Xây dựng phương pháp định lượng vitamin d2 trong sữa bằng HPLC

Chüng tôi hi vong ràng két quâ nghiên ciïu này së cô giâ tri thuc tiên cao, gôp phàn vào viêc thuc dây ûng dung sàc kÿ long hiêu nâng cao dë dinh luong câc chât trong thuc phâm... 1.1.7

BOY TE TRÜÔNG DAI HOC DUOC HÀ NÔI

BÙIVIÊT PHlTONG

VITAMIN D2 TRONG SÜA BÂNG HPLC

KHOÂ LU A • n TÔT NGHIÊP DUOC s i DAI HOC • • • •

Noi thuc hiêri:

PHÔNG HOÂ DÔC THl/C PHAM TRUNG TÂM KIÉM NGHIÊM- VIÊN DINH DIJ ON G

Thài gian thuc hiên: 01/2007-05/2007

HA NOI THANG 5 NAM 2007

LÔI CÂM ON

Triïôc hêt tôi xin bày tô long biét cm sâu sàc nhât tôi Th.S Tràn

Nguyên Hà, Th.S Tràn Quang Thuÿ, CN, Doàn Thi Hiïômg là nhüng nguôi

dâ truc tiép huorng dân, dâ dành nhiêu thôi gian và tâm suc, kinh phi giüp do' tôi trong suot quâ trinh nghiên cüru và hoàn thành khoâ luân tôt nghiêp này

Tôi cüng xin trân trong câm cfn câc thày cô giâo, cân bô kÿ thuât viên trong bô môn Hoâ Phân Tîch - Truông dai hoc Duac Hà Nôi dâ nhiêt tînh giüp

dô tao moi dieu kiên thuân loi cho tôi hoàn thành khoâ luân này

Tôi xin bày tô long biét on toi câc cân bô cüa phông hoâ dôc thuc

phâm, trung tâm kiëm nghiêm- viên Dinh Duông dâ giüp âd vê hoâ chat cho

tôi trong quâ trinh thuc hiên dé tài

Tôi xin chân thành câm on thu viên trucfng Dai hoc Duoc Hà Nôi dâ cung câfp nhüng tài lieu càn thiét cho tôi trong quâ trinh thuc hiên dè tài

Cuôi cùng tôi xin câm on gia dînh, ban bè và nhüng nguôi thân dâ dông viên và hét long giüp dô tôi hoàn thành khoâ luân này

Hà Nôi, thâng 5 nâm 2007

Bùi Viêt Phuong

BÂNG CHÜ VIÊT TÂT

MUC LUC

DAT VAN D E 1

PHAN 1: TÔNG QUAN 3

1.1 VitaminD 3

1.1.1 Công thûc câ'u tao 3

1.1.2 NguÔn gôc 3

1.1.3 Trnh chât 3

1.1.4 Tac dung duoc lÿ và ca ché tac dung 4

1.1.5 Chî d in h 4

1.1.6 Câc phirang phâp dinh lirçrng vitamin D 4

1.1.7 Mot s6 nghiên curu vê vitamin D 5

1.2 Kÿ thuât sâc kÿ long hiêu nàng cao 9

1.2.1 Khâi niêm cobân 9

1.2.2 Câc dai lirçmg dàc tnmg 9

1.2.3 Hê thô'ng HPLC 11

1.2.4 Phatînh 11

1.2.5 Pha dông 12

1.2.6 Phirang phâp dinh liïçfng và tmh két quâ trong HPLC 14

1.3 Mot so thông so thong kê de xur lÿ và dânh gia két quâ 15

PHAN 2: NGUYÊN LIEU, THIÊT BI, PHÜONG PHÂP VÀ KET QUÂ NGHIÊN CtTU 16

2.1 Nguyên lieu và thiét b i 16

2.1.1 Dô'i tuçmg nghiên cûu 16

2.1.2 Thiét bi và dung e u 16

2.1.3 Hoâ chât, dung môi và thuô'c thû 16

2.2 Phuong phâp nghiên ciîu 17

2.2.1 Chuan bi dung dich gôc và dung dich làm viêc cüa

viatamin D 2 17

2.2.2 Du dinh mot so diêu kiên chay sâc k ÿ 17

2.2.3 Thdm dinh phuong phâp 18

2.3 Két quâ nghiên crïu 20

2.3.1 Nguyên lÿ xü lÿ mâu 20

2.3.2 Xâc dinh diêu kiên chay sâc kÿ pha dâo 23

2.3.3 Khâo sât su phù hçfp cüa hê thong 25

2.3.4 Xâc dinh khoâng tuyén trnh 26

2.3.5 Xâc dinh giôi han phât hiên và gioi han dinh luçmg cûa vitamin D2 29

2.3.6 Dânh giâ dô chrnh xâc cüa phuong phâp 30

2.3.7 Xâc dinh tmh dung cüa phuong phâp 31

2.4.Bàn luân 34

PHAN 3: KÉT LUÂN VÀ DE XUAT 35

3.1 Ket luân 35

3.2 De xuât 35

»

DAT VAN DE

Dë tôn tai, phât triën, câi thiên noi giông, co thë chüng ta luôn cân duoc cung cap dày dû câc chat dinh duông và nguôn cung câp câc chat này chfnh là thuc phâm hàng ngày Câc chat dinh duông là câc nhôm cung câp nàng luong cho co thë nhu glucid, lipid, protein, nhôm cung câp muô'i khoâng, nhôm cung câp câc loai vitamin và nuôc Trong dô vitamin là nhôm cô vai tro eue kÿ quan trong tôi sure khoè cua môi con nguèi

Vitamin không thë thiéu duoc dôi vôi su ton tai và phât triën cüa môi co thë sông Vitamin cô vai trô tao ra câc coenzim càn thiét trong câc phân irng chuyën hoâ khâc nhau Tât câ câc quâ trinh sông gân liên vôi su trao doi chat trong co thë dêu cô su tham gia truc tiép cüa vitamin Nguôn cung câp vitamin chû yéu là tir thüc àn do vây trong co thë cô thë thiéu hay thùa vitamin Néu

co thë bi thiéu vitamin nào dô sê sinh ra mot s6 cân bênh nhât dinh nhu thiéu

vitamin A dë dân tôi bênh mù loà, thiéu vitamin BI dê bi bênh tê phù, thiéu vitamin PP mâc bênh pellagra, thiéu vitamin D bi bênh rickets , tuy nhiên mot sô loai vitamin mà du thùa cüng cô thë gây tâc hai dôi vôi co thë nhu vitamin A, D, K Mot trong nhüng loai vitamin khâ quan trong giüp viêc hïnh thành, phât triën câc té chirc xuong cüa co thë không thë không dê câp dén dô

là vitaminD

Rat nhiêu thuc phâm chüa vitamin D nhu sûa, bôt dinh duông, câc sân phâm câ, trirng Do dô, xâc dinh hàm luong vitamin D trong thuc phâm giüp dânh giâ dung giâ tri dinh duông cüa thuc phâm và khuyén câo cho câc bà me nuôi con nhô, hay nguôi lôn tuéi khi sü dung bo sung loai vitamin D này

Do dô tôi tién hành làm dê tài: “ Xây dung phuong phâp dinh luong vitamin D2 trong sûa bàng HPLC”

Dê tài này nham mue tiêu:

Xây dung quy trînh kÿ thuât dinh luong vitamin D2 trong sûa dë ûng

dung trong kiëm soât chat luong sân phâm và chàm soc suc khoê công dông

Chüng tôi hi vong ràng két quâ nghiên ciïu này së cô giâ tri thuc tiên cao, gôp phàn vào viêc thuc dây ûng dung sàc kÿ long hiêu nâng cao dë dinh luong câc chât trong thuc phâm

PHAN 1 TÔNG QUAN 1.1 Vitamin D.[2],[4],[6]

1.1.1 Công thurc câu tao [6]

C27H440 ( M = 384,6)Tên khoa hoc: ergocalciferol

1.1.2 Nguôn goc

Vitamin D co nhiêu trong câ bien, thit, trûng, süa và trong mot so thuc phâm bô sung Môt so nghiên cûu dua ra hàm luong vitamin D trong câ thu là 15|a,g/100g, trong gan bô l|ug/100g, trong trutng gà 2|ig/100g, trong nam rom

là 2|ig/100g

Trong co thë, vitamin D duoc tông hop à câc té bào ducfi da nhô ânh

sâng tu ngoai Vai tro lôn nhàt cüa vitaminD là duy tri nông dô calci trong mâu Do do nhiêu bâo cao dua ra cân bo sung khoâng 400 don vi vitamin D môi ngày trong khi uông calci diêu tri bêng loâng xuong

Vitamin D côn co nguôn gôc tông hop hoâ hoc và sinh hoc

1.1.4 Tac dung dirçrc lÿ và co ché tac dung [2],[6]

Vitamin D tham gia vào quâ trinh tao xuong: làm tâng hâp thu calci và

phosphat à ruôt, tâng hâp thu calci à ông luçm gân, tham gia vào quâ trinh

calci hoâ sun tâng truông Vi vây vitamin D rat cân cho su phât triën binh thucmg cüa trê em

Diêu hoà nông dô calci trong mâu: Néu câc quâ trinh trên không cung câp du calci, làm nông dô calci mâu giâm thi vitamin D ( két hop vôi hormon tuyén cân giâp) së phât huy calci tuf xuong ra

Ngoài ra vitamin D con tham gia biêt hoâ té bào biëu mô Gân dây câc

nhà khoa hoc dang nghiên cûu tâc dung ûc ché tâng sinh té bào ung thu.

Vi thé khi thiéu vitamin D, ruôt không hâp thu dü calci và phospho làm giâm calci huyét Khi dô calci bi huy dông tù xuong ra gây hâu quâ là trè em châm lôn, coi xuong, châm biét di, châm km thôp, nguôi lôn së bi loâng xuong, xop xuong

1.1.5 Chï dinh [2],[6]

-Phong và diêu tri coi xuong do thiéu vitamin D

-Phong và diêu tri loâng xuong, dê gây xuong

-Chông co giât do suy tuyén cân giâp

-Ha calci huyét

-Mot sô bênh ngoài da nhu chiîng xo ciîng bi.

1.1.6 Câc phuong phâp dinh liïomg vitamin D [4]

- Phuong phâp hôa hoc

+ Nguyên tâc: Tién hành làm mâu chuân và mâu thür Cho vitamin D tao

màu vàng vôi thuôc thü antimon clorid roi dem do quang à buée sông 500 và

550 nm

+ Nhân xét: Quy trinh thuc hiên rat phiïc tap, bao gôm câc giai doan xà phong hoâ trong diêu kiên trânh oxy hoâ, chiét tâch và tinh ché qua câc côt sâc kÿ bân diêu ché (su dung câc chât nhôi là dât tây màu và dât silic dùng cho sâc kÿ), sau do tao màu và do quang Do tién hành qua nhiêu giai doan nên dô chmh xâc giâm.

- Phuong phâp sinh hoc

+ Nguyên tâc: Hoat lue vitamin D duoc dânh giâ thông qua xâc dinh mue dô vôi hoâ xuong trên thô hoâc chuôt

+ Nhân xét: Phuong phâp này tién hành khâ phiîc tap Két quâ phuthuôc nhiêu vào câc câ thë và doi hôi nguôi thur nghiêm phâi duoc dào tao klluông

- Phuong phâp sâc kÿ long hiêu nâng cao

+ Nguyên tâc: Dua trên su phân bô khâc nhau cüa vitamin D giüa pha dông và pha tînh so vôi câc thành phân hoat chât khâc

+ Nhân xét: dây là phuong phâp hiên dai, ngày càng duoc âp dung phô bién Tuy nhiên cüng chî cô thë âp dung truc tiép vôi câc ché phâm don hoâc

da thành phân trong dô vitamin D cô hàm luong cao (> 500UI/1 don vi phân liêu) côn vôi câc ché phâm cô hàm luong D thâp thi dôi hôi phâi cô bien phâp

xü lÿ mâu phù hop dë làm sach và làm giàu mâu

1.1.7 Mot so nghiên cuti ve vitamin D [8],[10],[11],[12],[15]

Cùng vôi su phât triën cüa nên khoa hoc kÿ thuât tiên tién, su bùng no cüa ngành công nghê thông tin trong thôi kÿ nên kinh té tri thtrc, hàng loat câc

hê thông mây phân tich hoâ hoc dâ duoc câi tién nâng câp, nhàm xâc dinh duoc nhiêu loai chât hoâ hoc dông thefi nâng cao dô nhay cüa phép phân tfch cüng nhu dô làp lai cüa két quâ Câc nhà khoa hoc phân tich hoâ hoc trên thé giôi nôi chung, phân tich thuc phâm nôi riêng dâ cô nhiêu công trinh nghiên

cuu vê phuong phâp xâc dinh hàm luong vitamin D trong thuc phâm nhu thit,

câ, sûa,

Môt nghiên cüu dâ dua ra câch xû lÿ mâu nhu hinh lvà diêu kiên phân tfch hàm luong vitamin D trong thuc phâm, dô thu hôi cua phuong phâp là 90- 110% dôi vôi D2 và D3 [10]

Ô môt công trinh nghiên cüu khâc ta lai cô câch xû lÿ mâu nhu hinh 2

dô thu hôi cüa phuong phâp là 93- 107% [8]

Ngoài ra côn nhiêu công trinh nghiên cuu xâc dinh hàm luong vitamin

D trong mâu và huyét thanh, trong thuc v â t

Hiên nay à Viêt Nam chua cô 1 dê tài eu thé nào vê dinh luong vitamin

D trong thuc phâm

Trong khuôn khô cüa dê tài này, chüng tôi sau khi tham khâo câc tài liêu, cân eu’ vào nâng lue trang thiét bi hiên cô cüa labo, dua ra phuong phâp phân tfch phù hop Qua dô chüng tôi khâo sât diêu kiên chay mâu, phân tfch môt sô dôi tuçmg mâu nhu sûa bôt, sûa chua làm thü nghiêm lap lai dë xâc dinh dô chum, xâc dinh dô dung, khoâng tuyén tfnh, giôi han phât hiên, giôi han dinh luong dë dânh giâ hiêu lue cüa phuong phâp

Trong thuc phâm tu nhiên nôi chung hay thuc phâm bô sung nôi riêng hàm luong vitamin D cüng khâ thâp, nên viêc tâch chiét là vân dê rat quan trong Chüng ta cân phâi chü ÿ câc khâu, công doan ânh hucfng dén hàm luong vitamin D trong mâu nhu ânh sâng, diêu kiên thuÿ phân mâu

Hinh 1 So âô chiê't mâu

Hînh 2 Sa dô chiê't mâu

1.2 Kÿ thuât sâc kÿ long hiêu nâng cao [2], [3], [5], [4]

1.2.1 Khâi niêm ca ban.

- Sac kÿ long hiêu nâng cao( HPLC) là môt phuong phâp tâch hoâ lÿ dua vào âi lue khâc nhau cüa câc chât khâc nhau vôi 2 pha luôn tiép xüc và

không dông tan vcfi nhau goi là pha dông và pha tlnh Pha dông là chât long

chày qua côt vôi môt toc dô nhât dinh, côn pha tïnh chiïa trong côt là mot chât

ran dâ duoc phân chia duoi dang tiëu phân hoâc môt chât long phü lên mot

chât mang rân hay mot chât mang dâ duoc biên d6i bàng liên két hoâ hoc vôi

câc nhôm hüru co Quâ trinh sâc kÿ xây ra do câc co ché: hâp thu, phân bô,

trao doi ion hoâc rây phân tir

- Nguyên tac cüa quâ trinh sâc kÿ trong côt:

Pha tïnh là yéu tô quan trong quyét dinh bân chât cüa quâ trinh sâc kÿ

và loai sâc kÿ Néu pha tïnh là chât hâp phu ta cô sâc kÿ hâp phu, néu pha tïnh

là chât trao doi ion ta cô sâc kÿ trao doi ion, pha tïnh là chât dâ duoc gân pha

liên két ta cô sac kÿ phân bô, néu pha tïnh là gel ta cô sâc kÿ gel hay sâc kÿ

rây phân tu Quyét dinh hiêu quâ su tâch à dây là tong hop câc tuong tâc:

Chât tan

Tong cüa 3 tuong tâc này së quyét dinh chât nào duoc rüa giâi ra truôc

tiên khi lue luu giü là nhô nhât và nguoc lai

1.2.2 Câc dai luong dàc trimg

+Thdi sian lm (tD): Cüa 1 chât là thcfi gian tmh tù lue tiêm mâu vào côt

dén khi chât dô ra khôi côt dat giâ tri eue dai và cho pic trên sâc kî dô So sânh

thcfi gian liru cüa mâu thu và mâu chuan làm trong cùng diêu kiên ta së dinh tmh duoc chât dô.

+ Thài sian chef L,: là thcfi gian luu cüa 1 chât không bi luu giü ( tire là

chât cô toc dô bang toc dô di chuyén trung binh cüa câc phân tü dung môi khi

=-; -Pha tïnh trong HPLC là chât nhôi côt dë làm nhiêm vu tâch môt hôn hop chât phân tfch No là nhüng chât rân, xôp, kfch thuôc hat rât nhô, duông kfnh cô hat tù 3 - 10|Jm, diên tfch bê mât hat thuofng tù 50 -500m2/g.

* Phân loai

- Cân câ theo bân chât chfnh cüa quâ trinh sâc kÿ trong côt tâch, ngirài

ta chia nô thành nhiêu loai nhu hâp phu, phân bô, trao doi ion và rây phân tü Tuong üng vôi loai chât nhôi nhir thê nguôi ta cô 1 loai sâc kÿ riêng trong kÿ thuât HPLC

- Cân cü theo trang thâi rân hay long cüa pha tïnh, nguôi ta chia nô thành 2 loai, néu pha tïnh là chât rân ta cô sac kÿ long- ran(LSC), néu pha tïnh

là chât long ta cô sac kÿ lông-lông(LLC)

- Cân cü theo dô phân eue cüa pha tïnh và pha(dôpg, cô câc loai: Sac kÿ pha thuân, sâc kÿ pha dâo, sâc kÿ pha dâo tao câp ion và sac kÿ trao dôi ion

- Cân cü" theo câu truc xôp cüa pha tïnh là câc hat rân, nguôi ta chia nô thành 2 loai là xôp toàn phân hat và xôp bê mât hat ( xôp chî lôp vô ngoài )

* Diêu kiên dôi vôi 1 pha tïnh

- Phâi tro và bên vüng dôi vôi câc diêu kiên cüa môi trucmg sâc kÿ

- Cô khâ nâng tâch chon loc

- Tfnh chât bê mât phâi ôn dinh

- Cân bang dông hoc cüa su tâch phâi xây ra nhanh và lâp lai tôt

- Cô hat phâi tuong dôi dông nhât

trôn lân vôi nhau theo nhûng tÿ lê nhât dinh No cüng cô thé là dung dich câc muô'i cô chûa câc chat dêm, chât tao phûc.

Pha dông là mot trong nhûng yêii to quyét dinh hiêu suât tâch sâc kÿ cüa môt hôn hçfp mâu Nô quyét dinh thdi gian luu giCr câc chât phân tich và hiêu quâ quâ trînh sâc kÿ Pha dông cô thë ânh hurông dén:

+ Dô chon loc cüa hê pha,

+ Thdi gian liru giiî cua chât tan,

+ Hiêu lue cüa côt tâch,

+ Dô phân giâi câc chât trong 1 pha tînh,

+ Dô rông và su cân doi cüa pic sac kÿ

- Dieu kiên doi voi 1 pha dông

+ Phâi tro doi vcfi pha tînh,

+ Hoâ tan duçfc chât càn phân tich,

+ Bên vüng theo thdi gian,

+ Cô dô tinh khiét cao,

+ Phâi nhanh dat câc cân bâng trong quâ trînh sâc kÿ,

+ Phù hçfp câc loai detetor dùng dé phât hiên câc chât phân tich,

+ Cô tînh kinh té và không quâ hiém

- Câc yéu tô chmh càn chu ÿ trong lua chon pha dông:

+ Bân chât, thành phân cüa dung môi lua chon làm pha dông,

+ Toc dô dông pha dông,

+ pH cüa pha dông(dâc biêt chu ÿ à sâc kÿ trao doi ion và sac kÿ cap

ion)

1.2.6 Phuong phâp dinh lutfng và tmh két quâ trong HPLC.

Tât câ câc phuong phâp dinh luçfng bang sàc kÿ dèu dira trên nguyên tâc là: Nong dô cûa chât tÿ lê vôi chiêu cao hoac diên tich pic cüa nô

Dânh giâ theo diên tich pic: Diên tich pic cüa 1 chât tirong üng vôi tong ltfçfng chât dô

Dânh giâ theo chiêu cao pic: khi pic cô dang không doi thi chiêu cao pic là 1 dai ltfçmg tÿ lê vôi diên tich pic và nô cüng cô thé dùng dë dinh luang chât phân tich

Cô 4 phuong phâp dinh lirçmg duoc sur dung trong sac kÿ:

* Phuong phâp ngoai chuân

* Phuong phâp nôi chuân

* Phuong phâp thêm

* Phuong phâp phân trâm diên tich pic (hoac phân tram chiêu cao pic)

- Câch tmh két quâ trong phuong phâp HPLC

* Phuong phâp ngoai chuân: Là phuong phâp dua trên co sa so sânh mâu chuân và mâu thur trong cùng diêu kiên Két quâ cüa chât chua biét duoc tmh toân so vôi mâu chuân dâ biet truôc nong dô hoàc suy ra tir duông chuân

* Phuong phâp nôi chuân: Là phuong phâp cho thêm vào câ mâu thü và mâu chuân mot luong chât không doi, mà trong cùng diêu kiên sàc kÿ nô cô thoi gian luu gân vôi thcfi gian luu cüa chât cân phân tich trong mâu thü Nô duoc tâch hoàn toàn và cô nong dô gân bàng nong dô cûa chât cân phân tich

và cô câu truc hoâ hoc tirong tu

* Phuong phâp thêm chuân: Chü yéu duoc sü dung trong kÿ thuât HPLC khi cô vân dê ânh hucfng cûa chât phu nhu tâ duoc Dung dich mâu thir duoc thêm mot luong nhât dinh chât chuân Câc pic thu duoc cüa câ hai dung

dich mâu thü và mâu thü thêm chu an phâi duoc tién hành trong cùng môt dieu

kiên sàc kÿ Két quâ duçfc tmh toân dua vào su chênh lêch nông dô( luçfng

chât chuân thêm vào) và dô tâng cûa diên tfch hoâc chièu cao cüa pic

* Phuong phâp tmh theo phân trâm diên tfch pic (hoâc phân tràm chiêu cao pic): Nông dô cüa mâu thü duoc tmh toân dua trên diên tfch pic ( hoâc

chiêu cao pic) tmh theo tî le phân trâm diên tfch pfc ( hoâc chiêu cao pic) chât

thü trên tong toàn bô diên tfch pic trên sâc dô Trong phuong phâp HPLC,

phuong phâp này chî dung khi cô su dâp üng cüa detector trên tât câ câc chât

là nhu nhau, néu không nhu nhau khi dô vôi môi chât cân cô hê so hiêu chînh

1.3 Mot so dac trung thong kê dë xû lÿ và dânh giâ két quâ.

Câc thong so thuc nghiêm duçfc xü lÿ bang phuong phâp thông kê thông

qua câc dac trung sau:

Trong dô Xj là giâ tri do mâu thü i và

x là giâ tri trung binh cüa câc làn phân tfch

PHÂN H NGUYÊN LIÊU, THIÊT BI, PHÜONG PHÂP

VÀ KÊT QUÂ NGHIÊN CtJtJ 2.1 Nguyên lieu và thiet bi

2.1.1 Doi tiïtfng nghiên cuti

- Süra bot XO (HSD 24/10/2007, hàng Namyang Hàn Quoc)

2.1.2 Thiét bi dung eu

- Hê thong sâc kÿ long cao âp Finnigan voti detector PDA

- Côt chay pha dâo: côt RP |18^5|am, 250 x 4,6 mm), Supelco;

côt Inertsil ODS- 3 (5 |am, 250 x 4,0 mm), Japan;côt Symmetry: Shield RP |l8 j5 jum, 150 x 4,6 mm), Waters

- Côt chiét pha ran SPE

- Cân phân tich Frecisa

- Coc cô mô và câc dung eu thuÿ tinh khâc

- Mây do quang Shimadzu

2.1.3 Hoâ chât, dung môi, thuoc thür

- VitaminD2 chât chuân hàm ltfçmg 99,56% ( Supelco)

- n- hexan hoâc ete dâu hoâ PA (Merck)

- Ete etylic PA (Merck)

- Methanol HPLC (Merck)

- THF HPLC

- Ethanol HPLC (Merck)