Nghiên cứu hạn chế sự oxy hóa lipid trên sản phẩm cá nục khô bằng chất chống oxy hóa tự nhiên chiết xuất từ lá vối (cleistocalyx operculatus)

THỬ NGHIỆM HẠN CHẾ SỰ OXY HÓA LIPID TRONG SẢN PHẨM CÁ NỤC KHÔ BẰNG DỊCH CHIẾT LÁ VỐI CHỨA CHẤT CHỐNG OXY HÓA TỰ NHIÊN POLYPHENOL .... Em chọn hướng đề tài nghiên cứu đó là: Nghiên cứu h

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ CHẾ BIẾN THỦY SẢN

Nha Trang, tháng 07 năm 2015

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ CHẾ BIẾN THỦY SẢN

GVHD: PGS.TS NGUYỄN ANH TUẤN

Nha Trang, tháng 07 năm 2015

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, trước hết em xin bày tỏ lòng biết ơn đến Ban giám hiệu Trường Đại Học Nha Trang, toàn thể các thầy cô giáo trong Khoa công nghệ thực phẩm, Trung tâm phòng thí nghiệm và thực hành Trường Đại Học Nha Trang, các bạn cùng chuyên ngành đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành bài luận văn của mình

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô đã truyền đạt cho em những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập trong trường Đặc biệt em xin chân thành cảm

ơn Thầy, PGS TS Nguyễn Anh Tuấn đã định hướng, giúp đỡ, tận tình hướng dẫn

và động viên em trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Cuối cùng em xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thành viên trong gia đình, các bạn đồng môn đã động viên và giúp đỡ để em có thể thực hiện tốt đề tài này

Mặc dù đã cố gắng hết sức cho việc hoàn thành đồ án tốt nghiệp, nhưng do kiến thức còn hạn chế, chưa có kinh nghiệm thực tế nên không tránh khỏi những thiếu sót, kính mong quý thầy cô chỉ bảo để giúp em củng cố thêm về kiến thức và hoàn thiện hơn nữa kiến thức chuyên môn, giúp em vững tin trên con đường sự nghiệp

Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn!

Khánh Hòa, ngày 26 tháng 06 năm 2015

Sinh viên

Nguyễn Thị Huệ

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH vi

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT viii

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 OXY HÓA LIPID 3

1.1.1 Khái niệm về sự oxy hóa lipid 3

1.1.2 Cơ chế của quá trình oxy hóa lipid 3

1.1.3 Ảnh hưởng của sự oxy hóa lipid đến chất lượng thực phẩm 5

1.1.4 Ngăn chặn sự oxy hóa lipid 5

1.2 SỰ OXY HÓA LIPID TRONG CƠ THỊT CÁ 7

1.2.1 Thành phần hóa học của cơ thịt cá 7

1.2.2 Sự oxy hóa lipid trong cơ thịt cá 8

1.2.3 Sự oxy hóa lipid trong sản phẩm cá nục khô 10

1.3 TỔNG QUAN VỀ LÁ VỐI 11

1.3.1 Đặc điểm, phân loại, phân bố 11

1.3.2 Chất chống oxy hóa từ lá vối 12

1.3.3 Thu nhận chất chống oxy hóa từ lá vối 12

1.3.4 Ứng dụng chất chống oxy hóa từ lá vối trong lĩnh vực thực phẩm 13

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 14

2.1.1 Nguyên liệu lá vối 14

2.1.2 Nguyên liệu cá nục 14

2.1.3 Hóa chất 15

2.1.4 Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu 15

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.2.1 Bố trí thí nghiệm 16

2.2.1.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 16

2.2.1.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm thu nhận dịch chiết từ lá vối 17

2.2.1.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm sử dụng dịch chiết lá vối để xử lý các miếng cá nục phi lê 19

2.2.2 Các phương pháp phân tích 21

2.2.2.1 Xác định thành phần hóa học cơ bản 21

2.2.2.2 Xác định hiệu suất thu hồi dịch chiết từ lá Vối 22

2.2.2.3 Xác định sự có mặt của các nhóm hợp chất có trong dịch chiết thô 23

2.2.2.4 Định lượng polyphenol có trong dịch chiết lá vối 23

2.2.2.5 Định lượng flavonoid có trong dịch chiết lá vối 24

2.2.2.6 Xác định hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết lá vối 24

2.2.2.7 Xác định hàm lượng a xít béo tự do trong cơ thịt cá nục khô 25

2.2.2.8 Xác định các chỉ tiêu liên quan đến sự oxy hóa lipid trong cơ thịt cá nục 25

2.2.2.9 Xác định các chỉ tiêu vi sinh vật 26

2.2.3 Phương pháp xử lý số liệu 27

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 28

3.1 XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN CHIẾT 28

3.1.1 Ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết đến hàm lượng polyohenol tổng 28

3.1.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi chiết so với nguyên liệu đến hàm lượng polyphenol tổng 30

3.1.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng polyohenol tổng 31

3.1.4 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng polyphenol tổng 32

3.2 TINH SẠCH MỘT PHẦN DỊCH CHIẾT THÔ THU ĐƯỢC TỪ LÁ VỐI 34

3.2.1 Định danh một số nhóm chất có trong dịch chiết 34

3.2.2 Tinh sạch một phần dịch chiết thô thu được từ lá vối 35

3.3 ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH THU NHẬN DỊCH CHIẾT CHỨA

POLYOPHENOL TỪ LÁ VỐI 36

3.4 ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA DỊCH CHIẾT LÁ VỐI 39

3.4.1 Hoạt tính khử gốc tự do ABTS 39

3.4.2 Hoạt tính khử ion kim loại sắt 40

3.4.3 Khả năng ức chế sự oxy hóa lipid trong mô hình dầu – nước 41

3.5 THỬ NGHIỆM HẠN CHẾ SỰ OXY HÓA LIPID TRONG SẢN PHẨM CÁ NỤC KHÔ BẰNG DỊCH CHIẾT LÁ VỐI CHỨA CHẤT CHỐNG OXY HÓA TỰ NHIÊN POLYPHENOL 42

3.5.1 Thành phần hóa học cơ bản của thịt cá nục thuôn 42

3.5.2 Sự biến đổi chất lượng của thịt cá nục dựa vào các chỉ tiêu hóa học 43

3.5.2.1 Sự thay đổi hàm lượng a xít béo tự do trong cơ thịt cá nục khô trong quá trình bảo quản 43

3.5.2.2 Sự thay đổi của chỉ số đánh giá sự chuyển dịch của nối đôi liên hợp trong cơ thịt cá nục khô trong quá trình bảo quản 45

3.5.2.3 Sự thay đổi của chỉ số peroxide trong cơ thịt cá nục khô trong quá trình bảo quản 46

3.5.2.4 Sự thay đổi của chỉ số TBARS trong cơ thịt cá nục khô trong quá trình bảo quản 47

3.5.3 Đánh giá chất lượng cảm quan của sản phẩm cá nục khô 48

3.5.4 Đánh giá chỉ tiêu vi sinh vật của sản phẩm cá nục khô 50

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51

1 KẾT LUẬN 51

2 KIẾN NGHỊ 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

PHỤ LỤC 55

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần hóa học cơ bản của thịt cá 8

Bảng 3.1 Xác định sự có mặt của một số nhóm chất chính có trong dịch chiết lá vối 34

Bảng 3.2 Thành phần hóa học cơ bản của thịt cá nục thuôn 43

Bảng 3.3 Chỉ tiêu vi sinh vật của sản phẩm cá nục khô 50

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cơ chế chống oxy hóa dựa vào gốc tự do 6

Hình 1.2 Quá trình tự oxy hóa của lipid cao không no 9

Hình 1.3 Lá vối 11

Hình 2.1 Cá nục nguyên liệu sử dụng trong nghiên cứu 14

Hình 2.2 Các miếng phi lê cá nục đã được xử lý làm sạch 15

Hình 2.3 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 17

Hình 2.4 Sơ đồ nghiên cứu thu nhận dịch chiết từ lá vối 19

Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm sử dụng dịch chiết lá vối để xử lý các miếng cá nục phi lê 21

Hình 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết đến hàm lượng polyphenol tổng 29

Hình 3.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi chiết so với nguyên liệu đến hàm lượng polyphenol tổng 31

Hình 3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng polyphenol tổng 32

Hình 3.4 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng polyphenol tổng 33

Hình 3.5 Hiệu suất thu dịch chiết của các phân đoạn dung môi khác nhau 36

Hình 3.6 Hàm lượng polyphenol tổng của các phân đoạn dung môi chiết khác nhau 36

Hình 3.7 Sơ đồ quy trình để xuất thu nhận dịch chiết chứa chất chống oxy hóa polyphenol từ lá vối 38

Hình 3.8 So sánh khả năng khử gốc tự do ABTS của dịch chiết lá vối với các chất chống oxy hóa thương mại 40

Hình 3.9 So sánh khả năng khử ion sắt của dịch chiết lá vối với các chất chống oxy hóa thương mại 41

Hình 3.10 Khả năng ức chế sự oxy hóa lipid trong mô hình dầu – nước của dịch chiết lá vối ở nồng độ 200 ppm so với Vitamin C ở nồng độ 200 ppm 42

Hình 3.11 Sự thay đổi hàm lượng a xít béo tự do (FFA) trong cơ thịt cá nục trong quá trình bảo quản ở nhiệt độ phòng 44

Hình 3.12 Sự thay đổi chỉ số CD trong cơ thịt cá nục trong quá trình bảo quản

ở nhiệt độ phòng 46 Hình 3.13 Sự thay đổi chỉ số PV trong cơ thịt cá nục trong quá trình bảo quản

ở nhiệt độ phòng 47 Hình 3.14 Sự thay đổi chỉ số TBARS trong cơ thịt cá nục trong quá trình bảo quản ở nhiệt độ phòng 48 Hình 3.15 So sánh chất lượng cảm quan của các mẫu cá nục khô bán thành phẩm 49 Hình 3.16 So sánh chất lượng cảm quan của các mẫu cá nục khô thành phẩm 49

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

DPPH : 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

GAE : Gallic Acid Equivalent

TPC : Total polyphenol content

MAD : Malonaldehyde

QUE : Quercetin Equivalent

TCA : Acid Trichloracetic

no sẽ bị oxy hóa nhanh chóng Lipid bị oxy hóa sẽ tạo ra hydroperoxid, từ đó tạo nên các aldehyd no và không no, các ceton, acid mono và dicarbocylic, aldeacid, cetoacid, epocid, … làm cho sản phẩm có mùi ôi thối, đắng khét, … làm giảm giá trị thực phẩm

Để ngăn chặn sự biến đổi bất lợi này chúng ta chỉ có thể tăng cường hệ thống bảo vệ, chống oxy hóa của nó Hệ thống này gồm 2 nhóm chất chống oxy hóa: các chất nội sinh (bao gồm enzyme chống oxy hóa) và các chất chống oxy hóa được bổ sung vào từ bên ngoài (tocophenol, vitamin C & E, Polyphenol, BHT, BHA…) Việc tăng cường các chất chống oxy hóa từ bên ngoài là đơn giản nhất Chất chống oxy hóa bổ sung từ bên ngoài lại được chia làm 2 loại là chất chống oxy hóa tự nhiên và tổng hợp Theo nghiên cứu khi sử các chất phụ gia chống oxy hóa như BHT, BHA với hàm lượng cao sẽ gây hại cho cơ thể Cụ thể BHT ít có khả năng gây độc cấp tính, giá trị LD50 lên đến 1000mg/kg thể trọng ở tất cả các loài được thử nghiệm Thử nghiệm trên động vật cho thấy, liều lượng BHT cao khi đưa vào

cơ thể trong 40 ngày hoặc hơn sẽ gây độc cho các cơ quan

Hiện nay việc lựa chọn và bổ sung các chất có hoạt tính sinh học có nguồn gốc thực vật vào thực phẩm ngày càng được chú trọng bởi nó ít ảnh hưởng tới sức khỏe con người; đặc biệt hơn là sự hướng tới sử dụng các loại nguyên liệu tái sinh, nguyên liệu xanh trong các ngành công nghiệp

Rất phổ biến trong thực vật Polyphenol là một trong các nhóm hợp chất tự nhiên, nó có trong lá, thân, quả của nhiều loài thực vật như: cây chè, trầu không, ổi

… với hàm lượng cao Hiện nay polyphenol được quan tâm nhiều do chúng có đặc

tính chống oxy hóa và khả năng kháng khuẩn mạnh có thể ứng dụng nhiều trong thực phẩm cũng như dược phẩm

Thấy rõ vai trò tác dụng của polyphenol như là một chất chống oxy hóa trong quá trình bảo quản các loại thực phẩm, việc tìm ra tỷ lệ, chế độ xử lý bảo quản thực phẩm với polyphenol từ các nguyên liệu tiềm năng là cần thiết

Xuất phát từ nhu cần thực tiễn hiện nay đó là hạn chế sử dụng các chất phụ gia có nguồn gốc tổng hợp, thay vào đó là những chất có nguồn gốc tự nhiên, an toàn cho người sử dụng Em chọn hướng đề tài nghiên cứu đó là:

Nghiên cứu hạn chế sự oxy hóa lipid trong sản phẩm cá nục khô bằng

chất chống oxy hóa tự nhiên chiết suất từ lá vối (Cleistocalyx operculatus)

Những nội dung chính của đề tài bao gồm:

(1) Nghiên cứu quy trình thu nhận dịch chiết thô chứa polyphenol từ lá vối (2) Nghiên cứu tinh sạch dịch chiết thô chứa polyphenol từ lá vối

(3) Xác định hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết lá vối đã được tinh sạch (4) Nghiên cứu thử nghiệm sử dụng dịch chiết tinh sạch từ lá vối để hạn chế

sự oxy hóa lipid trong sản phẩm cá nục khô

Mục tiêu của nghiên cứu:

(1) Xây dựng được quy trình thu nhận dịch chiết từ lá vối

(2) Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết lá vối

(3) Hạn chế sự oxy hóa lipid trong sản phẩm cá nục khô bằng dịch chiết lá vối

Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu bổ sung lý thuyết về sự chống oxy hóa trên các sản phẩm thủy sản khô, là tài liệu tham khảo cho các nghiên cứu tiếp theo về sự oxy hóa lipid trên thủy sản khô

Ý nghĩa thực tiễn

Khi thu nhận được các chất chống oxy hóa từ lá Vối ta hoàn toàn có thể sử dụng để bảo quản, chống oxy hóa lipid cho các loại thực phẩm, đặc biệt là thực phẩm khô giàu lipid giúp kéo dài thời hạn bảo quản Bên cạnh đó việc ứng dụng chất chống oxy hóa từ lá vối vào bảo quản trong thực tiễn còn làm tăng giá trị kinh tế cho lá vối, mang lại hiệu quả kinh tế cao cho người trồng Vối

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 OXY HÓA LIPID

1.1.1 Khái niệm về sự oxy hóa lipid

Sự oxy hóa là loại phản ứng hóa học trong đó có electron được lan truyền sang chất oxy hóa, có khả năng tạo các gốc tự do sinh ra phản ứng dây chuyền phá hủy tế bào sinh vật

Trong sản xuất, bảo quản và chế biến thực phẩm, sự oxy hóa chất béo là nguyên nhân hạn chế thời gian bảo bảo quản thực phẩm

Các chất béo chứa nhiều acid béo không no như oleic, linoleic, linolenic,… trong các phân tử chứa nhiều nối đôi nên rất dễ bị oxy hóa tạo thành các hydoperoxyt, hợp chất này tiếp tục phân giải thành các sản phẩm cso mùi khó chịu (mùi ôi, tanh, mùi kim loại, mùi thực phẩm cũ… ) Do đó chất béo không no được xem là hợp chất không bền

Dù phản ứng oxy hóa thuộc loại cơ bản trong đời sống nhưng có thể ngăn chặn nó, chẳng hạn động thực vật duy trì hệ thống rất nhiều loại chất chống oxy hóa như glutathione, vitamin C, vitamin E, enzyme catalase, superoxide dismutase Chất chống oxy hóa yếu này còn gọi là chất ức chế có thể phá hủy tế bào

Có 2 kiểu phản ứng oxy hóa không no:

Phản ứng tự oxy hóa

Phản ứng oxy hóa dưới tác dụng của enzyme lipoxygenase: một số enzyme

có khả năng xúc tác phản ứng tạo sản phẩm trung gian, góp phần thúc đẩy quá trình oxy hóa chất béo diễn ra nhanh hơn

1.1.2 Cơ chế của quá trình oxy hóa lipid

Quá trình oxy hóa là phản ứng chuỗi nên thường có 3 thời kỳ sau:

H – Nguyên tử hydro ở Cα so với nối đôi, hoặc nguyên tử H của nhóm metylen bất

kỳ trong axit béo no

Để cắt đứt liên kết C-H trong phản ứng (1.1) đòi hỏi năng lượng là 70-100 kcal/mol

Tuy nhiên khi có oxy hòa tan thì tương tác giữa RH ban đầu với oxy sẽ diễn ra một cách mạnh mẽ hơn Vì sự tạo thành gốc sau phản ứng lưỡng phân đòi hỏi năng lượng chỉ là 47 kcal/mol:

RH + O2 → R* + HO2* (1.2) Trường hợp khi nồng độ RH cao thì có thể xảy ra phản ứng tam phân, phản ứng này đòi hỏi năng lượng bé hơn phản ứng phản ứng lưỡng phân

RH + O2 → R* + H2O2 + R*1 (1.3) Gốc tự do cũng có thể phát sinh khi có ion kim loại giao chuyển:

Từ hydro peroxyt sẽ phân mạch để cho những gốc tự do khác theo đường hướng sau:

ROOH → RO* + *OH (1.8) 2ROOH → RO*2 + H2O + RO* (1.9) ROOH +RH → RO* + H2O + R* (1.10) Việc cắt đứt liên kết O-O để tạo thành 2 gốc tự do theo phản ứng (1.8) sẽ thuận lợi khi nồng độ hydro peroxyt lớn Việc tạo nên dime (do liên kết hydro) sẽ làm yếu liên kết O-H và O-O, do đó làm giảm bớt năng lượng phân giải dime thành các gốc Hydro peroxyt có thể phân giải theo phản ứng (1.10) đòi hỏi năng lượng hoạt hóa bé hơn phản ứng đơn phân (1.8)

Các gốc peroxyt cũng có thể đứt nguyên tử H- đặt biệt ở vị trí β do quá trình nội phân và cũng có thể kết hợp với nối đôi olefin Vì vậy việc chuyển hóa các gốc peroxit sẽ tạo nên không những hydro peroxyt mà cả peroxyt polime, peroxyt vòng, oxyt, aldehit và các sản phẩm khác Do quá trình phát triển của chuỗi phản ứng oxy hóa với các phản ứng phân mạch (1.8), (1.9), (1.10) nên tích tụ gốc alcocxyl RO*, peroxyt RO*2 và hydroxyl *OH Từ gốc alcoxyl có thể tạo nên những sản phẩm thứ cấp như rượu, xeton, aldehit,…

Năng lượng hoạt hóa của các phản ứng này không đáng kể (1-2 kcal/mol) do

đó vận tốc phản ứng rất lớn

1.1.3 Ảnh hưởng của sự oxy hóa lipid đến chất lượng thực phẩm

Trong thực phẩm có nhiều chất không bền, độ ẩm cao dễ bị oxy hóa khi tiếp xúc với không khí, ví dụ như: các acid béo chưa no, các chất thơm, các sắc tố, các vitamin

Khi lipid bị oxy hóa sản phẩm trung gian đầu tiên là hydroperoxyt, sau đó tiếp tục bị oxy hóa để tạo thành các sản phẩm cấp thấp hơn như: peroxyt, hydroxyt, ancol, adehyt, ceton các chất này có mùi vị xấu: ôi khét khó chịu làm giảm giá trị sử dụng của sản phẩm Nhiều trường hợp đây là nguyên nhân chính làm hết thời hạn bảo quản của sản phẩm Các chất màu bị oxy hoá cũng làm thay đổi màu sắc của thực phẩm làm cho chúng trở nên sẫm màu hơn

Như vậy khi sự oxy hóa lipid trong thực phẩm xảy ra thì nó là một biến đổi bất lợi cho thực phẩm

1.1.4 Ngăn chặn sự oxy hóa lipid

Để ngăn chặn sự oxy hóa lipid ta sử dụng các chất chống oxy hóa (tự nhiên hoặc tổng hợp) để ngăn chặn sự hình thành gốc tự do

Sự khử gốc tự do của chất chống oxi hóa, trong đó các electron không ghép đôi của gốc tự do sẽ được nhận electron của chất chống ôxi hóa để tạo thành các electron ghép đôi bền vững

Hình 1.1 Cơ chế chống oxy hóa dựa vào gốc tự do (Nguồn Internet)

Có nhiều chỉ tiêu để đánh giá quá trình chống ôxi-hóa, trong đó mỗi chỉ tiêu thể hiện một khía cạnh của hoạt động chống oxi hóa, như vậy nhiều chỉ tiêu sẽ phán ánh một quá trình chống oxi hóa tổng thể Một số chỉ tiêu thường được sử dụng

để đánh giá quá trình chống oxi hóa như sau:

a Hoạt động quét gốc tự do DPPH

Cơ chế của hoạt động quét gốc tự do DPPH là sự ghép đôi hydro và đình chỉ quá trình oxi hóa bằng sự chuyển các gốc tự do sang trạng thái ổn định hơn Như vậy, khi có mặt của chất chống ôxi hóa nó sẽ khử gốc tự do DPPH và làm cho dung dịch bị giảm màu sắc, do đó độ hấp thụ của dung dịch sẽ giảm đi

Z. + AH = ZH + A (1)

Trong đó: Z.: là gốc tự do DPPH, AH là chất chống ôxi hóa

b Hoạt động khử ion sắt 3 +

Cơ chế của hoạt động khử ion sắt 3+ là sự ghép đôi electron và đình chỉ phản ứng ôxi-hóa dây chuyền bằng sự khử dạng ôxi-hóa thành dạng tự do Nguồn gốc chính của gốc tự do hydroxyl là phản ứng Haber-Weiss, trong đó gốc tự do superoxit khử Fe3+ thành Fe2+, sau đó nó xúc tác cho phản ứng Fenton giữa Fe2+ và

H2O2 Như vậy, khi có mặt của chất chống ôxi hóa nó sẽ khử gốc tự do superoxit nên hạn chế sự khử Fe3+thành Fe2+ và làm cho dung dịch giữ màu sắc, do đó độ hấp thụ của dung dịch sẽ tăng lên

O2 – + Fe 3+ = O2 + Fe2+ (2)

Fe2+ + H2O2 = Fe3+ + OH– + .OH (3)

c Hoạt động quét gốc H 2 O 2

Hydroperoxit có thể làm tăng sự hình thành gốc tự do hydroxyl trong tế bào

và gây độc Nguồn gốc của gốc tự do hydroxyl là phản ứng Fenton giữa Fe2+ và H2O2

Fe2+ + H2O2 = Fe3+ + OH– + .OH (4)

d Hoạt động chuyển ion sắt 2 +

Nguồn gốc của các gốc tự do hydroxyl là phản ứng Fenton giữa Fe2+ và

H2O2 Như vậy, khi có mặt của chất chống ôxi hóa sẽ hạn chế sự chuyển Fe2+thành

Fe3+ nên màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt hơn, do đó độ hấp thụ sẽ giảm đi

Fe2+ + H2O2 = Fe3+ + OH– + .OH (5)

1.2 SỰ OXY HÓA LIPID TRONG CƠ THỊT CÁ

1.2.1 Thành phần hóa học của cơ thịt cá

Thành phần hóa học của cơ thịt động vật thủy sản gồm có: nước, protein, lipid, glucid, muối vô cơ, vitamin, enzyme, hoocmon (kích thích tố) Những thành phần

có lượng tương đối nhiều là: nước, protein, lipid, glucid, muối vô cơ, lượng glucid trong động vật thủy sản thường rất ít và tồn tại dưới dạng glycogen (Nguyễn Trọng Cẩn và cộng sự, 2006)

Thành phần hóa học của động vật thủy sản thường khác nhau theo giống loài Trong cùng loài nhưng hoàn cảnh sinh sống khác nhau, thành phần hóa học cũng khác nhau ngoài ra chúng còn phụ thuộc vào trạng thái sinh lý, đực cái, mùa vụ , thời tiết

Theo tài liệu của viện nghiên cứu nghề cá Liên Xô cũ, thành phần hóa học của cá là: nước 48,0 – 85,1%, protein 10,3 – 24,4%, lipid 0,1 – 54,0% và muối vô cơ 0,5 – 5,6%

Theo tài liệu của Stansby (1962) và Love (1970) thì thành phần cơ bản của thịt cá fillet như Bảng 1.1

Bảng 1.1 Thành phần hóa học cơ bản của thịt cá

Thành phần

Thịt cá fillet Tối thiểu Trung bình Tối đa

- 0,4

28

16 – 21 0,2 – 25

< 0,5 1,2 – 1,5

66 – 81

28

67

- 1,5

96

Từ những số liệu trên cho thấy sự biến đổ về hàm lượng protein và muối vô cơ không lớn lắm, nhưng sự biến đổi về lượng nước và chất béo tương đối lớn và sự biến đổi chất béo thường tỷ lệ nghịch với nước, thông thường chất béo và nước chiếm khoảng 80% thịt cá

1.2.2 Sự oxy hóa lipid trong cơ thịt cá

Trong lipid cá có một lượng lớn acid béo không no đa nối đôi nên chúng rất nhạy cảm với quá trình oxy hóa nhờ cơ chế tự xúc tác (Huss, 2004) Như mô tả dưới đây quá trình bắt đầu bằng sự giải phóng một nguyên tử hydro từ carbon trung tâm của cấu trúc pentadien là cấu trúc có trong hầu hết các nhánh acyl của acid béo chứa hơn một nối đôi:

-CH=CH-CH2-CH=CH-  -CH=CH-C*H-CH=CH- + H

Khác với phân tử nguyên thể, gốc lipid tự do (L*) phản ứng rất nhanh với oxy không khí tạo thành peroxy của gốc lipid tự do (LOO*), peroxy của gốc tự do lại có thể lấy một hydro từ một nhánh acyl khác để hình thành một lipid hydroperoxyt (LOOH) và một gốc lipid tự do (L*) mới Sự lan truyền của phản ứng dây chuyền

này sẽ tiếp tục mãi đến khi một gốc tự do được loại ra bằng cách phản ứng với một

gốc tự do khác hoặc với chất chống oxy hóa (AH) mà phản ứng của chúng sẽ tạo

thành gốc (A*) kém hoạt động hơn nhiều Phản ứng dây chuyền hình thành một lượng tương đối lớn hydroperoxyt là chất không có vị nên “chỉ số peroxyt” thường ít liên quan đến các đặc tính cảm quan

Hình 1.2 Quá trình tự oxy hóa của lipid cao không no (H.H Huss, 2004)

Với xác tác của các ion kim loại nặng, hydroxyt dễ dàng bị bẻ gãy thành các sản phẩm tự oxy hóa thứ cấp với mạnh carbon ngắn hơn Các sản phẩm thứ cấp này phần lớn là các aldehyt, xêtôn, rượu và một phần nhỏ là các acid carboxylic và các alkan gây nên những mùi rất khác nhau và trong một số trường hợp còn gây mất màu làm cho sản phẩm có màu hơi vàng Một số aldehyt có thể xem là “các chất có phản ứng với acid thiobarbituric”

Các ion kim loại rất quan trọng trong bước đầu tiên của sự tự oxy hóa lipid – quá trình khởi đầu – trong việc xúc tác hình thành các gốc phản ứng với oxy, chẳng hạn như gốc hydroxyl (OH*) Gốc này lập tức phản ứng với lipid hoặc các phân tử khác tại nơi nó được tạo ra Tính phản ứng cao có thể giải thích tại sao các acid béo

tự do lại nhạy cảm với sự oxy hóa hơn các acid béo ở dạng liên kết Điều đó có lẽ

do lượng sắt trong pha nước nhiều hơn lượng sắt bao quanh bề mặt màng tế bào hoặc bao quanh các hạt lipid

Hydroperoxyt của acid béo cũng có thể được tạo thành dưới tác động của enzyme lipoxygenaza mà hàm lượng của loại enzyme này lại khác nhau ở các mô

cơ cá lại khác nhau Các enzyme có hoạt độ khá cao được tìm thấy trong mang và dưới da của nhiều loại cá Enzyme này không bền và có lẽ chỉ quan trọng đối với sự oxy hóa lipid ở cá tươi Nấu hoặc đông lạnh/rã đông là những phương thức khá hiệu quả để làm mất hoạt tính của enzyme này

Các tế bào sống có một vài cơ chế bảo vệ trực tiếp chống lại các sản phẩm của sự oxy hóa chất béo Một loại enzyme là glutathione peroxidaza sẽ khử hydroperoxyt trong màng tế bào thành hợp chất hydroxyl tương ứng Phản ứng này cần có glutathion dạng khử và do đó phản ứng sẽ chấm dứt sau khi cá chết vì cơ chất đó không còn Trong màng còn chứa hợp chất thuộc nhóm phenol là α-tocophenol (vitamin E) là chất chống oxy hóa tự nhiên quan trọng nhất Tocopherol

có thể nhường một nguyên tử hydro cho các gốc tự do (L*) hoặc (LOO*), thực hiện chức năng như phân tử AH ở hình 1.2 Nói chung, người ta thừa nhận rằng gốc tocopheryl được tạo thành sẽ phản ứng với acid ascorbic (vitamin C) tại mặt phân giới lipit/nước để tái tạo phân tử tocopherol Các hợp chất khác, ví dụ carotenoid, cũng có thể đóng vai trò là chất chống oxy hóa Các hợp chất phenol trong khói gỗ

có thể xuyên qua bề mặt cá trong quá trình hun khói và nhờ đó có thể bảo vệ lipid khỏi quá trình oxy hóa

1.2.3 Sự oxy hóa lipid trong sản phẩm cá nục khô

Với hàm lượng lipid 5,0 – 10% sau khi được làm khô lượng lipid này là nguyên nhân gây hư hỏng chủ yếu cho dòng sản phẩm cá nục khô Cá nục khô thường được bảo quản trong các bao PE hoặc được chứa đựng trong các thùng cactong để bày bán tại các cửa hàng Khi đó sản phẩm tiếp xúc trực tiếp với oxy không khí, nhiệt độ cao, tạo điều kiện cho phản ứng oxy hóa lipid xảy ra mạnh mẽ

Kết quả là tạo nên các sản phẩm cấp thấp có mùi khó chịu, sẫm màu như: hydroperoxyt, peroxyt, hydroxyt, ancol, adehyt…

1.3 TỔNG QUAN VỀ LÁ VỐI

1.3.1 Đặc điểm, phân loại, phân bố

Tên tiếng Việt: Cây vối, vối nhà

Tên Latin: Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr et Perry

Tên đồng nghĩa: Eugenia operculata Roxb

xì Toàn lá, cành non, và nụ vối có mùi thơm đặc biệt dễ chịu của vối

Hình 1.3 Lá vối

b Phân loại

Trong tự nhiên Vối được chia thành 2 loại chính là Vối nếp và Vối tẻ

Vối nếp là loại có lá nhỏ hơn bàn tay, màu vàng xanh

Vối tẻ là loại có lá to hơn bàn tay, hình thoi, màu xanh sẫm

c Phân bố

Cây vối được trồng và mọc hoang ở khắp các tỉnh nước ta, chủ yếu để lấy lá ủ nấu nước uống Vối còn thấy ở các nước nhiệt đới châu Á, Trung Quốc

1.3.2 Chất chống oxy hóa từ lá vối

Theo viện nghiên cứu Đông y

Người ta còn phát hiện trong nụ vối chứa một hàm lượng polyphenol cao (tương đương 128mg catechin/gam trọng lượng khô) và hoạt chất ức chế men alpha-glucosidase nên có thể hỗ trợ phòng và điều trị chứng tiểu đường

Các kết quả được tiến hành trong phòng thí nghiệm cũng cho thấy nụ vối có khả năng triệt tiêu các gốc tự do, chống oxy hoá mạnh Khả năng chống oxy hoá (antioxydants) của nụ vối đã làm giảm sự hình thành đục thuỷ tinh thể, bảo vệ sự tổn thương tế bào bê-ta tuyến tuỵ, phục hồi các men chống oxy hoá trong cơ thể

1.3.3 Thu nhận chất chống oxy hóa từ lá vối (Ngô Thanh Hùng và Nguyễn Xuân Duy, 2013)

Hiện nay đã có công trình nghiên cứu thu nhận dịch chiết từ lá vối

Theo nghiên cứu của Ngô Thanh Hùng và Nguyễn Xuân Duy (2013) đã xây dựng được quy trình chiết polyphenol từ lá vối với được điều kiện chiết thích hợp là: nhiệt độ 90oC, dung môi nước, tỷ lệ lá vối/dung môi 1:40 (w/v) thời gian 20 phút

Tương ứng với hiệu suất chiết là 0,987%

Theo TS.BS Trương Tuyết Mai viện dinh dưỡng và cộng sự việc thu nhận polyphenol từ lá vối như sau: lá vối được nghiền nhỏ đến kích thước 1-2 mm, sử dụng dung môi chiết là ethanol 50% trong điều kiện áp suất 1atm với tỷ lệ (w/v) là 1/10, thời gian chiết 4 giờ Kết thúc quá trình chiết tiến hành lọc để thu dịch chiết, dịch chiết được cô đặc chân không cho đến khi đạt khoảng 20% thủy phần sau đó chuyển dịch 20% vào sấy chân không, tại nhiệt độ 700C trong 48-72 giờ, thu được cao khô nguyên chất Hàm lượng polyphenol trong bột chiết của lá vối là 263,2 mg/g (chiếm tỷ trọng 26,3%)

1.3.4 Ứng dụng chất chống oxy hóa từ lá vối trong lĩnh vực thực phẩm

Cây vối lâu nay đã được dân gian sử dụng nhiều trong các bài thuốc đông y nhưng các sản phẩm mang tính ứng dụng vào công nghiệp chưa nhiều Nụ vối được

nghiên cứu sử dụng trực tiếp để sản xuất trà nụ vối thanh nhiệt, hạ cholesterol

Lá vối chứa nhiều hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa, đặc biệt là các hợp chất phenol, có nhiều tác dụng quý trong việc phòng và điều trị một số bệnh tật cho con người Tuy nhiên, khai thác các hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa để thu nhận các chất chống oxy hóa ứng dụng trong lĩnh vực thực phẩm vẫn còn rất hạn chế Vì vậy, tiềm năng khai thác các chất chống oxy hóa từ lá vối là rất lớn

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU

2.1.1 Nguyên liệu lá vối

Lá vối (Cleistocalyx operculatus) được thu hái trực tiếp tại vườn của người

dân trồng tại xã Vĩnh Thành, Huyện Vĩnh Lộc, Tỉnh Thanh Hóa trong tháng 1/2015

Xử lý nguyên liệu: Lá vối sau khi thu hái được phơi khô dưới ánh nắng tự nhiên để đạt được độ ẩm khoảng 10% Sau đó nguyên liệu được nghiền nhỏ bằng máy nghiền và rây qua lỗ sàng đường kính 1 mm để thu được nguyên liệu dạng bột đồng nhất, bao gói hút chân không và được bảo quản ở nhiệt độ - 40oC cho đến khi thực hiện các nghiên cứu tiếp theo

2.1.2 Nguyên liệu cá nục

Cá nục sử dụng trong nghiên cứu là cá nục thuôn (Decapterus lajang) được

mua từ chợ Xóm Mới, Thành phố Nha Trang, Khánh Hòa trong tháng 3/2015 Nguyên liệu được lựa chọn có chất lượng tươi tốt nhất, không ướp hóa chất, cỡ nguyên liệu 12 con/kg (Hình 2.1)

Hình 2.1 Cá nục nguyên liệu sử dụng trong nghiên cứu

Xử lý nguyên liệu: Cá được xử lý phi lê bằng tay Các miếng phi lê được rửa trong nước lạnh để loại bỏ tạp chất và làm sạch (Hình 2.2) Các miếngg phi lê cá được sử dụng ngay để tiến hành các nghiên cứu gồm: Xác định thành phần hóa học

cơ bản, xử lý ngâm trong dịch chiết lá vối có hoạt tính chống oxy hóa

Hình 2.2 Các miếng phi lê cá nục đã được xử lý làm sạch

2.1.3 Hóa chất

Hóa chất sử dụng để nghiên cứu là các hóa chất đạt các yêu cầu dùng trong thí nghiệm và nghiên cứu khoa học bao gồm: ABTS, Gallic, K3(Fe[CN] 6), AlCl3, Acid trichloracetic (TCA), NaH2PO4, Na2HPO4, Na2CO3, thuốc thử Folin Ciocalteu, Tween 40, Ethanol, chloroform, methanol, hexane, benzene, pyrindine, Cu-acetate, cumene hydroperoxide, thiobarbituric, malonaldehyde, acid linoleic, FeCl2, NaOH,… Tất cả hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đều đạt hạng phân tích mua từ một số hãng nổi tiếng như Sigma, Merk và Trung Quốc

2.1.4 Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu

Trong quá trình tiến hành nghiên cứu, đã sử dụng những dụng cụ, máy móc

và thiết bị như sau

Máy nghiền (model, nước sản xuất), kích cỡ lỗ sàng 1mm

Bể ổn nhiệt tĩnh phạm vị nhiệt độ từ 30 – 100oC, sai số 0,1oC

Bể ổn nhiệt siêu âm (Elma, S 300H, Elmasnonic, Germany), phạm vi nhiệt

độ từ 30 – 80oC theo bước 50C

Máy lọc chân không

Thiết bị cô quay chân không (RV 10, Germany)

2.2.1.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát

Sơ đồ nghiên cứu tổng quát được thể hiện trên Hình 2.3 Theo đó, dịch chiết thô thu được từ lá vối sẽ được tinh sạch một phần trước khi ứng dụng xử lý ngâm

các miếng cá nục phi lê Sự biến đổi chất lượng của các miếng cá nục phi lê sẽ được theo dõi theo thời gian bảo quản Sử dụng các chỉ tiêu hóa học để đánh giá mức độ oxy hóa lipid trong cơ thịt cá nục theo thời gian bảo quản Dữ liệu thu được sẽ được

xử lý, phân tích để đi đến kết luận về khả năng hạn chế sự oxy hóa lipid trong cơ thịt cá nục bằng dịch chiết từ lá vối

Hình 2.3 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát

2.2.1.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm thu nhận dịch chiết từ lá vối

Hình 2.4 trình bày sơ đồ bố trí thí nghiệm để thu nhận dịch chiết từ lá vối Nguyên liệu lá vối được thu hái và xử lý như được trình bày trong Mục 2.1.1 Các nhân tố ảnh hưởng đến điều kiện chiết bao gồm: Nồng độ dung môi ethanol, tỉ lệ

Nguyên liệu lá vối

dung môi/nguyên liệu, nhiệt độ chiết và thời gian chiết được nghiên cứu Thí nghiệm được bố trí theo phương pháp quy hoặc yếu tố từng phần, có nghĩa là để nghiên cứu ảnh hưởng của một nhân tố nào đó thì cố định các nhân tố khác và cho nhân tố cần nghiên cứu thay đổi Sau khi tìm được thông số thích hợp, cố định thông số đó để nghiên cứu ảnh hưởng của các nhân tố còn lại

Khi nghiên cứu ảnh hưởng của nhân tố nồng độ dung môi thì các thông số cố định gồm: Tỉ lệ dung môi/nguyên liệu (30/1, ml/g), nhiệt độ 60oC và thời gian 60 phút Nồng độ ethanol chạy từ 0 – 100%, bước nhảy 20%

Khi nghiên cứu ảnh hưởng của nhân tố tỉ lệ dung môi/nguyên liệu thì các nhân tố cố định gồm: Nồng độ dung môi, nhiệt độ 60oC, thời gian 60 phút, tỉ lệ chạy

từ 20/1 – 70/1 (ml/g), bước nhảy 10

Khi nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ thì các nhân tố cố định gồm: Nồng

độ dung môi, tỉ lệ dung môi/nguyên liệu, thời gian chiết 60 phút, nhiệt độ dao động

Dịch chiết thô thu được chiết qua các phân đoạn sử dụng các loại dung môi có

độ phân cực tăng dần bao gồm: Chloroform, Hexane, Ethyl acetate, n-butanol và nước Hiệu suất thu hồi dịch chiết, hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa của các phần chiết được xác định Phần chiết có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất được lựa chọn để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo

Hình 2.4 Sơ đồ nghiên cứu thu nhận dịch chiết từ lá vối

2.2.1.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm sử dụng dịch chiết lá vối để xử lý các miếng cá nục phi lê

Quy trình xử lý ngâm các miếng các nục phi lê bằng dịch chiết từ lá vối được thực hiện theo Hình 2.5 Các miếng cá nục phi lê được xử lý ngâm trong dịch chiết

lá vối ở hai nồng độ 200 ppm và 400 ppm, tỉ lệ nguyên liệu/dịch chiết là 1/4 (g/ml), thời gian ngâm là 45 phút, nhiệt độ ngâm khoảng 10oC Mẫu đối chứng cũng được

Nguyên liệu lá vối

Làm khô

Nghiền thành bột Chiết

Lọc

Dịch chiết thô

Chiết qua các phân đoạn

Phân đoạn có hoạt tính chống oxy

thực hiện trong điều kiện tương tự, ngoại trừ thay dịch chiết bằng nước cất Bên cạnh đó, mẫu đối chứng dương sử dụng dụng chất chống oxy hóa thương mại Vitamin C ở nồng độ 200 ppm cũng được tiến hành trong điều kiện tương tự Các miếng cá sau khi xử lý ngâm dịch chiết xong được để ráo 10 phút, được làm khô đến độ ẩm khoảng 12%, sau đó được bao gói trong túi PE và được bảo quản ở hai điều kiện nhiệt độ phòng và nhiệt độ lạnh (50C) Sự biến đối chất lượng của thịt cá,

sự oxy hóa lipid trong cơ thịt được đánh giá theo thời gian bảo quản Dựa vào dữ liệu thu thập được, tiến hành phân tích để đánh giá được hiệu quả hạn chế sự oxy hóa lipid của dịch chiết lá vối

Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm sử dụng dịch chiết lá vối để xử lý các miếng cá nục phi lê

2.2.2 Các phương pháp phân tích

2.2.2.1 Xác định thành phần hóa học cơ bản

Hàm lượng ẩm của cơ thịt cá nục được xác định theo phương pháp cân khối lượng như được mô tả trong AOAC (1995) Tóm tắt: Cân khoảng 5 g thịt cá được xay nhuyễn, sấy ở nhiệt độ 105oC đến khối lượng không đổi, sự chênh lệch khối lượng thịt cá trước và sau khi sấy chính là lượng ẩm có trong cơ thịt cá Từ đó xác

Cá nục nguyên con

Rửa Phi lê Rửa

Xử lý ngâm

Dịch chiết 200 ppm

Để ráo Làm khô Bao gói

Dịch chiết 400 ppm Nước cất Vitamin C 200 ppm

Bảo quản Nhiệt độ phòng Theo dõi biến đổi chất lượng Thu thập dữ liệu Kết luận

định được tỉ lệ phần trăm ẩm trong nguyên liệu Phương pháp trên cũng được áp dụng để xác định hàm lượng ẩm trong miếng cá nục sau làm khô và hàm ẩm trong nguyên liệu lá vối sau làm khô

Hàm lượng tro được xác đinh theo phương pháp của AOAC (1995) Cụ thể: Cân khoảng 3 g thịt cá được tro hóa ở nhiệt độ 560 oC trong 24 giờ, phần khối lượng còn lại sau tro hóa chính là lượng tro có trong nguyên liệu Kết quả được báo cáo dưới dạng phần trăm so với nguyên liệu ban đầu

Hàm lượng protein trong cơ thịt cá nục được xác định theo phương pháp Kjendahl Tóm tắt: Mẫu được vô cơ hóa bằng H2SO4 đậm đặc, các hợp chất hữu cơ

bị oxy hóa Cacbon và hydro tạo thành CO2 và H2O, trong khi đó Nitơ tạo thành dưới dạng NH3 sẽ kết hợp với H2SO4 để chuyển về dạng (NH4)2SO4 tan trong dung dịch Đuổi NH3 ra khỏi dung dịch bằng NaOH, đồng thời cất và thu NH3 bằng một lượng dư H2SO4 0,1N Định lượng H2SO4 0,1N dư còn lại bằng NaOH 0,1N chuẩn

Từ đó xác định được lượng Nitơ có trong mẫu, nhân với hệ số chuyển đổi 6,25 sẽ xác định được hàm lượng protein có trong mẫu

Hàm lượng lipid trong thịt cá nục được xác định theo phương pháp của Bligh

và Dyer (1957) với một vài thay đổi nhỏ Tóm tắt: Cân một lượng mẫu xác định (10g) được chiết với hỗn hợp dung môi chloroform: methanol (2/1, v/v) với tỉ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/6 (g/ml) Hỗ hợp được đồng hóa trong 15 phút trước khi

để qua đêm ở điều kiện lạnh Sau đó, lọc để thu dịch lọc, cho thêm 10 ml KCl 0,88%, hỗn hợp được trộn đều trong 5 phút bằng vortex ở tốc độ 3 Hỗn hợp được để lạnh trong vài giờ đồng hồ để sự tách lớp rõ ràng và triệt để Thu lớp bên dưới, bay hơi đuổi dung môi ở điều kiện áp suất giảm (máy cô quay chân không) để thu được lượng lipid Từ đó tính được hàm lượng lipid (%) có trong nguyên liệu

2.2.2.2 Xác định hiệu suất thu hồi dịch chiết từ lá Vối

Hiệu suất thu hồi dịch chiết từ lá Vối được xác định bằng phương pháp cân khối lượng Hiệu suất được xác định bằng khối lượng dịch chiết thu được so với nguyên liệu ban đầu, kết quả tính toán dưới dạng phần trăm theo công thức sau:

M

m HS

Trong đó: HS là hiệu suất thu dịch chiết (%), m là khối lượng dịch chiết thu được, M khối lượng nguyên liệu ban đầu

Công thức trên cũng được áp dụng để tính hiệu suất thu hồi dịch chiết từ các phân đoạn chiết

2.2.2.3 Xác định sự có mặt của các nhóm hợp chất có trong dịch chiết thô

Sự có mặt của các nhóm hợp chất có trong dịch chiết thô từ lá vối được nhận diện bằng các phép thử định tính theo phương pháp được mô tả bởi Yadav và Agarwala (2011)

Phát hiện sự có mặt của nhóm chất phenol và tannins: 1 ml dịch chiết (25 mg/ml) được trộn với 2 ml của FeCl3 2% Màu xanh nước biển xuất hiện chỉ ra sự

có mặt của phenol và tannins

Phát hiện sự có mặt của nhóm chất flavonoid bằng phép thử với AlCl3 Tóm tắt: Nhỏ vài giọt AlCl3 1% vào trong ống nghiệm chứa 4 ml dịch chiết (25 mg/ml) Nếu màu vàng xuất hiện chứng tỏ có sự hiện diện của flavonoid, màu càng đậm hàm lượng càng cao

Phát hiện sự có mặt của nhóm chất alkaloids bằng thuốc thử Mayer’s và Waner Tóm tắt: 1 ml dịch chiết (25 mg/ml) được trộn với 2 ml HCl 1% và đung nóng nhẹ Sau đó thêm thuốc thử Mayer’s và Waner vào Quan sát thấy kết tủa đục xuất hiện chứng tỏ có mặt của alkaloids

Phát hiện sự có mặt của nhóm chất steroid: 1 ml của dịch chiết (25mg/ml) được trộn với 2 ml chloroform và thêm từ từ H2SO4 đậm đặc được thêm vào hỗn hợp, sự xuất hiện của màu đỏ ở lớp chloroform bên dưới chỉ ra sự có mặt của steroids

2.2.2.4 Định lượng polyphenol có trong dịch chiết lá vối

Hàm lượng polyphenol tổng được xác định theo phương pháp của Singleton và cộng sự (1999) với một vài thay đổi nhỏ Tóm tắt: Chính xác 0,1 ml dịch chiết đã được pha loãng tới nồng độ thích hợp được trộn với 0,9 ml nước cất, sau đó thêm 1

ml thuốc thử Folin – Ciocalteu’s 1,5 N và cuối cùng thêm 4,5 ml Na2CO3 12,5%

Hỗn hợp được giữ ở nhiệt độ phòng trong tối, sau đúng 30 phút, độ hấp thu quang học của hỗn hợp phản ứng được đo trên máy quang phổ kế ở bước sóng 760 nm (Spectrophotometer, Cary 50, Varian, USA) Hàm lượng polyphenol tổng được tính toán từ đường chuẩn a xít gallic Kết quả báo cáo cuối cùng là mg a xít gallic tương đương (GAE)/g dịch chiết

2.2.2.5 Định lượng flavonoid có trong dịch chiết lá vối

Hàm lượng flavonoid tổng được xác định theo phương pháp của Lillian Barros

và cộng sự (2007) với một vài hiệu chỉnh nhỏ Cụ thể: Chính xác 0,25 ml dịch chiết

đã pha loãng đến nồng độ thích hợp được trộn với nước cất để đạt thể tích cuối cùng 2,5 ml, sau đó thêm 0,75 ml NaNO2 5%, giữ hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 10 phút trước khi thêm 0,15 AlCl3 10% và tiếp tục giữ thêm 10 phút ở cùng điền kiện như trên, sau đó thêm 0,5 ml NaOH 1M và cuối cùng thêm 0,275 ml nước cất Hỗn hợp phản ứng được đo độ hấp thu quang học ở bước sóng ở 630 nm (Spectrophotometer, Cary 50, Varian, USA) Hàm lượng flavonoid tổng được tính toán từ đường chuẩn sử dụng Quercetin Kết quả cuối cùng được báo cáo là mg Quercetin tương đương (QE)/g dịch chiết

2.2.2.6 Xác định hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết lá vối

Xác định khả năng khử gốc tự do ABTS: Xác định khả năng khử gốc tự do

ABTS theo phương pháp được mô tả bởi Richard và cộng sự (2009) với một vài hiệu chỉnh nhỏ: Tóm tắt:

ABTS (2,2′-Azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) bị oxi hóa bởi

K2S2O8 (potassium persufate) để tạo thành gốc tự do ABTS+ (có màu xanh đậm) hấp thụ bước sóng cực đại ở 734 nm Trong một hỗn hợp phản ứng có mặt chất chống oxi hóa và ABTS+, chất chống oxi hóa sẽ nhường điện tử cho ABTS+, dẫn đến cường độ màu của hỗn hợp phản ứng giảm Sự giảm cường độ màu của hỗn hợp phản ứng được xác định bằng máy đo quang phổ kế

Nhiều thể tích mẫu khác nhau trộn với nước cất để đạt thể tích tổng cộng 5 ml Sau đó thêm 1 ml dung dịch ABTS 12 mM, lắc đều và để yên trong bóng tối 30 phút Độ hấp thu quang học được đo ở bước sóng 714 nm (Spectrophotometer, Carry

50, Varian, Australia) Khả năng khử gốc tự do ABTS được xác định theo công thức sau: ABTS (%) = 100 × (ACT - ASP)/ACT Trong đó: ACT: Độ hấp thu quang học của mẫu trắng không chứa dịch chiết; ASP: Độ hấp thu quang học của mẫu có chứa dịch chiết Kết quả báo cáo bởi giá trị IC50 là nồng độ của dịch chiết khử được 50% gốc tự do ABTS ở điều kiện xác định Giá trị IC50 càng thấp thì hoạt tính khử gốc tự

do ABTS càng cao Mỗi phân tích được tiến hành lặp lại ba lần, kết quả báo cáo là giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn

Xác định tổng năng lực khử Fe: Năng lực khử được xác định theo phương

pháp của Oyaizu (1986) với một vài hiệu chỉnh nhỏ Cụ thể: Nhiều thể tích khác nhau của dịch chiết được trộn với đệm phosphate có pH = 6,6 để đạt thể tích cuối cùng 3,5 ml trước khi thêm 0,5 ml K3(Fe[CN]6) 1% Hỗn hợp được ủ ở 50oC trong

20 phút, làm nguội bằng vòi nước chảy trong 5 phút, sau đó thêm 0,5 ml TCA 10%

và tiếp đến là 2 ml nước cất, cuối cùng 0,4 ml AlCl3 0,1% được thêm vào Độ hấp thu quang học được xác định tại bước sóng 700 nm (Spectrophotometer, Carry 50, Varian, USA) Độ hấp thu quang học càng cao thì năng lực khử càng mạnh Kết quả được tính toán với giá trị IC50, là lượng mẫu làm tăng độ hấp thu quang học lên 0,5

2.2.2.7 Xác định hàm lượng a xít béo tự do trong cơ thịt cá nục khô

Cân khoảng 0,3 – 0,5 g dầu được chiết theo phương pháp của Bligh và Dyer (1959) như được trình bày ở Mục 2.2.2.1, được trộn với 5 ml benzene, sau đó thêm 1

ml dung dịch phản ứng Cu-acetate-pyridine, hỗn hợp được giữ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút trước khi được ly tâm ở tốc độ 5000 rpm trong 5 phút Phần dịch trong

ở lớp trên được đem đi xác định độ hấp thụ quang học ở bước sóng 715 nm trên máy quang phổ kế (Spectrophotometer, Carry 50, Varian, USA) Hàm lượng a xít béo tự

do được tính toán từ đường chuẩn a xít oleic Mỗi phân tích được tiến hành lặp lại hai lần, kết quả báo cáo là giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn

2.2.2.8 Xác định các chỉ tiêu liên quan đến sự oxy hóa lipid trong cơ thịt cá nục

Sự chuyển dịch của nối đôi liên hợp (CD): Sự chuyển dịch nối đôi liên hợp

được xác định theo phương pháp của Frankel và Huang (1996) với một vài hiệu chỉnh nhỏ như sau: Khoảng 0,1 – 0,3 g dầu được chiết theo phương pháp của Bligh

và Dyer (1959) được trộn với 5 ml isooctane Độ hấp thu quang học được đo ở bước sóng 234 nm (Spectrophotometer, Carry 50, Varian, USA)

Xác định chỉ số peroxide (PV): Chỉ số peroxide được xác định theo phương

pháp của Richard và Hultin (2002) với một vài sự thay đvối nhỏ Tóm tắt: Cân khoảng 0,1 – 0,3 g dầu, dầu được chiết theo phương pháp của Bligh và Dyer (1959), sau đó thêm 3,950 ml hỗn hợp chloroform và methanol (3:5, v/v) trước khi thêm 0,025 ml NH4SCN 30%, hỗn hợp được giữ trong 5 phút, rồi thêm 0,025 ml FeCl2, tiếp tục giữ hỗn hợp thêm 10 phút trước khi đo độ hấp thu quang học ở bước sóng

505 nm (Spectrophotometer, Carry 50, Varian, USA) Hàm lượng HPO được xác định từ đường chuẩn Cumene hydroperoxide Mỗi phân tích được tiến hành lặp lại hai lần, kết quả báo cáo là giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn

Xác định chỉ số TBARS: Chỉ số TBARS được xác định theo phương pháp của

Lemon (1975) với một vài sự thay đvối nhỏ Khoảng 5 g thịt cá đã được xay nhuyễn trộn với 10 ml dung dịch chiết TCA 7,5% và tiến hành chiết trong thời gian 15 phút, sau đó lọc qua giấy lọc số 1 Phần dịch lọc thu được trộn với dung dịch TBA 0,02 M theo tỉ lệ thể tích bằng nhau để đạt thể tích tổng cộng là 6 ml trong một ống nghiệm

10 ml và giữ ở nhiệt độ sôi trong 40 phút Sau đó làm nguội dưới vòi nước chảy đến nhiệt độ phòng trước khi đi xác định độ hấp thu quang học ở bước sóng 532 nm (Spectrophotometer, Carry 50, Varian, USA) Hàm lượng Malonaldehyde (MAD) được tính toán từ đường cong chuẩn được xây dựng với nồng độ MAD từ 0,01 đến 0,05 µM Kết quả được báo cáo là mg MAD/100g thịt cá Mỗi phân tích được thực

hiện lặp lại hai lần Kết quả báo cáo là giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn

Xác định hàm lượng a xít béo (FA): Hàm lượng a xít béo được phân tích tại

Viện nghiên cứu Dầu và cây có dầu Thành phố Hồ Chí Minh

2.2.2.9 Xác định các chỉ tiêu vi sinh vật

Các chỉ tiêu vi sinh vật được gửi kiểm tại Phòng thí nghiệm Hóa sinh – vi sinh,

Trung tâm thí ghiệm thực hành, Trường Đại học Nha Trang