PHẢN ỨNG HUYẾT THANH ứng dụng miễn dịch chẩn đoán vi sinh và bệnh nhiễm

Loại kháng nguyên– Kháng nguyên hòa tan = kết tủa • Không kết cụm nếu không có kháng thể kết hợp – Kháng nguyên hữu hình = ngưng kết • Kết cụm nếu không có kháng thể kết hợp... Đọc kết q

PHẢN ỨNG HUYẾT THANH

ứng dụng miễn dịch chẩn đoán vi sinh và

bệnh nhiễm

Võ Thị Chi Mai

Đáp ứng miễn dịch

Cơ quan miễn dịch

Chẩn đoán huyết thanh học

• Nhận biết kháng nguyên hoặc kháng thể

• Lượng giá kháng nguyên hoặc kháng thể

Loại kháng nguyên

– Kháng nguyên hòa tan = kết tủa

• Không kết cụm nếu không có kháng thể kết hợp

– Kháng nguyên hữu hình = ngưng kết

• Kết cụm nếu không có kháng thể kết hợp

• Đặc hiệu cho từng epitope

• Ít nhạy cảm hơn KT đa dòng

– Ít nhạy Không định lượng

– Tốn thời gian (24-48 giờ)

– Cần nhiều huyết thanh (0,5 mL/test)

– Có thể khó đọc kết quả

Kết tủa trên thạch

Control antibody Test Antibody

Antigen Control antibody Test Antibody

Phản ứng kết tủa

Đường cong kết tủa

Đường kết tủa xuất hiện khi tỉ lệ KN-KT tối ưu

- IgM ngưng kết hiệu quả hơn IgG

- IgM ngưng kết hiệu quả hơn IgG

• Sử dụng:

– Test sàng lọc

– Định nhóm máu

Ngưng kết trực tiếp

Ngưng kết gián tiếp

Đọc kết quả

• Hiệu giá: Số nghịch đảo của nồng độ huyết thanh pha loãng cao nhất cho phản ứng dương tính Hiệu giá là 100, không phải là 1/100.

– Hiệu giá KT trong huyết thanh tùy thuộc loại test thực hiện

• Do độ nhạy các loại test khác nhau.

• Ví dụ: mẫu huyết thanh kháng Bartonella henselae có hiệu

giá ngưng kết 20; hiệu giá miễn dịch huỳnh quang gián tiếp 128; hiệu giá western blot 400; hiệu giá ELISA 4.000.

Dilution of serum

Positive control

Patient 1 Patient 2 Patient 3 Negative Control

Phản ứng trung hòa

Trung hòa độc tố

Ngăn ngưng kết hồng cầu: trung hòa virus

Miễn dịch huỳnh quang (IFA)

• Ưu điểm

– Độ nhạy cao– Có thể định lượng– Kỹ thuật có thể phát triển

• Nhược điểm

– Thiết bị đắt

Detection: shines on dyeUV light

dye becomes excited -electron shift

light emitted from dye

at a different wavelength – Thiết bị đắt

Ví dụ: microscope >$15,000;

fluorometers >$25,000; flow cytometers >$100,000

• Mục đích

– Phát hiện mầm bệnh– Định danh mầm bệnh– Định lượng / loại tế bào

Thử nghiệm trực tiếp tìm KN

• Ví dụ: test tìm KN virus bệnh dại

– Dùng KT đánh dấu huỳnh quangphát hiện KN trong mô ký chủ

Phản ứng gián tiếp tìm KT

• Ví dụ: test huỳnh quang gián tiếp

tìm KT chống Toxoplasma gondii

– Dùng kháng kháng thể đánh dấu

• Ưu điểm

– Nhạy, định lượng– Có thể đọc kết quả bằng mắt– An toàn

Colorless substrate added

Colored

Phản ứng miễn dịch gắn men (ELISA)

• Nhược điểm

– Cần có quang phổ kế địnhlượng

• Thường được sử dụng hiện nay

Colored product produced

Test ELISA trực tiếp tìm KN

Test sandwich

• Phản ứng 2 KT

– KT đầu tiên gắn trên pha rắn, để bắt lấy KN

– KT thứ nhì được gắn enzyme, phát hiện KN

• Kháng nguyên phải có ít nhất 2 epitope khác nhau

• Có thể dùng để phát hiện KT hoặc KN

Test Western blot

• Phân tích protein theo kích

shows many proteins

in antigen

Western Blot

shows proteins recognized

Test Western blot

Mẫu huyết thanh

• Huyết thanh đơn

– Dương tính hoặc âm tính

• Hiệu giá

– Pha loãng mẫu

– KT phản ứng chéo bị pha loãng

• Huyết thanh kép

– Lấy 2 lần, cách nhau ≥ 1 tuần

– Kết quả

• Hiệu giá tăng nhiều hơn 2 lần = mới nhiễm gần đây

• Hiệu giá giảm / không tăng = nhiễm đã lâu – Cần thiết, để phân biệt nhiễm trùng mới mắc / do vaccine

Quá nhiều test xét nghiệm?

• Mỗi KN không thể đáp ứng cho mỗi test

– Phản ứng không đặc hiệu cần loại test ít nhạy hơn

• Các test khác nhau có độ nhạy khác nhau

– RIA > EIA và IFA > ngưng kết > kết tủa

• Khác biệt về chi phí

– Test sàng lọc (screening assay): ít tốn kém

– Test xác định: đắt hơn

Quá nhiều test xét nghiệm?

• Khó khăn kỹ thuật

– Một số chỉ có thể thực hiện ở lab tham chiếu hay phải có

đủ thiết bị

• Không phải tất cả test đều phát hiện tất cả isotype

– Chỉ IgG và IgM gắn được bổ thể

– IgM cho ngưng kết và kết tủa tốt hơn IgG

– Có thể điều chế antiglobulin đặc hiệu cho từng lớp KT

• Vấn đề độ nhạy và độ đặc hiệu

– Số phản ứng dương giả / âm giả phải chấp nhận được

Giá trị test huyết thanh: Độ nhạy – Độ đặc hiệu

Giá trị test huyết thanh

Độ nhạy = tỉ lệ dương thực = d/(c+d)

Độ đặc hiệu = tỉ lệ âm thực = a/(a+b)

Giá trị tiên đoán dương tính:

tỉ lệ có bệnh/số kết quả dương tính

Giá trị tiên đoán âm tính:

tỉ lệ không có bệnh/số kết quả âm tính