Góp phần nghiên cứu tác dụng sinh học của mật gấu và sơ bộ phân biệt với một số mật khác

1.3.3 Một số thuốc chống đông máu và tiêu fibrin 92.2.1 Sơ bộ phân tách thành phần của mật gấu và so sánh 20 với các mật khác bằng phương pháp SKLM... Từ thực tế đó chúng tôi tiến hành t

(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP D ư ợ c s ĩ KHOÁ 1998 - 2003)

- Người hướng dẫn: TS Nguyễn Văn Đồng

- Nơi thực hiện: Bộ môn Hoá Sinh

- Thời gian thực hiện: tháng 3 - 5 / 2003

U i

Em xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn

sâu sắc tới TS Nguyễn Văn Đồng, người đã tận

tình hướng dẫn, giúp đỡ em thực hiện khoá luận

thành công.

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô tại Bộ

môn Hóa Sinh, thư viện, các cán bộ nhân viên khoa

Trữ máu Bệnh viện Việt Đức đã tạo điều kiện giúp

đỡ em hoàn thành khoá luận này.

Trần Thị Điệu Oanh

C Á C CHỮ VIẾT TẮT

[oc ]20d Độ quay cực đo ở 20°c, với tia D của natri

VLDL Very low density lipoprotein (lipoprotein tỉ trọng rất thấp)

1.3.3 Một số thuốc chống đông máu và tiêu fibrin 9

2.2.1 Sơ bộ phân tách thành phần của mật gấu và so sánh 20

với các mật khác bằng phương pháp SKLM

2.2.2 Tác dụng của mật gấu trên thời gian phục hồi calci 242.2.3 Tác dụng của mật gấu trên thời gian tiêu fibrin 272.2.4 Tác dụng của mật gấu trên chuyển hoá lipid 28

Hiện nay, mật gấu được dùng khá phổ biến, cả ở dạng mật tươi, với nhiều công dụng khác như chữa đau dạ dày, giúp tiêu hoá, điều trị cao huyết áp, rượu thuốc bổ, thậm chí điều trị ung thư Người ta coi mật gấu như vị thuốc vạn năng nên có thời điểm tạo ra cơn sốt mật gấu Tuy nhiên, việc sử dụng mật gấu vẫn chỉ theo kinh nghiệm dân gian hoặc theo lời đồn đại mà chưa có

sự kiểm chứng Các tài liệu nghiên cứu về tác dụng của mật gấu không nhiều

và còn sơ sài

Trên thị trường có nhiều dạng mật gấu khác nhau: loại phơi sấy khô, dịch mật tươi, rượu mật gấu chưa có tiêu chuẩn để đánh giá chất lượng và phân biệt mật gấu thật hay giả

Từ thực tế đó chúng tôi tiến hành thực hiện khóa luận tốt nghiệp “Góp

phần nghiên cứu tác dụng sinh học của mật gấu và sơ bộ phân biệt với một

sô' mật khác” với mục tiêu là:

- Góp phần tìm hiểu về tác dụng chống đông máu và tác dụng trên quá trình thủy phân triglycerid của mật gấu

- Sơ bộ phân tách thành phần của mật gấu và phân biệt với một số mật khác bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng

Mật gấu còn nguyên thường là những túi được ép bẹp, có cuống dài, chiều rộng có thể tới 5 - 6 cm, chiều dài 1 4 -1 5 cm, chiều dày 1 - 4 mm Bên trong có chất đen nhánh, giữa đám đen có những hạt lổn nhổn màu vàng óng ánh như hổ phách Nếm có vị đắng, sau ngọt, dính lưỡi Ngửi có khi có mùi khói Đốt không cháy.

Mật gấu được dùng ở Triều Tiên, Trung Quốc, Việt Nam Tại Triều Tiên quy định tiêu chuẩn mật gấu: độ ẩm dưới 15%, độ tro dưới 7%, tro không

tan trong acid clohydric dưới 4%.

b Thành phần hóa học:

Một số thành phần chủ yếu : muối của các acid mật, cholesterol, sắc tố mật (bilirubin )-

Các acid mật trong mật gấu gồm có: acid cholic, acid chenodesoxycholic

(CDCA), acid urso desoxycholic (UCDA) (hình 1.1).

UCDA: là acid đặc biệt chỉ có trong mật gấu, t°c = 200°c - 204°c, [a]20D

= +59,0° -> +62,0° (dung dịch 40 mg/ml trong ethanol) [30]

Acid cholic Acid chenodesoxycholic

Acid ursodesoxycholic

Hình 1.1 Các acid mật [30]

1.1.2 Công dụng, cách dùng [1, 2,16]:

Công năng chủ trị:

- Thanh nhiệt giải độc, dùng cho bệnh do hỏa độc dẫn đến mụn nhọt sang

lở sưng đau, đặc biệt đau do bệnh trĩ, có thể hòa tan trong nước nóng rồi bôi

- Thanh nhiệt giáng hỏa, dùng trong bệnh sốt cao dẫn đến co giật, hoặc bệnh kinh giản, hồi hộp sợ hãi, co quắp Phối hợp với câu đằng, bình vôi sắc lấy nước, hòa với mật gấu để uống

- Thanh can hỏa, tan màng mộng ở mắt, dùng khi can hỏa mắt sưng đau, mắt có màng mộng, mật gấu hòa với nước lấy dịch trong nhỏ vào mắt Trường hợp viêm gan, hôn mê gan, sắc nước nhân trần rồi hòa với mật gấu mà uống Hoặc uống riêng để chữa xơ gan

- Hoạt huyết giảm đau, dùng cho trường hợp sưng tấy ứ huyết đau đớn do chấn thương, mật gấu hòa vào rượu, xoa và bóp nơi sang chấn

- Ngoài ra còn dùng chữa đau dạ dày, khó tiêu, lỵ lâu ngày, giun

Liều dùng: - Uống: 0,5 - 2 g / ngày.

- Nhỏ mắt: mật gấu một lượng bằng hạt gạo mài với nước đun sôi

để nguội, lấy dịch trong nhỏ vào mắt

- Xoa bóp: dùng dung dịch mật gấu 5g /lOOml rượu 35°

Kiêng kỵ: Những người đau do hỏa uất, trạng thái thực nhiệt không dùng

Không nên dùng liều cao kéo dài, dễ ảnh hưởng tới trạng thái thần kinh

1.1.3 Cách lấy - chế biến [15]:

Bất cứ mùa nào cũng có thể lấy mật Có thể ba tháng, sáu tháng hoặc một năm lấy một lần Mật gấu lấy vào mùa đông được nhiều, lấy vào mùa xuân được ít hơn nhưng có phẩm chất tốt hơn

Trước kia muốn lấy cả túi mật người ta phải giết gấu, nay có thể hút trực tiếp từ túi mật sau khi gây mê gấu và siêu âm túi mật

Túi mật phơi hoặc sấy khô, gói kín để vào hộp kín có chất hút ẩm, để nơi

mát Nếu để ở nơi ẩm, nhiệt độ cao, mật gấu chảy nước, rất nhanh hỏng [15].

Dịch mật tươi hút vào dụng cụ sạch, khô, nút kín, để 0°c Hoặc pha ngay vào rượu hoặc cồn

1.1.4 Thử mật gấu [2,15]

* Thử theo kinh nghiệm nhân dân:

- Nếm lúc đầu vị đắng, sau ngọt mát, dính lưỡi, ngậm lâu tan hết Các

mật khác đắng mà không mát, không dính lưỡi, mùi tanh, khó ngửi

- Thả vài hạt mật gấu vào bát nước, hạt mật quay tròn rồi chìm xuống đáy

và cho một sợi màu vàng không lan tỏa ra

- Lấy vài hạt mật đốt trên ngọn đèn cồn, hạt mật sủi bọt mà không cháy

* Thử bằng phương pháp hoá học:

- Định lượng: Cân chính xác 0,5g mật gấu, hòa tan vào dung dịch KOH

5% Đun sôi Sau khi hòa tan, acid hóa bằng HC1, lắc với ete etylic 3 lần, mỗi lần 10ml Hợp các dung dịch ete lại, dùng nước rửa sạch, bốc hơi hết ete Ta

sẽ có hỗn hợp CDCA và UDCA Hòa tan cặn này trong 10ml dung dịch

amoniac 12%, thêm 10ml dung dịch 10% BaCl2 Lọc lấy kết tủa, được muối bari của các acid trên Thêm 10ml dung dịch 10% Na2C 03, đun nóng để loại

bỏ Ba++ Acid hóa bằng HC1 Lắc với ete 3 lần, mỗi lần 10ml Hợp các dung dịch ete lại, cất thu hồi ete Hòa tan cặn trong ethyl acetat Để yên cho kết tinh, sau đó lọc lấy tinh thể (CDCA không kết tinh) Để khô Cân UDCA chiết xuất được Phải được 0,10g tức là trong mật gấu phải có tới trên 20% UDCA

- Định tính:

Đo độ chảy phải thấy 202°c, là độ chảy của UDCA

Phản ứng Pettenkofer: Lấy ít hạt nhỏ tinh thể UDCA hòa tan trong lml nước cất và một ít saccarose, thêm 1-2 giọt acid sulfuric đặc sẽ thấy xuất hiện màu đỏ rất đẹp

Phản ứng Lieberman-Surchard: Hòa tan một hạt tinh thể UDCA trong 0,5ml cloroform, thêm 0,5ml anhydrit acetic và một giọt acid sulfuric đặc Bắt đầu có màu đỏ hồng, sau chuyển sang xanh lam và xanh lục

1.2 VAI TRÒ CỦA MẬT TRÊN CHUYEN h ó a LIPID [7,18, 27,28]

1.2.1 Trên quá trình nhũ tương hoá lipid:

Muối mật làm giảm sức căng bề mặt của các hạt mỡ, phân chia chúng thành những hạt có kích thước rất nhỏ Đó là quá trình nhũ tương hoá lipid.Muối mật có tác dụng trên bởi có cấu trúc không gian đặc biệt: tất cả các nhóm có cực nằm về một phía, các nhóm không cực nằm về phía ngược lại

(hình 1.2) Các phân tử này nằm ở mặt phẳng ranh giới giữa hai pha dầu- nước

tạo ra nhũ tương rất bền vững, làm tăng diện tích bề mặt tiếp xúc với lipase

Hình 1.2 Cấu trúc không gian của acid cholic

1.2.2 Trên quá trình thuỷ phân triglycerid

Lipase do tuyến tụy tiết ra, được acid mật hoạt hóa, có tác dụng thủy

phân liên kết ester giữa acid béo (AB) và glycerol trong triglycerid

Lipase tan trong nước nên có thể tấn công vào bề mặt các hạt cầu mỡ

AB-OH-*

OH

OHOH

Hình 1.3: Tác dụng của lipase thủy phân triglycerid.

1.2.3 Trẽn quá trình hấp thu lipid

Muối mật tạo với lipid những phức hợp rất nhỏ gọi là các hạt micelle

Các hạt này có thể tan trong nước và được hấp thu qua màng ruột nhờ các

nhóm ưa nước của muối mật

1.3 QUÁ TRÌNH ĐÔNG MÁU VÀ TIÊU FIBRIN [5,11,16, 20]

Đông máu và chống đông máu là hai quá trình phức tạp tồn tại song song

trong cơ thể Quá trình đông máu giúp cầm máu còn chống đông máu ngăn

cản hiện tượng đông lan tràn, làm tiêu cục máu để lưu thông huyết mạch

1.3.1 Quá trình đông máu

Khi thành mạch bị tổn thương, lập tức xảy ra các hiện tượng:

- Hiện tượng co mạch: theo cơ chế phản xạ thần kinh và tác động thể

dịch, tiểu cầu dính và ngưng tập tạo thành đinh Hayem tại nơi bị tổn thương

- Hiện tượng đông máu: các yếu tố đông máu hoạt động tạo thành mạng

lưới fibrin, ôm lấy hồng cầu bạch cầu tạo thành cục máu đông

- Hiện tượng co cục máu: làm cho cục máu đông trở nên chắc và ổn định

hơn, sự cầm máu tốt hơn và kéo dài hơn

Quá trình đông máu

Ca1(1) Prothrombin Ỷ (2) ^ Hạ

(8) Yếu tô'hoạt hoá

(9)(9) Plasminogen ▼ (6)(7) ► Plasmin

QTĐM là chuỗi các phản ứng dây chuyền để biến đổi fibrinogen thành fibrin, tạo cục máu đông, với sự tham gia của các yếu tố đông máu.

a Các yếu tố đông máu

Các yếu tố này được ký hiệu bằng các chữ số La mã: Fibrinogen (I), Prothrombin (II), Thromboplastin tổ chức (III), Ion calci (IV), Proaccelerin (X), Proconvertin (VII), yếu tố chống chảy máu A (VIII), yếu tố chống chảy máu B (IX), yếu tố Stuart-Prower (X), Thromboplastin huyết tương (XI), yếu

tố Hageman (XII), yếu tố làm bền vững fibrin (XIII), Prekallikrein, HMWK

b Các giai đoạn quá trình đông máu:

QTĐM được chia làm ba giai đoạn, theo cách phân chia của Howell

Giai đoạn ỉ: Hình thành thromboplastin (chất xúc tác chuyển

prothrombin thành thrombin), xảy ra theo cả hai con đường nội mạch và ngoại mạch với sự tham gia của các yếu tố đông máu của huyết tương, tiểu cầu và tổ chức Trong giai đoạn này các yếu tố đông máu hoạt hoá trình tự theo kiểu bậc thang

Giai đoạn 2: Chuyển prothrombin thành thrombin dưới tác dụng của các

yếu tố Xa, Va và Ca++

Giai đoạn 3: Tạo fibrin từ fibrinogen dưới tác dụng của thrombin, Ca++

và yếu tố XlIIa Fibrin ở dạng đơn phân trùng hợp ngay thành fibrin đa phân Fibrin đa phân không bền do phản ứng trùng hợp có tính thuận nghịch, dưới xúc tác của yếu tố XlIIa tạo thành mạng lưới fibrin bền vững

c Các chất ức chê đông máu :

Nhóm ỉ: các chất ức chế của serin protease: Antithrombin III, a-,

macroglobulin, a t antitripsin, đồng yếu tố heparin

Nhóm 2: hệ thống protein C: Protein c, Thrombomodulin, Protein s.

1.3.2 Quá trình tiêu fibrin

a Các yếu tố tham gia trong hệ thống tiêu fibrin

- Plasminogen: Được tổng hợp ở gan, có trong nhiều tổ chức khác nhau, là

protein đơn chuỗi có 791 acid amin, không bền với nhiệt và pH trung tính

- Plasmin: Gồm hai chuỗi protein nối với nhau bằng cầu nối disulfua, hoạt động ở pH trung tính, phân hủy cả fibrin, fibrinogen, yếu tố V, VIII, XlIIa, .

Có nhiều cách hoạt hoá plasminogen thành plasmin: nhờ fibrinokinase trong mô và huyết tương, yếu tố hoạt hoá plasminogen của mô (t-PA: tissue plasminogen activator), urokinase có trong nước tiểu, streptokinase và staphylokinase phân lập từ vi khuẩn

b Các giai đoạn quá trình tiêu fibrin

Giai đoạn ỉ: Hoạt hóa plasminogen thành plasmin Tất cả các chất hoạt

hoá đều theo cơ chế cắt liên kết giữa arginin và valin trong phân tử plasminogen tạo ra hai chuỗi A và B liên kết nhau bằng cầu nối disulfua

Giai đoạn 2: Tiêu fibrin Plasmin làm phân huỷ fibrin không hoà tan, tạo

ra các sản phẩm thoái hoá có trọng lượng phân tử thấp, hoà tan Plasmin còn phân huỷ cả fibrinogen (Sản phẩm thoái giáng của fibrin và fibrinogen quay lại ức chế quá trình hình thành fibrin)

c.Các chất điều hoà quá trình tiêu fibrin

- Các chất ức chế sự hoạt hoá plasminogen 1, 2 (PAI-1, PAI-2:

Plasminogen activated inhibitor -1,-2)

- Các chất kháng plasmin: oc 2“ antiplasmin, chất ức chế Cj, glycoprotein giàu histidin, s-aminocaproic acid (EACA),1-antitrypsin, antithrombin III

- Các hormon: TSH (kích giáp trạng tố), STH (kích phát triển tố) có tác dụng thúc đẩy tiêu fibrin; ACTH (kích thượng thận tố) ức chế sự tiêu fibrin

1.3.3 Một số thuốc chống đông máu và tiêu fibrin (xem hình 1.4)

a Thuốc chống đông máu [3, 10, 23, 24]

- Thuốc ức chế tác dụng của các yếu tố đông máu: Heparin là một

mucopolysaccharid, ức chế sự tạo thành và tác dụng của thrombin do tạo phức với antithrombin III Phức hợp này còn ức chế các yếu tố IX, X, XI, XII Heparin còn có tác dụng chống kết vón tiểu cầu, ức chế kallikrein Ngoài ra

heparin hoạt hoá lipoprotein-lipase, làm tăng chuyển hoá chylomicron và VLDL, nên có tác dụng làm giảm TG và VLDL.

- Thuốc ức chế sự tổng hợp các yếu tố đông máu ở gan: Các kháng

Vitamin K (dẫn chất 4-hydroxycoumarol, dẫn chất indan-l,3-dion) Các chất

này cạnh tranh với vitamin K gây ức chế quá trình chuyển PIVKA (Protein induced by vitamin K antagonists) thành các yếu tố II, VII, IX, X có hoạt tính

- Thuốc chống kết dính tiểu cầu: Aspirin: ức chế enzym prostaglandin

cyclooxygenase của màng tiểu cầu, ngăn cản tổng hợp thromboxan A2, là chất gây giãn mạch và làm kết dính tiểu cầu mạnh Ngoài ra Aspirin còn ức chế phosphodiesterase làm tăng nồng độ AMP vòng, ức chế giải phóng ADP nội tại, là chất kích thích tiểu cầu phóng thích yếu tố tiểu cầu 3

Một sô thuốc khác: Phenylbutazol, oxyphenbutazon, sulfinpyrazon, Indomethacin, Dipyridamol, Ticlodipin.

b Thuốc làm tiêu fibrin [3, 10, 23]

Các chất này làm tăng nhanh quá trình tiêu fibrin sinh lý ở các huyết khối Hiện nay hay dùng urokinase (UK) và streptokinase (SK)

Urokinase: Là một protease phân lập từ nước tiểu người hoặc từ nuôi cấy tế bào phôi thận người UK hoạt hoá trực tiếp plasminogen thành plasmin

có sự phối hợp chặt chẽ với yếu tố hoạt hoá plasminogen tổ chức t-PA Thời gian bán huỷ của UK ngắn, 10-15 phút

Streptokinase: Phân lập từ môi trường nuôi cấy liên cầu khuẩn Ị3 tan máu nhóm c SK hoạt hoá plasminogen bằng cách liên kết với plasminogen với tỉ lệ 1 : 1 hoặc liên kết với plasmin SK còn có tác dụng làm giảm fibrinogen và có tính kháng nguyên Thời gian bán hủy là 20 phút

* Các thuốc tiêu fibrin còn có tác dụng:

- Làm giảm độ quánh máu, cải thiện các điều kiện huyết động.

- Cải thiện tuần hoàn trong các vùng cạnh khu vực có huyết khối hoặc có nhồi máu cơ tim do làm tiêu các vi huyết khối

* Đ ể đánh giá tác dụng của thuốc, các xét nghiệm thường dùng là:

- Nghiệm pháp Milstone xác định thời gian tiêu cục fibrin trong điều kiện

loại trừ các chất ức chế hệ thống tiêu fibrin

- Định lượng các chất do tiêu cục fibrin tạo thành

c Một sô' thuốc đông dược có tác dụng chống đông máu [1]

Theo y học cổ truyền, thuốc hoạt huyết là những thuốc có tác dụng lưu thông huyết mạch, thường dùng trong các trường hợp huyết ứ do sang chấn, viêm tắc gây đau đớn, huyết ứ do kinh bế, sau đẻ, sưng tấy, đau nhức Thuốc được chia làm hai loại:

- Thuốc hoạt huyết: tác dụng hành huyết ở mức độ nhẹ như đương quy,

xuyên khung, đan sâm , loại này dùng đối với các bệnh do huyết mạch lưu thông kém gây sưng đau

- Thuốc phá huyết: tác dụng hành huyết mạnh hơn như đào nhân, hồng

hoa, nga truật, tô mộc , dùng với các bệnh huyết ứ đọng, gây đau đớn mãnh liệt

* Mật gấu cũng được dùng trong những trường hợp tụ máu, sưng đau

và cũng như đa số các thuốc đông dược, cơ chế tác dụng của mật gấu chưa rõ

1.4 SẮC KÝ LỚP MỎNG [4, 8, 13, 29]

Lý thuyết SKLM một phần dựa trên lý thuyết sắc ký hấp phụ và một

phần dựa trên lý thuyết sắc ký phân bố

1.4.1 Nguyên tác của SKLM

Nguyên tắc tách chiết các chất trong SKLM dựa trên sự phân bố của các chất giữa hai pha tĩnh và động Pha tĩnh là chất hấp phụ được rải thành lớpmỏng trên một mặt tấm kính, chất dẻo hay kim loại Pha động là dung môi sẽ

t

thấm và chạy trên lớp mỏng do tác động của lực mao dẫn, đôi khi là lực điện hay trọng lực, làm chuyển dịch các chất và tạo ra các vết trên bản mỏng Phát hiện ra các vết này bằng các phương pháp lý, hoá sau khi làm bay hơi dung môi pha động

1.4.2 Kỹ thuật SKLM:

a Trang bị:

- Chất hấp phụ: Trong SKLM cần dùng bột chất hấp phụ rất mịn Các chất hấp phụ thường dùng là: Silicagel, nhôm oxyd, Kieselgur, thạch cao (calci sulfat), cellulose, bột polyamid, các ionid, sephadex

Trên thị trường còn có các loại silicagel G, Kieselgur G, nhôm oxyd G đã

trộn sẵn 5% thạch cao, loại silicagel H, nhôm oxyd H không trộn thạch cao,

loại silicagel thạch cao F254 có chất huỳnh quang

- Bản mỏng: Bản mỏng dính chắc: chất hấp phụ trộn thêm 5 - 15% chất

kết dính như thạch cao, tinh bột, dextrin Bản mỏng không dính chắc: rải bột

có hoạt độ thích hợp lên tấm kính, san bằng với một đũa thép hai đầu dầy lên khoảng 0,5-lmm, hoặc một đũa thuỷ tinh hai đầu lồng hai đoạn ống cao su, hoặc dùng dụng cụ rải riêng

- Dung môi: Dung môi phải tinh khiết Tốc độ dịch chuyển của một chất trên một chất hấp phụ nhất định phụ thuộc vào dung môi sử dụng

Đôi khi hỗn hợp 2-3 dung môi có độ phân cực khác nhau lại tách tốt hơn những dung môi đồng đều về mạt hoá học

- Bình sắc ký: Có thể dùng các loại bình chuyên dùng cho SKLM hoặc các lọ rộng miệng, bình hình trụ có nút mài hoặc nắp đậy thông thường

- Khai triển sắc ký: đặt bản mỏng vào bình sắc ký đã bão hoà dung môi

pha động, mép phía chấm mẫu chạm trực tiếp vào dung môi Khi dung môi chạy được khoảng 10 cm lấy ra đánh dấu tiền tuyến dung môi, để khô Có thể chạy sắc kỷ đi lên, đi xuống hoặc nằm ngang, chạy một chiều hoặc hai chiều

Trường hợp SKLM với bản mỏng không dính chắc thì dùng chậu thuỷ tinh có kích thước phù hợp với bản mỏng, đặt bản mỏng nằm nghiêng 15-20° nhúng vào dung môi để ở đáy chậu

- Phát hiện các vết trên bản mỏng:

* Dùng ánh sáng tử ngoại để phát hiện.

* Dùng thuốc thử hoá học: phun thuốc thử lên bản mỏng (acid sulfuric

đậm đặc hoặc thuốc thử đặc hiệu với từng loại chất), hoặc dùng hơi iod

Vị trí các vết trên sắc đồ có thể xác định nhờ chỉ số Rf, phản ánh tốc độ

di chuyển của các chất: Rf =

-2-^đm

Trong đó: Sct, Sdm là đường đi của chất thử và dung môi

* Cách tốt nhất là cho chạy song song những chất chuẩn trên cùng bản mỏng và tính giá trị Rs

Trong đó: - Rf(ct), Rf(cc) là tốc độ di chuyển của chất thử và chất chuẩn

- Scc là đường đi của chất chuẩn

1.4.3 Ưu điểm của phương pháp SKLM

- Nhanh (15 phút - 3 giờ), trang thiết bị tương đối đơn giản, do đó có thểtiến hành nhanh chóng và ít tốn kém các thí nghiêm thăm dò cho sắc ký cột

- Dễ kết hợp định tính với định lượng, bán định lượng

- Tách nhiều hỗn hợp phức tạp

- Được dùng để thử độ tinh khiết của sản phẩm, được dùng nhiều trong các phòng thí nghiệm lâm sàng, trong nghiên cứu sinh học, hoá sinh

- Dịch mật lợn, bò, gà, cóc, cá trắm: được lấy từ các súc vật trên khi giết thịt, đựng trong lọ, sạch, nút kín, bảo quản ở 0°c.

- Dịch chiết tụy được chiết từ lOg tuỵ tươi với 30ml NaCl 0,9%, điều chế thành dịch tuỵ 5% (5ml dịch chiết tuỵ/lOOml NaHC03 1%), bảo quản 4°c, dùng trong vòng 12 giờ

- Huyết tương người: Máu người bình thường (người hiến máu tại Bệnh viện Việt Đức) được chống đông bằng dung dịch natri citrat 3,8% theo tỉ lệ 1 thể tích citrat : 9 thể tích máu, để lắng hoặc li tâm chậm 500 vòng/5 phút lấy huyết tương giàu tiểu cầu, hoặc li tâm 3500 vòng/20 phút để lấy huyết tương nghèo tiểu cầu, dùng ngay

- Sữa: Sữa tươi không đường Vinamilk

- Bản mỏng chạy sắc kỷ silicagel aluminum 60 F254 của Merck (Đức)

- Hoá chất, thuốc thử:

+ Dung dịch NaCl 0,9%

+ Dung dịch CaCl2 0,1M, 0,025M

+ Dung dịch acid acetic 1%, 0,016%.

+ Máy điều nhiệt CLIFTON (Nickel Electro - Anh)

+ Máy li tâm EBA 21 (Hettich Zentrifligen - Đức

+ Máy đo pH MODEL 3305 (Jenway - Anh)

+ Các dụng cụ thông thường dùng trong phòng thí nghiệm

2.1.2 Phương pháp nghiên cứu

a Phân tách thành phần của mật gấu và phân biệt mật gấu với một số mật

Các bước tiến hành: xem phần 1.4.

(Chú ý sau khi phun chất hiện màu, sấy ở 100°C/5 phút)

b Đánh giá tác dụng chống đông máu của mật gấu [12, 16, 20, 21]

Tác dụng chống đông máu của mật gấu được thực hiện bằng phương pháp invitro trên huyết tương người với các xét nghiệm sau: