Nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith gây bệnh héo xanh hại lạc và xác định các dòng, giống kháng bệnh ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam

1.6.3 Loài phức 19 1.7.1 Phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc bằng giống kháng bệnh 20 1.7.2 Phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc bằng các biện pháp khác 22 1.8 Sử dụng chỉ t

-  -

NGỌ VĂN NGÔN

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN VI KHUẨN

RALSTONIA SOLANACEARUM SMITH GÂY BỆNH HÉO

XANH LẠC VÀ XÁC ĐỊNH CÁC DÒNG, GIỐNG KHÁNG

BỆNH Ở MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

HÀ NỘI, NĂM 2015

-  -

NGỌ VĂN NGÔN

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN VI KHUẨN

RALSTONIA SOLANACEARUM SMITH GÂY BỆNH HÉO

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học do tôi thực hiện Công trình được thực hiện trong thời gian từ năm 2012-2014

Các số liệu và kết quả nghiên cứu trình bày trong luận án là trung thực, chưa từng bảo vệ ở bất kỳ học vị nào

Luận án có sử dụng kết quả của đề tài khoa học “Nghiên cứu chọn tạo giống lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn bằng kỹ thuật chỉ thị ADN” do PGS.TS Nguyễn Văn Viết - Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam làm chủ nhiệm đề tài phối hợp với Viện Bảo vệ thực vật; Viện Công nghệ sinh học; Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ - Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm Phần kết quả nghiên cứu này đã được những người cùng tham gia thực hiện cho phép công bố trong luận án

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2015

Tác giả luận án

Ngọ Văn Ngôn

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới Ban Giám đốc, Ban Đào tạo sau đại học, các quý thầy, cô giáo của Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam đã hướng dẫn, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu

và thực hiện luận án

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới PGS.TS Nguyễn Văn Viết và TS Hà Viết Cường, những người thầy tâm huyết đã tận tình hướng dẫn, động viên khích lệ, dành nhiều thời gian trao đổi và định hướng khoa học cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án

Tôi xin trân trọng cảm ơn Lãnh đạo Viện Bảo vệ thực vật; Viện Công nghệ sinh học; Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ - Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm; Trung tâm Nghiên cứu Bệnh cây nhiệt đới - Học viện Nông nghiệp Việt Nam, các địa phương tác giả thu thập số liệu, quý thầy cô, cán bộ nghiên cứu, các phòng, bộ môn của đơn vị đã có nhiều ý kiến đóng góp và tạo điều kiện giúp đỡ quý báu cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn các nhà khoa học, tác giả các công trình công bố

đã trích dẫn trong luận án vì đã cung cấp nguồn tư liệu quý báu, những kiến thức liên quan trong quá trình tác giả nghiên cứu hoàn thiện luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo UBND Thành phố Hà Nội, Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn Hà Nội; Chi cục Phát triển nông thôn Hà Nội đã tạo điều kiện giúp đỡ về thời gian và tài chính để tác giả hoàn thành luận án này

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể bạn bè, đồng nghiệp đã luôn động viên tinh thần cho tôi trong suốt thời gian học tập và hoàn thành luận án

Cuối cùng, với tình yêu từ đáy lòng, tác giả xin gửi lời cảm ơn tới bố, mẹ,

vợ, con cùng các anh, chị, em của tác giả, những người thân yêu trong gia đình đã luôn ở bên cạnh, động viên về vật chất và tinh thần để tác giả vững tâm hoàn thành luận án của mình

Xin chân thành cảm ơn

Tác giả luận án

Ngọ Văn Ngôn

1.2 Phân bố, tác hại của bệnh héo xanh vi khuẩn gây ra đối với sản xuất lạc 8

1.4 Phân loại và phổ ký chủ của vi khuẩn gây bệnh héo xanh hại lạc 11 1.5 Đặc điểm hình thái, sinh hóa, sinh thái của vi khuẩn R solanacearum 12

1.5.3 Phương thức tồn tại, xâm nhập và lan truyền của vi khuẩn R solanacearum 14 1.5.4 Ảnh hưởng của điều kiện ngoại cảnh đến sự phát sinh, phát triển của

1.5.5 Chuẩn đoán bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc và phân lập vi khuẩn gây bệnh 16

1.6.3 Loài phức 19

1.7.1 Phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc bằng giống kháng bệnh 20 1.7.2 Phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc bằng các biện pháp khác 22 1.8 Sử dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu bệnh héo xanh hại lạc và

1.8.1 Chỉ thị phân tử trong nghiên cứu ký sinh gây bệnh và chọn giống

1.8.2 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu vi khuẩn gây bệnh héo

2.4.1 Môi trường, hóa chất sử dụng trong phân lập vi khuẩn, phản ứng sinh hóa 39

2.5.3 Phương pháp thử phản ứng siêu nhạy của nguồn vi khuẩn gây bệnh

2.5.5 Phương pháp thí nghiệm một số yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển

của vi khuẩn R solanacearum thuộc các biovar khác nhau gây bệnh

2.5.7 Phương pháp lây nhiễm bệnh nhân tạo đánh giá khả năng chống chịu

2.5.8 Phương pháp thí nghiệm đồng ruộng đánh giá tập đoàn và so sánh giống 49

3.1 Điều tra, thu thập và phân lập vi khuẩn héo xanh hại lạc ở một số tỉnh

3.1.1 Tình hình bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc ở một số tỉnh trồng lạc miền

3.1.3 Phân lập vi khuẩn héo xanh hại lạc ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc

3.1.4 Thử phản ứng siêu nhạy của nguồn vi khuẩn gây bệnh héo xanh hại lạc 58 3.2 Nghiên cứu biovar và đa dạng di truyền vi khuẩn R solanacearum gây

3.2.1 Xác định biovar, nòi một số isolate vi khuẩn R solanacearum 60 3.2.2 Ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự phát triển khuẩn lạc của một số

isolate vi khuẩn R solanacearum gây bệnh héo xanh hại lạc thuộc các

3.2.3 Nghiên cứu đa dạng di truyền một số isolate vi khuẩn R

solanacearum bằng phân tích ADN 67 3.2.4 Sự phân bố các biovar và đa dạng di truyền của một số isolate vi khuẩn

R solanacearum hại lạc ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam 72 3.3 Đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn của tập đoàn

mẫu giống lạc, dòng lai và dòng triển vọng bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo và chọn lọc dòng, giống kháng bệnh HXVK bằng chỉ thị phân tử 78 3.3.1 Đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn của tập đoàn

mẫu giống lạc bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo và chọn lọc mẫu giống

3.3.2 Đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn của các dòng

lạc từ các tổ hợp lai đơn bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo và chọn lọc

3.3.3 Đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn của các dòng

lạc từ một số tổ hợp lai hồi quy bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo và chọn

3.3.4 Đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn của các dòng

lạc ƣu tú bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo và chọn lọc dòng có khả năng

3.3.5 Đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn của các dòng

lạc triển vọng bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo và chọn lọc dòng kháng

Danh mục các công trình khoa học đã công bố liên quan đến luận án 130

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ

12 ICRISAT International Crops Research Institute for the Semi-Arid

Tropics (Viện Nghiên cứu Cây trồng cho vùng nhiệt đới bán khô hạn Quốc tế)

16 R solanacearum Ralstonia solanacearum

đƣợc nhân bội ngẫu nhiên)

chiều dài của đoạn cắt giới hạn)

2.1 Trình tự các chỉ thị phân tử SSR liên kết với tính trạng kháng bệnh

2.2 Trình tự các nucleotide của 10 mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu 39

3.1 Tình hình bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc tại một số tỉnh miền Bắc

3.2 Đặc điểm hình dạng, màu sắc khuẩn lạc một số isolate vi khuẩn

R solanacearum trên môi trường nhân tạo sau nuôi cấy 72 giờ 56 3.3 Kết quả kiểm tra phản ứng siêu nhạy của một số isolate vi khuẩn

R solanacearum hại lạc trên cây thuốc lá Nicotiana tabacum 58 3.4 Kết quả xác định biovar của 61 isolate vi khuẩn R solanacearum gây

bệnh héo xanh hại lạc (Viện Bảo vệ thực vật, năm 2012-2013) 60 3.5 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sự phát triển khuẩn lạc

của một số isolate vi khuẩn R solanacearum hại lạc (Viện Bảo vệ

3.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển khuẩn lạc của một số isolate

vi khuẩn R solanacearum hại lạc trên môi trường SPA (Viện Bảo vệ

3.7 Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của khuẩn lạc

một số isolate vi khuẩn R solanacearum hại lạc trên môi trường SPA

3.8 Mức độ đa hình của 10 mồi RAPD ngẫu nhiên khi phân tích với các

isolate vi khuẩn R solanacearum (Viện Công nghệ Sinh học, năm 2012) 68 3.9 Phân bố biovar vi khuẩn R solanacearum hại lạc ở một số tỉnh trồng

3.10 Phân bố của các nhóm vi khuẩn R solanacearum hại lạc ở một số tỉnh

3.11 Biovar và nhóm đa dạng di truyền của các mẫu bệnh ở một số tỉnh

3.12 Đánh giá khả năng kháng bệnh HXVK của tập đoàn mẫu giống lạc

3.13 Chỉ thị phân tử liên kết với tính kháng bệnh HXVK tập đoàn mẫu

3.14 Một số yếu tố cấu thành năng suất và năng suất thực thu của tập đoàn

mẫu giống lạc (Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ, năm

3.15 Khả năng kháng bệnh HXVK và năng suất thực của thu một số mẫu

3.16 Đánh khả năng kháng bệnh HXVK bằng lây bệnh nhân tạo của các

3.17 Chỉ thị phân tử liên kết với tính kháng bệnh héo xanh vi khuẩn của các

dòng lạc từ các tổ hợp lai đơn (Viện Công nghệ Sinh học, năm 2014) 95 3.18 Một số yếu tố cấu thành năng suất và năng suất thực thu của các dòng

lạc từ các tổ hợp lai đơn (Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ,

3.19 Khả năng kháng bệnh HXVK và năng suất thực thu của các dòng lạc

3.20 Đánh giá khả năng kháng bệnh HXVK bằng lây bệnh nhân tạo của các

dòng lạc từ một số tổ hợp lai hồi quy (Thanh Trì, năm 2013-2014) 102 3.21 Chỉ thị phân tử liên kết với tính kháng bệnh HXVK của các dòng lạc

từ một số tổ hợp lai hồi quy (Viện Công nghệ Sinh học, năm 2014) 104

3.22 Một số yếu tố cấu thành năng suất và năng suất thực thu của các dòng

3.23 Khả năng kháng bệnh HXVK và năng suất thực thu của các dòng lạc

3.24 Đánh giá khả năng kháng bệnh HXVK bằng lây bệnh nhân tạo của các

3.25 Chỉ thị phân tử liên kết với tính kháng bệnh HXVK của các dòng lạc

3.26 Một số yếu tố cấu thành năng suất và năng suất thực thu của các dòng

lạc ƣu tú (Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ, năm 2014) 113 3.27 Khả năng kháng bệnh HXVK và năng suất thực thu của các dòng lạc

3.28 Đánh giá khả năng chống chịu bệnh HXVK bằng lây bệnh nhân tạo

3.29 Chỉ thị phân tử liên kết với tính kháng bệnh HXVK của các dòng lạc

3.31 Mức độ nhiễm một số bệnh hại chính của các dòng lạc triển vọng

3.32 Một số yếu tố cấu thành năng suất và năng suất thực thu của các dòng

lạc triển vọng (Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ, năm

3.33 Khả năng kháng bệnh HXVK và năng suất thực thu của các dòng lạc

3.34 Tình hình bệnh hại chính và khả năng chịu hạn của các giống lạc khảo

nghiệm (Trung tâm Khảo kiểm nghiệm giống, sản phẩm cây trồng

3.35 Năng suất của các giống lạc khảo nghiệm (Trung tâm Khảo kiểm

DANH MỤC CÁC HÌNH

3.1 Triệu chứng bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc trên đồng ruộng năm 2012 55 3.2 Hình thái vi khuẩn R solanacearum gây bệnh héo xanh trên (A)- môi

trường TZC; (B) - môi trường SPA; (C) và (D)- bảo quản nguồn vi khuẩn 57

3.4 Xác định biovar các isolate vi khuẩn R solanacearum gây bệnh héo

3.5 Kết quả tách chiết ADN một số isolate vi khuẩn R solanacearum 67 3.6 Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 56 isolate vi khuẩn R

3.7 Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 56 isolate vi khuẩn R

3.8 Quan hệ di truyền giữa các isolate vi khuẩn héo xanh hại lạc ở một số tỉnh

trồng lạc miền Bắc Việt Nam (Viện Công nghệ Sinh học, năm 2012) 70 3.9 Đánh giá khả năng chống chịu bệnh HXVK tập đoàn mẫu giống lạc bằng

lây nhân tạo (năm 2013) (A: sau lây 30 ngày; B: sau lây 45 ngày) 81 3.10 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR chỉ thị pPGPseq3F5

3.11 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR Chỉ thị GA161 với 25

3.12 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR chỉ thị 7G2 với 25

3.13 Thí nghiệm tập đoàn mẫu giống lạc (Trung tâm Nghiên cứu và Phát

3.14 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR chỉ thị pPGPseq3F5

3.15 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR chỉ thị GA161 với 16

3.16 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR chỉ thị 7G2 với 16

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Lạc (Arachis hypogaea L.) là cây công nghiệp ngắn ngày thuộc họ đậu, có

nguồn gốc ở Nam Mỹ và được trồng ở trên 100 quốc gia thuộc cả 6 châu lục Lạc là cây trồng có giá trị dinh dưỡng và giá trị kinh tế cao, là cây công nghiệp đứng thứ 2 trong các cây lấy dầu thực vật Sản phẩm chế biến từ lạc rất đa dạng, trong đó chủ yếu từ hạt Hạt lạc là nguồn nguyên liệu quan trọng cho công nghiệp chế biến và khô dầu Bên cạnh giá trị dinh dưỡng, giá trị kinh tế, cây lạc còn có thể trồng xen, trồng gối với những cây trồng khác góp phần cải tạo đất, chuyển dịch cơ cấu cây trồng nông nghiệp tăng thêm nguồn thu nhập cho người sản xuất

Ở Việt Nam, lạc đang là một trong số các mặt hàng nông sản xuất khẩu quan trọng Ngoài ra, lạc còn là cây trồng có khả năng thích ứng rộng, không đòi hỏi đầu

tư phân bón cao do bộ rễ có khả năng cố định đạm, tạo ra lượng đạm sinh học cung cấp cho cây và làm tăng độ phì cho đất Hiện nay, lạc là cây họ đậu chính tham gia vào các công thức luân canh, xen canh mang tính bền vững và thân thiện với môi trường Trong hơn 100 quốc gia trồng lạc trên thế giới, Việt Nam đứng thứ 10 về diện tích và trong 25 nước trồng lạc ở châu Á, Việt Nam đứng thứ 5 về diện tích gieo trồng sau Ấn Độ, Trung Quốc, Myanma và Indonesia (FAO, 2013)

Tại Việt Nam, mặc dù có nhiều lợi thế về điều kiện tự nhiên nhưng năng suất

và sản lượng lạc tăng chưa tương xứng với tiềm năng Nguyên nhân chủ yếu là hầu hết các địa phương trồng lạc, đặc biệt là vùng đất trồng lạc nhờ nước trời như đất đồi gò, đất bãi ven sông thường bị bệnh gây hại, trong đó bệnh héo xanh do vi

khuẩn Ralstonia solanacearum gây ra là đối tượng gây hại nặng trên cây lạc

Trên thế giới, bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc phân bố ở hầu hết các vùng trồng lạc như Ấn Độ, Đài Loan, Indonesia, Malaysia, Mỹ, Nhật Bản, Papua New Guinea, Philippines, Thái Lan, Sri Lanka, Trung Quốc, Uganda, Việt Nam,…

(He, 1986; Hayward, 1990; Mehan et al., 1994; Lam và Hamidah, 1995) Bệnh

HXVK gây hại nghiêm trọng trên cây lạc với tỷ lệ cây nhiễm bệnh trung bình từ 5%

đến 20% (Mehan et al., 1986), thậm chí có những cánh đồng bị nhiễm nặng có thể tới 100% (Tan et al., 1994)

Ở Việt Nam, bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc được coi là bệnh hại phổ biến

ở nhiều tỉnh trồng lạc trong cả nước như: Bắc Giang, Bắc Ninh, Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Long An, Tây Ninh, (Mehan và cs., 1991; Nguyễn Xuân Hồng và cs., 1997; Lê Lương Tề, 1997a) Bệnh gây hại nghiêm trọng ở một

số vùng trọng điểm ở tỉnh Nghệ An và Thanh Hóa với tỷ lệ bệnh dao động trong khoảng 15% đến 35% và ở vùng trồng lạc của tỉnh Long An và Tây Ninh là từ 20% đến 30%

Năm 1896 nhà bác học Smith là người đã phát hiện vi khuẩn R solanacearum

gây ra bệnh héo xanh (Hayward, 1990) Bệnh HXVK gây hại nặng ở vùng nhiệt đới, á nhiệt đới và các vùng có nhiệt độ ấm áp Phạm vi ký chủ của bệnh rộng, gây hại trên 400 loài cây trồng thuộc 80 họ thực vật khác nhau Vi khuẩn có thể tồn tại lâu trong hạt giống, trong đất và cỏ dại, chính vì vậy việc phòng chống bệnh gặp nhiều khó khăn

Đã có nhiều công trình nghiên cứu về phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn

hại lạc ở trong nước và trên thế giới như biện pháp luân canh, sinh học, hóa học,

bằng giống kháng bệnh Tuy nhiên sử dụng giống lạc kháng bệnh là biện pháp chủ động và có hiệu quả trong phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn (Liao, 2005a)

Trong thời gian qua, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam, Viện Bảo vệ thực vật đã chọn tạo thành công một số giống lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn như giống MD7 và giống TK10 phát triển ở một số vùng thường bị bệnh gây hại góp phần hạn chế tác hại của bệnh Tuy nhiên, các giống này sản xuất liên tục trong thời gian dài nên bị thoái hóa, năng suất và khả năng kháng bệnh giảm dần

Công tác chọn tạo giống lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn ở nước ta đã đạt được những kết quả đáng khích lệ, tuy nhiên chủ yếu theo phương pháp truyền thống nên hiệu quả tích lũy các gen kháng bệnh vào con lai còn khó khăn và mất thời gian dài Đến nay ở nước ta chưa có nghiên cứu nào về sử dụng chỉ thị phân tử

để chọn giống lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn được công bố Các nghiên cứu mới chỉ khảo sát đánh giá mức độ kháng bệnh héo xanh vi khuẩn của mẫu giống lạc bằng quan sát, đánh giá bệnh trong điều kiện nhân tạo và đánh giá ở các khu vực có nguồn bệnh trong điều kiện sản xuất

Để rút ngắn thời gian trong việc chọn tạo giống lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn, ứng dụng chỉ thị phân tử là con đường ngắn và hiệu quả, không những góp phần hạn chế tác hại của bệnh mà còn hạn chế sử dụng thuốc bảo vệ thực vật trong phòng chống bệnh, bảo vệ môi trường và tạo sự đa dạng sinh học đối với cây lạc (Liao

et al., 2005b; Peng et al., 2011; Ding et al., 2012) Trong chọn tạo giống lạc kháng

bệnh héo xanh vi khuẩn bằng chỉ thị phân tử, cần xác định biovar, nòi và đánh giá đa dạng di truyền của vi khuẩn gây bệnh héo xanh hại lạc đồng thời phải chọn lọc được nguồn vật liệu các dòng, giống lạc mang gen kháng bệnh bằng lây nhiễm nhân tạo và chỉ thị phân tử, từ đó làm cơ sở chọn tạo ra các dòng, giống lạc mới mang gen kháng với biovar, nòi vi khuẩn gây bệnh héo xanh hại lạc phổ biến ở các vùng sản xuất

Nhằm giải quyết được các yêu cầu quản lý bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc

trong sản xuất tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam, việc thực hiện đề tài “Nghiên

cứu đa dạng di truyền vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith gây bệnh héo

xanh hại lạc và xác định các dòng, giống kháng bệnh ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam” mang tính thời sự cấp thiết

2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài

2.1 Mục tiêu

Xác định được đa dạng di truyền của vi khuẩn R solanacearum gây bệnh héo

xanh hại lạc ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam và dòng, giống lạc kháng bệnh bằng đánh giá bệnh nhân tạo kết hợp chỉ thị phân tử làm cơ sở phòng chống bệnh có hiệu quả

2.2 Yêu cầu

Điều tra xác định được mức độ nhiễm bệnh héo xanh vi khuẩn ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam

Xác định được biovar, nòi và đặc điểm sinh học một số isolate vi khuẩn

R solanacearum thu thập ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam

Đánh giá đa dạng di truyền một số isolate vi khuẩn R solanacearum và sự

phân bố của chúng ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam Đánh giá được khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn của tập đoàn giống, con lai và dòng lạc triển vọng bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo kết hợp chỉ thị phân tử

Trên cơ sở chọn lọc các dòng, giống kháng bệnh và đánh giá một số đặc điểm nông học chính, xác định được các dòng, giống lạc kháng bệnh, có năng suất cao để phát triển trong sản xuất

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

3.1 Ý nghĩa khoa học

Luận án cung cấp thông tin khoa học mới về đa dạng di truyền của vi khuẩn

R solanacearum gây bệnh héo xanh hại lạc ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam.

Cung cấp tư liệu khoa học mới về áp dụng phương pháp sinh học phân tử kết hợp với đánh giá bệnh nhân tạo nguồn vật liệu và dòng, giống lạc kháng bệnh cho chọn tạo, phát triển giống lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Từ kết quả xác định được sự phân bố biovar, đa dạng di truyền các isolate vi

khuẩn R solanacearum ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam làm cơ sở bố trí

giống kháng bệnh Xác định được vi khuẩn gây bệnh héo xanh lạc ở miền Bắc Việt Nam thuộc biovar 3, biovar 4 và thuộc nòi 1

Một số mẫu giống lạc như L28, L29 có khả năng kháng bệnh héo xanh vi khuẩn và có năng suất cao có thể sử dụng trong quản lý cây trồng tổng hợp nhằm sản xuất lạc hiệu quả, bền vững

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài

4.1 Đối tượng nghiên cứu

Loài vi khuẩn R solanacearum gây bệnh héo xanh lạc

Một số mẫu giống lạc trong tập đoàn, dòng lai, dòng triển vọng và giống lạc

được trồng ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam là ký chủ của vi khuẩn R solanacearum

gây bệnh héo xanh hại lạc

4.2 Phạm vi nghiên cứu

Đề tài thực hiện tại Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, Viện Bảo vệ thực vật, Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam, Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ thuộc Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm

Nghiên cứu tập trung vào điều tra xác định mức độ nhiễm bệnh héo xanh vi khuẩn trên đồng ruộng; xác định đa dạng di truyền, đặc điểm sinh học một số isolate vi

khuẩn R solanacearum và sự phân bố của chúng ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt

Nam; đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn và chọn lọc các dòng, giống lạc kháng bệnh bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo và chỉ thị phân tử

5 Những đóng góp mới của luận án

Luận án bổ sung các tư liệu khoa học mới về bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc đặc biệt là phòng chống bằng giống kháng bệnh; sử dụng thành công phương pháp sinh học phân tử kết hợp phương pháp truyền thống trong xác định đa dạng

di truyền vi khuẩn R solanacearum và chọn lọc giống lạc kháng bệnh héo xanh

vi khuẩn

Ứng dụng thành công đánh giá bệnh nhân tạo kết hợp với chỉ thị phân tử SSR là pPGPseq3F5, GA161 và 7G2 liên kết với tính trạng kháng bệnh héo xanh vi khuẩn chọn lọc được các dòng, giống lạc kháng bệnh HXVK và có năng suất cao gồm 26 mẫu giống trong tập đoàn (kháng bệnh HXVK mức kháng trung bình đến kháng cao), 07 dòng từ tổ hợp lai đơn (kháng bệnh HXVK mức kháng trung bình đến kháng, năng suất từ 35,7-41,6 tạ/ha), 14 dòng lạc từ các tổ hợp lai hồi quy (kháng bệnh HXVK mức kháng trung bình đến kháng, năng suất từ 35,4-40,6 tạ/ha), 13 dòng lạc ưu tú (kháng bệnh HXVK mức kháng trung bình đến kháng, năng suất từ 36,6-40,5 tạ/ha) và 04 dòng lạc triển vọng (kháng bệnh HXVK mức kháng trung bình đến kháng, năng suất từ 35,7-37,8 tạ/ha) để làm vật liệu chọn tạo

và phát triển giống kháng bệnh

Xác định được 2 giống lạc triển vọng gồm L28 và L29 có khả năng kháng bệnh héo xanh vi khuẩn và có năng suất cao đã được khảo nghiệm Quốc gia để phát triển trong sản xuất

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình sản xuất lạc trên thế giới và ở Việt Nam

1.1.1 Tình hình sản xuất lạc trên thế giới

Cây lạc đứng hàng thứ hai sau cây đậu tương trong số các cây trồng lấy dầu thực vật (cả về diện tích và sản lượng) và được trồng rộng rãi ở hơn 100 quốc gia trên thế giới Theo số liệu thống kê của Tổ chức Nông Lương Thế giới (FAO, 2013), các nước có sản lượng lạc lớn nhất trong niên vụ 2011/2012 là Trung Quốc, Ấn Độ, Nigeria và Mỹ (bảng 1.1)

Bảng 1.1 Giá trị sản xuất và sản lượng lạc của một số nước đứng đầu thế giới

Trong niên vụ 2011/2012 về sản lượng lạc, Trung Quốc là nước đứng đầu với 16,8 triệu tấn, tiếp theo là Ấn Độ với 5,78 triệu tấn và Việt Nam là nước đứng thứ 12 với sản lượng 0,47 triệu tấn Trung Quốc có giá trị sản xuất lạc lớn nhất thế

giới đạt gần 7,39 triệu đô la Mỹ (USD), tiếp theo là Ấn Độ, Mỹ với các chỉ số này lần lượt là 2,45 và 1,33 triệu USD (FAO, 2013)

1.1.2 Tình hình sản xuất lạc ở Việt Nam

Sản xuất lạc ở nước ta được phân bố ở hầu hết các vùng sinh thái nông nghiệp với diện tích trồng lạc chiếm khoảng 28% tổng diện tích cây công nghiệp hàng năm (gồm đay, cói, mía, lạc, đậu tương và thuốc lá), tập trung ở các vùng chủ yếu như vùng Duyên hải Nam Trung Bộ, vùng Đồng bằng sông Hồng, vùng Trung du và Miền núi phía Bắc, vùng Bắc Trung Bộ Các vùng khác có diện tích trồng lạc thấp hơn

Bảng 1.2 Diện tích, năng suất và sản lượng lạc của Việt Nam

(năm 2002 - 2012)

(1.000 ha)

Năng suất (tấn/ha)

Theo số liệu của Tổng cục Thống kê Việt Nam (2013) cho thấy, trong vòng

10 năm qua (2002-2012) Mặc dù diện tích giảm từ 246,7 ha (năm 2002) xuống còn 220,5 ha (năm 2012) nhưng sản xuất lạc ở Việt Nam đã có những bước chuyển biến tích cực về năng suất từ 1,62 tấn/ha (năm 2002) tăng lên 2,13 tấn/ha (năm 2012) với sản lượng tăng từ 400,4 nghìn tấn (năm 2002) lên 470,6 nghìn tấn (năm 2012) Năm

2012, năng suất lạc bình quân cả nước đạt cao nhất là 2,13 tấn/ha Sản lượng lạc của

cả nước đạt cao nhất vào năm 2008 với 530,2 nghìn tấn (Tổng cục Thống kê, 2013)

1.2 Phân bố, tác hại của bệnh héo xanh vi khuẩn gây ra đối với sản xuất lạc

Trên thế giới, bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc phân bố ở hầu hết các vùng trồng lạc Tuy nhiên, bệnh gây hại nghiêm trọng hơn ở những vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới (Denny, 2006; Genin và Denny, 2012) Bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc được thông báo ở Đông và Đông Nam Á như Trung Quốc (He, 1986); Philippines, Thái Lan, Sri Lanka, Papua New Guinea và Ấn Độ (Hayward, 1990) Bệnh cũng được thông báo ở một số nước như Đài Loan, Nhật Bản và Nam Carolina ở Mỹ

Bệnh cũng được coi là gây thiệt hại kinh tế quan trọng ở Uganda (Mehan et al.,

1994); ở Indonesia, Thái Lan, Malaysia (Lam và Hamidah, 1995) và Việt Nam (bảng 1.3)

Bảng 1.3 Một số thông tin về mức độ giảm năng suất lạc do bệnh héo xanh vi

khuẩn gây ra ở châu Á

Nguồn: Pande et al (1998)

Hàng năm ước tính thiệt hại do bệnh héo xanh vi khuẩn (HXVK) trên lạc từ 50.000 đến 150.000 tấn (Machmud và Rats, 1994)

Ở Trung Quốc, bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc phân bố ở 16 tỉnh, nhưng gây hại chủ yếu ở vùng sản xuất lạc miền Trung và miền Nam Trung Quốc, các tỉnh bị bệnh nặng là Quảng Đông, Quảng Tây, Hải Nam, An Huy Tỷ lệ bệnh héo xanh ở Quảng Đông từ 10% đến 20%, ở những cánh đồng bị nhiễm nặng có thể tới 100%

(Tan et al., 1994)

Với điều kiện nóng ẩm của vùng nhiệt đới ở Malaysia, bệnh HXVK gây hại nghiêm trọng trên nhiều loài cây trồng, trong đó có cây lạc Trên cây lạc, tỷ lệ cây nhiễm bệnh trung bình từ 5% đến 20% và là nguyên nhân chính làm diện tích trồng lạc giảm từ 5.197 ha năm 1980 còn 1.318 ha năm 1986 với sản lượng tương ứng từ

19.437 tấn giảm còn 5.000 tấn (Mehan et al., 1986) Kết quả khảo sát năm 1993 cho

thấy bệnh xuất hiện chủ yếu ở các vùng trồng lạc chính của vùng Kelantan và Terengganu Tỷ lệ bệnh trên đồng ruộng biến động từ 0% đến 20% (Lam và Hamidah, 1995) Mức độ thiệt hại của bệnh ở vùng đất thấp có tưới thường thấp hơn ở vùng đất cao và khô hạn Bệnh gây hại chủ yếu ở Nam Sumatra, Tây Java và Nam Sulawesi Các vùng thuộc Trung và Đông Java, Bali và Bắc Sulawesi bệnh nhẹ hơn (Hayward, 1990; Machmud và Hayward, 1993)

Ở Thái Lan, bệnh héo xanh vi khuẩn R solanacearum gây hại lạc ở nhiều

vùng thuộc miền Nam, miền Trung và các tỉnh phía Bắc Bệnh gây hại chủ yếu ở những vùng trồng lạc liên tục nhiều vụ hàng năm trồng trên đất cát và tùy thuộc và

giống, khí hậu, điều kiện canh tác (Butranu et al., 1994)

Ở Việt Nam từ năm 1968, Đặng Thái Thuận và cs (1968) đã phát hiện, mô tả bệnh chết ẻo cây lạc, mức độ gây hại của bệnh từ 20% đến 30% Bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc được coi là bệnh hại phổ biến ở nhiều vùng trồng trong cả nước (Mehan

và cs., 1991; Nguyễn Xuân Hồng và cs., 1997; Lê Lương Tề, 1997a)

Nguyễn Thị Ly và Phan Bích Thu (1991) cho rằng ở 14 hợp tác xã trồng lạc thì bệnh HXVK hại nặng nhất ở một số điểm điều tra của tỉnh Nghệ An với tỷ lệ từ 15% đến 40%, trong khi đó ở các điểm điều tra của huyện Việt Yên, tỉnh Bắc Giang

tỷ lệ bệnh trung bình chỉ từ 10% đến 15%

Nguyễn Văn Liễu và cs (1995) điều tra tình hình bệnh HXVK hại lạc trong sản xuất ở miền Bắc và xác định hầu hết các giống lạc đang được trồng phổ biến trong sản xuất tại thời điểm nghiên cứu là không kháng bệnh HXVK (tỷ lệ cây chết trung bình trong vụ Xuân là 15% đến 25%, ở những vùng ổ dịch bệnh gây chết từ 90% đến 100%) Theo Nguyễn Văn Liễu (1998), bệnh HXVK có ở hầu khắp các vùng trồng lạc của miền Bắc, các tỉnh trọng điểm trồng lạc như Nghệ An, Thanh Hoá, Bắc Giang là những vùng bị bệnh gây hại từ 10% đến 20%

Theo Nguyễn Tất Thắng và Đỗ Tấn Dũng (2010), bệnh héo xanh vi khuẩn là một bệnh gây hại phổ biến trên cây lạc vùng Hà Nội và phụ cận Trong năm 2008-

2009, kết quả điều cho thấy tỷ lệ bệnh HXVK hại lạc cao nhất ở huyện Ý Yên, tỉnh Nam Định trên giống lạc Sen lai (1,28%) và tỷ lệ bệnh thấp nhất ở huyện Lạng Giang, tỉnh Bắc Giang trên giống lạc L14 (0,19%)

1.3 Triệu chứng bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc

Mehan et al (1994) đã mô tả triệu chứng bệnh HXVK hại lạc như sau: triệu

chứng bệnh có thể quan sát rõ trên cây lạc sau khi trồng 2 - 3 tuần Cây con nhiễm bệnh nặng, héo chết nhanh Trên đồng ruộng triệu chứng bệnh thể hiện rõ và nhiều nhất ở giai đoạn cây bắt đầu ra hoa trở đi Dấu hiệu đầu tiên của bệnh là một vài lá ở phía trên tái đi, hơi rủ xuống Lúc đầu, lá cây héo vào ban ngày và ban đêm lại hồi phục được, nhưng chỉ sau vài ngày cây bị héo nhanh chóng, bộ lá héo rũ xuống không hồi phục được Tiếp theo là cây bị khô, lá có màu xanh nâu, chóp rễ cây bệnh

bị thối nhũn, mầu nâu đen Cắt gốc thân có thể thấy mạch dẫn mầu nâu sẫm kéo dài lên phía trên Dùng tay bóp nhẹ chỗ cắt ngang có dịch nhầy trắng sữa chảy ra Đối với cây già hơn hoặc những giống ít bị nhiễm bệnh héo xanh vi khuẩn thì quá trình héo diễn ra từ từ và thường bắt đầu bị bệnh ở cành trên và cuối cùng toàn bộ cây có thể bị héo và chết Đôi khi cây bị nhiễm bệnh héo xanh không biểu hiện rõ triệu chứng Bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc là loại bệnh hại mạch dẫn nên triệu chứng đặc trưng nhất là mạch dẫn ở thân, cành, rễ bị biến màu nâu sẫm, trong đó chứa đầy dịch vi khuẩn Trên cây bệnh lá bị héo rũ, cuối cùng cây héo khô, rễ và quả lạc bị

thối đen (Mehan et al., 1994)

Ở Việt Nam, Nguyễn Tất Thắng và Đỗ Tấn Dũng (2010) nghiên cứu bệnh héo xanh hại lạc tại vùng Hà Nội và phụ cận cho biết, triệu chứng gây hại chủ yếu của bệnh trên cây lạc làm lá ngọn héo rũ có mầu xanh tái, mặt lá phía dưới, các cành cũng bị héo dần và chết nhanh Ban đầu lá héo vào ban ngày, ban đêm lại phục hồi, nhưng chỉ sau vài ngày cây lạc héo rũ hẳn xuống không phục hồi được Cắt gốc thân thấy mạch dẫn mầu nâu sẫm kéo dài lên phía trên Dùng tay bóp nhẹ chỗ cắt ngang có dịch nhầy trắng như sữa chảy ra

1.4 Phân loại và phổ ký chủ của vi khuẩn gây bệnh héo xanh hại lạc

Các nghiên cứu trên thế giới cho biết: đầu tiên vi khuẩn đƣợc Smith đặt tên

là Bacillus solanacearum Tiếp theo, vi khuẩn đƣợc đổi tên là Pseudomonas

solanacearum (Smith, 1896) Các nghiên cứu phân loại gần đây về các vi khuẩn Pseudomonas không tạo sắc tố huỳnh quang đã tạo ra một chi mới là Burkholderia

Vi khuẩn P solanacearum đã đƣợc phân loại lại thành Burkholderia solanacearum (Yabuuchi et al., 1992) Các nghiên cứu phân loại sau đó đã chứng minh rằng

B solanacearum khác hoàn toàn các vi khuẩn Burkholderia khác và thuộc một chi

mới là Ralstonia Dựa trên các nghiên cứu phân loại mới này, B solanacearum đã đƣợc đổi tên lại là R solanacearum (Yabuuchi et al., 1995) Sau Hội nghị Quốc tế lần thứ 2 về vi khuẩn năm 1997, đa số các tác giả gọi vi khuẩn là Ralstonia

solanacearum Hiện nay phân loại chính thức của vi khuẩn héo xanh là:

Giới (Kingdom): Bacteria

Ngành (Phylum): Proteobacteria

Lớp (Class): Beta Proteobacteria

Bộ (Order): Burkholderiales

Họ (Family): Ralstoniaceae

Chi (Genus): Ralstonia

Loài: Ralstonia solanacearum (Smith, 1896) (Yabuuchi et al., 1995; Yabuuchi et al., 1996; Tahat và Sijam, 2010)

Ngoài ra, vi khuẩn còn có các tên đồng nghĩa khác (synonym) là

Pseudomonas ricini (Archibald) Robbs, 1954; Pseudomonas batatae Cheng và

Faan, 1962 (Yabuuchi et al., 1995; Yabuuchi et al., 1996; Tahat và Sijam, 2010)

Ngoài gây hại trên cây lạc (Arachis hypogaea L.), vi khuẩn R solanacearum còn gây hại trên 450 loài cây thuộc 54 họ thực vật khác nhau Vi khuẩn R solanacearum gây bệnh trên một số cây khác nhƣ Ageratum conyzoides, Amaranthus spp., Artemisia pallens, Artemisia sp., Beta vulgaris var cicla, Capsicum annuum,

Casuarina cunninghamiana, Casuarina equisetifolia, Casuarina glauca, Cereus peruvianus, Coleus forskohlii, Coleus sp., Colocasia esculenta, Commelina communis,

Cucumis melo, Cucumis sativus, Cucurbita moschata, Cucurbita pepo, Curcuma longa, Cynara cardunculus var scolymus, Emilia sonchifolia sp., Eucalyptus sp., Galinsoga parviflora sp., Gossypium sp., Heliconia sp., Heliconia caribaea, Hevea brasiliensis, Hibiscus sabdariffa, Ipomoea batatas, Justicia adhatoda, Maranta arundinacea, Musa sp., Musa x paradisiaca, Nicotiana tabacum, Olea europaea

subsp europaea, Pelargonium sp., Platostoma chinensis, Plectranthus barbatus,

Pogostemon cablin, Polygonum capitatum, Portulaca oleracea, Ricinus communis, Siraitia grosvenorii, Solanum cinereum, Solanum lycopersicum, Solanum melongena, Solanum nigrum, Solanum tuberosum, Talinum fruticosum, Tectona grandis, Urtica dioica, Washingtonia filifera, Zingiber officinale, (Hayward,

1994; Mehan et al., 1994, Agrios, 2008; Chandrashekara và Prasnnakumar, 2010; Peng et al., 2012; Wu et al., 2013; Lin et al., 2015) Tuy nhiên, loài vi khuẩn

R solanacearum rất dễ bị biến dị và phân hoá hình thành nhiều nòi và biovar khác

hẳn nhau về tính chuyên hoá ký chủ, tính gây bệnh và tính độc, phân bố khác nhau

ở các vùng địa lý sinh thái

Ở Việt Nam, Nguyễn Thị Ly và Phan Bích Thu (1993) đã xác định vi khuẩn

R solanacearum là nguyên nhân gây bệnh héo xanh lạc Theo Nguyễn Xuân Hồng và

cs (1993) vi khuẩn R solanacearum là nguyên nhân gây bệnh héo xanh lạc và một

số cây trồng khác Đỗ Tấn Dũng (1995) cho rằng bệnh HXVK phát sinh, phát triển và gây hại nghiêm trọng trên cây cà chua, khoai tây, lạc Đoàn Thị Thanh và cs (1995)

cho biết vi khuẩn R solanacearum không những gây hại trên cây khoai tây mà còn

ký sinh và gây hại trên cây cà chua, thuốc lá, lạc, cây cà Tác giả còn cho rằng đây là loài vi khuẩn đa thực, có phạm vi ký chủ rộng, gây hại chủ yếu trên các cây trồng

thuộc họ cà (Solanaceae), họ đậu (Leguminaseae) Năm 1977, Lê Lương Tề (1997a)

đã xác định vi khuẩn R solanacearum là nguyên nhân gây bệnh héo xanh lạc và

một số cây trồng khác như cà chua, khoai tây, thuốc lá, cây cà, vừng, ớt và đay

1.5 Đặc điểm hình thái, sinh hóa, sinh thái của vi khuẩn R solanacearum

1.5.1 Đặc điểm hình thái, cấu tạo

R solanacesrum là vi khuẩn hình que, kích thước tế bào 0,5 x 1,5 µm,

nhuộm gram âm Các mẫu phân lập (isolate) có độc tính cao phần lớn không có

lông roi và không di động, ngược lại những isolate có độc tính thấp thường có từ 1 đến 4 lông roi mọc đối nhau, có mức di động cao và đều có các lông roi nhỏ ở rìa

(Mehan et al., 1994; Anitha et al., 2003) Nếu isolate vi khuẩn chuyển sang kiểu

khuẩn lạc nâu, răn reo là isolate vi khuẩn mất tính độc (nhược độc) Để phát hiện dòng vi khuẩn có tính độc thường dùng môi trường chọn lọc TZCA (tetrazolium chloride agar) Trên môi trường này isolate vi khuẩn có tính độc sẽ có khuẩn lạc nhỏ, ở giữa màu hồng, rìa trắng (Kelman, 1954)

Vi khuẩn R solanacearum có cấu tạo đơn bào Cấu trúc của tế bào vi khuẩn

gồm có: vỏ tế bào chiếm 15% đến 30% trọng lượng khô của tế bào có tác dụng bảo

vệ và giữ cho vi khuẩn có hình dạng xác định Tế bào gồm chất nguyên sinh, chất này chứa bào tương, chất nhân (nucleus) và các hạt tròn nhỏ khác nhau trong có chứa chất dinh dưỡng dự trữ Bào tương giàu RNA còn nhân giàu ADN Bằng kính hiển vi điện

tử có thể phân biệt được các cấu trúc đại phân tử với đường kính khoảng 200 Ao

(Angstron), các cấu trúc này là tổng thể của RNA-Protein, là những ribosome Các phân tử ribosome chứa nhiều men cần cho sự tổng hợp protein Trong tế bào vi khuẩn không thể hiện rõ nhân như trong tế bào của các cây trồng bậc cao và động vật, nhưng trong bào tương thường có thể phân biệt được “những nhiễm sắc thể” mà thường được xem như tương ứng với nhân Tế bào chất nằm trong màng bào tương, ngoài màng bào tương lại có một lớp vỏ tế bào rắn hơn bao bọc, nhờ đó tế bào có hình dạng nhất định Thức ăn vào tế bào qua màng nửa thẩm thấu và những chất trao đổi hình thành trong bào tương cũng qua màng đó mà bị thải ra ngoài (Kinaly và cs.,

1983; Izrainxki, 1988; Mehan et al., 1994)

1.5.2 Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn R solanacearum

Vi khuẩn R solanacearum là vi khuẩn háo khí, không hình thành bào tử và

nhuộm gram âm Vi khuẩn này có khả năng tổng hợp poly-B hydroxybutyrate như là

nguồn các bon dự trữ Vi khuẩn R solanacearum không hóa lỏng gelatin, không thủy

phân tinh bột, không có khả năng tạo indol và không sử dụng arginin Tuy nhiên, loài

vi khuẩn này có khả năng tạo ra H2S, khử nitrat, có khả năng thủy phân Tween 80, phản ứng dương tính Le-van, phân giải đối với sữa limut, có phản ứng oxidase và

catalase, urê, pectin, ôxi hóa acetat, malonate và gluconate Vi khuẩn R solanacearum

chịu đựng kém với muối NaCl Các isolate của vi khuẩn R solanacearum không thể

phát triển trên môi trường chứa 2% NaCl và bị kìm hãm ở môi trường có 0,5% đến

1,5% NaCl (Hayward, 1964; He et al., 1983; Ryan et al., 2008)

1.5.3 Phương thức tồn tại, xâm nhập và lan truyền của vi khuẩn R solanacearum

Vi khuẩn R solanacearum tồn tại trong đất, trong tàn dư thực vật Nhiều loài

cỏ dại còn là ký chủ phụ của loài vi khuẩn này, là cầu nối giữa nguồn bệnh với cây trồng Vi khuẩn còn tồn tại trong hạt giống Ở Indonesia và Trung Quốc, hạt lạc thu

từ những cây nhiễm bệnh có thể truyền bệnh cho vụ sau Vi khuẩn tồn tại trên vỏ hạt, vỏ lụa và trong phôi hạt (Middleton và Hayward, 1990; Machmud, 1993;

Anitha et al., 2003)

Vi khuẩn R solanacearum xâm nhập vào cây lạc qua vết thương cơ giới

hoặc qua lỗ mở tự nhiên ở rễ của cây và được nhân lên nhanh chóng trong mạnh dẫn làm cho mạnh dẫn trở nên bị tắc nghẽn, vi khuẩn có thể tiếp tục xâm nhập vào những mô lân cận Trong quá trình này, vi khuẩn sản sinh ra các hệ men như pectinase, cellulose để phân hủy mô, tế bào cây và sinh ra các độc tố làm tắc mạch dẫn, cản trở vận chuyển nước, nhựa nguyên và nhựa luyện trong cây làm cây bị héo

nhanh chóng Đặc tính gây bệnh của vi khuẩn R solanacearum có độc tính được quyết định bởi hệ gen độc hrp (hypersensitive response and pathogenicity)

Bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc là bệnh lây lan chủ yếu qua đất Trong số các

vi khuẩn hại cây trồng thì vi khuẩn R solanacearum bền vững nhất trong đất Vi khuẩn R solanacearum có thể sống sót trong đất bỏ hóa vài năm thậm chí cả khi không có cây trồng trên đất đó Vi khuẩn R solanacearum có thể qua đông trong đất,

đất bị nhiễm bệnh là nguồn bệnh ban đầu quan trọng nhất Vi khuẩn tồn tại lâu trong đất khi trồng liên tục cây ký chủ nhiễm bệnh hoặc có sự kết hợp với cây ký chủ khác xen kẽ trên đồng ruộng Vi khuẩn tồn tại tốt ở đất đủ ẩm, thoáng khí, nhưng bị kìm

hãm ở đất khô và đất bị ngập nước Vi khuẩn R solanacearum lây lan chủ yếu qua

đất nhưng cũng dễ dàng truyền lan theo nguồn nước, qua mưa gió và qua những vết thương cơ giới, qua dụng cụ sản xuất của con người, cũng có thể qua vết thương ở rễ

do côn trùng và tuyến trùng gây ra (Middleton và Hayward, 1990)

1.5.4 Ảnh hưởng của điều kiện ngoại cảnh đến sự phát sinh, phát triển của bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc

Sự phát sinh, phát triển của bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc có liên quan chặt chẽ với các yếu tố thời tiết khí hậu như nhiệt độ, độ ẩm, mưa, gió, độ pH đất, Từ lúc xâm nhiễm tới khi xuất hiện triệu chứng đầu tiên của bệnh phải trải qua một khoảng thời gian nhất định Thời gian đó phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện ngoại cảnh

Bệnh phát triển mạnh, thuận lợi trong điều kiện thời tiết nóng ẩm nhất là ở nhiệt độ từ 25oC đến 35oC nên bệnh gây hại chủ yếu là ở vùng nhiệt đới Đất có độ

ẩm cao >60% và độ pH 5 - 6,8 thích hợp cho sự sinh trưởng của vi khuẩn (Anitha et

al., 2003) Bệnh hại nặng hơn trên đất cát pha, thịt nhẹ, trên ruộng nghèo chất hữu

cơ, độc canh cây ký chủ… Bệnh phát triển kém, mức độ nhiễm bệnh nhẹ hơn trên các ruộng luân canh lạc với lúa nước, các loài cây không phải là ký chủ và trên đất kiềm hoặc bón vôi

Ở Việt Nam, Nguyễn Xuân Hồng và cs (1995) cho rằng bệnh HXVK hại lạc

là một trong những bệnh phổ biến phát sinh, phát triển thuận lợi trong điều kiện nhiệt

độ và ẩm độ tương đối cao Theo Lê Lương Tề (1997b), bệnh HXVK hại lạc thường phát sinh ở cả hai thời vụ trồng là lạc Xuân và lạc Thu Trong điều kiện nhiệt độ tương đối cao, ẩm ướt, cây sinh trưởng kém, đất cát, nhất là trên đất trồng độc canh cây lạc, bệnh gây hại nặng Khi nghiên cứu về mối liên quan giữa bệnh HXVK hại lạc với các yếu tố sinh thái, kỹ thuật, Lê Lương Tề (1997b) cho rằng bệnh có thể phát sinh ở các giai đoạn sinh trưởng của cây, cao điểm của bệnh là thời kỳ cây ra hoa đến quả non, sau đó bệnh giảm ở giai đoạn quả già Về ảnh hưởng của phân bón thì vôi và kali có tác dụng hạn chế tác hại của bệnh, cho năng suất lạc cao hơn so với đối chứng Chế độ luân canh có ảnh hưởng tới sự phát triển của bệnh, chu kỳ luân canh càng dài, mức độ gây hại của bệnh càng giảm Ở công thức luân canh lúa - lạc - lúa và mía - lạc thì tỷ lệ bệnh HXVK thấp hơn so với công thức luân canh lạc Xuân - lạc Thu hoặc lúa - khoai tây - lạc Nguyễn Xuân Hồng và cs (1997) cho rằng ở phía bắc Việt Nam, bệnh HXVK phát sinh và gây hại nặng trên vùng đất đồi, đất bãi ven sông, còn trên đất luân canh với lúa nước thì mức độ nhiễm bệnh nhẹ hơn Đỗ Tấn Dũng (1999) nghiên cứu bệnh HXVK hại lạc ở vùng Đông Anh, Hà Nội có nhận xét bệnh phát sinh và gây hại nặng từ giai đoạn cây lạc ra hoa rộ đến quả non

Nguyễn Văn Viết và Phan Duy Hải (2010) nghiên cứu mối tương quan giữa bệnh và biện pháp canh tác đã cho rằng trồng lạc liên tục trên đất gò đồi và đất dốc miền núi làm gia tăng tích lũy nguồn bệnh và làm tăng tỷ lệ bệnh các năm tiếp theo

1.5.5 Chuẩn đoán bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc và phân lập vi khuẩn gây bệnh

Trên đồng ruộng có thể xác định bệnh nhanh bằng cách cắt một đoạn thân ngắn khoảng 3 cm gần gốc thân cây bị bệnh, ngâm vào cốc nước, sau một thời gian xuất hiện dòng dịch vi khuẩn màu trắng đục chảy ra từ vết cắt Cắt dọc theo thân cây, dễ dàng nhận thấy mạch dẫn bị chuyển màu thành nâu sẫm hoặc nâu nhạt (Wang và Hou, 1983) Phương pháp chẩn đoán này cũng đã được áp dụng tại

Việt Nam (Burgess et al., 2009; Nguyễn Tất Thắng và Đỗ Tấn Dũng, 2010)

Có nhiều phương pháp để xác định vi khuẩn R solanacearum gây bệnh héo

xanh hại lạc như phân lập trên môi trường, phương pháp huyết thanh, phương pháp phân tích PCR (Mehan và Mc Donald, 1995)

Theo Mehan (1995), môi trường tetrazolium chloride agar (TZCA) phù hợp

để phân lập vi khuẩn R solanacearum, còn môi trường sucrose peptone agar (SPA) phù hợp để nhân vi khuẩn R solanacearum Trên môi trường TZCA khuẩn lạc vi khuẩn R solanacearum tròn, nhầy, màu trắng kem, rìa mép nhẵn, ở giữa có màu phớt hồng, còn trên môi trường SPA, khuẩn lạc của vi khuẩn R solanacearum có

hình dạng tròn, nhẵn bóng, màu trắng sữa

Nhiều công trình nghiên cứu về phương pháp và ứng dụng kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) trong chẩn đoán bệnh trên cây trồng và các ứng dụng khác trong bệnh học thực vật đã được công bố Phương pháp PCR có nhiều lợi thế hơn hẳn so với các phương pháp chẩn đoán truyền thống nhờ có độ nhạy cao, tốc độ nhanh Bằng phương pháp ứng dụng PCR, chỉ một vài giờ, từ một đoạn ADN ban đầu và đoạn mồi có thể nhân lên hàng trăm triệu lần sau đó đi sâu phân tích kiểu

gen, xác định, nhận biết một cách chính xác nòi, biovar vi khuẩn R solanacearum ở

trong mẫu cây bệnh cũng như trong đất nhiễm bệnh

Theo kết quả nghiên cứu của các phòng thí nghiệm tham gia mạng lưới nghiên cứu vi khuẩn héo xanh ở các nước và vùng lãnh thổ châu Á, Thái Bình Dương như: Australasia, Đài Loan, Philippines,… thì sản phẩm PCR của các mẫu

phân lập thuộc loài R solanacearum sử dụng với chỉ thị 759/760 có kích thước

không đổi là 281 cặp bazơ (base pair-bp) và chỉ có các isolate cho sản phẩm PCR có

kích thước như vậy mới có tính độc (Opina et al., 1997)

1.6 Nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn héo xanh hại lạc

1.6.1 Biovar và nòi của vi khuẩn R solanacearum

Trong hơn 40 năm qua, nhiều tác giả sử dụng khái niệm nòi và biovar để

phân biệt đặc tính gây bệnh của vi khuẩn R solanacearum Biovar của vi khuẩn

R solanacearum được xác định dựa trên khả năng chuyển hóa cácbon hydrat, cụ thể

là khả năng ô xy hóa 3 đường đôi (cellobiose, lactose, maltose) và 3 rượu Hexo -

cacbon (dulcitol, manitol, sorbitol) (Hayward, 1964; He et al., 1983) Hiện nay, 5 biovar của vi khuẩn R solanacearum đã được ghi nhận bao gồm:

- Biovar 1: không ô xy hóa cácbon hydrat

- Biovar 2: ô xy hóa đường nhưng không ô xy hóa rượu

- Biovar 3: ô xy hóa tất cả các bon hydrat

- Biovar 4: chỉ ô xy hóa rượu

- Biovar 5: ô xy hóa lactose, maltose, cellobiose và manitol nhưng không

ô xy hóa sorbitol, dulcitol

Các mẫu R solanacearum thuộc biovar 2 phân lập từ vùng Amazon (châu

Mỹ) có đặc tính sinh hóa khá khác biệt (dựa trên khả năng sử dụng đường ribose và đường trehalose) Nhóm này được đặt tên là biovar 2-T (hoặc N2) còn biovar 2 gốc được đổi thành biovar 2-A (Hayward, 1995b)

Biovar 1, biovar 3 và biovar 4 gây hại cho lạc còn biovar 2 và biovar 5 không gây bệnh cho lạc Biovar 1 gây bệnh trên lạc ở Mỹ, còn hầu hết các isolate gây bệnh trên cây lạc ở các nước châu Á, châu Phi chủ yếu là biovar 3, biovar 4 và thuộc nòi 1

Theo Wu et al (2013), 11 isolate của vi khuẩn R solanacearum thu thập từ các tỉnh

khác nhau của Trung Quốc thuộc biovar 3

Buddenhahem và Kelman (1964), Hayward (1964), He et al (1983) đã phân chia các isolate vi khuẩn R solanacearum thành 5 nòi (race) dựa trên phổ ký chủ Năm nòi của R solanacearum gồm:

Nòi 1 (race 1): Có phạm vi ký chủ rộng, lây nhiễm các cây họ cà

(Solanaceae) và một số cây họ đậu (Leguminoseae), phân bố chủ yếu ở vùng đất

thấp của vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Nòi 1 gồm biovar 1, biovar 3 và biovar 4

Nòi 2 (race 2): Gây bệnh trên chuối (Heliconia spp.) ở miền Trung và

Nam Mỹ gồm biovar 2 và biovar 3

Nòi 3 (race 3): Phạm vi ký chủ hẹp gây bệnh chủ yếu cho khoai tây, cà chua

và được tìm thấy ở vùng ôn đới vĩ độ cao và ở những vùng nhiệt đới cao Nòi 3 chỉ

Ở Việt Nam, Nguyễn Xuân Hồng và cs (1997) cho rằng các nguồn vi khuẩn

R solanacearum phân lập được kiểm tra đều có tính độc cao đối với cây lạc và một

số cây ký chủ khác, các mẫu phân lập được đều thuộc nòi 1, biovar 3 và biovar 4

Đỗ Tấn Dũng (1999) cho rằng, tác nhân gây ra bệnh HXVK trên cây cà chua,

cà pháo, lạc, khoai tây ở tỉnh Ninh Bình đều do loài vi khuẩn R solanacearum Smith,

thuộc nòi 1, biovar 3 Các isolate vi khuẩn gây bệnh héo xanh phân lập từ các cây ký chủ đều có khả năng lây bệnh chéo cho nhau, mức độ nhiễm bệnh khác nhau, điều đó thể hiện tính độc, tính gây bệnh giữa các isolate vi khuẩn cũng khác nhau

Phân tích các mẫu bệnh HXVK thu thập từ một số vùng trồng lạc, Nguyễn

Thị Yến và cs (2002) cũng xác định vi khuẩn R solanacearum gây bệnh héo xanh

hại lạc là biovar 3, biovar 4 và thuộc nòi 1 Nguyễn Xuân Hồng và cs (2002) đã cho biết trồng lạc ở đất đồi gò, đất bãi ven sông thường bị bệnh héo xanh gây hại nặng

và cũng đã xác định được biovar 3 và biovar 4 gây hại trên lạc ở Việt Nam

1.6.2 Chủng

Cho tới nay, không có một định nghĩa chính thức về chủng (strain) của vi

khuẩn R solanacearum Các tác giả trên thế giới thường sử dụng thuật ngữ chủng

để chỉ các mẫu vi khuẩn R solanacearum khác nhau về bất cứ đặc điểm nào như

nguồn gốc phân lập, hình thái, sinh học, sinh thái và di truyền

Chủng của vi khuẩn R solanacearum khác nhau tùy thuộc vào cây ký chủ,

phân bố, độc tính, mối quan hệ dịch tễ và đặc tính sinh lý của vi khuẩn (Buddenhagen và Kelman, 1964) Bên cạnh phương pháp truyền thống xác định nòi dựa vào phạm vi ký chủ và xác định biovar dựa vào phản ứng sinh hóa, nhờ thành tựu của sinh học phân tử, ngày nay phân tích ADN trở thành phương pháp chính xác và phù hợp để xác định chủng nhiều loại ký sinh Bên cạnh phương pháp truyền thống xác định nòi và biovar, Hayward (1990) cho biết, bằng phân tích ADN qua

phương pháp RFLP đã xác định vi khuẩn R solanacearum gây hại lạc gồm 2 nhóm

chính là nhóm I và nhóm II

Nguyễn Văn Tuất và cs (2007) đã phân tích tính đa hình của 25 isolate vi khuẩn với 10 mồi ngẫu nhiên cho thấy có sự sai khác về mặt di truyền của chúng và phân chia thành 2 nhóm gồm nhóm I và nhóm II

1.6.3 Loài phức

Khi phân tích đa dạng vi khuẩn gây bệnh héo xanh, Gillings và Fahy (1993)

đã nhận thấy vi khuẩn R solanacearum rất đa dạng và gợi ý rằng vi khuẩn này có lẽ

là một loài phức (complex species) Theo Fegan và Prior (2005) “loài phức” là một tập hợp các cá thể có quan hệ gần gũi nhưng thuộc các loài khác nhau Các nghiên cứu đa dạng vi khuẩn dựa trên lai ADN cho thấy vi khuẩn héo xanh cực kỳ đa dạng với mức độ tương đồng ADN của các mẫu vi khuẩn thường < 70% (là ngưỡng thường được sử dụng để phân biệt vi khuẩn ở mức loài) Hiện nay, vi khuẩn

R solanacearum chính thức được xem là một loài phức (Meng, 2013)

1.6.4 Kiểu gây bệnh

Các chủng vi khuẩn héo xanh còn được phân biệt thành các kiểu gây bệnh

(pathotype) dựa trên phản ứng đối với một loại cây trồng nào đó Theo Tan et al (1994), 36 mẫu vi khuẩn R solanacearum thu thập từ 6 tỉnh của Trung Quốc đã

được xếp thành 7 kiểu gây bệnh khác nhau cụ thể dựa trên độc tính của chúng đối với 6 giống lạc chỉ thị (Xiekangking, Taishan sanlirou, Huangchuan zhigan, Lukang qing, Fuhua Sheng, Ehua 1)

1.6.5 Kiểu quan hệ phả hệ

Gần đây, một hệ thống phân loại nữa gọi là kiểu quan hệ phả hệ (phylotype)

đã được áp dụng nhằm đánh giá đa dạng vi khuẩn R solanacearum Cách phân loại

này dựa trên phân tích trình tự các gen mã hóa như gen 16S RNA ribosome, gen

egl, gen hrpB, và gen mutS (Poussier et al., 2000; Allen et al., 2005; Prior và Fegan,

2005) Có 4 phylotype (Denny, 2006) đã được ghi nhận và phân tích cho thấy các phylotype tương quan với nguồn gốc địa lý của các chủng: phylotype I gồm các chủng chủ yếu từ châu Á, phylotype II từ châu Mỹ, phylotype III từ châu Phi và các

đảo thuộc Ấn Độ Dương và phylotype IV từ Indonesia (Remenant et al., 2011)

Nhìn chung, phylotype là hệ thống phân loại rất ổn định và có ý nghĩa về mặt tiến

hóa đối với phức hợp loài vi khuẩn R solanacearum (Meng, 2013)

1.7 Nghiên cứu phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc

1.7.1 Phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc bằng giống kháng bệnh

Trên thế giới, từ năm 1910 biện pháp dùng giống kháng bệnh HXVK đã được biết đến trên cây lạc Việc chọn tạo và đưa vào ứng dụng giống lạc Schwarz 21 kháng bệnh HXVK tại Indonesia năm 1927 và sau đó giống này trở thành vật liệu khởi đầu cho chọn giống lạc kháng bệnh như Gajah, Pelanduk, Tupai (Middleton và Hayward, 1990) Ở Trung Quốc cũng đã tạo được những giống lạc kháng bệnh HXVK cho năng suất cao và chất lượng tốt như Luhua 3, Guiyou 28, Zhong Hua 2, Yue You 92,

Jinyou 3121 Những giống lạc kháng R solanacearum thường tỷ lệ nhiễm bệnh

trong khoảng 10%, trong khi đó ở những giống nhiễm bệnh thì ở cùng điều kiện tỷ lệ

nhiễm bệnh lên đến 90% (Mehan et al., 1994) Ở Uganda, Busolo-Bulafu et al

(1993) đã nghiên cứu đánh giá chọn lọc nhiều giống lạc và đã tìm ra được một số giống lạc kháng bệnh HXVK đưa vào thực tế sản xuất như Igola-1, AT474/3/5/3

Chương trình chọn tạo giống lạc kháng bệnh HXVK đã rất được chú ý ở Trung Quốc Những giống lạc vừa có tính kháng bệnh HXVK vừa có khả năng cho năng suất cao đã được đưa vào sản xuất có vai trò hết sức quan trọng trong việc

kiểm soát bệnh và tăng sản lượng lạc ở những vùng nhiễm bệnh HXVK (Mehan et

al., 1986) Cuối những năm 1960 đã có một số lượng giống lạc kháng bệnh HXVK

đáng kể được đưa vào sản xuất (Mehan et al., 1994)

Việc xác định nguồn gen kháng bệnh HXVK luôn được coi là một hướng ưu tiên và được xúc tiến ngay từ những giai đoạn nghiên cứu đầu tiên về bệnh HXVK ở

nhiều quốc gia (Mehan et al., 1994) Một số nước như Uganda, Mỹ, Thái lan,

Malaysia, Philippines, Sri Lanka cũng luôn coi việc sử dụng giống chống bệnh là biện pháp chính và quan tâm nhất trong chương trình kiểm soát bệnh HXVK (Mehan

et al., 1994) Từ đó cho thấy sử dụng giống khánh bệnh luôn là hướng ưu tiên hàng

đầu trong chiến lược phòng chống bệnh HXVK ở hầu hết các nước mà có bệnh HXVK gây hại

Trong các thập kỷ 1960 - 1980 việc sàng lọc giống lạc kháng bệnh HXVK tiếp tục được thực hiện và đã xác định được nhiều dòng có tính kháng như:

PI 341884, PI 341885, PI 341886, R12, 708, ICGS 5313, ICGS 7968 Với sự hợp tác của ICRISAT, nhiều giống và dòng lạc được nhập từ ICRISAT được tiếp tục đánh

giá tính kháng ở Uganda (Busolo-Bulafu et al., 1993)

Ở Việt Nam, công tác chọn tạo giống lạc kháng bệnh HXVK đã được nghiên cứu thành công và ứng dụng trong sản xuất Nguyễn Xuân Hồng và cs (1993) đã chọn được một số giống lạc kháng bệnh HXVK như giống KPS17, đặc biệt là giống MD7 có tính kháng bệnh HXVK cao, được đưa vào khảo nghiệm diện rộng và sản xuất tại một số vùng sinh thái Theo Nguyễn Văn Liễu và cs (1998) giống lạc Gié Nho Quan là giống có mức kháng bệnh HXVK cao nhất trong tập đoàn (tỷ lệ cây sống sót trong vườn nhiễm trung bình là 94,9 ± 1,9%) Phổ kháng bệnh của giống này rộng với nhiều nguồn bệnh ở các vùng sinh thái khác nhau thuộc miền Bắc và

ổn định qua nhiều vụ, nhiều năm Hầu hết các giống trong bộ giống lạc kháng bệnh HXVK quốc tế đều biểu hiện ở mức kháng và kháng cao trong điều kiện miền Bắc Việt Nam Giống MD7 đã được công nhận là giống chính thức và phát triển ở nhiều tỉnh trồng lạc trọng điểm (Nguyễn Xuân Hồng và cs., 2002) Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Văn Tuất và cs (2007), trong số 94 mẫu giống lạc tham gia đánh giá chỉ có 5 mẫu lạc kháng cao và kháng trung bình, còn lại các giống đều bị nhiễm Kết quả nghiên cứu này khẳng định được rằng tỷ lệ các mẫu giống lạc kháng bệnh HXVK

là rất ít Do vậy công tác nghiên cứu, xác định nguồn vật liệu khởi đầu cho công tác chọn tạo giống lạc kháng bệnh là cần thiết và đòi hỏi nhiều công sức Nguyễn Thị Vân và cs (2013) đã chọn tạo thành công giống lạc TK10 kháng bệnh HXVK và đã phát triển ở nhiều vùng sản xuất đem lại hiệu quả kinh tế cao

1.7.2 Phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc bằng các biện pháp khác

Á (Mehan et al., 1994) Ở những vùng đất khô hạn, theo Tan et al (1994) thì luân

canh lạc với ngô hoặc cao lương với chu kỳ từ 4 đến 5 năm hoặc với mía từ 2 đến 5 năm cũng làm giảm đáng kể thiệt hại do bệnh HXVK gây ra Đặc biệt biện pháp luân canh lạc với ngô là có tính khả thi ở nhiều vùng bị bệnh HXVK gây hại nặng thuộc một số nước ở Đông Nam Á Việc luân canh lạc với cây không phải là ký chủ như

ngô, lúa, mía là một biện pháp hữu hiệu để kiểm soát bệnh (Mehan et al., 1994)

Luân canh cây trồng không phải là ký chủ của vi khuẩn héo xanh hại lạc là một trong những giải pháp quan trọng giúp giảm mật độ vi khuẩn trong đất và hạn chế tối đa nguồn bệnh từ các tàn dư thực vật vụ trước He (1990) cho rằng ngâm ruộng 15 ngày đến 30 ngày trước trồng lạc hoặc luân canh với cây lúa nước từ 2 đến

4 năm có tác dụng giảm tỷ lệ nhiễm bệnh của lạc Ở các công thức luân canh khác nhau, hiệu quả phòng chống bệnh HXVK cũng khác nhau (Machmud, 1993) Đối với các vùng đất cao, khó khăn trong việc trồng lúa nước và có tưới nước nói chung thì luân canh với cây lúa mì, đại mạch, tiểu mạch, ngô trong chu kỳ từ 4 năm 5 năm cũng

có tác dụng giảm tỷ lệ bệnh (Wang và Hou, 1983; Mehan et al., 1994) Trên đất sét,

bón vôi kết hợp với phân hữu cơ cũng có hiệu lực phòng bệnh nhưng không ổn định

Xử lý và cải tạo đất bằng việc bón tăng cường phân chuồng, lưu huỳnh,

canxi cũng đem lại những kết quả khác biệt nhau (Kelman et al., 1994) Tuy nhiên,

một số tác giả cho rằng việc bổ sung các chất hữu cơ và vô cơ trên đã làm tăng sức

đề kháng của cây do vi khuẩn R solanacearum rất mẫn cảm với điều kiện khô, vì

vậy việc cày ải đất cũng có tác dụng làm giảm bệnh HXVK rất rõ, hơn nữa việc cày

ải còn làm hạn chế sự phát triển của cỏ dại, vì cỏ dại cũng rất có thể là ký chủ của vi

khuẩn héo xanh hại lạc (Mehan et al., 1994)

1.7.2.2 Biện pháp sinh học

Biện pháp sinh học phòng chống bệnh HXVK chủ yếu sử dụng các chế phẩm

vi sinh vật đối kháng Nhiều loại vi khuẩn đối kháng với vi khuẩn gây bệnh héo

xanh hại lạc như Pseudomonas cepacia, Ps fluorescens, Bacillus polymyxa,

B subtilis, v.v.,…(Nawangsih et al., 2012; Wang và Liang, 2014) Tại Indonesia,

Nawangsih et al (2012) sử dụng các chế phẩm Pseudomonas fluorescens RH4003

và Bacillus subtilis AB89, Bacillus sp KS2 có hiệu quả cao trong phòng chống

bệnh vi khuẩn héo xanh hại lạc

Ở Việt Nam, đối với biện pháp sinh học phòng chống bệnh HXVK hại lạc,

Nguyễn Thu Hà và cs (2006) đã nghiên cứu sử dụng vi khuẩn đối kháng Bacillus

sp nhằm hạn chế bệnh héo xanh vi khuẩn và nâng cao năng suất đối với cây lạc Lê

Như Kiểu và cs (2010) đã xây dựng được quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh vật (VSV) phòng chống bệnh HXVK hại lạc qui mô phòng thí nghiệm Mức độ sống sót và hoạt tính sinh học của các chủng vi sinh vật trong chế phẩm duy trì sự ổn định sau 3 tháng bảo quản Tác giả đã sử dụng chủng vi sinh vật để sản xuất chế

phẩm vi sinh vật cho lạc gồm Ps1 (Pseudomonas fluorescens), TS6 (Pseudomonas sp.), BK1 (Bacillus sp.), Ba5.1 (Bacillus subtilis) và T15 (Bacillus megaterium)

1.7.2.3 Biện pháp hóa học

Biện pháp dùng thuốc bảo vệ thực vật được cho là ít có hiệu quả trong phòng

chống vi khuẩn R solanacearum do vi khuẩn này có nguồn gốc từ đất xâm nhiễm

gây bệnh và sinh sản trong hệ thống mạch của cây Xử lý đất bằng các loại thuốc xông hơi ít có tác dụng hạn chế bệnh

Wang và Hou (1983) cho biết việc khảo nghiệm thuốc trừ bệnh HXVK cho lạc đã được tiến hành từ những năm 1960 Một số thuốc có hiệu quả là Clopicrin liều lượng 300 kg/ha xử lý đất trước khi trồng lạc 10 ngày cho hiệu quả tốt Một số thuốc khác như Thiabendazol (C5H6N6S2) có thể giảm tỷ lệ bệnh xuống 50% nhưng

do thuốc này có độ độc cấp tính cao với con người và gia súc nên chưa thể áp dụng

vào sản xuất (Tan et al., 1994) Nhiều tác giả khác cũng công bố kết quả góp phần

chứng minh luận điểm dùng hóa chất phòng chống bệnh HXVK có hiệu quả thấp

Dùng thuốc kháng sinh được coi là biện pháp hạn chế bệnh HXVK có triển vọng, thay thế thuốc hóa học do thuốc kháng sinh được hấp phụ tốt, chuyển dịch trong mạch dẫn, trong mô cây dễ dàng Tuy nhiên, dùng thuốc kháng sinh dễ tạo ra các chủng vi khuẩn mới kháng thuốc Hơn nữa thuốc kháng sinh có giá thành cao cũng là một trở ngại cho việc ứng dụng rộng rãi Theo Kiraly và cs (1983) thì dùng streptomycine với liều lượng từ 200 đến 400 mg/lít đã kìm hãm sự sinh trưởng và sinh sản của vi khuẩn, tuy nhiên nếu dùng streptomycine không cẩn thận có thể gây ra sự phát triển của những chủng vi khuẩn gây bệnh lao kháng thuốc ở người và kết quả là rất nguy hiểm nếu dùng rau quả tươi có sử dụng streptomycine để phòng chống bệnh

Hartman và Elphinstone (1994) cũng đã nghiên cứu việc xử lý đất bằng một số loại muối như KNO3, NaNO3, NaCl và KCl với nồng độ 1% cũng thấy mật độ vi

khuẩn R solanacearum ở trong đất giảm đáng kể tới mức không thể phân lập được

nữa ở 4 đến 25 ngày sau xử lý, tùy loại muối Như vậy, cho tới nay việc dùng hóa chất để kiểm soát bệnh HXVK là chưa có tính khả thi trong điều kiện sản xuất đại trà

1.7.2.4 Biện pháp quản lý tổng hợp

Để kiểm soát và phòng chống bệnh HXVK, yếu tố quan trọng là sử dụng giống sạch bệnh, dùng giống chống chịu với bệnh HXVK, luân canh với những cây trồng không phải là ký chủ của bệnh, áp dụng những biện pháp canh tác tốt (vệ sinh đồng ruộng và cây trồng, quản lý giun đất, loại bỏ thân cây bị bệnh, làm cỏ, khử trùng nông cụ, không tưới nước bị ô nhiễm, cày ải phơi nắng đất,…) Hạn chế làm đất sau khi trồng (việc làm đất chỉ tại thời điểm trồng để tránh gây tổn thương đến

rễ cây) Việc làm cỏ cũng nên làm bằng tay để tránh tổn thương đến cây trồng Áp

dụng biện pháp kiểm dịch: Khi bệnh HXVK đã xuất hiện, việc kiểm dịch cần phải

được áp dụng triệt để tránh sự lây lan của vi khuẩn gây bệnh héo xanh ra các vùng

khác chưa nhiễm bệnh Vì vậy biện pháp quản lý tổng hợp mới thành công trong

việc giảm sự lây lan và phòng chống bệnh HXVK có hiệu quả

1.8 Sử dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu bệnh héo xanh hại lạc và chọn lọc giống kháng bệnh

1.8.1 Chỉ thị phân tử trong nghiên cứu ký sinh gây bệnh và chọn giống kháng bệnh

Trong thời gian gần đây, việc sử dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống cũng như trong việc sàng lọc giống kháng bệnh và tính chống chịu được đặc biệt quan tâm Xác định được chỉ thị ADN liên kết chặt với tính trạng nào đó thì có thể sử dụng cho chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (marker assisted selection-MAS)

Chỉ thị phân tử ADN là những chỉ thị có bản chất là đa hình Chỉ thị phân tử được chia làm hai loại chính: (1) Chỉ thị dựa trên cơ sở lai ADN (chỉ thị RFLP); (2) Chỉ thị dựa trên cơ sở phản ứng nhân ADN bằng PCR (RAPD, AFLP…)

1.8.1.1 Chỉ thị dựa trên cơ sở lai ADN: chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

Ở loài A hypogaea, sự khác biệt ở mức độ phân tử đã được phát hiện bằng

kỹ thuật RFLP (Kochert et al., 1991; Halward et al., 1991) Kochert et al (1991) đã chỉ ra không có sự khác biệt giữa A hypogaea và A monticola Tuy nhiên, một sự khác biệt đáng kể giữa các loài Arachis đã được ghi nhận

Để chọn giống có hiệu quả, cần phải nghiên cứu mối liên kết giữa tính trạng mong muốn với một lượng lớn chỉ thị để đánh giá quần thể với nhiều tính trạng như: năng suất, tính kháng, mùi vị Một bản đồ liên kết với nhiều chỉ thị, đặc biệt

là được lập với một số lượng lớn chỉ thị (mức độ bão hòa) có thể được sử dụng để phân lập các gen quan tâm Bằng phân tích quần thể F2, một bản đồ RFLP đã được

lập ở lạc của cặp lai nhị bội (2n = 2x = 20) giữa A stenosperma Krapov và W.C Gregory và A cardenasii Krapov và W.C Gregory Bản đồ có chiều dài 1.063 cM

với 117 chỉ thị trong 11 nhóm liên kết, 15 chỉ thị không liên kết cũng đã được thông

báo (Halward et al., 1993)

Bản đồ di truyền thứ 2 trên cơ sở chỉ thị RFLP được lập bởi Burow et al., (2001) của cặp lai tứ bội Florunner x 4x [A batizocoi Krapov và W.C Gregory (A cardenasii x A diogoi Hoehne)] Phần lớn trong 380 chỉ thị RFLP được lập bản

đồ có tính di truyền bởi nhiều cặp nhiễm sắc thể, với một số trường hợp ngoại lệ một nhóm liên kết có thể ở trên nhiều nhiễm sắc thể

Kỹ thuật RFLP cũng được sử dụng để phân tích đa dạng giữa các giống thuộc

loài Arachis (giống đại diện sẽ được sử dụng để lai với A hypogaea) và tạo nên các

nhóm bằng việc sử dụng các phân tích đa chiều tương ứng chặt chẽ với các nhóm

hình thái Thể tứ bội được tách biệt rõ ràng với thể nhị bội (Kochert et al., 1991)

Stalker et al (1995) đã sử dụng kỹ thuật RFLP trong nghiên cứu đa dạng di truyền giữa 18 dòng của loài A duranensis Krapov và W.C Gregory và đã phát

hiện một lượng lớn khác biệt giữa các dòng trong loài này, sự khác biệt giữa các

mẫu trong dòng cũng được xác định bằng RFLP Kochert et al (1991) kết luận rằng, giống lạc trồng trọt là kết quả lai giữa A duranensis và A ipaensis Krapov và W.C Gregory, phân tích lục lạp cũng chỉ ra rằng A duranensis đóng vai trò là mẹ

trong cặp lai

Chỉ thị RFLP là chỉ thị đồng trội nghĩa là có khả năng biểu hiện tất cả các alen của cùng một locut gen Do vậy có thể phân biệt được các cá thể đồng hợp tử (AA hoặc aa) và các cá thể dị hợp tử (Aa) Đây là đặc điểm ưu việt của loại chỉ thị RFLP Hạn chế của phương pháp này là tiêu tốn nhiều thời gian và sức lực, lượng công việc cồng kềnh Đặc biệt là tiêu hao một lượng lớn ADN mà số lượng đa hình thu được rất ít ỏi, thậm chí ở một số loài khó nhận được đa hình

1.8.1.2 Chỉ thị dựa trên cơ sở phản ứng nhân ADN bằng PCR

Phản ứng PCR dựa trên cơ sở phản ứng nhân ADN nhờ enzym ADN polymerase chịu nhiệt (Taq, Pfu…) với sự có mặt của đoạn ADN khuôn mẫu, mồi (primer), các nucleotide (dNTP) gồm dATP, dCTP, dGTP, dTTP và ion Mg2+

hoạt động như một chất xúc tác Tùy theo bản chất của những đoạn mồi sử dụng mà có những hệ thống chỉ thị đặc trưng

a) Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

Chỉ thị RAPD được tạo ra do sử dụng những đoạn mồi đơn lẻ, ngẫu nhiên (random primer) dài khoảng 10 nucleotide với nhiệt độ bắt mồi thấp Sản phẩm của phản ứng được phân tích bằng điện di trên gel agarose, nhuộm trong ethidium bromide và quan sát dưới đèn cực tím RAPD là chỉ thị trội do không phân biệt được thể dị hợp tử Đó là hạn chế của loại chỉ thị này so với chỉ thị đồng trội RFLP Lợi thế của chỉ thị này là không cần biết những thông tin về trình tự (Rohlf, 2000)