Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ chủng streptomyces 9 25

Phương pháp thử độ ổn định của hoạt chất kháng sinh trong dịch lên men với pH khác nhau.. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các loại môi trường đến khả năng sinh tổng hợp kháng sinh.. Kết

BỘ Y TÊ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

Giáo viên hướng dẫn: TS Cao Văn Thu

Noi thực hiện: BM Công Nghiệp Dược

Thời gian thực hiện: 2/2003- 5/2003

Hà Nội - 5/2003

li?

64-Tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với thầy giáo TS CAO VĂN THU, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn tôi thực hiện khoá luận này.

Đồng thời tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong bộ môn Công Nghiệp Dược đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện khoá luận.

Với kiến thức và thời gian thực hiện khoá luận còn hạn chế, chắc rằng khoá luận của tôi còn nhiều thiếu sót Tôi rất mong được sự đóng góp ỷ kiến của các thầy cô và bạn bè để khóa luận của tôi được hoàn thiện hơn.

Tôi xin chân thành cảm ơn.

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2003

Sinh viên

Lê Quang Vũ

MỤC LỤC

TRANG

2.1.1 Một số đặc điểm về hình thái của chi Streptomyces.

2.1.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của Streptomyces.

2.1.3 Một số khá lớn kháng sinh do một số loài Streptomyces sinh tổng

hợp đã được nghiên cứu và sử dụng

2.4.1 Phương pháp chia cắt pha

2.4.2 Phương pháp chuyển pha

2.5 Các kết quả mới về quá trình nuôi cấy và chiết tách một sô

2.5.1 Bafilomycin B, và Cị.

2.5.2 Kháng sinh adriamycin, 14 hydroxyl daunomycin chống ung thư

từ chủng Str peucetius var caesius.

3.2.1 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuyếch tán.3.2.2 Phương pháp cải tạo giống

3.2.3 Phương pháp lên men

3.2.5.Phương pháp xác định kháng sinh nội bào

3.2.4 Phương pháp thử độ ổn định của hoạt chất kháng sinh trong dịch lên men với pH khác nhau

3.2.6 Phương pháp chiết tách kháng sinh

3.2.7 Phương pháp sắc ký

3.2.8 Phương pháp phân loại Streptomyces theo ISP (International

Strepmyces Project)

3.3.1 Kết quả thử hoạt tính kháng sinh Streptomyces 9.25 sinh tổng hợp

trong môi trường 2

3.3.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các loại môi trường đến khả năng sinh tổng hợp kháng sinh

3.1 Nguyên liệu và trang thiết bị

3.1.1 Chủng gốc vi sinh vật và nguyên liệu

3.1.2 Các trang thết bị

3.2 Phương pháp thực nghiệm

13

17

3.3.3 Kết quả nghiên cứu tuyển chon giống bằng phương pháp sàng lọc ngẫu nhiên.

3.3.4 Kết quả cải tạo giống bằng phương pháp đột biến nhân tạo với các

3.3.7 Kết quả thử kháng sinh nội bào

3.3.8 Kết quả quá trình lựa chọ dung môi chiết và pH chiết thích hợp với hoạt chất kháng sinh ở dịch lọc dịch lên men

3.3.9 Kết quả thử độ ổn định của hoạt chất tại các pH khác nhau

3.3.10 Kết quả sắc ký lớp mỏng

3.3 11 Kết quả phân loại và định tên Streptomỵces 9.25

TẢI LIỆU THAM KHÁO

PHU LUC

BuOAc: Butyl acetat

EC: Escherichia coli

EtOAc: Ethyl acetat

MeOH: Methanol

MT: Môi trường

Pro: Proteus mirabilis

Pseu: Pseudomonas aeruginosa

S hi: Shigella flexneri

PHẦN I

ĐẶT VẤN ĐỂ •

Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, ngày càng có nhiều kháng sinh mới, đã được sản xuất bằng phương pháp bán tổng hợp hoặc tổng hợp toàn phần, nhưng việc tìm ra các kháng sinh mới nguyên gốc từ các loài vi sinh vật vẫn đang được nhiều quốc gia trên thế giới quan tâm

Ở Việt Nam có điều kiện khí hậu nhiệt đới là điều kiện tốt cho các loài

vi sinh vật phát triển trong đó có nhiều loài có khả năng sinh tổng hợp kháng

sinh tốt, tiêu biểu là chi Streptomyces thuộc lớp phụ Actinomycetales cũng

đang được đánh giá cao và nhiều nhà khoa học quan tâm

Việc phân lập các chủng Streptomyces được tiến hành nghiên cứu tại bộ

môn công nghiệp dược của trường ĐH Dược Hà Nội Tuy nhiên những chủng nguyên thuỷ ban đầu, khả năng sinh tổng hợp kháng sinh chưa cao Do vậy, nghiên cưú nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh và nghiên cứu chiết tách tinh chế kháng sinh là điều kiện cần thiết ở quy mô phòng thí nghiệm trước khi đưa ra công nghiệp hoá

Tiếp tục từ những việc nghiên cứu đã

tài có tên: “Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ chủng xạ

khuẩn streptomyces 9.25" với các mục tiêu sau:

- Nghiên cứu cải tạo giống và lên men để nâng cao hiệu suất sinh tổnghợp kháng sinh

- Nghiên cứu sơ bộ phương pháp chiết tách và tinh chế kháng sinh

- Nhận dạng định tên chủng Streptomyces 9.25

lởi phát) chúng tôi lựa chọn đề

1

PHẦN II

TỔNG QUAN

2.1 Đặc điểm chung về streptomyces

2.1.1 Một sô đặc điểm về hình thái của chi streptomyces

Streptomyces là chi thuộc lớp phụ Actinomycetales phân bố rộng rãi trong tự

nhiên ở nhiều nơi: đất, bùn ao hồ, cát, nước Trung bình cứ 1 gam đất nói chung có trên một triêu xạ khuẩn Mật độ xạ khuẩn ở các mẫu đất khác nhau rất khác nhau, phụ thuộc nhiều điều kiện: môi trường như độ ẩm, nhiệt độ, dinh dưỡng, pH

Streptomỵces tạo ra khuẩn ty khí sinh và khuẩn ty cơ chất, các khuẩn lạc

hình thành sau vài ngày nuôi cấy có mầu sắc hết sức phong phú, thường hay gặp là màu trắng, màu xám, màu tím Khuẩn lạc thường có dạng thô ráp, dạng phấn, không trong suốt có nếp toả ra hình phóng xạ

Khuẩn ty cơ chất đang sinh trưởng có tính chất như xốp, bề mặt nhẵn hoăc xù xì có xu hướng dính chặt vào môi trường

Khuẩn ty khí sinh có đường kính từ 0,5 - 1,4 |Lim và từ đó hình thành nên những chuỗi bào tử Đây là cơ sở sinh sản đặc trưng, chuỗi bào tử có cấu tạo gồm một sợi trục không có chức năng sinh sản, những đoạn phân nhánh cuối cùng mới có khả năng sinh bào tử Trên mỗi nhánh có từ 10 - 100 bào tử Bào

tử có thể hình cầu, elip Đường kính của bào tử có kính thước tương ứng với đường kính của khuẩn ty

2.1.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của Streptomyces.

Streptomyces phát triển được ở nhiệt độ từ 20 - 40 °c Nhưng điều kiện

phát triển tối thích của nó là 30 ± 2°c và ở pH: 7,0 ± 0,2

Một số đặc điểm cần lưu ý của streptomyces là sự tạo sắc tố hoà tan,

khuẩn lạc có màu sắc khác nhau trên các môi trường nuôi cấy khác nhau, đây

cũng là những cơ sở để giúp phân loại định tên loài cho các loài Streptomyces.

2

Các loài trong chi Streptomyces là các vi khuẩn gram dương, hiếu khí,

sống hoại sinh trong đất và nước Chúng có khả năng phân huỷ mạnh glucid,

có thành tế bào kiểu I chức DAP (diaminopimelat) và glycin

2.1.3 Một sô khá lớn kháng sinh do một sô loài streptomyces sinh tổng

hợp đã được nghiên cứu và sử dụng

Nhiều loài Streptomyces có khả năng sinh tổng hợp tạo ra được nhiều loại thuộc nhiều nhóm kháng sinh khác nhau như: aminoglycosid, phenicol,

macrolid, lincosamid, tetracylin

- Kháng sinh chống nấm.

+ Nystatin do S.noursei

+ Amphotericin do s nodosus

2 .2 Cải tạo giống vi sinh vật

Hầu hết các vi sinh vật sinh kháng sinh phân lập được từ các cơ chất thiên nhiên thường có hoạt tính thấp, đồng thời trong quá trình nuôi cấy hoạt tính của chúng thường giảm dần Do đó để thu được những chủng có hoạt tính cao, ổn định đưa vào sản xuất cần phải tiến hành cải tạo giống bằng các biện pháp khác nhau

2.2.1 Chọn lọc ngẫu nhiên

Các vi sinh vật biến dị tự nhiên theo tần số khác nhau có cá thể tăng hoạt tính kháng sinh so với cá thể khác Ta cần chọn lấy những cá thể có hoạt tính cao nhất để nghiên cứu tiếp

Trên thực tế tần suất xuất hiện các biến chủng dương tính rất thấp và việc chọn lọc tự nhiên các cá thể có hoạt tính kháng sinh cao chỉ để nghiên cứu ban đầu ít có giá trị áp dụng vào sản xuất, để thu được những chủng có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh cao Ta phải cải tạo giống Ở đây chúng tôi kết hợp đột biến và sàng lọc

Ngày nay với sự phát triển mạnh mẽ của di truyền học hiện đại và việc tìm ra bản chất gen, hiểu bản chất đột biến và quá trình phát sinh đột biến Người ta có khả năng tạo ra đột biến mạnh để tăng hiệu quả trong quá trình nghiên cứu sản xuất

2 .2 .2 Đột biến nhân tạo

Đột biến là quá trình làm thay đổi trình tự sắp xếp của các base hoặc thay đổi bản thân các base trong ADN Các yếu tố gây đột biến là các tác nhân gây đột biến có thể làm thay đổi một vài nhược điểm của giống

Đột biến nhân tạo là đột biến được tạo bởi các tác nhân đột biến với mục đích nhằm nâng cao tần suất xuất hiện đột biến

4

Các tác nhân đột biến:

+ Tác nhân vật lý: Tia X, ánh sáng uv, tia Ỵ

+ Tác nhân hoá học: N-mustar, etylenimin, HN02

+ Tác nhân sinh học: Đột biến do hiện tượng thiếu các base, nitơ hay do tác động của gen gây đột biến

Trong khoá luận này chúng tôi chỉ nghiên cứu cải tạo giống bằng cách gây đột biến bằng ánh sáng tử ngoại Ánh sáng u v có khả năng đâm thấu tới nhân với tế bào vi sinh vật nên được sử dụng rộng rãi trong việc cải tạo giống

Cơ chế gây đột biến của ánh sáng UV:

Ánh sáng uv có tác dụng trên ADN và mạnh nhất ở bước sóng 260 nm, gây dime hoá thymin (do làm đứt liên kết hydro trong mạch kép ADN) Ở đây

2 thymin gần nhau sẽ liên kết cộng hoá trị với nhau ở nguyên tử C5 và C6, hậu quả là sao chép bị nhầm Do ADN- polymease dễ lắp một nucleotit vào vị trí trên Ngoài ra do tác dụng của ánh sáng uv trên sợi ADN cũng xuất hiện mộtdime pyrimidin khác gọi là quang sản phẩm 6-4 Ở đây C6 của pyrimidin 5' được liên kết với C4 của pyrimindin 3' Các sản phẩm này là nguyên nhân chủ yếu gây lên đột biến bỏti tia uv.

Các yếu tố ảnh hưởng đến hậu quả gây chết và tần số phát sinh đột biến:

+ Thòi gian chiếu

Hầu hết các kháng sinh hiện có đều là sản phẩm của quá trình lên men hoặc bán tổng hợp rất ít kháng sinh có thể tổng hợp toàn phần như cloramphenicol.

Có 2 kiểu lên men chính:

cơ giới tự động hoá Vì vậy không được áp dụng trong sản xuất công nghiệp

mà chỉ sử dụng để chọn giống trong phòng thí nghiệm

2.3.2 Lên men chìm.

Đa số các kháng sinh hiện nay đều được sản xuất bằng phương pháp lên men chìm Ở phương pháp này vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường lỏng, phát triển trong không gian 3 chiều Giống lên men được tạo ra qua các cấp nhân giống khác nhau

+ Giống cấp I: được nuôi cấy trong bình trên máy lắc,

+ Giống cấp II: trong bình giống 50 lít,

+ Giống cấpIII: nuôi cấy trong bình có dung tích 1- 5 m3

Tỷ lệ giống từ 1-10 % Tuỳ thuộc vào sản phẩm và thời gian lên men có thể kéo dài từ 96h — 180h, tuy nhiên hiệu quả lên men tăng lên khi thời gian lên men được rút ngắn

ư u điểm của lên men chìm:

+ Sử dụng môi trường dinh dưỡng tối ưu, đáp ứng được nhu cầu sinh lý, sinh hoá của vi sinh vật

+ Hiệu suất sử dụng không gian cao

+ Các thiết bị lên men chìm dễ cơ giới hoá tự động hoá tiết kiệm được mặt bằng, nhân công

Tuy nhiên lên men chìm đòi hỏi nhiều trang thiết bị kỹ thuật, các thiết bị chịu áp lực và vô trùng tuyệt đối, đòi hỏi đầu tư lớn

Lên men chìm được chia ra nhiều kiểu như: lên men gián đoạn, lên men

có bổ sung và lên men liên tục

* Lên men gián đoạn: Lên men gián đoạn như một hệ thống đóng kín sau khi cấy giống trong điều kiện vô trùng, tiến hành lên men trong điều kiện sinh lý tối ưu, trong thòi gian lên men ngoài cấp khí, chất phá bọt, chất điều chỉnh pH ngoài ra không bổ sung gì thêm

Để theo dõi quá trình lên men người ta tiến hành phân tích các mẫu dịch lên men mới lấy để xác định tham số chính

* Lên men liên tục: Hệ thống lên men liên tục hoạt động như một hệ mở Trong quá trình lên men vừa bổ sung liên tục môi trường dinh dưỡng vừa lấy bớt ra đồng lượng dịch lên men đã biến đổi cùng vi sinh vật trong đó giữ thể tích không đổi, lên men liên tục có sản lượng cao, có thời gian chết ngắn hơn lên men gián đoạn

* Lên men bổ sung là biến tướng phát triển tiếp tục của lên men gián đoạn khi ta bổ sung thêm môi trường dinh dưỡng để tránh các ức chế trao đổi chất của vi sinh vật nhằm tăng cường sinh tổng hợp hoạt chất

Trong quá trình lên men, lượng giống, tuổi, cách nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy có ảnh hưởng đến hiệu suất của quá trình Theo kinh nghiệm, nếu muốn đạt hiệu suất sinh tổng hợp cao thì môi trường nhân giống phải khác môi trường lên men

7

2.4 Chiết tách và tinh chê

Các sản phẩm mục tiêu có trong dịch lên men thường có nồng độ thấp Ngoài ra dịch lên men còn tồn tại nhiều sản phẩm phụ của quá trình trao đổi chất khác Do đó việc nghiên cứu quá trình chiết tách và nghiên cứu kháng sinh là một việc vô cùng quan trọng

Có hai phương pháp hay dùng nhất để chiết hỗn hợp đổng nhất đó là phương pháp chia cắt pha và phương pháp chuyển pha

2.4.1 Phương pháp chia cắt pha

Đây là phương pháp đi từ hỗn hợp đồng nhất tách thành hỗn hợp không đồng nhất

* Loại dung môi: Bằng cách cô đặc có thể tiến hành ở áp suất giảm Nếu

cô ở áp suất thường thì hoạt chất có thể bị phân huỷ bởi nhiệt độ cao Nhưng ngược lại cô ở áp suất giảm, tiến hành phức tạp hơn ở nhiệt độ thấp hơn sẽ an

toàn cho hoạt chất hơn Người ta thường dùng một bình cất quay nối với một bơm chân không, dung môi ngưng đọng chảy qua một bình khác Sự quay làm tăng diện tích bề mặt bay hơi, do dung môi được tráng lên thành bình

* Giảm khả năng hoà tan của dung môi

- Thay đổi nhiệt độ

- Thêm chất lỏng không phải là dung môi vào dung dịch

- Phương pháp muối kết (dựa vào độ mạnh yếu khách nhau của cácion)

2.4.2 Phương pháp chuyển pha.

Dùng một dung môi hay một hệ dung môi thích hợp để chuyển một chất

từ pha này sang pha khác Trong nhóm này hai phương pháp chiết và sắc ký là hay được sử dụng để nghiên cứu kháng sinh

* Phương pháp chiết

Nguyên tắc: Dựa vào sự phân bố khác nhau của chất tan giữa hai pha không đồng tan vói nhau

Nếu lắc dung dịch A có chứa chất tan s với dung môi B thì quá trình phân bố chất tan s vào hai pha A và B sẽ được trạng thái cân bằng như sau:

c

K =

q CA

CA, CB lần lượt là nồng độ của chất s trong pha (A và B)

Kq là hằng số cân bằng ở nhiệt độ xác định trong những điều kiện lý

tưởng

Các phương pháp chiết:

- Chiết một lần (chiết đơn) thường cho hiệu suất thấp

- Chiết lặp (chiết nhiều lần) cho hiệu suất cao, nhưng tốn thời gian vàcông sức, có thể chiết gián đoạn hay chiết liên tục

- Chiết ngược dòng: dựa trên nguyên tắc dung môi chiết và dung dịch cần chiết chuyển động ngược chiều nhau hai pha tiếp xúc chặt chẽ, pha trộn và di động ngược chiều nhau

* Sắc ký:

Sắc ký là phương pháp tách và phân tích các chất dựa vào sự phân bố của chúng giữa hai pha: pha động và pha tĩnh Khi tiếp xúc vói hai pha các cấu tử hỗn hợp sẽ phân bố vào hai pha tương ứng với các phần tử của pha động mới chuyển động dọc theo hệ thống sắc ký

Các chất khác nhau thì có các ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh, chất có ái lực lớn với pha tĩnh thì chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký

so vói chất có ái lực yếu hơn với pha này do vậy các chất có thể được tách riêng xa nhau

Theo bản chất có thể chia sắc ký thành 4 loại:

Sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion và sắc ký trên gel

- Sắc ký phân bố: pha tĩnh là chất lỏng không hoà tan được với pha động chất lỏng này được bao trên bề mặt chất rắn gọi là giá mang

- Sắc ký hấp phụ: pha tĩnh là chất rắn có khả năng hấp phụ

Q

- sắc ký trao đổi ion: pha tĩnh là chất mang có nhóm hoạt hoá chứa các ion trao đổi, sắc ký trao đổi ion dựa vào hiện tượng trao đổi thuận nghịch giữa các ion trong dung dịch với các ion thành phần của chất trao đổi ion.

- Sắc ký trên gel: chất hấp phụ là các gel, pha tĩnh là dung môi nằm trong lỗ xốp các hạt, pha động là dung môi giữa các hạt, các phân tử chất

có phân tử lượng lớn thì sẽ không bị giữ và di chuyển theo dung môi các phân tử nhỏ chui vào các lỗ xốp Khi rửa các phân tử sẽ ra lần lượt là các

cỡ lớn đến nhỏ Có nhiều loại gel với các lỗ xốp khác nhau để tách phân

Khi nuôi cấy Streptomyces halstedii theo phương pháp thông thường thì

tác dụng chống nấm không phát hiện được ở cả dịch môi trường và dịch chiết

nội bào Tuy nhiên khi nuôi cấy Streptomyces halstedii trong môi trường dạng

film mỏng 1 mm thì thấy đây là một môi trường thích hợp cho sự tạo kháng

sinh chống nấm S.halstedii được nuôi cấy qua đêm ở nhiệt độ 30°c trong môi

trường này, sau đó dùng 1 ml môi trường trên thêm vào 15 ml môi trường lên men, hỗn hợp này được phân tán vào bình Rhou để ở nhiệt độ 30°c đến khi tạo bào tử (từ 10-14 ngày) Ly tâm để lấy hệ sợi, hệ sợi được rửa bằng nước cất và lọc qua phễu lọc cellulose Hệ sợi được thu nhận và chiết bằng MeOH

Ly tâm phá vỡ tế bào bằng siêu âm, sau đó ly tâm lấy dịch

Để thu đủ hoạt chất tinh khiết phục vụ cho việc phân tích cấu trúc, dịch chiết của 80 bình lên men được gộp lại để cất quay và cô đặc Dịch cô đặc được tinh chế bằng cột C18Ec, chất hấp phụ được hoạt hóa bằng MeOH và được rửa bằng nước

Sau đó được phản hấp phụ bằng hệ dung môi MeOH: nước {8:2} Các phân đoạn chứa kháng sinh được phát hiện bằng hai phương pháp: Phương pháp vi sinh vật và phương pháp sắc ký lóp mỏng với hệ dung môi EtOAc : MeOH : H20 {7:2:1}

Hai chất bafilomycin B| và Cịđược tách riêng và phân tích bằng phương pháp HPLC Kết quả phân tích cho thấy bafilomycin là một kháng sinh thuộc nhóm macrolid

2.5.2 Kháng sinh adrỉamycỉn, 14 - hydroxyl daunomycin chống ung thư

từ chủng Str peucetius var caesius

Daunomycin là một kháng sinh thuộc nhóm anthracylin được chiết từ

môi trường nuôi cấy Streptomyces peucetius Cấu trúc của daunomycin là một

một a- glucosid của daunomicinon (có 4 vòng là dẫn chất có màu của anthraquinon) Daunomycin được chỉ định trong bệnh bạch cầu cấp tính, đặc

biệt là ở trẻ em Chủng sinh tổng hợp daunomycin là Str.peucetius var.caesius

có đặc điểm: Khuẩn ty khí sinh phát triển yếu, có màu trắng hoặc đỏ, khuẩn ty

cơ chất có màu vàng chanh, vàng da cam hoặc nâu đỏ, khi nuôi cấy trên môi trường hữu cơ hình thành sắc tố màu đỏ sáng Khi đột biến bằng tác nhân N-

nitroso-Nmetylurethan tạo ra được biến chủng caesius có khuẩn ty khí sinh

phát triển mạnh, màu xanh xám, khuẩn ty cơ chất màu đỏ sẫm, sắc tố hoà tan

từ màu vàng đến cam hay tím Biến chủng này có khả năng sinh tổng hợp một hợp chất mới có cấu trúc gần giống daunomycin đó là adriamycin

Adriamycin là một kháng sinh nội bào quá trình chiết tách bao gồm chiết bằng dung môi, sắc ký cột, cellulose và kết tinh dưới dạng Hydroclorid Adriamycin hydroclorid tan trong nước, ethanol không tan trong các dung môi

hữu cơ không phân cực, dung dịch adriamycin có màu da cam à pH acid, da cam đỏ ở pH trung tính, tím xanh ở pH > 9 Khi thuỷ phân adriamycin bằng

acid yếu thì thu được aglycon là adriamycinon là một đường amin Những nghiên cứu hoá trị liệu cho thấy adriamycinon kìm hãm sự phát triển của ung

thư biểu mô, có khả năng ức chê mạnh sacom và ung thư tuỷ ác tính oberling- gluerin-gluerin Chỉ số điều trị adriamycin có nhiều triển vọng hơn cả daunomycin.

PHẦN III

THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

3.1 Nguyên liệu và trang thiết bị

3.1.1 Chủng gốc vi sinh vật và nguyên liệu

* Giống xạ khuẩn gốc: Streptomyces 9.25 do phòng thí nghiệm vi sinh

kháng sinh bộ môn Công Nghiệp Dược trường ĐH Dược Hà Nội cung cấp

* Chủng vi sinh vật kiểm định:

- Escherichia coli (EC) A TCC25922

- Proteus mirabilis (pro) B V 108

- Pseudomonas aeruginosa (pseu) VM201

- Shigella ũexneri (shi) D TI 12

- Salmonella typhi (Typhi) DT220

30 phút

13

Môi trường 3 (MT 3): Lactose 30,Og; NH4NO3 2,0g; cao ngô

5,0g; K2HP04 l,0g; MgS04.7H20 0,2 g; Na2S04 0,5g; thạchl8,0g, nước cất vừa đủ 1000ml, pH: 6 , 8 - 7,2 tiệt trùng 120°c, thời gian

30 phút

Môi trường 4 (MT 4): Glucose 20g; cao ngô 5,0g; K2HP04 0,5g; MgS04.7H20 0,5g; NH4NO3 2,0g; CaC03 4,0g; thạch 18,0g, nước cất vừa đủ 1000ml; pH: 6 ,8-7,2, tiệt trùng ở 120°c, thời gian 30

phút

Môi trường 5 (MT 5): Bột ngô 20g; bột đậu tương 10,Og; NaCl lg; CaC03 2,0g; K2HP04 l,Og; CoC12.7H20 0.002g; thạchl8,0g, nước cất vừa đủ 1000ml; pH: 6 ,8-7,2 tiệt trùng ở 120°c, thời gian

30 phút

Môi trường 6 (MT 6 ): Bột đậu tương 15,0g; tinh bột khoai tây 20,Og; (NH4)2S04 2,0g, cao nấm men 5,0g; CaC03 4,0g; CoC12.7H20 0.02g, thạch 18,0g, nước cất vừa đủ 1000ml;

pH: 6 ,8-7,2 tiệt trùng ở 120°c, thời gian 30 phút.

Môi trường 7 (MT 7): Saccarose 30,Og; bột đậu tương lOg;(NH4)2S04 2,0g ; CaC03 2,0g ; NaCl l,Og; CoC12.7H20 0,002g; thạch 18,Og; nước vừa đủ 1000ml; pH 6 , 8 — 7,2 Tiệt trùng ở 120°

c, thời gian 30 phút

Môi trường lên men chìm:

Môi trường l ũ (MT 1’) : Tinh bột 20g; KNO3 1,0g; K2HP04 0,5g; MgS04.7H20 0,5 g; NaCl 0,5g; FeS04.7H20 0,0 lg; nước cất vừa

đủ 1000ml; pH: 6 ,8-7,2 tiệt trùng ở 120°c, thời gian 30 phút.

Môi trường 2D (MT 2'): Tinh bột 20g; NaN032,()g; K2HP04 1,0g; KC1 0,5g; MgS04.7H20 0,5 g; nước cất vừa đủ 1000ml; pH: 6 ,8-

7,2 tiệt trùng ở 120°c, thòi gian 30 phút.

Môi trường 3d (MT 3’): Tinh bột 20g; NaNO32,0g; MgS04.7H20 0,5 g; K2HP04 l,0g; KC1 0,5g; Cao nấm men 5,0g; nước cất vừa đủ 1000ml; pH: 6 ,8-7,2 tiệt trùng ở 120°c, thời gian 30 phút.

Môi trường Sabrouraud glucose 20,Og; pepton 10,Og; thạch 18,0g;

nước cất vừa đủ 1000ml; pH 6,0, tiệt trùng ò 0,8 atm, thời gian 30

phút

Môi trường phân loại xạ khuẩn.

ISP1: pepton 5,0g; cao nấm men3,0g; nước cất vừa đủ 1000ml;

tiệt trùng ở 120°c, thời gian 30 phút.

ISP2: Cao nấm men 4,0g; dịch chiết Malt 10,Og; glucose 4,0g; nước cất vừa đủ 1000ml; pH 7,3; thạch 20; tiệt trùng 120°c thời gian 30 phút

ISP 3: Yến mạch 20,Og; Dung dịch muối vi lượng l,Og; Thạch

18,Og; Nước cất vđ 1000ml; pH: 7,3 Tiệt trùng ở 120°c trong thời

gian 30 phút

ISP4: dung dịch I: tinh bột 10,Og; nước cất vừa đủ 500ml; dung dịch II: K2HP04 l,Og; MgS04.7H20 1,0 g; (NH4)2S04 2,0g, CaC03

2,0g; muối vi lượng 1,0 ml; nước cất vừa đủ 500ml pH: 7,0-7,4

Trộn dung dịch I, II thêm 20,0g thạch tiệt trùng ở nhiệt độ 120 °c

thời gian 30phút

ISP5: L-aspragime l,Og; glycerin 10,Og; KH2P 04 l,0g; dung dich muối vi lượng lml: thạch 20,Og; nước cất vừa đủ 1000ml; pH: 7,0

— 7,4 tiệt trùng ở 120°c, thòi gian 30 phút

ISP6 : Pepton 20,Og; sắt amonicitrat 0,5g; K2HP04 l,Og; Na2S203

0,08g; thạch 18,0g; Cao nấm men l,0g; nước cất vừa đủ 1000ml,

pH:7,0-7,2 tiệt trùng ở 120°c, thời gian 30phút.

ISP7: glycerin 15,0g; L-tyrosin 0,5g; L-aspargin l,Og; ; K2HP04

0,08g; MgS04.7H20; NaCl 0,5g; FeS04.7H20 0,01g; Muối vi lượng 0,lml; thạch 20g; nước cất vừa đủ 1000ml; pH:7,0-7,2 tiệt trùng ở 1 2 0°c, thời gian 30phút

ISP9: (NH4)S04 2,64g; KH2P 04 2,38g; K2HP04 5,65g;MgS04.7H20 l,Og; Môi trường MTB l,Oml; nước cất vừa đủ

1000ml; pH: 7,0-7,2; tiệt trùng ở 120°c, thời gian 30phút.

Trong đó môi trường B: CuS04.5H20 0,064g; FeS04.7H20 0,1 lg; MgCl2.4H20 0,079g; ZnS04 7H20 0,lg; nước cất vừa đủlOOml

* Dung dịch muối vi lượng: FeS04.7H20 0,lg; MgCl2.4H20 0,lg ZnS04 7H20 0,115g; Nước cất vừa đủ 10ml

* Các nguồn đường gồm các dung dịch đường 10% của các đường sau:

+ D — xylose + Rhamnose + Arabinose

+ D — manitol + Raffinose + Inositol

+ D — fructose + Saccarose + glucose

Các dung dịch này được khử trùng bằng phương pháp tyndal

3.1.2 Các trang thiết bị.

- Tủ sinh học - Cân phân tích

- Đèn tử ngoại - Cân kỹ thuật

- Máy li tâm - pH mét

- Tủ ấm - Nồi hấp áp lực

16

- Máy lắc - Kính hiển vi điện tử.

3.1.3 Các dung môi hoá chất được sử dụng

3.2.1 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuyếch tán

* Nguyên tắc: Mẫu thử được đặt lên lófp thạch dinh dưỡng đã cấy vi sinh

vật kiểm định Kháng sinh từ mẫu thử khuy ếch tán vào môi trường thạch sẽ ức chế sự phát triển của các vi sinh vật tạo thành vòng vô khuẩn Đo đường kính vòng vô khuẩn Hoạt tính kháng sinh tỷ lệ vói đường kính vòng vô khuẩn

* Tiến hành:

Chuẩn bị môi trường kiểm định: vi sinh vật kiểm định trước khi thử được cấy vào môi trường canh thang trước 18 — 24 h đối với vi khuẩn (ủ ở 37°C) và

môi trường Sabouraud lỏng trước 18 — 24 h ( đối với vi nấm ở 30°C), tạo

thành nhũ dịch vi sinh vật kiểm định có nồng độ 1 07- 1 0 8 tế bào trên lml, cho vào môi trường thạch thường (đã được tiệt trùng ở 118°c, thời gian 30phút) ở 45-50°C với tỷ lệ nhũ dịch: Vthạchthường= 1 :40 (vói vi khuẩn) vói môi trường Sabouraud đặc (với vi nấm) đổ ra hộp petri (20ml/hộp)

Đặt mẫu thử:

17