Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm hỗn dịch ceftiofur hydroclorid dùng trong thú y

Hiện nay, nhóm cephalosporin đang được sử dụng rộng rãi trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn.

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ THUỐC TIÊM 2

1.1.1 Định nghĩa 2

1.1.2 Thành phần của thuốc tiêm liên quan đến độ ổn định của thuốc 2

1.1.3 Ảnh hưởng của kỹ thuật bào chế đến độ ổn định của thuốc tiêm 3

1.1.4 Ảnh hưởng của điều kiện bảo quản đến độ ổn định của thuốc tiêm 4

1.2 THUỐC TIÊM HỖN DỊCH 4

1.2.1 Khái niệm thuốc hỗn dịch 4

1.2.2 Độ ổn định vật lý, hóa lý của hỗn dịch thuốc 5

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến đến độ ổn định của hỗn dịch tiêm cần lưu ý khi thiết kế công thức thuốc tiêm hỗn dịch dầu 7

1.3 THUỐC TIÊM TÁC DỤNG KÉO DÀI DÙNG TRONG THÚ Y 9

1.3.1 Khái niệm thuốc tiêm tác dụng kéo dài 10

1.3.2 Ưu nhược điểm của thuốc tiêm tác dụng kéo dài 10

1.3.3 Vị trí tiêm 11

1.3.4 Các dạng bào chế thuốc tiêm tác dụng kéo dài 11

1.3.5 Các yếu tố liên quan khi thiết kế thuốc tiêm hỗn dịch tác dụng kéo dài dùng trong thú y 13

1.4 ĐẠI CƯƠNG VỀ CEFTIOFUR HYDROCLORID 15

1.4.1 Cấu trúc hoá học 15

1.4.2 Tính chất lý hoá 16

1.4.3 Tác dụng dược lý 17

1.4.4 Phương pháp định lượng ceftiofur hydroclorid 17

1.4.5 Một số chế phẩm của ceftiofur có lưu hành trên thị trường 18

1

1.5 MỘT SỐ CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU VỀ BÀO CHẾ, SINH DƯỢC HỌC

VÀ PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM CỦA CEFTIOFUR HYDROCLORID 19

1.5.1 Bào chế 19

1.5.2 Dược động học 20

1.5.3 Phương pháp kiểm nghiệm 21

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 23

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 23

2.1.2 Nguyên vật liệu và thiết bị dự trù cho nghiên cứu 23

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 24

2.2.1 Xây dựng công thức và qui trình bào chế thuốc tiêm hỗn dịch tác dụng kéo dài ceftiofur 24

2.2.2 Xây dựng phương pháp định lượng chế phẩm 24

2.2.3 Xây dựng dự thảo tiêu chuẩn cơ sở của chế phẩm nghiên cứu 24

2.2.4 Theo dõi độ ổn định của chế phẩm trong điều kiện thực 24

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.3.1 Phương pháp bào chế 24

2.3.2 Phương pháp xác định kích thước tiểu phân 27

2.3.3 Phương pháp xác định Rsl 29

2.3.4 Thử nghiệm lắc 10 giây……… 29

2.3.5 Phương pháp định lượng ceftiofur hydroclorid 29

2.3.6 Phương pháp đánh giá độ ổn định 34

2.3.7 Phương pháp xử lý số liệu 34

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 35

3.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG 35

3.1.1 Thẩm định phương pháp HPLC 35

3.1.2 Phương pháp vi sinh vật 39

3.2 NGHIÊN CỨU CÔNG THỨC BÀO CHẾ HỖN DỊCH TIÊM CEFTIOFUR

HYDROCLORID 44

3.3 ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC THÀNH PHẦN TRONG CÔNG THỨC VÀ TÌM RA CÔNG THỨC TỐI ƯU CHO HỖN DỊCH TIÊM 47

3.3.1 Đánh giá ảnh hưởng của span 80 đến độ ổn định của hỗn dịch 47

3.3.2 Đánh giá ảnh hưởng của propylen glycol đến khả năng phân tán, độ ổn định của hỗn dịch 49

3.3.3 Đánh giá ảnh hưởng của WA đến khả năng phân tán, độ ổn định của hỗn dịch 52

3.3.4 Kết quả so sánh Rsl của một số công thức 54

3.4 ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG KỸ THUẬT BÀO CHẾ ĐẾN ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA HỖN DỊCH 56

3.5 XÂY DỰNG DỰ THẢO TIÊU CHUẨN KỸ THUẬT 58

3.6 NGHIÊN CỨU ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA CHẾ PHẨM 59

3.6.1 Kết quả nghiên cứu độ ổn định của chế phẩm ở điều kiện thực 59

3.6.2 Kết quả nghiên cứu độ ổn định của chế phẩm ở điều kiện lão hóa cấp tốc 61

3.6.3 Kết quả nghiên cứu độ ổn định của chế phẩm ở điều kiện cưỡng bức 62

Chương 4: BÀN LUẬN 65

4.1 VỀ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG 65

4.2 VỀ CÁC CHỈ TIÊU VẬT LÝ VÀ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH KÍCH THƯỚC TIỂU PHÂN 65

4.3 VỀ CÔNG THỨC HỖN DỊCH TIÊM VÀ VAI TRÒ CỦA CÁC THÀNH PHẦN 66

4.4 VỀ QUY TRÌNH BÀO CHẾ 67

4.5 V 67

4.6 VỀ THEO DÕI ĐỘ ỔN ĐỊNH VÀ BẢO QUẢN CHẾ PHẨM 67

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 68

1 KẾT LUẬN: 68

2 ĐỀ XUẤT Ý KIẾN: 69

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 Một số chế phẩm hỗn dịch tiêm chứa ceftiofur 18

Bảng 2.1 Nguyên vật liệu dùng cho nghiên cứu 23

Bảng 2.2 Thành phần trong công thức hỗn dịch 25

Bảng 3.1 Tương quan giữa nồng độ và diện tích đỉnh 36

Bảng 3.2 Kết quả tính thích hợp hệ thống (n = 6) 37

Bảng 3.3 Kết quả đánh giá tính chính xác của phương pháp 38

Bảng 3.4 Kết quả tính đúng của phương pháp 39

Bảng 3.5 Kết quả đo đường kính vòng vô khuẩn (mm) ở các nồng độ khác nhau 40

Bảng 3.6 Kết quả định lượng chế phẩm bằng pp VSV 42

Bảng 3.7 Kết quả đo đường kính vòng vô khuẩn trong định lượng Cef trong huyết tương 44

Bảng 3.8 Công thức mẫu hỗn dịch trong thí nghiệm sơ bộ 45

Bảng 3.9 Kết quả thực nghiệm sơ bộ 46

Bảng 3.10 Công thức hỗn dịch ceftiofur đánh giá ảnh hưởng của span 80 47

Bảng 3.11 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của span 80 48

Bảng 3.12 Công thức mẫu hỗn dịch đánh giá ảnh hưởng của propylen glycol 50

Bảng 3.13 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của propylen glycol 51

Bảng 3.14 Công thức mẫu hỗn dịch đánh giá ảnh hưởng của WA 52

Bảng 3.15 Kết quả đánh giá ảnh hưởng của WA 53

Bảng 3.16 Kết quả so sánh R sl 55

Bảng 3.17 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của kỹ thuật bào chế 57

Bảng 3.18 Tiêu chuẩn kỹ thuật của hỗn dịch tiêm ceftiofur hydroclorid 5% 58

Bảng 3.19 Kết quả nghiên cứu độ ổn định của chế phẩm ở điều kiện thực 60

Bảng 3.20 Kết quả nghiên cứu độ ổn định của chế phẩm ở điều kiện lão hóa cấp tốc 61

Bảng 3.21.Kết quả nghiên cứu độ ổn định của chế phẩm ở điều kiện có ánh sáng 62

Hình 1.1 Đồ thị hàm phân phối chuẩn 5

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình bào chế hỗn dịch ceftiofur hydroclorid 26

Hình 2.2 Nguyên lý cấu tạo máy đo kích thước tiểu phân 29

Hình 3.1 Sắc kí đồ của ceftiofur hydroclorid chuẩn 35

Hình 3.2 Sắc ký đồ của ceftiofur hydroclorid trong chế phẩm thử 35

Hình 3.3 Đường biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ Cef và diện tích đỉnh thu được 36

Hình 3.4 Hình ảnh đường kính vòng vô khuẩn của 7 nồng độ Cef

Hình 3.5 Hình ảnh đường kính vòng vô khuẩn định lượng Cef 43

trong huyết tương 43

Hình 3.6 Đường biểu diễn sự tương quan giữa R sl và nồng độ Span 80 cho vào 48

Hình 3.7 Đường biểu diễn sự tương quan giữa KTTB và nồng độ Span 80 cho vào 49

Hình 3.8 Đường biểu diễn sự tương quan giữa R sl và nồng độ WA cho vào 53

Hình 3.9 Đường biểu diễn sự tương quan giữa KTTB và nồng độ WA cho vào 54

Hình 3.10 Đồ thị so sánh tỉ lệ R sl của một số mẫu 55

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, nhóm cephalosporin đang được sử dụng rộng rãi trong điều trịcác bệnh nhiễm khuẩn Ceftiofur là một cephalosporin thế hệ mới (thế hệ IV)được sử dụng trong ngành thú y Trên thế giới đã có dạng bào chế thuốc bộtpha tiêm và thuốc tiêm hỗn dịch Thuốc tiêm hỗn dịch tác dụng kéo dài làdạng thuốc có nhiều ưu điểm trong điều trị Tuy nhiên, do đặc điểm củađường dùng thuốc, thuốc tiêm có yêu cầu cao về chất lượng và phải ổn định

về mặt vật lý, hoá học, sinh học và sinh khả dụng Độ ổn định của thuốc tiêmphụ thuộc nhiều vào thành phần công thức, kỹ thuật bào chế và điều kiện bảoquản Ở Việt nam cũng đã có chế phẩm hỗn dịch tiêm bắp ceftiofur Tuynhiên, chất lượng cũng như hiệu quả điều trị còn chưa được chứng minh, tiêuchuẩn chất lượng của thuốc tiêm hỗn dịch ceftiofur không được đầy đủ

Xuất phát từ thực tế đó, để nâng cao chất lượng thuốc thú y sản xuấttrong nước và phát triển dạng bào chế mới chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiêncứu bào chế thuốc tiêm hỗn dịch ceftiofur hydroclorid dùng trong thú y” vớimục tiêu:

- Nghiên cứu xây dựng công thức, quy trình bào chế thuốc tiêm hỗn dịchceftiofur tác dụng kéo dài

- Xây dựng phương pháp định lượng ceftiofur hydroclorid, áp dụng đểđánh giá độ ổn định của thuốc tiêm

- Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng và bước đầu theo dõi độ ổn định củachế phẩm nghiên cứu

1.1.2 Thành phần của thuốc tiêm liên quan đến độ ổn định của thuốc

Một chế phẩm thuốc tiêm thường có 4 thành phần là: Dược chất, dungmôi, các chất phụ và bao bì tiếp xúc trực tiếp với thuốc

Đối với bất kỳ dạng thuốc nào, dược chất luôn là thành phần quyết địnhtác dụng điều trị hay phòng bệnh của chế phẩm Do đó, việc xây dựng côngthức thuốc tiêm phải dựa vào đặc điểm của dược chất (tính chất vật lý, hoáhọc, đặc tính dược động học…), đường tiêm thuốc mà lựa chọn dung môi vàcác thành phần khác cho thích hợp, để chế phẩm đạt yêu cầu đề ra

Một dược chất có thể tồn tại dưới nhiều dạng khác nhau (dạng acid haybase tự do, cũng có thể ở dạng muối, ở dạng kết tinh hay vô định hình, ở dạngkhan hay ngậm nước…) Các dạng khác nhau của cùng một dược chất thường

có độ tan trong nước khác nhau, độ ổn định dưới tác dụng của môi trườngcũng rất khác nhau Do đó, phải chọn dược chất ở dạng vừa có độ tan thíchhợp, vừa ổn định trong dạng thuốc

Dung môi thường được sử dụng để bào chế thuốc tiêm là: nước cất phathuốc tiêm, dung môi đồng tan với nước như ethanol, propylen glycol,

polyethylen glycol, glycerin, …dầu thực vật như dầu lạc, dầu vừng để phathuốc tiêm.

Để đảm bảo độ ổn định của dược chất, độ an toàn và tác dụng dược lýcủa chế phẩm, ngoài dược chất và dung môi, trong thành phần thuốc tiêm cònthêm một số chất như: chất chống oxy hoá, các chất điều chỉnh pH, chất sátkhuẩn, chất làm tăng độ tan, chất đẳng trương hoá dung dịch thuốc tiêm…

Bao bì đóng thuốc tiêm có vai trò bảo vệ và duy trì độ vô khuẩn và sựnguyên vẹn của thuốc, dễ dàng cho việc vận chuyển bảo quản và sử dụng.Bao bì đóng thuốc tiêm có thể là ống tiêm, chai, lọ thuỷ tinh, túi hay chaibằng chất dẻo Các bao bì được tiếp xúc trực tiếp thì các thành phần từ bao bì

có thể khuyếch tán vào thuốc, tương tác với các thành phần của thuốc Kếtquả làm biến chất dược chất, giảm hiệu quả điều trị và độ an toàn của thuốc

Do vậy, để đảm bảo chất lượng thuốc cần chọn những bao bì phù hợp với cácthành phần của thuốc tiêm [1]

Ljiljana và cộng sự đã nghiên cứu sự tác động của đồ bao gói trực tiếpđến độ ổn định của thuốc tiêm methyl prednisolon natri Kết quả chỉ ra rằngloại thủy tinh dùng để đóng thuốc ít ảnh hưởng đến pH của chế phẩm Tuynhiên, nút cao su dùng để làm nút đậy lại ảnh hưởng lớn đến pH của dd thuốc[35]

1.1.3 Ảnh hưởng của kỹ thuật bào chế đến độ ổn định của thuốc tiêm

Kỹ thuật bào chế ảnh hưởng rất lớn đến độ ổn định của thuốc tiêm baogồm: điều kiện pha chế kín hay hở, nhiệt độ và thời gian pha, trình tự pha, sự

có mặt của khí trơ, nhiệt độ, thời gian và phương pháp tiệt khuẩn Do đó,nguyên tắc chung là phải tiến hành hoà tan nhanh để hạn chế thời gian thuốctiếp xúc với không khí Có thể sử dụng các biện pháp làm tăng độ hoà tan như

chia nhỏ dược chất trước khi hoà tan, hoà tan nóng…Hoà tan các chất phụtrước khi hoà tan dược chất, lọc, đóng và hàn ống trong bầu khí trơ [1], [2].

1.1.4 Ảnh hưởng của điều kiện bảo quản đến độ ổn định của thuốc tiêm

Các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm trong quá trình bảo quản có thể xúctác cho phản ứng phân huỷ dược chất Khi nhiệt độ tăng lên 10oC thì tốc độphản ứng phân huỷ dược chất tăng lên từ 2 đến 5 lần Vì vậy, tuỳ theo tínhchất của dược chất và các thành phần có trong công thức, cần phải nghiên cứuđiều kiện bảo quản thích hợp để đảm bảo tuổi thọ của thuốc[1], [2]

1.2 THUỐC TIÊM HỖN DỊCH

1.2.1 Khái niệm thuốc hỗn dịch

Hỗn dịch gồm các thuốc lỏng để uống, tiêm hoặc dùng ngoài, chứa cácdược chất rắn không hoà tan ở dạng hạt nhỏ (đường kính >0,1 m) phân tánđều trong môi trường phân tán [1]

 Các phương pháp điều chế hỗn dịch:

+ Phương pháp phân tán: Dựa trên cơ sở các phương pháp cơ học (nhưnghiền, xay, quấy trộn…) hoặc phương pháp dùng siêu âm để phân chia dượcchất rắn và phân tán vào chất dẫn

+ Phương pháp ngưng kết: Dựa trên cơ sở quá trình kết hợp của các tiểuphân nhỏ như các ion, phân tử mixen thành các tiểu phân to hơn có kích thướcđặc trưng cho các tiểu phân phân tán trong hỗn dịch (đường kính > 0,1m)[1]

1.2.2 Độ ổn định vật lý, hóa lý của hỗn dịch thuốc

Hỗn dịch thuốc được đánh giá có độ ổn định vật lý khi các chỉ tiêu chấtlượng của thuốc như phân bố kích thuớc tiểu phân, độ nhớt, khả năng phântán trở lại của tiểu phân trong hỗn dịch, thể tích sa lắng, pH giữ được tronggiới hạn tiêu chuẩn đề ra Các chỉ tiêu trên ảnh hưởng đến độ ổn định củathuốc, độ đồng đều hàm lượng, từ đó ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị củathuốc [2], [10], [21], [24]

Hỗn dịch thuốc là hệ phân tán chứa các tiểu phân dược chất rắn trongmôi trường lỏng và các tiểu phân có kích thước lớn hơn tiểu phân keo Cáctiểu phân trong hỗn dịch có các dạng thù hình khác nhau như hình cầu, hìnhhạt, hình sợi

Phân bố kích thước tiểu phân trong hỗn dịch là một yếu tố quan trọngquyết định hình thức cảm quan, tốc độ sa lắng, khả năng tái phân tán, độ hấpthu của hỗn dịch thuốc Các tiểu phân trong hỗn dịch có thể phân bố theo kiểuhàm phân phối chuẩn hoặc các phân bố khác như hình 1.1 [23]

Hỗn dịch thuốc chứa các dược chắt rắn có thể có sự tăng kích thước tiểu phân kết tinh trong thời gian bảo quản theo một số cơ chế:

 Dạng vô định hình chuyển dần sang dạng kết tinh bền hơn

 Kết tinh lên bề mặt tiểu phân do hạ thấp nhiệt độ

 Tăng kích thước tiểu phân theo chiều hướng tự diễn biếnlàm giảm diện tích bề mặt tiếp xúc trong hệ làm giảm năng lượng tự

 Sử dụng chất bảo vệ keo (như gôm, gelatin, dẫn chấtcellulose ) tạo hàng rào bảo vệ xung quanh tiểu phân, hạn chế sự hòatan và kết tinh.

 Bảo quản hỗn dịch ở điều kiện nhiệt độ ổn định [10], [11]

Tỉ lệ thể tích lớp tiểu phân sa lắng (Vs) so với tổng thể tích của hỗn dịch(Vt) là R được dùng làm thước đo sự sa lắng của các tiểu phân trong hỗn dịch

Biện pháp làm tăng độ nhớt và giảm nhỏ kích thước tiểu phân có tácdụng làm chậm quá trình sa lắng Các tiểu phân nhỏ mịn trong môi trườngphân tán có độ nhớt cao có thể sa lắng chậm hơn các tiểu phân có kích thướclớn hơn, nhưng sau khi sa lắng chúng tạo khối lắng kết (đóng bánh) tạo sựliên kết chặt chẽ khó phân tán trở lại Ngược lại, với trạng thái sa lắng đóngbánh là trạng thái tập hợp tơi xốp của các tiểu phân, khi sa lắng hay tập hợplại gần nhau thì các tiểu phân rời rạc, liên kết lỏng lẻo, vì vậy dễ dàng phântán trở lại thành các tiểu phân riêng biệt khi lắc nhẹ 1- 2 phút [13]

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến đến độ ổn định của hỗn dịch tiêm cần lưu ý khi thiết kế công thức thuốc tiêm hỗn dịch dầu

Trong thiết kế dạng bào chế hỗn dịch phần lớn các thuốc được điều chếbằng phương pháp phân tán Việc lựa chọn công thức thuốc được tiến hànhdựa trên thực nghiệm, đánh giá các yếu tố làm tăng độ ổn định vật lý của hỗn

dịch như đã nêu trên Các thành phần quan trọng đối với bào chế hỗn dịch dầucần lựa chọn là môi trường phân tán, các tác nhân gây thấm, tác nhân gâyphân tán Ngoài ra, còn có thể có một số chất phụ khác như chất bảo quản,chất gây tê

KTTP nhỏ giúp cho tiểu phân trong hỗn dịch sa lắng chậm Tuy nhiên,KTTP nhỏ thì khi sa lắng thường tạo khối liên kết chặt chẽ, tạo khối lắng kếtkhó phân tán trở lại hơn Ngược lại, KTTP lớn thì tiểu phân sẽ sa lắng nhanhhơn nhưng trạng thái tập hợp tơi xốp, tạo khối liên kết lỏng sẽ giúp cho cáctiểu phân dễ dàng phân tán trở lại hơn [10], [13]

Dung môi có ảnh hưởng trực tiếp tới quá trình điện ly của các tiểu phân,ảnh hưởng tới sự tích điện bề mặt của tiểu phân và thế điện động  Các hỗndịch trong dung môi nước thường bền vững hơn trong dung môi kém phâncực có hằng số điện môi nhỏ như dung môi hữu cơ như alcol, aceton vìchúng sẽ làm giảm độ bền trạng thái tập hợp của tiểu phân

Tuy nhiên, độ nhớt của dung môi phân tán cũng ảnh hưởng rất lớn Vớicác hỗn dịch dầu, độ nhớt cao thì tốc độ chuyển động của các tiểu phân chậm

đi, năng lượng va chạm giảm, các tiểu phân khó sát nhập với nhau, độ bền của

hệ tăng lên Độ nhớt của hỗn dịch luôn lớn hơn độ nhớt của môi trường phântán [9], [17], [29]

Một số loại môi trường phân tán sử dụng trong bào chế thuốc tiêm hỗndịch dầu:

Các loại dầu thực vật: dầu bông, dầu ngô, dầu oliu, dầu đậu lành, dầuvừng, dầu lạc, dầu hướng dương, dầu cọ [28]

Các triglycerid mạch trung bình (Labrafac PG, Myglyol)

Các chất diện hoạt hay chất gây thấm sử dụng trong hỗn dịch có tác dụnggây thấm, gây phân tán tạo điều kiện giảm nhỏ KTTP dược chất, làm tăng độbền trạng thái tập hợp của hỗn dịch

Việc sử dụng chất gây thấm, gây phân tán thích hợp có tác dụng chốnglại sự bám dính của các tiểu phân với nhau, cản trở quá trình đóng bánh củahỗn dịch

Một số chất gây thấm, chất gây phân tán sử dụng trong thiết kế côngthức thuốc tiêm hỗn dịch: Lecithin, PEG 400 caprylic/capric glycerid, nhômmonostearat, sorbitan monooleat (span 80) [28]

Glycerol, propylen glycol, PEG 400, polyoxyl 40 hydrogenat 28

 Quy trình xử lý chai lọ đựng thuốc tiêm cũng ảnh hưởng tới chấtlượng hỗn dịch [13], [29]

Nhiệt độ trong quá trình tiệt khuẩn cũng như điều kiện bảo quản tănglàm tăng động năng của các tiểu phân, dễ gây ra sự tập kết các tiểu phân.Nhiệt độ tăng có ảnh hưởng tới sự tích điện của bề mặt rắn (tăng quátrình phản hấp phụ của các ion tạo điện thế bề mặt), làm giảm độ nhớt củamôi trường Nhiệt độ ảnh hưởng lên lượng hấp phụ của các chất lên bề mặttiểu phân theo phương trình:

1 2

1 2 2

1

ln

T T

T T R

H q

 Trong đó, q1, q2 là lượng chất hấp phụ lên bề mặt của 1gam tiểu phân tạinhiệt độ là T1 và T2, Hads là nhiệt hấp thụ, R là hằng số

Cả 3 mặt ảnh hưởng này dẫn đến giảm độ bền của hỗn dịch Điều nàygiải thích tại sao trên nhãn mác các chế phẩm thường ghi chú “Để nơi mát,tránh nhiệt độ cao” [13]

1.3 THUỐC TIÊM TÁC DỤNG KÉO DÀI DÙNG TRONG THÚ Y

Thuốc tiêm tác dụng kéo dài là dạng bào chế có nhiều ưu điểm trongthuốc thú y Với đặc tính ưu việt của dạng bào chế, thuốc tiêm tác dụng kéodài ít phải nhắc lại liều hơn so với dạng bào chế quy ước Ví dụ, thuốc phòngchống bệnh tim HeartguardR dùng 1 liều /tháng, chế phẩm Excede (ceftiofurhydroclorid) dùng một liều duy nhất, trong khi đó Naxel (natri ceftiofur) cầntiêm 2lần/ngày x 3-5 ngày Do vậy, thuốc tiêm tác dụng kéo dài sẽ thuận tiệnhơn cho người chăn nuôi, giúp tuân thủ liều tốt hơn, tăng hiệu quả điều trị củathuốc Mặt khác, số lần tiêm thưa hơn sẽ giúp súc vật ít bị đau, và giảm đượctác dụng phụ của thuốc Tuy nhiên, thuốc tiêm tác dụng kéo dài là một dạngbào chế khó nghiên cứu và phát triển, do một số yếu tố như sự hấp thu bấtthường, gây đau mô nơi tiêm, sự ổn định của chế phẩm, phương pháp phântích [37]

Thị phần của thuốc tiêm tác dụng kéo dài.

Tổng doanh thu của thuốc thú y ở Mỹ năm 1998 là 7 tỉ USD Trong đó,thuốc giải phóng có kiểm soát chiếm 1tỉ , trong đó 40% doanh số là củathuốc tiêm tác dụng kéo dài [37]

1.3.1 Khái niệm thuốc tiêm tác dụng kéo dài

Thuốc tiêm tác dụng kéo dài là thuốc tiêm có khả năng giải phóng liêntục để duy trì nồng độ dược chất trong ngưỡng điều trị với một khoảng thờigian dài, nhằm nâng cao hiệu quả và giảm số lần dùng thuốc cho đối tượng sửdụng [2], [37]

1.3.2 Ưu nhược điểm của thuốc tiêm tác dụng kéo dài

 Duy trì nồng độ dược chất trong phạm vi điều trị tốt hơn,giảm sự giao động nồng độ thuốc trong máu (tránh hiện tượng đỉnh-đáy)

 Giảm số lần dùng thuốc, giúp tuân thủ điều trị.

 Nâng cao SKD của thuốc do thuốc được hấp thu đều hơn

 Giảm tổng liều, do đó giảm tác dụng phụ, giảm giá thànhđiều trị

1.3.3 Vị trí tiêm

Thuốc tiêm tác dụng kéo dài thường được bào chế dưới dạng tiêm bắphoặc tiêm dưới da Vị trí tiêm ảnh hưởng trực tiếp đến sự hấp thu, thời gianduy trì cũng như sinh khả dụng của thuốc tiêm

+ Tiêm dưới da: Tiêm vào sâu trong hạ bì, dưới lớp mỡ của da, hầu hếtcác súc vật thì nên tiêm vào phía sau tai hoặc vào vùng sau cổ, chỗ da mềm.+ Tiêm bắp: Là tiêm sâu hơn vào trong cơ, dưới lớp da [37]

1.3.4 Các dạng bào chế thuốc tiêm tác dụng kéo dài

+ Thuốc tiêm hỗn dịch: hỗn dịch nước, hỗn dịch dầu

+ Thuốc tiêm nhũ tương: dầu/nước, nước/dầu, nước/dầu/nước, vi nhũtương [37]

+ Thuốc tiêm chứa vi cầu, dạng gel, liposome và nano [14]

Trong dạng thuốc tiêm TDKD, lượng thuốc giải phóng quá nhanh sẽgây ngộ độc cho đối tượng sử dụng Vì vậy, cần làm các thử nghiệm giảiphóng in vitro trước khi sản xuất hàng loạt để đưa vào sử dụng Mô hình giảiphóng phải được xây dựng trước

Cơ chế giải phóng in vitro của của dược chất từ dạng thuốc tiêm TDKDbao gồm các liposom, hệ phân phối nano, các vi cầu, các hỗn dịch và dạng gel

đã được đề cập tới trong nghiên cứu của Claus và cộng sự Các con đườnghấp thu thuốc vào cơ thể từ dạng thuốc giải phóng có kiểm soát cũng được mô

Vào mao mạch

Chia cắt

1 phần thuốc ở lại vị trí tiêm

Khuếch tánVào bạch huyết

Thuốc tiêm giảiphóng kiểm soát

dùng dạng thuốc này là rất quan trọng, cần phải cẩn trọng khi xây dựng côngthức và trong quá trình sản xuất.Việc lựa chọn các tá dược có vai trò cốt yếu

để chế phẩm có độ bền trạng thái tập hợp, quyết định đến độc tính của sảnphẩm Hạt nano sẽ được sử dụng ngày càng rộng rãi, đặc biệt là đối với cáchoạt chất ít tan [30]

Lieven và cộng sự đưa ra công thức thuốc tiêm hỗn dịch nano củarilpivirin (TMC278), một thuốc điều trị HIV, với 3 kích thước hạt trung bình

là 200, 400, 800nm, chế phẩm ổn định sau 6 tháng bảo quản Tuy nhiên, kếtquả nghiên cứu chỉ ra rằng ở kích thước hạt 200nm, nồng độ hoạt chất tronghuyết tương đạt được cao hơn và ít thay đổi hơn Nồng độ thuốc có thể duy trìtrong ngưỡng điều trị tới 3 tháng ở chó và 3 tuần ở chuột sau khi tiêm mộtliều đơn [32]

Tushar Nahata và cộng sự đã nghiên cứu công thức tiêm vi cầu tác dụngkéo dài aripiprazole Bằng cách phối hợp một tỉ lệ thích hợp giữa hoạt chất vàcholesterol trong công thức vi cầu có thể đạt được sự giải phóng trong khoảngthời gian là 14 ngày [46]

1.3.5 Các yếu tố liên quan khi thiết kế thuốc tiêm hỗn dịch tác dụng kéo dài dùng trong thú y

Thông tin về sinh khả dụng và tác dụng trị liệu của sản phẩm là rất quantrọng Trước hết là sự ổn định về mặt lý, hoá và vi sinh của chế phẩm Để cóđược chế phẩm đảm bảo chất lượng, thì yêu cầu về công thức và kỹ thuật bàochế cũng rất khác nhau đối với từng chế phẩm Mặt khác, thuốc TDKD cònphải chú ý đến những điểm giống và khác nhau trong sự phân phối thuốc vào

cơ thể giữa người và gia súc [40]

Larsen và cộng sự chỉ ra sự phụ thuộc của tốc độ giải phóng in vivo vào

hệ số phân bố dầu/nước của dược chất Các hợp chất có hệ số phân bốdầu/nước cao sẽ giải phóng chậm hơn [37]

Khả năng phân tán các tiểu phân của hỗn dịch dầu để đạt được sự đồngnhất liều cũng là một vấn đề quan trọng Foste và Kiefer đã có một phát minh:một lượng nước nhỏ trong công thức hỗn dịch dầu sẽ làm tăng khả năng phântán trở lại của hỗn dịch Tỉ lệ nước trong công thức dầu có thể có từ các thànhphần của dược chất, các tá dược hoặc bằng cách cho thêm nước vào

Ví dụ: Sau sáu tháng bảo quản hỗn dịch ceftiofur hydroclorid với hàm lượngnước 0,39% có thể đồng nhất lại sau test thử 10 giây Trong khi đó hỗn dịchnày với hàm lượng nước 0,2%, không phân tán đồng nhất trở lại [20]

 Các yếu tố lý hoá

+ pKa

Sự thay đổi trạng thái ion của dược chất có thể tạo kết tủa tại vị trí tiêm(dung dịch thuốc TDKD), gây hoại tử hoặc có thể chết Tuy nhiên, có thể sựkết tủa dược chất ở kích thước tiểu phân thích hợp có thể có tác động quantrọng đến sự giải phóng và thời gian tiềm tàng một cách có ý nghĩa trong côngthức thuốc tiêm tác dụng kéo dài [40]

+ Ảnh hưởng độ tan của dược chất

Hỗn dịch nước pocain penicillin G duy trì được tác dụng từ 14-24h,trong khi dung dịch thuốc tiêm kali penicillin chỉ được 4h Như vậy, dựa vàođặc tính độ tan và tốc độ hoà tan của dược chất, người ta có thể tăng nhanhhay kéo dài quá trình hấp thu dược chất bằng việc chọn dạng dược chất có độtan thích hợp để pha các thuốc tiêm có SKD mong muốn [2]

+ Kích thước tiểu phân

Tốc độ giải phóng dược chất cũng phụ thuộc vào bề mặt tiếp xúc giữatiểu phân dược chất với môi trường khuếch tán Diện tích bề mặt tiếp xúccàng lớn (kích thước tiểu phân nhỏ) thì tốc độ giải phóng càng nhanh Nhưvậy, có thể bào chế thuốc tiêm hỗn dịch tác dụng kéo dài bằng cách tăngKTTP dược chất đến kích thước thích hợp [2], [40]

+ Ảnh hưởng của độ nhớt môi trường phân tán

Độ nhớt của môi trường phân tán cũng là yếu tố ảnh hưởng đến tốc độhoà tan và hấp thu dược chất từ dạng bào chế Khi độ nhớt tăng cao, hệ sốkhuếch tán của dược chất giảm, tốc độ hoà tan dược chất cũng giảm, làmchậm quá trình hấp thu Độ nhớt còn làm khu trú liều thuốc tại chỗ tiêm, hạnchế diện tích tiếp xúc với màng hấp thu, làm giảm tốc độ hấp thu, kéo dài thờigian khuếch tán của dược chất [2], [40]

+ Cấu trúc hoá lý của thuốc tiêm

Các thuốc tiêm có cấu trúc hoá lý khác nhau sẽ có tốc độ giải phóngdược chất khác nhau Tốc độ giải phóng dược chất ra khỏi thuốc tiêm có cấutrúc hoá lý khác nhau giảm dần theo thứ tự: Dung dịch nước > hỗn dịch nước

> dung dịch dầu > nhũ tương dầu/nước > nhũ tương nước/dầu > hỗn dịch dầu[2]

 Các yếu tố sinh lý

+ Loài và trọng lượng cơ thể vật nuôi

Loài và trọng lượng cơ thể vật nuôi là yếu tố quan trọng trong nghiêncứu công thức tác dụng kéo dài Cần phải chú ý trong việc xác định liều dùng

Ví dụ, liều dùng cho các vật nuôi như (trâu, bò, ngựa…) có thể lại quá caocho vật nuôi trong nhà như (mèo, chó ) Ngay cả cùng là chó thì trọng lượng

cơ thể cũng rất thay đổi, vì vậy khi thiết kế liều dùng phải có nghiên cứu cụthể [40]

+ Hấp thu: Sự hấp thu thuốc từ dạng bào chế TDKD dao động bởi sựthay đổi nhỏ trong công thức, kỹ thuật bào chế… cũng như các yếu tố về sinh

lý, bệnh lý của súc vật [40]

1.4 ĐẠI CƯƠNG VỀ CEFTIOFUR HYDROCLORID

1.4.1 Cấu trúc hoá học

Công thức phân tử: C19H17N5O7S3 HCl

Khối lượng phân tử: 560,03

Công thức cấu tạo:

Tên khoa học:

(6R-(6,7(Z))-7-(((2-amino-4-thiazolyl) (methoxyimino)acetyl)amino) ))-7-(((2-amino-4-thiazolyl) (methoxyimino)acetyl)amino) -3-(((2-furanylcarbonyl)thio)methyl)-8-oxo-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylic acid hydrochlorid [47]

Nhiệt độ nóng chảy: 187 – 1920C [47]

 Tính chất hoá học

Tính không bền vững của vòng -lactam:

Dễ dàng bị phá vỡ dưới sự tấn công của các tác nhân ái điện tử và áinhân Dẫn đến dễ bị thuỷ phân trong môi trường acid mạnh và môi trườngkiềm

Tính acid yếu: do nhóm COOH ở vị trí 4 nên có tính acid yếu Muốinatri của ceftiofur dễ tan trong nước nên có thể bào chế dạng bột pha tiêm [7].

và ái khí thì tác dụng như thế hệ II

+ Nó kháng lại các vi khuẩn sinh -lactamase như Fusobactreiumnerophorum, Bacteroides melaninogenieus [7], [47]

Tiêm bắp 3-5mg/kg / ngày x 3ngày

+ Mèo: Dùng trong nhiễm khuẩn da, viêm tử cung, nhiễm trùng đường

hô hấp Tiêm bắp hoặc tiêm dưới da

- Viêm da: 1,1 – 2,2 mg/kg/ngày x 3ngày

- Viêm tử cung: 2,2mg/kg/ngày x 5ngày

- Viêm đường hô hấp: 1,1-2,2mg/kg/ngày x 3 – 5ngày

Không nên tiêm quá 15ml hỗn dich ceftiofur vào cùng một vị trí tiêm [47]

1.4.4 Phương pháp định lượng ceftiofur hydroclorid

1.4.5 Một số chế phẩm của ceftiofur có lưu hành trên thị trường

Hiện nay, tại Việt Nam dạng hỗn dịch tiêm chứa hoạt chất ceftiofur cócác số đăng ký lưu hành còn hiệu lực được thống kê ở bảng 1.1 như sau:

Bảng 1.1 Một số chế phẩm hỗn dịch tiêm chứa ceftiofur

BM-Ceftiofur

suspension

ExcedeTM for

Swine

Ceftiofur acid

1.5 MỘT SỐ CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU VỀ BÀO CHẾ, SINH DƯỢC HỌC VÀ PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM CỦA CEFTIOFUR HYDROCLORID

- Foster và cộng sự nghiên cứu độ ổn định của thuốc tiêm hỗn dịch

dầu ceftiofur hydroclorid 50mg/ml, lecithin, sorbitan monooleat, dầu thựcvật, nước Kết quả nghiên cứu cho thấy với một lượng nước nhỏ (0,2 – 2,2%)cho vào trong thành phần hỗn dịch không ảnh hưởng đến độ ổn định hoá họccủa dược chất, trong khi độ ổn định vật lý của hỗn dịch có thêm nước tốt hơnnhiều so với hỗn dịch không có nước [20]

- Jindal và cộng sự nghiên cứu bào chế công thức thuốc tiêm hỗn dịchgồm ceftiofur hydroclorid, dầu thực vật, lecithin, sorbitan monooleat Các tácgiả đưa ra quy trình bào chế hỗn dịch ceftiofur như sau: Tiệt khuẩn dầu ở

1600, cho các tá dược phân tán, chất diện hoạt vào khuấy cho tan, để nguộiđến 800C rồi cho dược chất vào khuấy, nghiền bằng máy xay keo và đóng lọ[28]

- Lin Z))-7-(((2-amino-4-thiazolyl) (methoxyimino)acetyl)amino) hang và cộng sự đã nghiên cứu phát triển công thức gel tác dụngkéo dài gồm natri ceftiofur, 25-30% poloxamer 407, và một số tá dược khácnhư PVP, CMC, HPMC [33]

- Cazer và cộng sự nghiên cứu bào chế thuốc tiêm phức hợp ceftiofurhydroclorid với ion kẽm cho thấy: tốc độ giải phóng hoạt chất từ dạng thuốc

và thời gian bán thải của phức hợp kẽm với Cef chậm hơn so với chỉ riêngCef [12]

- Wang và cộng sự sử dụng dimethicon và một số tá dược khác trongcông thức tiêm TDKD ceftiofur [48]

1.5.2 Dược động học

Tại vị trí tiêm, ceftiofur hấp thu vào trong máu Khác với cáccephalosporin khác, là sau khi hấp thu nó nhanh chóng bị chuyển hoá thànhchất thứ cấp desfuroylceftiofur Chất này có một nhóm sulhydryl hoạt động,

là nguyên nhân khiến ceftiofur liên kết với protein huyết tương ở tỉ lệ lớn dohình thành lên liên kết đồng hoá trị với protein huyết tương [47]

- Elizabeth và cộng sự nghiên cứu DĐH của ceftiofur acid trên một số

loài động vật, kết quả như sau: Nồng độ điều trị (so với nồng độ ức chế tối

thiểu MIC trên loài Pasteurella multocida, Mannheinia hamemolytica là 0,2g/ml) của chế phẩm đạt được trong máu 9,1 ngày ở mèo, 8,5 ngày ở bò,

6,7 ngày ở dê không tiết sữa và 7,5 ngày ở dê tiết sữa sau khi tiêm dưới damột liều 6,6mg/kg [19]

- Liu S và cộng sự đã nghiên cứu DĐH của liposom ceftiofur natri sovới ceftiofur natri trên bò Kết quả sau khi tiêm tĩnh mạch liều 2,2mg/kg,AUC0- của liposom ceftiofur natri là 472 so với 163 ± 16,2 g.giờ/ml ởceftiofur natri, T1/2 = 32,4 giờ so với 15,3  3,21 giờ Nồng độ sau 48 giờtrong máu của liposom ceftiofur natri là 3,46  0,23 g/ml, cao hơn nhiều sovới nồng độ ức chế tối thiểu với các vi khuẩn Streptococcus aureus, E.coli,Salmolella enteritidis [34]

- Tang S và cộng sự nghiên cứu DĐH ở lợn của hỗn dịch ceftiofurhydroclorid (chế phẩm nghiên cứu) so với chế phẩm ExenelR của Pfizer Kết

quả như sau: Tiêm bắp một liều 5mg/kg, AUC0- chế phẩm nghiên cứu(400,86 ± 27,35g.giờ/ml) xấp xỉ bằng AUC0- của ExenelR (395,56±16,33g.giờ/ml), Cmax của chế phẩm thấp hơn của ExenelR 2,34 lần (15,22 0,57 so với 35,56 ± 2,4), thời gian bán thải T1/2 của chế phẩm kéo dài hơn 1,65lần (22,67  1,39 so với 13,74 ± 0,24) Nồng độ điều trị của chế phẩm kéodài từ 87,2 – 135,36 giờ, trong khi một đợt điều trị bệnh ở lợn là 5 ngày [43].

- Drew M L và cộng sự đã nghiên cứu DĐH của natri ceftiofur trênhươu Châu Âu Thuốc tiêm natri ceftiofur được tiêm bắp với liều 250mg/kg,lấy máu sau 0,25; 0,5; 1; 2; 4; 8; 12; 24; 36; 72 giờ Kết quả như sau AUC0 - 

(15,4 g.giờ/ml ), T1/2(8,42giờ), Cmax (0,681g/ml ) [17]

- Goudah A đã nghiên cứu DĐH của natri ceftiofur trên lạc đà Tiêmbắp và tiêm tĩnh mạch với liều 2,2mg/kg Kết quả AUC0- không khác nhaunhiều giữa đường tiêm bắp (AUC0 -  = 70,53  9,44 g.giờ/ml) và tiêm tĩnhmạch (AUC = 68,70  7,19 g.giờ/ml) [22]

- Dumonceaux, G và cộng sự nghiên cứu DĐH ceftiofur base trên voi.Tiêm bắp và tiêm tĩnh mạch với liều 1,1mg/kg Kết quả cho thấy AUC0-

khác nhau nhiều giữa đường tiêm bắp (AUC = 6,1g.giờ/ml) và tiêm tĩnhmạch (AUC = 187 g.giờ/ml) [18]

1.5.3 Phương pháp kiểm nghiệm

- Souza và cộng sự tiến hành định lượng ceftiofur bằng sắc ký lỏng hiệunăng cao và thẩm định phương pháp với điều kiện sau:

+ Sử dụng cột C18 (250 x 4,6mm), cỡ hạt 5m

+ Pha động: Hỗn hợp dd đệm dinatri hydrophosphat (pH =6) (điều chỉnh

pH bằng acid orthor phosphoric 85%) và acetonitril, tỉ lệ (78 : 22)

+ Tốc độ dòng : 1,0ml/phút

+ Detector UV, bước sóng phát hiện  = 292nm

+ Thể tích tiêm: 20l

Kết quả như sau: Thời gian lưu 6,8 phút Độ lặp lại (99,55%), độ chínhxác (99,45%) [41].

- Patricia và cộng sự đã định lượng ceftiofur bằng pp điện di mao quản.Kết quả là pp có độ nhạy cao với giới hạn tìm thấy tới 10ng/lít Các tác giảcũng dùng pp điện di để định lượng ceftiofur trong huyết tương bò [38], [39]

- Jacobson G và cộng sự đã nghiên cứu định lượng ceftiofur trong huyếttương bò bằng phương pháp HPLC Tác giả dùng dithioerythriol trong quátrình phân tách phức hợp desfuroylceftiofur với protein huyết tương thànhdạng tự do Tiến hành định lượng desfuroylceftiofur

Điều kiện sắc kí như sau : Pha động, hỗn hợp dd A (dd acid trifluoracetic0,1% trong nước) và dd B (acid trifluoracetic 0,1% trong acetonitril) tỉ lệ(75:25) Sử dụng cột C18 (150 x 4,6mm), cỡ hạt 5m.Tốc độ dòng 1,0ml/phút.Detector UV đo ở bước sóng  = 265nm.Thể tích tiêm 20l

Kết quả đưa ra giới hạn xác định được là 0,15 g/ml và tốt nhất là chọnnồng độ trong khoảng 0,4 – 4 g/ml để tiến hành định lượng [25]

- Jeffrey và cộng sự định lượng ceftiofur trong sữa bò bằng pp HPLC.Giới hạn tìm thấy là 10ppb và khoảng tuyến tính từ 25 – 200 ppb với hệ sốtương quan r2 = 0,993 [27]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Ceftiofur hydroclorid

2.1.2 Nguyên vật liệu và thiết bị dùng cho nghiên cứu

Bảng 2.1.Nguyên vật liệu dùng cho nghiên cứu.

1 Ceftiofur hydroclorid Trung Quốc T/c nhà sản xuất

8 BHT (Butyl hydroxytoluen) Trung Quốc BP2007

11 ExenelR (chế phẩm đối chiếu) Pfizer

Hoá chất dùng phân tích: đạt tiêu chuẩn tinh khiết hoá học hoặc loạidùng cho HPLC

Lọ thuỷ tinh trung tính, không màu

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Aligment 1100 Siries

- Máy xay keo VMX008.01 và VMX008.02

-Máy đo kích thước tiểu phân SPECTREX LASER PARTICLECOUNTER

- Tủ sấy tĩnh Memmert UM400 , tủ ấm WTB Binder, tủ lạnh sâu

- Tủ vi khí hậu Climacell

- Cân phân tích Sartorius AG, cân kỹ thuật Adventurer AR2130.

- Nồi hấp, thước đo và các dụng cụ khác

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.2.1 Xây dựng công thức và qui trình bào chế thuốc tiêm hỗn dịch tác dụng kéo dài ceftiofur hydroclorid Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của chế phẩm nghiên cứu

- Xác định phân bố KTTP

- Xác định tốc độ sa lắng (dựa trên Rsl)

- Hàm lượng còn lại sau thời gian bảo quản

2.2.2 Xây dựng phương pháp định lượng chế phẩm

- Định lượng bằng phương pháp HPLC

- Định lượng bằng phương pháp vi sinh

2.2.3 Xây dựng dự thảo tiêu chuẩn cơ sở của chế phẩm nghiên cứu

2.2.4 Theo dõi độ ổn định của chế phẩm

Trong điều kiện thực (nhiệt độ phòng 25 – 350C, độ ẩm 45 – 85%), lãohoá cấp tốc (400C  2, RH 75%  5) và điều kiện cưỡng bức có tác động củaánh sáng

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Phương pháp bào chế

a Xây dựng công thức

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng phân tán dược chất, độ ổnđịnh của hỗn dịch nghiên cứu bao gồm:

- Loại dầu để pha hỗn dịch tiêm

- Loại chất gây phân tán và nồng độ chất gây phân tán đưa vào hỗn dịch tiêm

- Loại chất và nồng độ chất gây thấm sử dụng

- Tốc độ và thời gian xay hỗn dịch bằng máy xay keo

Dựa theo tài liệu tham khảo, chúng tôi lựa chọn thành phần hỗn dịchtiêm như sau:

Labrafac PG (propylen glycol dicaprylocaprat) Vừa đủ 100 ml

Để nghiên cứu ảnh hưởng của từng yếu tố trên, chúng tôi giữ nguyênspan 80 với nồng độ 0,5% kết hợp với một trong ba chất gây thấm lecithin,nhôm monostearat, WA

Từ kết quả nghiên cứu đề xuất được một công thức thuốc tiêm hỗn dịchchứa 5% ceftiofur hydroclorid có độ ổn định và có khả năng phân tán trở lại

một cách dễ dàng để có thể đưa vào sản xuất.

b Quy trình bào chế hỗn dịch tiêm ceftiofur hydroclorid

Mô tả quy trình bào chế

Đun dầu ở nhiệt độ trên 1600C trong 1h

Để nguội 800C, cho chất gây phân tán, BHT vào, khuấy cho tan

Cho tiếp propylen glycol, alcol benzylic vào khuấy đều

Lọc qua màng 0,2 m

Cho ceftiofur hydroclorid vào, khuấy trộn khoảng 15 phút

Xay bằng máy xay keo khoảng 45- 60phút

Kiểm nghiệm bán thành phẩm

Đóng lọ thuỷ tinh

(Mỗi lần pha 500ml)

(Thuốc được pha chế trong môi trường sạch cấp D Bao bì cấp 1, dụng

cụ sản xuất đã được tiệt khuẩn).

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình bào chế hỗn dịch tiêm ceftiofur hydroclorid

Tiệt khuẩn dầu

Để nguội đến 800C

Khuấy trộn cho tan

Khuấy trộn cho tan

Xay bằng máy xay keokeo

Bán thành phẩm

Đóng lọLọc qua màng 0,2m

2.3.2 Phương pháp xác định kích thước tiểu phân

Nguyên lý đo kích thước hạt bằng phương pháp tán xạ lase:

Khi chiếu chùm tia lase vào các hạt có kích thước khác nhau ta sẽ thuđược mức độ tán xạ ánh sáng khác nhau Dựa vào mức tán xạ của chùm tiasau khi va đập vào hạt ta có thể tính được kích thước hạt theo thuyết Mie [36]

Phương pháp tán xạ lase đưa ra kết quả tỷ lệ phần trăm thể tích của cáchạt theo đường kính hạt Khi chiếu tia lase tới hạt thì tại rìa hạt xảy ra hiệntượng tán xạ ánh sáng mạnh, do đó ta thu được hình ảnh của hạt trên nền

Thông thường để đánh giá một cách chuẩn xác người ta dùng hệ sốgiao thoa tán xạ trên một micromet:

SCPM = Csca x (4r3/3)

Hệ số giao thoa tán xạ được tính theo công thức:

S (m-1) = 0,75 (1 - cos) SCPMTrong đó: cos là cosin của góc tán xạ trung bình

Máy đo kích thước tiểu phân SPECTREX LASER PARTICLECOUNTER dựa trên sự tán xạ và nhiễu xạ của ánh sáng khi đi qua rìa tiểuphân để tính toán ra KTTP theo nguyên lý trình bày ở trên [13]

Máy được kết nối với máy tính và có phần mềm xử lý số liệu để đưa rakết quả đo phân bố KTTP và thường được đánh giá bằng hai chỉ số là KTTPtrung bình và SD (độ lệch chuẩn của phân bố kích thước các tiểu phân trongmẫu đo) Hai chỉ số này được phần mềm máy tính thống kê đưa ra trên bảngkết quả đo (Phụ lục 5)

Nguyên lý cấu tạo của máy gồm các nguồn lase được chiếu vào dịch đo.Trong dịch đo có sự tán xạ và giao thoa, các tia tán xạ được nhận biết bằngcác detetor khác nhau (hình 2.2)

Phương pháp đo KTTP hỗn dịch tiêm ceftiofur 5% [42].

Số tiểu phân sẵn có trong dung môi dùng để pha loãng là rất quan trọng

Các bước tính hệ số pha loãng:

- Đo và đếm số lượng tiểu phân trong dung môi dùng để pha loãng Sốtiểu phân trong dung môi pha loãng càng thấp càng tốt Lớn nhất là 30 tiểuphân/1ml

- Pha loãng bằng dung môi một thể tích mẫu xác định sao cho số tiểuphân đếm được cuối cùng phải lớn hơn ít nhất 20 lần số tiểu phân trong dungmôi pha loãng

VD: Dung môi pha loãng đếm được là 10 TP/1ml thì số tiểu phân đếm

trong dung dịch cuối cùng ít nhất phải là 10 x 20 = 200 TP/1ml (trị số Min).

- Luôn chắc chắn rằng số tiểu phân cuối cùng đếm được không vượt quá

800 – 1000 TP/1ml (trị số Max) để tránh hiện tượng các hạt trùng lên nhau.

Tức là trong ví dụ trên thì số tiểu phân trong dung dịch đo phải nằm trong

khoảng 200 – 1000 TP/ml (Min – Max) thì phép đo mới có ý nghĩa.

Từ các điều kiện trên ta có thể áp dụng tìm hệ số và cách pha loãng hỗn dịch như sau:

Do là hỗn dịch dầu nên lượng mẫu lấy quá ít sẽ sai số vì tiểu phân dượcchất dính lên thành dụng cụ Vậy nên lấy mẫu bằng pp cân là tốt nhất (dựavào tỉ trọng của hỗn dịch để tính ra thể tích tương ứng)

Đo và đếm số tiểu phân trong 1ml dung môi dùng pha loãng -> Tính ra

trị số Min Kết quả đo dung môi của chúng tôi là 4 tiểu phân/ml.

Cân khoảng 0,5gam hỗn dịch, pha loãng bằng dung môi Labrafac PG

vào bình định mức 1000ml

Hút chính xác 5,0ml hỗn dịch trên pha loãng vào bình định mức 100ml.Tiến hành đo và đếm lượng tiểu phân và xác định xem số lượng tiểuphân có nằm trong khoảng cho phép chưa Kết quả đo của chúng tôi là 537tiểu phân/ml

Min (4TP) < số TP đếm được (537TP) < Max (800 – 1000)

Vậy hệ số pha loãng thích hợp ở đây là khoảng 10,000 lần

2.3.3 Phương pháp xác định tốc độ sa lắng (dựa trên R sl )

Tỉ lệ thể tích lớp tiểu phân sa lắng (Vs) so với tổng thể tích của hỗn dịch(Vt) là Rsl được dùng làm thước đo sự sa lắng của các tiểu phân trong hỗndịch Ta có biểu thức Rsl = Vs Vt = ho h (2.3.3)

Trong đó: h o là chiều cao ban đầu của hỗn dịch trong ống đong.

h là chiều cao lớp tiểu phân sa lắng ở trạng thái đã sa lắng.

2.3.4 Thử nghiệm lắc 10 giây

Lắc mạnh trong 10 giây, yêu cầu hỗn dịch phải đồng nhất trở lại

2.3.5 Phương pháp định lượng ceftiofur hydroclorid

Trước hết, cần xác định tỉ trọng của chế phẩm như sau:

Dùng picnomet để đo tỉ trọng của chế phẩm

Cân khối lượng bì được mlọ trắng = 15,5692 gam

Rót nước vào picnomet cân được mn = 25,3648 gam

Cho chế phẩm vào cân được mcp = 24,7801 gam

Tính tỉ trọng d của chế phẩm d =

l n

l cp

m m

m m

- Pha động: Hỗn hợp dd đệm dinatri hydrophosphat 0,02M (pH =6)

(điều chỉnh pH bằng acid orthor phosphoric 85%) và acetonitril tỉ lệ(78:22)

- Tốc độ dòng: 1,0ml/phút

- Detector UV, bước sóng phát hiện:  = 292nm

- Thể tích tiêm: 20l

 Tiến hành

Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 50,0mg ceftiofur hydroclorid

chuẩn vào bình định mức 50,0ml, hòa tan bằng pha động vừa đủ thể tích Hút chính xác 3,0ml dd trên cho vào bình định mức dung tích 50,0ml, hòa loãng

bằng pha động cho vừa đủ thể tích (dd có nồng độ khoảng 60g/ml), lắc đều Lọc qua màng lọc 0,45m.

Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 1,0 gam chế phẩm vào bình định

mức 50,0ml, hòa tan bằng pha động cho vừa đủ thể tích (dd A) Hút chính xác3,0ml dd A, cho vào bình định mức dung tích 50,0ml, hòa loãng bằng pha động cho vừa đủ thể tích (dd có nồng độ khoảng 60g/ml), lắc đều Lọc qua màng lọc 0,45m

Tiến hành tiêm lần lượt các dd chuẩn và dd thử vào hệ thống sắc ký Ghi lại sắc ký đồ

Hàm lượng ceftiofur hydroclorid so với hàm lượng ghi trên nhãn được tính theo công thức:

% hoạt chất so với hl trên nhãn =   5100

t c

c c

t

m S

C d m S

(2.3.5)

Trong đó: Sc , St lần lượt là diện tích pic của chuẩn và thử

mc , mt là khối lượng cân của chuẩn, thử

Cc là hàm lượng của ceftiofur hydroclorid chuẩn

- Thuốc thử: methanol (TT), dd acid phosphoric

- Chủng chỉ thị: Micrococus luteus ATCC 9341 [25]

- Môi trường định lượng.

Điều chỉnh pH dung dịch đệm bằng acid phosphoric 2M hoặc natrihydroxyd 2M, pH dung dịch đệm sau khi tiệt khuẩn là 6,0  0,1

 Chuẩn bị hỗn dịch vi sinh vật (USP 30) [45]

Tăng sinh chủng trên ống môi trường thạch nghiêng số 1(USP30), sau24h, gặt chủng bằng 5ml nước muối sinh lý, thu được hỗn dịch chủng làmviệc

Cấy hỗn dịch VSV làm việc vào môi trường định lượng để được nồng

độ 1ml/100ml

 Chuẩn bị dd chuẩn và dd thử

Cân chính xác một lượng 50,0mg chất chuẩn ceftiofur hydroclorid, hoàtan và pha loãng bằng pha động trong pp định lượng HPLC vừa đủ 50,0ml đểthu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 1000g/ml Pha loãng dung dịch

chuẩn gốc bằng dung dịch đệm pH 6 để thu được các dung dịch chuẩn SH,

SM, SL (viết tắt của Standard High, Standard Medium và Standard Low)

Dung dịch thử được chuẩn bị tương tự: Cân chính xác một lượng chếphẩm tương ứng khoảng 50,0mg kháng sinh, hòa tan và pha loãng bằng dungmôi pha động trong pp định lượng HPLC vừa đủ 50,0ml để thu được dd thử

có nồng độ khoảng 1000g/ml Pha loãng bằng dung dịch đệm pH 6 để thuđược các dung dịch TH, TM, TL

 Phương pháp định lượng

Phương pháp được lựa chọn là phương pháp khuyếch tán trên thạch,

mô hình 3 + 3, trên 6 đĩa petri

Đặt các đĩa petri lên bàn tạo mặt phẳng Kiểm tra lại độ phẳng của bànbằng thước có giọt nước Mở nắp đĩa Thể tích môi trường cho vào mỗi đĩapetri là 22ml (rót vào đĩa 12 ml thạch nền, sau đó thêm 10ml môi trường địnhlượng đã cấy chủng) Sau đó, để ở nhiệt độ phòng khoảng 15 - 20 phút chothạch đông cứng Đậy nắp Sử dụng khoan thạch vô trùng bằng thép (đườngkính trong 8 mm) để khoan 6 lỗ thạch cách đều nhau Dùng kim vô trùng đểlấy thạch ra

- Dùng micropipet để nhỏ các dung dịch kháng sinh vào lỗ thạch (mỗi lỗ90l) theo chiều ngược kim đồng hồ

- Để khay vuông ở nhiệt độ phòng 1 giờ để kháng sinh khuyếch tán

- Ủ khay vuông đã nhỏ dung dịch kháng sinh trong tủ ấm ở nhiệt độ 35-370C

- Đo đường kính vòng vô khuẩn tạo thành bằng thước đo Mitutoyo (độ chínhxác 0,01mm)

Tính kết quả theo phụ lục 13.10 DĐVN IV – Phân tích thống kê các kết quả thử nghiệm sinh học [4],[44].

2.3.6 Phương pháp đánh giá độ ổn định

Bảo quản thuốc trong những điều kiện khác nhau, sau những khoảngthời gian xác định tiến hành đánh giá chất lượng sản phẩm dựa trên một số chỉtiêu như sau:

- Hình thức

- Thử nghiệm lắc 10 giây

- Kích thước tiểu phân

- Tốc độ sa lắng của hỗn dịch (dựa trên Rsl)

- Hàm lượng ceftiofur hydroclorid

 Mẫu bảo quản ở điều kiện thực: Thuốc đóng trong lọ nút kín, đóng hộpbảo quản ở điều kiện thực (nhiệt độ phòng 25 - 350C ; độ ẩm 45 – 85%)

 Mẫu bảo quản ở điều kiện lão hóa cấp tốc: Thuốc đóng trong lọ nút kín,đóng hộp bảo quản ở điều kiện lão hoá cấp tốc:

+ Thiết bị bảo quản: tủ vi khí hậu

+ Nhiệt độ: 400C  2

+ Độ ẩm: 75%  5

 Theo dõi ở điều kiện cưỡng bức có tác động của ánh sáng

2.3.7 Phương pháp xử lý số liệu

Thực nghiệm được tiến hành 3 lần, kết quả được tính trung bình

Các số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm excel

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG

3.1.1 Thẩm định phương pháp HPLC

Với điều kiện sắc kí lỏng hiệu năng cao như đã nêu ở mục 2.3.5.a Quakhảo sát chúng tôi đã xác định được điều kiện pha động gồm: Hỗn hợp ddđệm dinatri hydrophosphat 0,02M (pH =6) và acetonitril tỉ lệ (78:22) Sửdụng cột C18 (250 x 4,6mm), cỡ hạt 5m.Tốc độ dòng: 1,0ml/phút Detector

UV đo ở bước sóng  = 292nm Thể tích tiêm: 20l, kết quả ghi lại được sắc