Nghiên cứu tác động của nồng độ nacl tới sinh trưởng mầm và hoạt độ một số emzym chống oxy hóa ở hạt mầm đậu tương (glycine max (l) merr)

LỜI CAM ĐOAN Tôi đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tác động của nồng độ NaCl tới sinh trưởng mầm và hoạt độ một số emzym chống oxy hóa ở hạt mầm đậu tương Glycine Max L.Merr ”.. Những ng

VÀ HOẠT ĐỘ MỘT SỐ EMZYM CHỐNG OXY HÓA Ở HẠT MẦM ĐẬU TƯƠNG

(GLYCINE MAX ( L).MERR)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật

HÀ NỘI, 2015

VÀ HOẠT ĐỘ MỘT SỐ EMZYM CHỐNG OXY HÓA Ở HẠT MẦM ĐẬU TƯƠNG

(GLYCINE MAX ( L).MERR)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật

Người hướng dẫn khoa học PGS TS NGUYỄN VĂN MÃ

HÀ NỘI, 2015

LỜI CẢM ƠN

Em xin bày tỏ lòng biết ơn, sự kính trọng sâu sắc tới thầy giáo PGS.TS Nguyễn Văn Mã đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành bản khóa luận này

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Khoa Sinh – KTNN và Trung tâm

Hỗ trợ Nghiên cứu Khoa học và Chuyển giao Công nghệ - Trường ĐH Sư Phạm

Hà Nội 2 đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để em thực hiện tốt đề tài này

Lần đầu làm quen với việc nghiên cứu khoa học, đề tài của em không tránh khỏi những thiếu sót Rất mong nhận được sự chỉ bảo, góp ý kiến của các thầy cô và các bạn sinh viên để đề tài của em được hoàn thiện hơn

LỜI CAM ĐOAN

Tôi đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tác động của nồng độ NaCl tới sinh trưởng mầm và hoạt độ một số emzym chống oxy hóa ở hạt mầm đậu tương

(Glycine Max ( L).Merr) ”

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Kết quả nghiên cứu của đề tài này đảm bảo tính chính xác, khách quan, trung thực, không trùng lặp với các tác giả khác

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1.1 Lý do chọn đề tài 1

1.2 Mục đích nghiên cứu 3

1.3 Nội dung nghiên cứu 3

1.4 Ý nghĩa lý luận và thực tiễn 3

NỘI DUNG 4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Sự nảy mầm và sinh trưởng của mầm đậu tương 4

1.2 Tình hình nghiên cứu sự sinh trưởng và phát triển của đậu tương ở Việt Nam và thế giới 5

1.3 Vai trò của hai enzyme catalase và peroxidase trong giai đoạn nảy mầm và sinh trưởng mầm của thực vật nói chung và ở cây đậu tương nói riêng 8

1.4 Tình hình nghiên cứu về vai trò của enzym chống oxy hóa ở thực vật nói chung và ở cây đậu tương nói riêng 9

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11

2.1 Đối tượng nghiên cứu 11

2.2 Phương pháp nghiên cứu 11

2.2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 11

2.2.2 Cách bố trí thí nghiệm 12

2.2.3 Phương pháp phân tích các chỉ tiêu nghiên cứu 13

2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu 17

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 18

3.1 Khả năng nảy mầm và sự sinh trưởng của mầm đậu tương trong môi trường mặn 18

3.1.1 Khả năng nảy mầm của hạt đậu tương 18

3.1.2 Sinh trưởng của mầm đậu tương trong môi trường mặn 19

3.2 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến hoạt độ một số enzym chống oxy hóa của mầm đậu tương 25

3.2.1 Hoạt độ enzym catalase 25

3.2.2 Hoạt độ enzym peroxidase 30

KẾT LUẬN 34

TÀI LIỆU THAM KHẢO 36

PHỤ LỤC 17

1

MỞ ĐẦU 1.1 Lý do chọn đề tài

Đậu tương hay đỗ tương, đậu nành (tên khoa học là Glycine max) là loại

cây họ Đậu, có giá trị dinh dưỡng, giá trị kinh tế khá cao, có khả năng cải tạo đất rất tốt và giữ một vị trí quan trọng trong cơ cấu cây trồng hiện nay Cây đậu tương được trồng chủ yếu lấy hạt để chế biến thức ăn cho người và gia súc Sản phẩm từ cây đậu tương được sử dụng rất đa dạng như dùng trực tiếp hạt thô trong chế biến món ăn thường ngày, làm snack, salad Đối với hạt già phơi khô, nấu chín hầm khoảng 15 phút, hạt sẽ mềm bở, không dai, bùi, ngon đậm hoặc chế biến thành đậu phụ, ép thành đậu nành, nước tương, làm bánh kẹo, sữa đậu nành, okara

Hạt đậu tương có thành phần dinh dưỡng rất phong phú gồm protein (40%), lipit (12-25%), gluxit (10-15%), có các muối khoáng Ca, Fe, Mg, P,Na,S; các vitamin A,B1, B2, E, D, F, các enzym, sáp, nhựa, xenlulozo .Đậu tương còn được xem như là một thứ dược liệu có tác dụng ức chế phân hủy protein , điều hòa ngũ tạng, phòng bệnh và chữa bệnh cho con người

Ngoài ý nghĩa về mặt dinh dưỡng, kinh tế đậu tương còn có tác dụng cao trong cải tạo đất vì hệ rễ có nốt sần chứa vi khuẩn cố định đạm Hiện nay đậu tương được gieo trồng ngày càng rộng rãi ở nước ta và trên thế giới

Trong quá trình sống, thực vật luôn chịu tác động của các nhân tố ngoại cảnh Trong số đó có những nhân tố không thuân lợi cho hoạt động sống của thực vật như: khô hạn, giá rét, đất chua, đất mặn, sâu bệnh Một trong những nhân tố bất lợi của môi trường gây ảnh hưởng lớn đến năng suất là tác động của muối Hàm lượng muối cao trong đất là một trong những nguy cơ hạn chế năng suất và phẩm chất cây trồng ở nhiều nơi trên thế giới Hiện nay có khoảng 230

2

triệu ha đất (sản suất gần 50% sản lượng lương thực trên thế giới) bị nhiễm mặn Riêng ở Việt Nam và Đông Nam Á ước tính có khoảng 54 triệu ha đất bị nhiễm mặn Phần lớn diện tích mặn chưa được sử dụng, chỉ một phần nhỏ được sử dụng nhưng cho năng suất chưa cao

Những nghiên cứu về tác động của mặn và hạn nói chung lên sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng cho thấy, cây trồng có khả năng thích ứng trong một giới hạn nhất định với tác động của các nồng độ muối Khi gặp điều kiện stress muối, thực vật sẽ có các phản ứng về mặt hình thái, sinh lý, sinh hóa

để thích nghi với điều kiện bất lợi đó của môi trường như thay đổi một số đặc điểm hình thái giải phẫu phù hợp hoặc gia tăng một số chất có khả năng bảo vệ, đặc biệt là sự hình thành và tích lũy một số enzym chống oxy hóa như: enzym catalase và enzym peroxidase

Vấn đề nghiên cứu khả năng chống oxy hóa ở cây trồng đến nay còn ít, nhất là ở giai đoạn sinh trưởng đầu tiên của mầm Vì thế để nâng cao năng suất

và chất lương đậu tương cùng với công tác tạo giống thì việc lựa chọn những giống thích hợp với từng vùng sinh thái khác nhau nhất là vùng đất mặn là việc làm có ý nghĩa thực tiễn rất lớn

Ở Việt Nam có khí hậu nhiệt đới, gió mùa nóng ẩm thích hợp cho việc trồng đậu tương Tuy nhiên, đậu tương lại khá nhạy cảm với các điều kiện bất lợi của môi trường đặc biệt là giai đoạn nảy mầm, việc stress muối sẽ ảnh hưởng lớn tới năng suất đậu tương

Xuất phát từ những lý do trên nêu trên, trong điều kiện thời gian cho phép,

chúng tôi đã tiến hành đề tài: “ Nghiên cứu tác động của nồng độ NaCl tới sinh trưởng mầm và hoạt độ một số emzym chống oxy hóa ở mầm đậu

tương (Glycine Max ( L).Merr) ”

3

1.2 Mục đích nghiên cứu

Nghiên cứu ảnh hưởng của các mức nồng độ NaCl tới hoạt động của một

số enzym chống oxy hóa ở mầm của giống đậu tương ĐT22

1.3 Nội dung nghiên cứu

- Xác định về tỷ lệ nảy mầm, sinh trưởng mầm của hạt trong các mức

nồng độ dung dịch muối

- Xác định về ảnh hưởng của NaCl tới hoạt động của các enzym oxy hóa: catalase, peroxidase ở các nồng độ dung dich NaCl : 0.3%, 0.6%, 0.9%, 1.2%, 1.5%, 1.8%

1.4 Ý nghĩa lý luận và thực tiễn

- Nghiên cứu góp phần bổ sung vào nguồn tài liệu về tính chống chịu của đậu tương, đặc biệt là giống đậu tương ĐT 22 dưới tác động của điều kiện môi trường mặn

- Sử dụng chỉ thị về sự biến đổi enzym catalase và enzym peroxidase trong điều kiện mặn để đánh giá khả năng chịu mặn của thực vật

4

NỘI DUNG CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sự nảy mầm và sinh trưởng của mầm đậu tương

Sự sinh trưởng phát triển của đậu tương được chia làm các giai đoạn sau: Nảy mầm, cây con, ra hoa, hình thành quả, quả chín

Sau khi trồng hạt đậu tương ngấm nước rất nhanh trừ một vài giống đặc biệt là loại hoang dại khả năng ngấm nước chậm hơn Trong điều kiện thuận lợi,

rễ xuất hiện sau khi trồng 1-2 ngày Rễ này gọi là rễ chính nó phát triển nhanh xuống phía dưới, đến ngày thứ 3 - 4 rễ phụ bắt dầu xuất hiện Sau 4 - 5 ngày lá mầm xuất hiện và đẩy lên khỏi mặt đất sự sinh trưởng mạnh của phần trên trụ mầm dưới lúc đầu lá mầm có màu vàng nhạt, sau có màu xanh sau cùng chuyển sang màu vàng và rụng xuống

Thực chất quá trình nảy mầm là quá trình biến đổi sinh lí, sinh hoá mạnh

mẽ diễn ra trong hạt,chuẩn bị cho sự hình thành cây non Đậu tương thuộc cây hai lá mầm nên sự nảy mầm cũng gồm các pha như sự nảy mầm ở các cây hai lá mầm đó là:

+ Pha trương hạt: tính từ khi bắt đầu nảy mầm, hạt hút nước rất mạnh làm trương hạt

+ Pha hình thành và hoạt hoá enzym: hạt có một lượng enzym nhất định nhưng chủ yếu ở dạng liên kết, khi hạt hút nước thì enzym mới được giải phóng

ở dạng tự do và bắt đầu hoạt động mạnh

+ Pha tích luỹ chất dinh dưỡng: ngay trong những phút đầu ngâm trong nước, độ hấp thụ oxy của hạt tăng lên đặc biệt là chu trình hexozomonophotphat tăng lên nhiều lần, do vây lượng ATP tích luỹ nhiều hơn

5

+ Pha động viên các chất dự trữ và xây dựng các chất hữu cơ đặc trưng cho

cơ thể ở giai đoạn nảy mầm: các chất dinh dưỡng trong hạt chủ yếu thuộc 3 nhóm chất hữu cơ là: gluxit ,protein, lipit.trong quá trình nảy mầm enzym α-amilaza tác động vào liên kết 1,4-glucozit phân giải tinh bột thành các đextrin tham gia vào quá trình hô hấp ở các dạng saccarozo tích luỹ ở các tế bào trụ phôi Protein được phân giải bởi emzym proteaza thành các axit amin và các amit Phần lớn các enzym lipaza phân giải lipit thành axit béo và glixerol Ngoài ra lipit còn được tái chuyển hoá thành gluxit cung cấp năng lượng cho hạt nảy mầm

1.2 Tình hình nghiên cứu sự sinh trưởng và phát triển của đậu tương ở Việt Nam và thế giới

Trên thế giới chia thành hai nhóm nghiên cứu chính:[28 ]

- Nghiên cứu về giống đậu tương:

Thí nghiệm quốc tế về đánh giá giống đậu tương thế giới (ISVEX) lần thứ nhất vào năm 1973 đã được tiến hành với quy mô là 90 điểm thí nghiệm được bố trí ở 33 nước đại diện cho các đới môi trường Kết quả nghiên cứu cho thấy: trong phạm vi các điểm thí nghiệm từ xích đạo đến vĩ tuyến 30o

và độ cao dưới 500m, năng suất trung bình và trọng lượng hạt giảm khi vĩ tuyến tăng Tuy vậy, chiều cao cây không đạt mức tối ưu ở tất cả các đới Mức đổ cây giảm khi vĩ tuyến tăng Mức tách quả rụng hạt đều không nặng ở tất cả các đới

Trung tâm nghiên cứu và phát triển rau màu châu Á (AVRDC) đã thiết lập hệ thống đánh giá (Soybean – Evaluation – Aset) giai đoạn 1 đã phân phát được trên 20.000 giống đến 546 nhà khoa học của 164 nước Nhiệt đới và Á Nhiệt đới Công trình đã đưa vào trong mạng lưới sản xuất được 21 giống ở trên 10 quốc gia

6

Mỹ là quốc gia đứng đầu về năng suất và chất lượng đậu tương do Mỹ đã tạo ra được nhiều giống đậu tương tốt mới Năm 1893 Mỹ đã có trên 10.00 mẫu đậu tương thu thập từ các nước khác trên toàn thế giới Mục tiêu của công tác chọn tạo giống mới của Mỹ là chọn ra những giống có khả năng thâm canh, phản ứng với quang chu kỳ, chống chịu tốt với điều kiện ngoại cảnh bất lợi, hàm lượng protein cao, dễ bảo quản và chế biến (Johnson H.W và Bernard R.L, 1976)

Trung Quốc đã tạo ra nhiều giống đậu tương mới bằng phương pháp gây đột biến Giống Tiefeng 18 được tạo ra do xử lý bằng tia gamma có khả năng chịu được phèn cao, không đổ, năng suất cao, phẩm chất tốt Giống Heinoum N06, Heinoum N016 xử lý bằng tia gamma có hệ rễ tốt, lóng ngắn, nhiều cành, chịu hạn, khả năng thích ứng rộng

Thái Lan với sự phối hợp giữa hai trung tâm là MOAC và CGPRT nhằm cải tiến tạo giống có năng suất cao, chống chịu với một số sâu bệnh hại chính đồng thời có khả năng chịu được đất mặn, chịu được hạn hán và ngày ngắn (Judy W.H và Jackobs J.A, 1979)

- Nghiên cứu về biện pháp kỹ thuật:

Theo Lawn các yếu tố khí hậu bao gồm nhiệt độ, ánh sáng và lượng mưa

là những yếu tố cơ bản ảnh hưởng đến các thời kỳ sinh trưởng và phát triển, khả năng cố định đạm và năng suất hạt đậu tương Gieo trồng đậu tương ở thời vụ không thích hợp thường làm giảm năng suất hạt đậu tương vì các nguyên nhân sau: giảm mật độ cây trồng do độ ẩm đất thấp không đảm bảo cho sự nảy mầm của hạt, rút ngắn thời kỳ sinh trưởng sinh dưỡng do điều kiện nhiệt độ cao…

Tại Queensland – Úc, Dickson và các cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của phân lân được bón đã chỉ ra rằng năng suất đậu tương tăng lên rất đáng kể khi đậu tương được bón phân lân

7

Oliver S and S.A Barler cho biết: Hoạt động cố định Nito của vi khuẩn nốt

sần được đo bằng hàm lượng Legemoglobin vào cuối thời kì ra hoa đã tăng 2,5 lần ở

600 ppmP và 800 ppmP Nhưng Canxi lại làm giảm hoạt động của vi sinh vật Khi

bón nhiều lân, tốc độ cố định Nitơ cao hơn và lượng axit glutamic tăng

Ở nước ta, do vị trí quan trọng của đậu tương trong hệ thống cây trồng nên

các nhà khoa học đã đầu tư chọn, tạo các giống đậu tương mới với mục tiêu: nâng

cao năng suất, phẩm chất và khả năng thích ứng, tính chống chịu Bên cạnh đó,

công tác nhập nội nguồn gene đậu tương cũng làm xuất hiện nhiều giống đậu

tương có năng suất cao song việc đưa các giống này gieo trồng đại trà ở nhiều

vùng sinh thái đã gặp nhiều khó khăn do điều kiện đất đai, khí hậu, tập quán Để

khắc phục dần những khó khăn đó, đã có rất nhiều nhà khoa học đi sâu nghiên cứu

các vấn đề: sinh trưởng, năng suất, bản chất sinh lý, sinh hóa của đậu tương

Trong số các công trình nghiên cứu về khả năng sinh trưởng của cây đậu tương:

Nguyễn Danh Đông, Trần Đình Long,…đã tiến hành nghiên cứu về quá trình sinh

trưởng của rễ, thân, hoa, quả là chủ yếu, một số công trình lại tìm hiểu biện pháp

kỹ thuật canh tác ảnh hưởng đến sinh trưởng của đậu tương [3], [9], [10]

Một số công trình nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh

trưởng, Nguyễn Văn Đính đã nghiên cứu về ảnh hưởng của - NAA tới khả

năng nảy mầm, năng suất của đậu tương trên giống DT84,…[2].Một số nghiên

cứu tìm hiểu ảnh hưởng của các nguyên tố khoáng và phân vi lượng: Nguyễn

Văn Mã, Điêu Thị Mai Hoa tìm hiểu ảnh hưởng của phân vi lượng tới khả năng

chịu hạn của đậu tương [7], [20], Phạm Gia Ngân nghiên cứu ảnh hưởng của

Co, Mo, B, Zn,… đến khả năng sinh trưởng, năng suất của đậu tương [12], [23] Bên cạnh đó, cũng có những nghiên cứu đề cập tới sự sinh trưởng, khả năng

quang hợp của đậu tương trên đất bạc màu [18], [19] Một số nghiên cứu lại tập

8

trung vào việc tìm hiểu khả năng chịu hạn của các giống đậu tương năng suất cao thông qua việc tìm hiểu mối quan hệ giữa tính chịu hạn và một số đặc điểm giải phẫu hình thái lá, thời gian sinh trưởng, diện tích lá, chiều cao cây, [4], [5], [16], [17] Một số khác lại đi sâu tìm hiểu các khía cạnh khác: Trần Thị Phương Liên và cộng sự nghiên cứu mối quan hệ của tính chịu hạn, chịu nóng với hàm lượng protein, lipit và thành phần axit amin trong hạt đậu tương.[11]

Hiện nay cùng với sự phát triển mạnh mẽ của khoa học kỹ thuật đã giúp các nhà khoa học chọn tạo được các giống đậu tương mới năng suất cao góp phần nâng cao hiệu quả kinh tế của cây đậu tương Các kết quả nghiên cứu của Mai Quang Vinh, Ngô Phương Thịnh tại Viện Di truyền Nông nghiệp đã tạo ra nhiều giống đậu tương mới: DT84, DT90, DT95,… có năng suất cao và tính chống chịu điều kiện bất lợi cũng tăng hơn các giống cũ [24], [25]

1.3 Vai trò của hai enzyme catalase và peroxidase trong giai đoạn nảy mầm và sinh trưởng mầm của giới thực vật nói chung và ở cây đậu tương nói riêng

Trong các yếu tố ngoại cảnh thì nước là yếu tố ngoại cảnh ảnh hưởng lớn nhất đến sinh trưởng phát triển và năng suất của đậu tương Dưới điều kiện tác động của NaCl, lượng nước cung cấp cho các quá trình sinh lí, sinh hóa giảm , gây khó khăn cho sự phát triển của hạt mầm Nồng độ muối cao dẫn tới hạn sinh

có những biến đổi để bảo vệ hạt mầm trong điều kiện mặn: khi cây bị stress nước, ở mức độ nội bào sẽ tạo ra các tác nhân gây hại như gốc superoxit, H2O2

và gốc hydroxy tự do, đây là nguyên nhân gây hư hại cho màng sinh chất, các bào quan gây ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng Và khi đó hệ thống enzym chống oxy hóa sẽ hoạt động: superoxit dismutase chuyển gốc supeoxit thành O2

và H2O2 , sau đó H2O2 được giải độc nhờ catalase và peroxidase.[14 ]

1.4 Tình hình nghiên cứu về vai trò của enzym chống oxy hóa ở thực vật nói chung và ở cây đậu tương nói riêng

Trong cơ thể thực vật, ở điều kiện bình thường, dưới sự kiểm soát chặt chẽ của các enzym chống oxy hóa superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), peroxidase (POD)…, các gốc tự do chứa oxy như: superoxit (O2-), hydrogen peroxit (H2O2), và hydroxy ( ·OH), các dạng oxy hoạt hóa (ROS-reactive oxygen species) là sản phẩm chuyển hóa của oxy, tham gia điều khiển sự sinh trưởng, phát triển của các cơ quan lá, hoa, quả… thông qua điều tiết các quá trình chuyển hóa nội bào Khi cơ thể gặp điều kiện sống bất lợi như hạn hán, mặn, lạnh, nóng, nấm bệnh…, hàm lượng các gốc này tăng đột biến, gây nên hiện tượng “stress oxy hóa”.[30]

Theo Journal of Integrative Plant Biology 2008, trong “stress oxy hóa”, các gốc tự do biểu hiện cả hai vai trò tích cực và tiêu cực Với hàm lượng cao trong tế bào, chúng tác động tiêu cực làm thay đổi tính thấm, độ dẫn điện, phân

10

giải thành phần photpholipid, dẫn đến phá hủy màng nội chất, gây chết các tế bào, tổn thương các cơ quan, bộ phận Vai trò tích cực được đánh giá trên phương diện sự bùng nổ đó lại là một dạng phản ứng phòng vệ của cơ thể thực vật đối với các yếu tố gây stress, đặc biệt là đối với bệnh nấm, bệnh vi khuẩn và

có nhiều nghiên cứu đã đánh giá vai trò này trên các loại cây trồng (Maffei và cộng sự, 2007; Ahmad và cộng sự, 2008) Trong trường hợp sâu bệnh tấn công, vai trò bảo vệ của các gốc tự do bước đầu đã được ghi nhận ở một số loài ngũ cốc (Ni và cộng sự, 2000; Ni và Quisenberry, 2003) Tuy nhiên, những nghiên cứu theo hướng này còn chưa nhiều và chưa trải rộng đến các giống cây trồng nói chung và cây đậu tương nói riêng.[ 29]

Một số thí nghiệm nghiên cứu đã cho thấy, ở đậu tương, khi bị stress mặn nhẹ, bên trong mầm có một mức độ cao của các enzym chống oxy hóa và giảm hàm lượng glutathione có thể bảo vệ chống lại các gốc tự do hay oxy hoạt tính (ROS), và do đó tránh được các sự cố của leghemoglobin, peroxy lipid và protein.[ 30]

Tuy nhiên, nếu stress mặn nghiêm trọng thì tế bào hạt mầm bị suy thoái không thể đảo ngược trong leghemoglobin và giảm hoạt động nitrogenase bất chấp sự gia tăng GR hoạt động mức độ cao của glutathione ở trạng thái khử (GSH) (Comba et al 1998)

11

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tư ng nghiên cứu

Giống ĐT22:

- Nguồn gốc: Được Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ chọn tạo từ dòng đột biến của hạt lai DT95 và ĐT12 Đã được Hội đồng Khoa học và Công nghệ ( Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn) công nhận là giống mới.[33]

- Đặc điểm: ĐT22 có hoa màu trắng, hạt vàng, rốn nâu đậm, quả chín có màu nâu, phân cành trung bình, số quả chắc trung bình đạt 25 – 45 quả trên cây,

có khoảng 16% – 20% số quả ba hạt, chiều cao cây khoảng 45cm – 75cm, khối lượng 1000 hạt 155g – 160g.[32]

Năng suất đạt 18 – 27 tạ/ha, tùy thuộc vào mùa vụ và điều kiện thâm canh, có thể trồng được cả ba vụ trong năm

ĐT22 là giống chịu được đất ướt và những bệnh mức nhẹ đến trung bình đối với một số loại bệnh hại chính, kháng được bệnh phấn trắng

Được Trung tâm Khuyến nông – Khuyến lâm tỉnh Bắc Cạn đưa vào dự án trồng khảo nghiệm bảy giống đậu tương mới và hai giống đối chứng, ĐT22 được công nhận nổi trội hơn so với các giống khác

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được tiến hành từ tháng 7/2014 đến 5/2015

Địa điểm nghiên cứu: Được tiến hành tại Trung tâm hỗ trợ Nghiên cứu khoa học và chuyển giao công nghệ và phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật trường

ĐHSP Hà Nội 2

12

2.2.2 Cách bố trí thí nghiệm

- Chọn hạt giống đều, khỏe, có phôi sáng, không sâu mọt, không nấm mốc

- Khử trùng khay đựng (kích thước phù hợp 20 x 35cm, có nắp, đảm bảo

đủ oxy), bình, tay… bằng cồn

- Giấy thấm phải được sấy ở 1300C trong vòng 1 giờ

- Hạt được khử trùng bằng dung dịch KMnO4 1% trong 5 phút ( để hạt vào túi màn, nhúng vào trong dung dịch) Sau đó rửa bằng nước cất rồi ngâm hạt vào nước từ 5 - 10 phút để hạt trương nước

- Gieo hạt trên khay với tỉ lệ 50 hạt/khay, trên các rãnh gấp nếp của giấy thấm

- Xếp hạt vào các khay với 6 nồng độ NaCl tăng dần Mỗi nồng độ có 3 khay hạt và gieo 3 khay hạt dùng làm đối chứng

Tiến trình

- Hạt được gieo trong khay với nồng độ đã được đánh dấu NaCl : 0% (đối chứng), 0.3%, 0.6%, 0.9%, 1.2%, 1.5% và 1.8%, đánh dấu khay theo thứ tự lần lượt là ĐC, M 0,3; M0,6; M0,9; M1,2; M1,5; M1,8 và hạt được tiếp xúc với nước bằng ba mặt

- Tiến hành đo hoạt độ của các enzym chống oxy hóa sau 2 giờ, 4 giờ và 6 giờ sau khi hạt được gieo (ngày 1)

- Ngày thứ 2, 3, 4, 5, 6, tiến hành đo hoạt độ của các enzym chống oxy hóa 1 lần và vào một khung giờ giống nhau Ghi lại kết quả thu được của một ngày vào bảng để theo dõi và tổng hợp

- Hàng ngày, bổ sung lượng dung dịch muối NaCl khoảng 50 ml/khay, gia giảm số lượng để đạt mức độ đủ ẩm, không úng ngập

P =  100

b

a

Trong đó:

P: Khả năng nảy mầm của hạt (%)

a: Số hạt nảy mầm

b: Tổng số hạt đem gieo

Xác định khả năng sinh trưởng của mầm

Đo chiều dài thân mầm, thân rễ vào các ngày 2, 4 và 6 và khối lượng tươi, khô vào ngày 1 và ngày 6 sau khi gieo hạt

- Sinh trưởng của thân, rễ mầm (mm): Dùng thước chia đến milimet đo chiều dài của thân, rễ mầm

- Khối lượng tươi của mầm (g): Dùng giấy thấm thấm sạch nước, sau đó cân khối lượng tươi của mầm bằng cân phân tích

- Khối lượng khô của mầm (g): Rửa sạch mầm bằng nước cất, sau đó sấy trong 4 giờ ở nhiệt độ 105oC, sau đó cân khối lượng khô bằng cân phân tích

Xác định hoạt độ enzym catalase

Xác định hoạt độ enzym catalase bằng phương pháp chuẩn độ (theo Nguyễn Quang Vinh và cộng sự)[ 14]

14

Nguyên tắc thí nghiệm:

Catalase xúc tác cho phản ứng:

2 H2O2 catalase O2 + 2 H2O

Để định lượng catalase có thể dùng dung dịch KMnO4 0,1N để xác định lượng

H2O2 trước và sau khi enzym tác dụng, từ đó tính lượng H2O2 đã bị chuyển hóa

- KMnO4 o,1N , H2SO4 10%, H2O2 0,1% trong đệm photphat 50mM (pH 7,0)

Chuẩn độ H2O2 dư thừa bằng KMnO4 0,1N cho đến khi xuất hiện màu hồng bền ( bền màu trong khoảng 30 giây)

15

Đun sôi cách thủy trong 5 phút để biến tính enzym, lấy ra để nguội

Dung dịch H2O2 0,1% (ml): 10

Giữ ở 30o

C trong 30 phút Axit H2SO4 10% (ml) : 5

Chuẩn độ H2O2 dư thừa bằng KMnO4 0,1N cho đến khi xuất hiện màu hồng bền ( bền màu trong khoảng 30 giây)

Tính hoạt độ enzym:

- Tính số mg H2O2 bị phân giải dưới tác dụng của enzym có trong a (g) mẫu:

x =

a V

V B A

2

1 7 , 1 ).

V2- Số ml dịch chiết enzym dùng cho phản ứng (= 10ml)

a - Khối lượng mẫu (g)

- Số đơn vị catalase trong 1g mẫu (số µmol H2O2 bị phân giải trong 1 phút):

C( U/g) =

30 034 , 0

X

Trong đó: 30- thời gian enzym tác dụng

0,034- 1µmol đương lượng H2O2

Xác định hoạt độ enzym peroxidase

Xác định bằng phương pháp đo máy quang phổ sử dụng Pyrogallol làm cơ chất( theo BBI Solutions, Blaenavon AP 132 Analytical procedures 1/5/2013)[28]

Peroxidase phân giải H2O2 thành H2O và O2, khi có mặt của chất cho hidro

là pyrogallol Sự oxi hóa pyrogallol thành sản phẩm có màu vàng là

16

purpurogallin có thể được đo quang phổ ở bước sóng 420nm với khoảng thời gian đặc hiệu ( sử dụng phần mềm Kinetis, đo trong 3 phút, 20 giây đọc kết quả một lần)

đó dâng nước lên 500ml

- C: 5,33% Pyrogallol: Hòa tan 1,333g Pyrogallol trong 20ml nước cất, sau đó dâng lên vạch 25ml ( Bảo quản lạnh, để trong lọ tối, pha mới mỗi ngày)

- D: Dung dịch H2O2: Pha 0.66ml H2O2 30% vào 50ml nước cất ( Để trong lọ tối, pha mới mỗi ngày)

- E: Dịch chiết enzym: Nghiền mẫu với 5ml đệm pH 6,0 ( tỷ lệ 1 phần mẫu : 5 phần đệm) Tiến hành ly tâm dịch nghiền 6000g/30 phút/ 0oC Dịch trong phía trên là dịch chiết enzym thu được

17

U/ml = X = E420nm/20s 2,5 50

U/g = a

X

Trong đó: E420nm/20s – giá trị đo được trong 20 giây

a - Khối lượng gam mẫu

2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu

- Mỗi lần 21 phép đo (3 lần lặp lại x 7 nồng độ) Các đồ thị được biểu diễn bởi giá trị trung bình và sai số trung bình của các phép đo Kết quả thí nghiệm được tổng hợp và xử lý bằng phần mềm thống kê Microsoft Excel theo các tham số: giá trị trung bình (X ), độ lệch chuẩn ( ), sai số trung bình (m), hệ số biến động (Cv), sai số của hiệu các trung bình số học (md), độ chính xác của thí nghiệm( m%), độ tin cậy của hai số trung bình (td) được tính theo các công thức:

Xi – giá trị đo được qua mỗi lần đo

n – số lần nhắc lại

- trung bình đối chứng

- trung bình thí nghiệm

m1 - sai số mẫu đối chứng

m2 – sai số mẫu thí nghiệm