (pha dông) và hê thông xùr lÿ dung môi:

- Pha dông là yê'u tô' thü 2 quyê't dinh hiêu suât tâch sâc kÿ, no quyê't dinh thôi gian luu giü cüa câc châ't phân tîch và hiêu quâ cüa su tâch sâc kÿ Pha dông cô

thë làm thay doi: Dô chon loc a; Thôi gian luu tR; Hiêu nâng cüa côt tâch H; Dô

phân giâi R; Dô rông hoâc su cân dôi pic

+ Trong truông hop rüa giâi thuông (isocratic) chî càn 1 bînh dung môi

+ Trong trucfng hap rüa giâi gradient:

Thucmg dùng 2,3,4 bînh chua câc dung môi khâc nhau và hê dung môi rüa giâi là hôn hop câc dung môi trên duac trôn trong quâ trînh sâc kÿ vôi tî le bien doi theo chuang trinh dâ dinh.

b/ Boni cao âp:

De bam pha dông vào côt tâch thuc hiên quâ trînh sâc kÿ, bom phâi tao duac

âp suât cao (khoâng 250at-500at) và phâi tao dông liên tue

cl Côt tâch:

Côt chua pha tînh duac coi là trâi tim cüa hê thong sâc kÿ

+ Côt pha tînh thucmg làm bàng thép không ri, dài khoâng 10-30cm, dudng kmh trong 4-10mm, hat nhôi cô 5-10|im

+ Vôi châ't nhôi côt cô 3-5 jum cô thë dùng côt ngân (3-10cm) và nhô (duông kmh trong 1- 4,6cm) loai côt này co hiêu nâng râ't cao

+ Chât nhôi côt tùy theo loai côt và kiëu sâc kÿ.Thông thucmg châ't nhôi côt

là silicagel hoâc là silicagel dâ duac silan hôa hoâc bao môt lôp mông h Cru ca, Nguôi ta côn dùng câc hat khâc: Nhôm oxit, polymer xô'p, chât trao doi ion

+ Doi vôi câc phuong phâp phân tich yêu câu nhiêt dô cao hoâc thâ'p hem nhiêt dô phông thi côt sê duac dât trong bô phân diéu nhiêt

d/ Detector

+ Là bô phân phât hiên câc chât khi chüng ra khôi côt và cho câc tm hiêu ghi trên sâc kÿ dô dë cô thë dinh tînh và dinh luçmg Tùy theo tînh châ't cüa câc châ't cân phân tich mà nguôi ta sü dung loai detector thfch hap và phâi thôa màn diêu kiên trong môt vùng nông dô nhâ't dinh cüa chât phân tich

+ Tm hiêu cô thë là: Dô hâ'p thu quang, cuàng dô phât xa, cucmg dô dông diên, diên thê', dô dân diên, chiét suât

Cô câc loai detector sau :

+ Detector quang pho tü ngoai và khâ kiên: 190-900nm dë phât hiên câc chât hâ'p thu quang Dây là loai thông dung nhâ't Loai don giàn chî cô thë dât môt buôc

sông cô' dinh trong quâ trînh sâc kÿ Loai hiên dai là loai Diod array cô khâ nâng thay doi buôc sông theo chuang trinh dâ cài dât trong mot quâ trînh sâc kÿ

+ Môt sô' loai detector khâc: Detector do khüc xa vi sai; Detector huÿnh quang; Detector diên hoâ; Detector khô'i pho, Detector tân xa ânh sâng bay hai

1.2.1.4 Diéu kiên tien hành:

Trên ca sô môt mây HPLC dâ duac lira chon, dë tien hành phân tich thi phâi

cô môt diêu kiên sâc kÿ phù hofp Diêu kiên này cô thë duac nêu ra trong câc tiêu chuân chât luçfng cüa chê' phâm càn kiëm nghiêm, nê'u chua cô thi phâi tien hành nghiên cün xây dung Môt diêu kiên sâc kÿ bao gôm:

- Pha tînh: Loai côt sâc kÿ và câc thông sô vê kich thuôc

- Pha dông: Thành phàn và tî le câc thành phàn, tô'c dô dông hoâc chuang trinh gradient dung môi

- Detector: Loai detector và câc thông sô phù hçfp

- Thë tich bam mâu; Câc yê'u tô' khâc: Nhiêt dô, thuô'c thü

1.2.1.5 Câch tînh két quâ:

- Dua vào diên tich hoâc chiêu cao cüa pic dâp umg cüa dung dich chuân và dung dich thü cô tuang quan tÿ le thuân trong khoâng tuyê'n tînh dâ khâo sât, ta tmh duçfc nông dô dung dich thü

- Thông thucmg dung dich chuân duçfc sü dung là ngoai chuân, nhung cô nhüng trucfng hçfp dâc biêt phâi dùng nôi chuân hoâc thêm chuân

- Trong câc nghiên cüru chua cô châ't chuân, cô thë tînh theo phân trâm diên tich pic: Nông dô cüa mâu thü duac tfnh toân dua trên diên tich pic tfnh theo tî lê phàn trâm diên tîch pic chât thü trên tong diên tîch toàn bô pic cô trong sâc dô Trong HPLC, phuong phâp này chî dung khi cô su dâp ûng cüa detector trên tâ't câ câc châ't là nhu nhau, nê'u nhu không nhu nhau khi dô vôi môi châ't càn cô hê sô' hiêu chînh

1.3.2 Phuong phâp dinh luang khâng sinh bàng vi sinh vât:[l] ,[4] ,[7],[ 13], [14] [15], [18], [23],

1.3.2.1 Khai quât vê phuong phâp dinh luçmg khâng sinh bàng vi sinh vât:

Phuong phâp vi sinh vât là môt trong nhüng phuong phâp duçfc sûr dung dâu tiên dë xâc dinh hoat lue cüa thuoc khâng sinh, nhâ't là nhûng khâng sinh môi, hoâc nhûng châ't cô tâc dung khâng khuân Dôi vôi nhûng châ't cô nguôn gô'c sinh vât mà tâc dung sinh hoc không thë tuong un g vôi phân ûng hoa hoc, nguôi ta thuông âp dung phuong phâp vi sinh vât.

Phuong phâp này cô nhûng uru diëm sau:

+ Rat nhay câm, nên cô thë xâc dinh à hàm luçmg nhô.

+ Cô tfnh dâc hiêu cao, nên su cô mât cüa câc hôn hçfp khâc không ành huông dén két quâ thi nghiêm

+ Rât thfch hçfp dôi vôi khâng sinh, câc chât diêu chê' tùr vi sinh vât, câc vitamin và câc acid amin trong hôn hçfp

+ Phuong phâp xâc dinh hoat lue khâng sinh bàng vi sinh vât dâ duçfc nghiên cüru nhiêu vê lÿ thuyê't và thuc hành

Dë xâc dinh hàm luçmg cüa câc khâng sinh, thuông âp dung pho bien hai phuong phâp: Phuong phâp khuyê'ch tân và Phuong phâp do dô duc

Dôi vôi dê tài này chî sü dung phuong phâp khuyê'ch tân

I.3.2.2 Nguyên tâc cüa phuong phâp khuyê'ch tân:

Trong thü nghiêm, nhûng khâng sinh chua biét duoc chrnh xâc hoat lue, duçfc

dë cho khuyê'ch tân vào môi truông nuôi câ'y dâ tiê'p chûng Chüng khuyê'ch tân và tao ra xung quanh môt vùng üc chê' vôi chüng mang thü nghiêm Tiê'n hành dông thôi khâng sinh chua biét nông dô vôi khâng sinh cùng loai dâ biê't châc chân nông

dô và kîch thuôc vùng urc chê' do chüng tao ra Dùng phuong phâp thông kê sinh hoc

sê tfnh ra duoc hoat lue cüa khâng sinh cân xâc dinh

Cô nhiêu yê'u tô' tâc dông dê'n quâ trînh khuyê'ch tân, ành huông dê'n quâ trînh khuyê'ch tân, ành huông dê'n kê't qüa dinh luçmg nhu: nhiêt dô, thành phàn môi truông nuôi câ'y, thôi gian ü, dô khô cüa thach, chiêu dày lôp thach, dô thuân nhâ't và

sô luçmg cüa vi khuân nuôi câ'y

Cô 2 loai khuyê'ch tân: Khuyê'ch tân duông doc và duông ngang

Hiên nay phuong phâp khuyê'ch tân duông doc ft duoc sü dung

*Phuong phâp khuyê'ch tân duông ngang:

+ Tao môi truông khuyê'ch tân duông ngang bàng câch:

Dùng dïa pétri cô dây phâng, trong dô do môi truông thach nuôi câ'y, tao mot lôp môi truông cô bê mât phâng và dô dày dông dêu Khâng sinh thu: nghiêm duoc tâm vào khoanh giâ'y roi dât lên môi truông, hay pha thành dung dich roi nhô vào câc ong tru dât trên bê mât thach, hoâc nhô vào câc lô thach dâ duoc tao ra bàng câch duc vào môi truông thach Khâng sinh sè khuyê'ch tân tù câc diëm dât ra môi truông tao thành mot vùng ire chê' hînh trôn Do và so sânh vùng uc chê' cüa khâng sinh thir và khâng sinh chuân trong cùng môt diêu kiên

+ Dùng phuong phâp thông kê sè tmh toân duçfc hoat lue cüa khâng sinh thü

1.3.2.3 Nguyên lÿ khuyêch tân dudng ngang:

Theo Cooper trong truông hoip khâng sinh khuyê'ch tân tù môt diëm nhu tù ô'ng tru, khoanh giâ'y tâm hoâc lô dung dung dich khâng sinh vào môi truông thach dinh duông Khi sir dung khay kmh phâng hoâc hôp pétri cô dây phâng thi sê xây ra hiên tuçfng khuyê'ch tân theo chiêu ngang Phuong trînh tfnh khoâng câch vùng ûc chê' khi cho luçfng khâng sinh cô nông dô M, khuyê'ch tân tù ô'ng tru cô chiêu dày H nhu sau:

r2=4.D.T( ln ^ -lnC-ln(47t.D.T))

M: luofng khâng sinh trong ô'ng tru hoâc ô'ng thach

D: Hê sô' khuyê'ch tân

T : Thôi gian khuyê'ch tân

H: Chiêu dày lôp thach

C : Nông dô tôi han cüa khâng sinh

r: Bân kmh vùng vô khuân

Doi sang logarit thâp phân ta cô:

2,3031gM + 2,303.1g(47c.D.T.H.C)

lgM = — + lg(4îr.D.T.H.C)

9,21 D.T

Ta thây phuong trînh cô dang: Y=aX+b

Nhu vây tri so logarit luçmg khâng sinh trong ong tru co su tuong quan tuyén

tînh vôi kich thuôc vùng ûc ché

1.3.2.4 Câc dieu kiên thi nghiêm :

> Chon diêu kiên thü nghiêm

> Tim dung chrnh xâc mûc liêu làm viêc : De phép thü chmh xâc, càn chon

câc mire liêu trong “vùng nhay câm” cüa duông cong dâp ûng, tai vùng này, mot su

thay doi nhô cüa nông dô sê cho su thay doi eue dai cüa su dâp ûng

> Càn tiêu chuàn hôa luçmg nhü dich câ'y truyên cho môi thü nghiêm Trong

thü nghiêm khuyê'ch tân, bf quyê't dë dat duoc su phât triën dông dêu sau khi ü, cô

duçfc vông vô khuàn rô ràng, sâc nét là do trôn vùa dü và dông nhâ't luçmg nhü dich

câ'y truyên vào môi truông

> Diêu chînh cô vông vô khuàn

Nê'u thi nghiêm thu duçfc câc vông vô khuàn cô duông kmh quâ nhô sê

chua thât chrnh xâc Nô không chî làm giâm kfch thuôc vông vô khuàn mà côn

giâm dô dô'c duông thâng (hay giâm dô nhay cüa thü nghiêm)

- Dôi khi môi truông duçfc sü dung quâ nhiêu châ't dinh duông, cho phép chüng chî thi phât triën khâ nhanh, nhung lai gây cân trô su khuyê'ch tân cüa khâng

sinh

> Câch bô' tri thi nghiêm: Bô tri theo hînh vuông Latin

Thuông dùng hôp pétri duông kmh 10 cm hoâc khay hinh vuông cô canh 23cm

• Bô' tri 4x4 (2+2) hai liêu chuàn, hai liêu thü Thü nghiêm giûa mot châ't chuàn và môt châ't thü

• Bo tri 6x6 (2+2) thir nghiêm giûa hai chat thü và mot chat chuân, môi chat hai lieu.

• Bo tri 6x6 (3+3) thü nghiêm gôm mot châ't thü và mot châ't chuân, môi chat

ba liéu, co 6 vong cho mot liêu Dây là phuong phâp thuân tien de chon duoc câc

thü nghiêm cô dô doc cüa dudng dâp üng Liêu lirçmg dat dirac dô thâng song song à

mire châc chân và chfnh xâc cao

1.3.2.5 Câch tien hành thü nghiêm:

a/ Ché tao dich cây truyên:

- Nguôn chüng dông khô thtfông cô duoc tùr : National collection of type cultures (NTCT) Hoâc American type culture collection (ATCC) - Câc chüng dông khô này phâi diiçfc hoàn nguyên trong canh thang dinh dirông bâng câch ü qua dêm 32-37°C

- Dich canh thang cô vi sinh vât, sau dô duçfc cây vào thach nghiêng roi tiê'p tue cây truyên ît nhât 2 lân Câc ong thach nghiêng này cô thë bào quàn tü lanh và cây chuyën hàng thâng

b/ Chê tao nhü dich nha bào cua vi khuân:

- Cây chuyën câc chüng chî thi nhu B Pumilus, B Subtilis tù ong thach

nghiêng vào môi truong nuôi cây, ü qua dêm d 32-37°C.

- Dùng nuôc câ't gât lâ'y vi khuân dâ moc, dùng pipet vô trùng hüt nhü dich vôkhuân và trâi dêu lên mât thach nghiêng cüa mot binh Roux chûa khoâng 100ml

*)

môi trucmg U bînh Roux a 37°C trong 7 ngày.

Dùng nirôc cât và nhûng viên bi thüy tinh dë gât vi khuân, chuyën và rüa djeh

vi khuân trong ong ly tâm vô trùng

- Dun câch thüy nhü dich nha bào à 70°C trong 30 phüt dë giê't thuc thë.

- Làm test và diêu chînh su pha loàng cüa dung dich tiê'p chüng de cô vông

üc chê' sâc nét

c/ Chê tao dîa hoâc khay phàng thür nghiêm:

+ Câc môi truông dâ ché tao dirçfc dông vào bînh non cô thé tîch thïch hop, duofc dây bàng nüt bông, bao ngoài bàng giây nhôm, tiêt trùng, kiëm tra lai giâ tri

pH cüa môi bînh và diêu chînh lai düng pH Do môi trvràng vào dla, khay phang:

* Do mot lôp:

- Môi truông duofc dun nông, khuâ'y cho tan, hâ'p tiêt trùng à 121°C trong 15

phüt, de nguôi dén nhiêt dô 50-60°C

- Sâp xép câc khay dïa thü nghiêm trên mot mât phâng

- Trôn dêu dich câ'y truyên trong môi truông trirôc khi phân phôi vào dïa

- Dùng pipet chia vach hüt dich môi truông dâ câ'y truyên (côn mât và long) phân phôi vào câc dïa vôi mot luong thich hçfp

- Giû yen dïa trong khoâng 20-30phüt de thach dông ciing

*Do hai lôp:

- Câc buôc chuàn bi và tao môi trucmg tuong tu nhu do môt lôp thach

- Dé truôc mot lôp thach nên vào hôp pétri De cho thach dông dâc,

- Tiép tue dé lôp thach nuôi câ'y (thach dâ câ'y truyên chüng chî thi) lên trên lôp thach nên vôi mot luçmg thfch hçfp Thuông dô'i vôi môi dïa pétri duông kfnh 10cm

do 5ml thach nuôi câ'y

d/ Ché tao dung dich chuân cua thi nghiêm:

- Cân môt luong chfnh xâc khoâng 50mg chat chuân

- Pha mot dung dich chudn gô'c cô nông dô 1000 Ul/ml bàng câch thêm chmh xâc mot thë tfch dung môi bàng buret vào luçfng cân trên dé tao thành dung dich gô'c mong muô'n

- Lâc hoâc dùng siêu âm dé hôa tan hoàn toàn

- Câc dung dich chuân mang thir nghiêm duoc pha loâng tùt dung dich chuân gô'c bàng dung môi hoâc dung dich dêm thfch hôp

e/ Ché tao dung dich thur cua thi nghiêm:

Théo chuyên luân riêng cüa tùng chê' phâm hoâc

Vf du: Viên nén thi lâ'y 20 viên nghiên thành bot min Cân chînh xâc mot phân bot này tuong ung vôi nông dô giâ dinh 1000 Ul/mg Thêm chînh xâc mot thé ti'ch

dung môi bàng buret vào luçmg cân trên dë tao thành dung dich gôc mong muôn Tiép tue hôa loâng vôi dung dich dêm dë duoc câc dung dich thu nghiêm

g/ Tao lô thach, dât ong tru:

- Dùng dung eu tao lô thach, làm thành 6 lô thach trong môt hôp Pétri

- Câc lô thach câch dêu nhau và câch tâm hôp Pétri khoâng 2,5cm

- Dung dich chuân và mâu thü duoc chuyën vào câc lô thach hoâc ong tru bàng micropipet, môi lô 100(il theo kiëu bô' tri thi nghiêm ngâu nhiên hôa

Vi du: Mâu chuân và mâu thü duçfc pha thành 3 nông dô 1, 2, 3 Môi nông dô làp lai 6 làn Duçfc bô' tri nhu sau:

• S,: Vi tri cüa dung dich chuân

O T,: Vi tri cüa dung dich thü

Hinh 3: Kiéu bô tri thi nghiêm trên dîa thach

h/ Tînh toân kê't quâ: [4]

Sau khi thü nghiêm ta thu duçfc câc vông vô khuân ( xem hinh 4) do duông kfnh câc vông vô khuân này dë tînh toân két quâ

Két quâ tî le phân trâm hoat lue (R) cüa khâng sinh thü so vôi chuân duoc tmh theo công thûc:

R = Antilog 2 +4 [(7^+ r , + r î ) - f e + s ; + s 1)]

Sj, S2, Ss 7 ;, T2, T3 là tong giâ tri dirô'ng kïnh câc vông vô khuân tfnh bàng

mm cüa câc nông dô tj, t2, t3, sx, s2, s3;

I là tî sô cüa hai nông dô pha loâng ke tiê'p nhau, I = 2, do dô log2=0,301 Hoat lue cüa mâu thü duoc tînh theo công thüc:

- Nguyên liêu (UI/mg)= R%.a/b.S

- Viên (UI/viên)= R%.a/b MTBV.S

Trong dô: R%: Phân trâm hoat lue tînh theo kê't quà thông kê

a : Khôi luçmg chuân (mg) mang pha dung dich thü gôc

b : Khôi luong mâu thü (mg) mang pha dung dich thü gôc.Mtbv: khôi luçmg trung bïnh cüa mot viên

S : Sô don vi trong mot mg chuân Thi nghiêm phâi dat duoc câc dieu kiên theo qui dinh và câc sô liêu thông kê sai sô dat yêu câu (e< 5%) thî kê't qua môi cô giâ tri

Hinh 4: Hînh ânh kê't qua dinh litong khâng sinh trên hôp Pétri

Sa dô quy trinh tien hành thü nghêm:

— 1 ”

> Giâ tri trung binh: x = ~ T *!x ,

n , =l

Môt so công thûc tinh toân trong x û ly thong kê ket quâ

> Sai so tuyêt doi: s —

Trong do : x, là két quâ xâc dinh lân thû i; n: là sô làn xâc dinh

+ Tiêu chuân Fischer dé dânh giâ dô chînh xâc hay dô làp lai cüa 2 phuong phâp thî nghiêm khâc nhau:

PHAN 2: THÜC NGHIÊM VÀ KÊT QUÂ

2.1 NGUYÊN VÂT LIÊU VÀ PHlTONG PHAP THlTC NGHIÊM

2.1.1 Nguyên liêu, hoâ chat, thuôc thu:

2.1.1.1 Dô'i titçtng nghiên cüu:

■ Clarithromycin: Châ't chuân hàm luçmg: 97,28% tinh theo hiên trang

Dô âm:l,26% do Viên kiëm nghiêm thuôc TW sân xuât

■ Mot sô lô ché phâm viên nén Clarithromycin:

- Viên nén bao phim Claritab 250mg, So lô SX: 0306 ; HD: 06.09 Nai sân xuâ't: Công ty Duoc-TTBYT Binh Dinh

- Viên nén bao phim Clarthrimax 250mg, Sô lô SX: 0605002; HD: 0508 Nai sân xuâ't: Công ty TNHH SPM

- Viên nén bao phim Clarithromycin 250mg Sô' lô SX:5L8847; HD: 0908 Nai sàn xuâ't: Pharmaniaga Malaysia

- Viên nén bao phim ClarBact 250mg Sô' lô SX: 020706 ; HD: 022008 Nai sân xuât: Công ty CP Duac Hâu Giang

- Viên nén bao phim Clarithromycin 250mg Sô' lô SX 6027002HD:052008 ; Nai sân xuâ't: Công ty TNHH Dông Nam

2.1.1.2 Hoâ chat, thuôc thü:

> Muô'i monobasic potassium phosphat (KH2P 04), muô'i dikalihydrophosphat (K2HP04), H3P04: Hôa châ't tinh khiê't phân tfch

> Methanol tinh khiê't HPLC, Methanol tinh khiê't phân tfch

> Hôa châ't pha chê' môi truông dinh duông nuôi cây vi khuân: pepton khô, casein pancreatic glucose, nuôc câ't, thach

> Chüng vi sinh vât chî thi: Chüng Bacillus pumillus ATCC 8241

2.1.1.3 Thiëtbi

+ Mây sâc kÿ long hiêu nâng cao Elit Chrom 2000 (Merck-Hitachi)

- Bom: Gradient pump (4 kênh dung môi)

- Côt sâc kÿ RP18(4xl50mm);5fim

- Detector UV-Vis

- Buông tiêm mâu bàng tay: loop 20|il

- Dàu loc, màng loc duông kmh lô loc 0,45(xm

+ Cân phân tich Satorius CP 224S dô chrnh xâc 0,1 mg

+ Mây do pH JENWAY cüa Anh

+ Mây do vông khâng khuân

+ Mây câ't nuôc 2 làn

+ Mây làc siêu âm EBRO ARMATUREN cüa Dure

+ Mây loc hüt chân không Satorius

+ Nôi hâ'p tiêt trùng

+ Tü â'm

+ Tü sâ'y Memmert

+ Phàn mém xü lÿ kê't quâ HPLC

+ Phàn mêm xü lÿ két quâ vi sinh vât

+ Câc dung eu thüy tinh: Pipet, autopipet, bînh dinh müc, binh non, phêu loc: Dat yêu câu dùng cho kiëm nghiêm thuô'c

2.1.2 Phuong phâp nghiên cûu:

> Nghiên cûu trên lÿ thuyê't và tài liêu tham khâo dë lua chon phuong phâp phân tich

> Bàng thuc nghiêm, dua vào kê't quâ thu duoc, xü lÿ thông kê và rut ra két luân

> Phuong phâp sü dung trong thuc nghiêm: HPLC, Vi sinh vât

2.2 KÊT QUÂ THUC NGHIÊM VÀ NHÂN XÉT

2.2.1 Kê't quâ thiic nghiêm dinh luong Clarithromycin trong viên nén

2.2.1.1 Lua choit dieu kiên sâc ky de dinh luong Clarithromycin trong viên nén

bàng HPLC:

Tham khâo USP 28, BP2005, JP 2001 câc dieu kiên sâc kÿ dinh luçmg

Clarithromycin (ghi trong bàng 1)

Bàng 1 : Câc dieu kiên sac ky tham khâo

Dêm phosphat pH4,4

Acetonitril- Dêm phosphat pH4,4

Acetonitril- Dêm phosphat pH4,4

Methanol-Dêmphosphat(pH=4,0)

C18 (4mmx 150mm 5|im)

C18 (4mmx 150mm 5|im)

C18 (4mmx 150mm 5|im)