Cell based screening assay for inhibitors of porcine circovirus type2 (PCV2) replication

CELL-BASED SCREENING ASSAY FOR INHIBITORS OF PORCINE CIRCOVIRUS TYPE 2 PCV2 REPLICATION CARLA BIANCA LUENA VICTORIO YONG LOO LIN SCHOOL OF MEDICINE NATIONAL UNIVERSITY OF SINGAPORE &

CELL-BASED SCREENING ASSAY FOR INHIBITORS OF PORCINE CIRCOVIRUS TYPE 2 (PCV2) REPLICATION

CARLA BIANCA LUENA VICTORIO 

  YONG LOO LIN SCHOOL OF MEDICINE  NATIONAL UNIVERSITY OF SINGAPORE 

& 

SWISS TROPICAL AND PUBLIC HEALTH INSTITUTE 

UNIVERSITY OF BASEL 

2010 

PORCINE CIRCOVIRUS TYPE 2 (PCV2) REPLICATION

CARLA BIANCA LUENA VICTORIO 

(BSc. Molecular Biology and Biotechnology)  University of the Philippines Diliman 

& 

SWISS TROPICAL AND PUBLIC HEALTH INSTITUTE 

UNIVERSITY OF BASEL 

2010 

This  research  project  wouldn’t  have  been  possible  without  the  support  and  funding  from 

Temasek  Life  Science  Laboratories  (TLL)  and  the  expertise  of  the  researchers  at  the  Animal  Health 

Biotechnology Group headed by Prof. Jimmy Kwang. My special thanks to my supervisor, Prof. Kwang, co‐

supervisor, Prof. Justin Chu, and mentor Mr. Anbu Karuppannan for giving me guidance and direction in 

this research endeavor.  

This Joint Msc program had been a wonderful, albeit stressful, experience and I am grateful for 

this  opportunity  bestowed  to  me  by  Novartis  Institute  of  Tropical  Diseases  (NITD),  Swiss  Tropical  and 

Public  Health  Institute  (STPH),  and  National  University  of  Singapore  (NUS).  My  special  thanks  to  Ms. 

Christine Mensch for all the much‐needed assistance during my stay in Basel, and to Ms. Susie Soh for the 

constant  gentle  reminders  in  Singapore.  I  would  like  to  acknowledge  the  program  lecturers,  most 

especially  Prof.  Reto  Brun,  for  providing  the  inspiration  to  delve into  the field  of  drug discovery.  To the 

JIBES, thank you for making life outside the lab and lecture memorable. To Patricia, who has been my life 

raft these past 2 years; to Casey, Mad, Ed, Sukriti, Hanwern, Neisha, and Ashley, thank you for all the fond 

memories. 

I wish to express my heartfelt thanks to the people of TLL who showed me how to make stress a 

bearable  part  of  daily  life.  To  Shaz,  Peypey,  Lu  ting,  Keiko,  Adi,  Ivan,  and  Ranjay,  thanks  for  all  your 

support;  and  to  Vin, who  has  been  my source of  respite  during  the  crucial moments,  thank  you for the 

Summary . . .  5 

List of Tables and Figures . . .  6 

List of Abbreviations. . .  8 

  1.   Introduction  1.1.   Porcine Circoviruses (PCV) . . . 12 

  1.1.1.   PCV Taxonomy, Morphology and Genetics . . . 12 

  1.1.2.   Pathogenesis and Replication Cycle of PCV2 . . .  14 

1.2.   PCV2‐Associated Diseases (PCVAD) . . . 16 

  1.2.1.   Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome (PMWS) . . . 17  

  1.2.2.   PDNS and other PCVAD . . .  18 

  1.2.3.   Treatment of PCVAD  . . .  19 

1.3.   Assay Development and Screening . . .  20 

  1.3.1.   Cell‐based and Cell‐free Assays   . . .  21 

  1.3.2.   Signal Detection Systems   . . .  22 

  1.3.3.   Assay Development for HTS  . . .  23 

1.4.   Objectives of the Study  . . .  25 

  2.   Materials and Methods  2.1.   Maintenance of cell lines       

  2.1.1.   Culturing PK15‐C1 Cells   . . . 27 

  2.1.2.   Culturing 3D4/31 Cells   . . .  27 

  2.1.3.   Culturing #4 Clone Hybridoma Cells  . . . 28 

  2.1.4.   Cryopreservation of Cells  . . .  28 

  2.1.5.   Establishment of Cell Growth Curve  . . . 28 

2.2.  Production of High Titer PCV2 Stock       

  2.2.1.   Infecting Cells and Harvesting Virus  . . . 29  

  2.2.2.   Increasing PCV2 Titer   . . .  30 

  2.2.3.   Detection of Infection by Western Blot   . . . 31 

  2.2.4.   Detection of Infection by PCR   . . .  31 

2.2.5.   Virus titration by IFA   . . . 32 

2.3.  Cell‐Based Screening Assay Optimization       

  2.3.1.   Downscaling IFA to 384‐well Plate Format  . . .  33 

  2.3.2.   Cell‐Based ELISA   . . .  33 

2.4.  Testing Efficacy of Reference Drugs Against PCV2 Replication  2.4.1.   Establishment of Standard Curve for FI at Various   . . .  34         

Seeding Densities  2.4.2.   Evaluating Drug Cytotoxicity    . . . 34 

2.4.3.   Inhibition of PCV2 Replication with Reference Drugs  . . . 35 

2.5.  Generation of Graphs and Statistical Analyses    . . .   35 

  3.   Results  3.1.  Preparation of materials needed for the screening  . . . 37 

  3.1.1.   Finding the best cell line for the screening assay   . . 37 

  3.1.2.   Growth dynamics of PK15‐C1 cells . . .  39 

  3.1.3.   Generation of high titer PCV2 stock . . .  39 

3.1.4.   Large‐scale production of monoclonal antibodies . . . 40          

(clone #4)  3.2.  Scaling down of Assay to 384‐well plates . . .  42 

3.2.1.   Comparison of infection rates between glucosamine‐treated . . .  42      

and untreated cells  3.2.2.   Determining optimum cell seeding density, MOI, and . . .  42       

duration of infection 

3.2.4.   Comparison of FITC with Alexa Fluor 546 . . . 49 

  3.3.  Testing efficacy of reference drugs against PCV2 replication . . . .50 

3.3.1.   Standardizing the alamar blue cytotoxicity assay. . . 50 

3.3.2.   Determining cell tolerance for CAPE . . . 51 

3.3.3.   Efficacy of CAPE against PCV2 replication . . . 52 

3.3.4.  Development of screening assay using cell‐ELISA . . . 53 

  4 Discussion  . . .   58 

  5 References  . . . 73 

  6 Appendix  . . .  79 

6.1.  Effect of glucosamine treatment on infection rates at . . .  79      

various seeding densities     

6.2.  Standard curves for FI and absorbance with alamar blue . . .  82 

PVC2  is  a  small  non‐enveloped  virus  that  causes  a  wide  array  of  porcine  diseases 

categorized  under  the  umbrella  term  PCV‐Associated  Diseases  (PCVAD).  To  date,  the  only 

available antiviral strategy, albeit ineffective against diseased pigs, is prevention via vaccination. 

Thus,  treatment  of  affected  pigs  requires  discovery  of  drugs  that  inhibit  viral  replication.  The 

focus  of  this  MSc  project  was  to  develop  a  suitable  primary  screening  assay  for  inhibitors  of 

due  to  low  infection  rates  (<  5%)  resulting  from  stringent  blocking  and  washing,  which  were 

necessary  to  reduce  background  signals  in  ELISA.  Thus,  significantly  improving  infection  rates 

above  50%  is  necessary  to  optimize  these  cell‐based  screening  assays  for  inhibitors  of  PCV2 

replication. 

Tables 

1 Introduction 

Table 1.1   Common equations for determining assay performance . . . 24        

and sensitivity      Figures  1 Introduction  Figure 1.1   PCV Ultrastructure and Genome Morphology  . . . 12 

Figure 1.2  Genome Organization of Porcine Circoviruses . . .  14 

Figure 1.3  Map of Worldwide Occurrence of PWMS  . . . 18 

Figure 1.4  Flow of a Typical Drug Discovery Process  . . . 21 

  2 Materials and Methods    3 Results  Figure 3.1   Detection of PCV2 from PK15‐C1 and 3D4/31 Cultures . . . 38        

by PCR and Western Blot  Figure 3.2  PCV2 Rep Expression in PK15‐C1 and 3D4/31 Cells  . . . 38 

Figure 3.3  Growth Curve for PK15‐C1  . . . 39 

Figure 3.4  Titration of PCV2 BJW  . . . 40 

Figure 3.5  Titration of Concentrated PCV2 BJW  . . .   41 

Figure 3.6  Effect of Glucosamine Treatment on Infection Rates  . . .  43        

in 384‐well Plates 48 HPI  Figure 3.7  Effect of Glucosamine Treatment on Infection Rates . . . 43        

in 384‐well Plates 60 HPI  Figure 3.8  72 HPI Rates at Different Cell Seeding Densities and MOI . . .  44 

Figure 3.9  48 HPI Rates at Different Cell Seeding Densities and MOI  . . . 45 

1.1.1 PCV Taxonomy, Morphology and Genetics 

Porcine  circoviruses  (PCV)  are  small  non‐enveloped  viruses  with  a  circular  single‐

stranded DNA genome (1,700 nucleotides). The genome is packaged in an icosahedral capsid of 

17  nm  in  diameter  (Figure  1.1)  and  is  considered  the  smallest  virus  infecting  mammalian  cells 

(Tischer  et  al.,  1982;  Nawagitgul  et  al.,  2000).  PCV  was  serendipitously  identified  as  a  benign 

picornavirus‐like  contaminant  persisting  in  a  porcine  kidney  (PK‐15)  cell  line  without  causing 

PCV  was  recently  divided  into  two  genotypes  (PCV1  and  PCV2)  based  on  the 

identification  of  PCV‐like  entities  in  lesions  derived  from  pigs  affected  with  Post‐Weaning 

Multisystemic  Wasting  Syndrome  (PMWS),  but  displaying  distinct  antigenic  properties  from 

currently  known  PCV1  (Allan  et  al.,  1998;  Ellis  et  al.,  1998).  PCV1  and  PCV2  have  the  same 

ambisense  genomic  organization,  which  is  the  main  strategy  employed  by  PCV2  to  encode  six 

bacteriophages  that  replicate  by  the  same  manner  (Finsterbusch  and  Mankertz,  2009).  The 

origin  of  PCV2  replication  is  located  in  the  intergenic  region  between  the  transcriptional  start 

sites  of  ORF  1  and  ORF  2.  The  loop  has  an  AxTAxTAC  sequence  where  replication  is  initiated, 

while the stem has a 10‐nucleotide palindrome that serves as binding site for the Rep complex. 

Downstream of the stem‐loop is  a  series of four hexanucleotide  repeats (H1, H2,  H3, and H4), 

2009;  Mankertz  et  al.,  2004),  and  it  either  participates  in  another  round  of  replication  or 

packaged  into  the  capsid.  The  exact  mechanism  of  the  lagging  strand  synthesis  is  currently 

Figure  1.2  |  Genome  Organization  of  Porcine  Circoviruses.  ORF  1  (Rep)  is  encoded  on  the 

positive  (leading)  strand,  while  ORF  2  (Cap)  and  ORF  3  are  encoded  on  the  negative  (lagging) 

strand  of  the  PCV  genome.  ORF3‐encoded  protein  has  a  C‐terminal  truncation  compared  with the  PCV1  homolog.  The  stem‐loop  structure  represents  the  origin  of  replication  located  in  the intergenic region between the 5’ ends of ORF 1 and ORF 2. The arrow indicates the nicking site from  where replication  is  initiated. Boxed regions  represent  hexanucleotide  repeats, which  act 

as binding sites for Rep proteins. Source: (Finsterbusch and Mankertz, 2009). 

PCV2  is  capable  of  infecting  various  cell  types  from  various  species  (Liu  et  al.,  2005; 

Chaiyakul et al., 2010). Based on infection studies in 3D4/31 cells, a porcine‐derived monocytic 

cell  line,  PCV2  utilizes  the  surface  glycosaminoglycans  (GAG)  heparin,  heparan  sulfate  and 

chondroitin  sulfate‐B  on  the  host  cell  for  attachment  (Misinzo  et  al.,  2006).  The  virus  is 

afterwards  internalized  by  clathrin‐mediated  endocytosis  and  passes  through  the  endosome 

pathway, where uncoating requires an acidic environment (Misinzo et al., 2005). In PK15 cells, a 

porcine‐derived  kidney  cell  line,  inhibition  of  endosome  acidification  led  to  increased  PCV2 

disassembly  (Misinzo  et  al.,  2008)  suggesting  that  acidification  is  unnecessary  for  virus 

uncoating.  This  disparity  in  findings  was  speculated  to  be  due  to  distinct  serine  proteases 

mitosis when nuclear  material  is being distributed to the daughter cells” (Tischer et al.,  1987). 

However,  treatment  with  glucosamine  enables  the  PCV  DNA  to  “enter  the  nucleus  directly” 

through an  unknown  mechanism, hence  circumventing  the  need for  mitosis  before replication 

initiation (Tischer et al., 1987) and resulting to significantly higher infection rates. 

Once  the  negative‐strand  DNA  has  been  produced,  ORF  2  encoding  the  Cap  protein  is 

expressed. The protein has a mass of 26 kilo Daltons (kDa) and is found to self‐assemble to form 

the  characteristic  icosahedral  structure  of  PCV2  capsid  (Nawagitgul  et  al.,  2000).  The  viral 

genome  is  packaged  into  the  capsid  through  still  unknown  mechanism,  and  the  progeny  virus 

subsequently  form  paracrystalline  arrays  within  inclusion  bodies  under  the  cell  membrane  of 

infected cells, in preparation for release to the environment (Stevenson et al., 1999). At the end 

by ORF 3 protein (Liu et al., 2006; Liu et al., 2005), which was shown to interact with a porcine 

homolog  of  human  ubiquitin  ligase  E3  hPirH2  (human  p53‐induced  RING‐H2).  ORF3  protein 

binding  destabilizes  pPirH2  (porcine  p53‐induced  RING‐H2)  and  results  to  increased  p53 

expression  and  subsequent  apoptosis  (Liu  et  al.,  2007;  Karuppannan  et  al.,  2010).  Apoptosis 

allows progeny virus to be disseminated into the environment and aids infection of neighboring 

cells, resulting to increased viral load (Karuppannan and Kwang, 2010).  

Although  both  PCV1  and  PCV2  have  been  detected  in  and  isolated  from  both  healthy 

and diseased pigs (Allan and Ellis, 2000; Chae, 2004; Harding, 2004) and despite the documented 

high  homology  between  the  two  virus  genomes,  only  PCV2  had  been  associated  with  porcine 

disease  while  PCV1  remained  benign.  Determinants  hypothesized  to  cause  the  differential 

pathogenic  potential  of  these  two  closely  related  viruses  are  ORF2  and  ORF3  proteins.  ORF2 

PCVAD  is  divided  into  “clinical  syndromes  and  diseases  that  have  pre‐or  post‐natal 

manifestations”  (Grau‐Roma  et  al.,  2010)  and  include  Postweaning  Multisystemic  Wasting 

Disease  Complex  (PRDC),  Reproductive  Failure,  etc.  PCV2  is  a  ubiquitous  virus  and  has  been 

reported  from  all  continents  (Grau‐Roma  et  al.,  2010).  It  is  believed  to  be  horizontally 

transmitted  by  direct  contact  among  pigs  through  the  oronasal  route,  although  it  can  also  be 

shed  in  bodily  secretions  such  feces,  saliva,  urine,  milk,  and  semen  (Larochelle  et  al.,  2000; 

nodes,  diarrhea,  pallor,  and  jaundice  or  yellowing  of  the  skin  (Harding,  2004;  Chae,  2005). 

Isolation  of  microscopic  lymphoid  lesions  with  PCV2  antigen  detected  either  through  in  situ 

hybridization  (ISH)  or  immunohistochemistry  (IHC)  is  also  necessary  to  diagnose  PMWS  (Chae, 

2004).  Although  PCV2  is  necessary  to  cause  PMWS,  it  is  not  sufficient  and  it  only  causes  the 

disease  in  the  presence  of  either  immunomodulatory  agents  or  other  swine  pathogens.  The 

most  commonly  found  pathogens  in  PCV2  co‐infections  resulting  to  PMWS  include  porcine 

parvovirus (PPV), porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), swine influenza 

virus  (SIV),  Streptococcus  suis,    and  Mycoplasma  hyopneumoniae.  Noninfectious 

immunomodulators  leading  to  the  disease  include  keyhole  limpet  hemocyanin  in  incomplete 

Freund’s  adjuvant  (Kennedy  et  al.,  2000;  Tomás  et  al.,  2008).  One  hypothesis  put  forward  to 

explain  this  phenomenon  is  that  lymphoid  depletion  caused  by  PCV2  infection  leads  to  an 

immunocompromised  state  in  pigs  resulting  to  enhanced  susceptibility  to  other  swine 

pathogens. This is supported by the observation of successful induction of PMWS in postweaned 

pigs  once  maternal  antibodies  have  waned,  and  following  immunosuppression  caused  by 

along  with  the  initial  reports  of  PMWS.  The  disease  has  been  reported  from  North  and  South 

America,  Europe,  and  Asia.  Source:  (Nawagitgul  et  al.,  2000;  Chae,  2004).  PCV2  but  not  the  disease  has  been  reported  from  Australia  and  New  Zealand  (Raye  et  al.,  2005;  Muhling  et  al., 

2006). 

in PDNS‐affected pigs are localized in kidneys and not in lymphoid tissues. 

PRDC is another health problem observed in pigs 16‐22 weeks of age. It is also caused by 

co‐infections of PCV2 with PRRSV, SIV, M. hyopneumoniae, and other swine pathogens. PRDC is 

diagnosed  by  meeting  criteria,  which  includes  presence  of  respiratory  signs  such  as  prolonged 

dyspnea,  pulmonary  microscopic  lesions  with  PCV2  antigens,  and  absence  of  lymphoid  lesions 

characteristic of PMWS (Ellis et al., 2004).   

PCV2 is also associated with high rates of abortion, stillbirths and fetal mummification. 

PCV2 has been isolated from specimens with reproductive failure at different stages of gestation 

(Sanchez  et  al.,  2001),  although  characteristic  lesions  were  absent  in  recovered  fetuses.  Aside 

from  the  diseases  and  syndromes  mentioned,  PCV2  has  been  associated  with  other  infectious 

porcine  diseases  including  necrotizing  lymphadenitis,  congenital  tremors,  and  other  hepatic, 

enteric and renal diseases (Ellis et al., 2004; Chae, 2005). 

1.2.3 Treatment of PCVAD 

Agents that inactivate PCV2 could potentially aid in the treatment of PCVAD. PCV2 is a 

non‐enveloped  virus  and  therefore resistant  to  lipid‐dissolving  disinfectants  commonly  used  in 

farms  such  as  alcohol,  chlorhexidine,  and  phenol.  Moreover,  PCV2  is  highly  thermostable  and 

a  subunit  vaccine  containing  purified  Cap  protein  expressed  from  Baculovirus 

(BoehringerIngelheimVetmedica,  2010); CircumventTM vaccine (Intervet Inc., Millsboro, Denver, 

USA) is derived from killed baculovirus expressing purified PCV2 Cap antigen (Schering‐Plough, 

2009) . Both CircoFLEXTM and Suvaxyn® are single‐dose vaccines, while CircumventTM is a 2‐dose 

vaccine. All three vaccines are recommended to be given to healthy piglets prior to weaning and 

had  been  tested  in  field  conditions.  Trial  immunizations  resulted  to  reduction  of  viremia  in 

unchallenged  pigs  (Kixmöller  et  al.,  2008;  Segalés  et  al.,  2009)  and  development  of  long‐term 

Since  PCV2  causes  a  wide  array  of  swine  diseases  and  vaccination,  which  is  the  only 

antiviral  strategy  currently  available,  confers  only  limited  protection,  there  is  urgent  need  for 

developing drugs that can cure diseased pigs. No such drugs exist to date and they have to be 

discovered.  The  drug  discovery  process  is  usually  divided  into  two  phases:  1)  Research  and  2) 

Development.  The  research  phase  deals  with  the  identification  of  an  array  of  suitable 

compounds  with  desired  effect  against  a  selected  target,  while  the  development  phase  deals 

with (1) optimization of the compound for greater potency and efficacy, and (2) formulation into 

a  marketable  drug  suitable  for  consumption.  The  research  phase  typically  begins  with 

Generally,  assays  in  drug  discovery  are  classified  as  either  cell‐based  or  target‐based 

techniques.  In  the  former,  whole‐cell  phenotypic  responses  are  measured;  while  in  the  latter, 

binding and kinetics of individual molecules (the target and candidate drug) are measured in cell‐

free  systems.  Cell‐based  assays  are  further  classified  into  three  broad  categories:  (1)  second 

messenger assays, (2) reporter gene assays, and (3) cell proliferation assays. Second messenger 

Figure  1.4  |  Flow  of  a  Typical  Drug  Discovery  Process.  Drug  discovery  is  divided  into  two 

phases:  1)  Research  and  2)  Development.  The  research  phase  deals  with  identification  of candidate  compounds  against  a  selected  target,  while  the  development  phase  deals  with optimizing  the  compound  for  human  consumption  and  formulating  as  a  suitable  marketable 

drug. Source: (Novartis, 2010) 

assays  involve  measurement  of  signal  transduction  resulting  from  activation  of  cell‐surface 

receptors,  such  as  in  the  discovery  of  ion  channel  activators  and  inhibitors  (Gonzales  et  al., 

1999). Reporter gene assays monitor responses at the transcriptional and translational levels of 

cells  transfected  with  reporter  genes  depending  on  the  expression  of  the  reporter  upon 

activation of the target gene (Mankertz et al., 2003). These offer advantages such as availability 

of  multiple  instrumentation  platforms,  relative  low  cost  of  reagents,  and  high  amenability  for 

HTS  (Johnston,  2002).  Lastly,  cell  proliferation  assays  monitor  the  activated  or  stunted  cell 

less  complicated  due  to  the  absence  of  whole  biological  systems,  hits  obtained  are  often 

confounded  by  nonspecific  binding  and  background  signals  from  the  compounds  being  tested 

SPA  microbeads  or  FlashPlateTM  surfaces  containing  scintillant  and  coated  with  the  target  of 

interest.  Binding  of  a  radiolabeled  molecule  to  the  target  brings  the  radioisotope  in  close 

proximity to the solid support, leading to energy transfer between the emitted beta particle and 

the  scintillant  and  subsequent  release  of  photons.    However,  radiometric  assays  were  slowly 

phased  out  due  to  safety  issues,  limited  reagent  stability,  and  relatively  long  read  times 

Another  method  to  circumvent  problems  resulting  from  high  background  signal  is 

through  luminescent  detection  systems  (Inglese  et  al.,  2007).  Luminescence  generates  light 

through  catalytic  reactions  on  a  substrate,  either  through  an  enzyme  (Bioluminescence)  or 

through  decay  of  an  unstable  chemical  intermediate  (Chemiluminescence)  (Schweitzer  and 

Once  the  format  and  detection  system  have  been  chosen,  the  assay  is  developed  as  a 

bench  top  method  with  low  throughput,  and  later  miniaturized  to  smaller‐volume  formats 

(typically  using  microtiter  plates)  amenable  to  high‐throughput  screening  (HTS).  Factors  to 

consider  when  developing  an  assay  include:  (1)  defined  response  to  be  measured,  (2)  clear 

parameter‐response  dependence,  and  (3)  lag  time  between  stimulation  with  the  compounds 

and response readout  (Inglese  et al.,  2007).  An orthogonal  assay,  which  can  be done either in 

parallel with the primary screen or as a secondary screen, is beneficial for confirmatory test and 

precluding false‐positive hits from the panel of candidate molecules. 

HTS  is  the  main  driving  force  in  the  drug  discovery  process  implemented  in 

pharmaceutical  industries  (Fox  et  al.,  2006).  Before  miniaturizing  the  assay  for  HTS,  however, 

several  factors  must  be  optimized.  These  include  (1)  reasonable  sensitivity,  (2)  result 

reproducibility  and  stability,  (3)  accuracy  of  positive  and  negative  controls,  and  (4)  economic 

mechanization  and  automation;  throughput  reaching  100,000  compounds  per  day  is  possible 

with  ultra  high‐throughput  screening  (uHTS)  (Sundberg,  2000).  Although  the  concept  remains 

the same when adapting the assay for HTS, several modifications have to be done from normal 

bench  top  formats;  HTS  assays  require  fewer  steps,  often  as  a  “mix‐and‐measure”  technique, 

precluding  washing  and  other  intermediate  steps  that  may  be  time‐consuming  and  difficult  to 

automate.  Assay  volume  is  in  the  microliter  and  sometimes  nanoliter  range  due  to 

miniaturization  with  384‐well  and  even  96,000‐well  plates  (Hertzberg  and  Pope,  2000).  Lastly, 

readout  from  individual  wells  is  analyzed  with  defined  statistical  parameters  instead  of 

population‐averaged  data.  This  is  currently  done  with  the  aid  of  computers  equipped  with 

PCV2  is  a  widespread  virus  that  causes  an  array  of  diseases  and  syndromes  in  pigs 

(PCVAD)  worldwide  but  currently  the  only  antiviral  strategy  is  prevention  by  vaccination  of 

1  mM  sodium  pyruvate  (SIGMA),  2.2  g/L  sodium  bicarbonate  (NaHCO3, SIGMA),  5%  heat‐

inactivated FBS and antibiotics, incubated at 37o C and 5% CO2 in a humidified chamber. Upon 

confluence,  cells  were  split  in  1:4  ratio;  cells  were  washed  four  times  in  1x  PBS  (pH  7.4)  and 

twice in Trypsin (0.25% trypsin, 1 mM EDTA). Afterwards cells were incubated for 3 minutes at 

37o  C  in  trypsin  and  the  dislodged  cells  were  washed  in  pre‐warmed  5%  MEM.  Trypsin  was 

removed  by  centrifugation  of  cells  at  200  RCF  for  5  minutes  in  RT,  and  the  cell  pellet  was 

resuspended in fresh 5% MEM, stained with trypan blue, and viable cells were counted with a 

hemacytometer prior to seeding in culture vessels. 

2.1.2 Culturing 3D4/31 Cells 

The  transformed  monocytic  cell  line  3D4/31  (ATCC  No.  CRL‐2844)  was  also  used  to 

propagate  PCV2.  Cells  were  maintained  in  filter‐sterilized  RPMI  1640  (GibcoTM)  medium 

supplemented with 2mM L‐glutamine, 1.5 g/l NaHCO3, 4.5 g/L glucose, 10 mM HEPES buffer, 1 

mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acids, and 10% FBS incubated at 37o C, 5% 

CO2 . Cells were split at 1:5 ratio by washing 5 times in PBS and twice in 0.25% trypsin solution 

before incubation in trypsin for 5 minutes at 37o C. Dislodged cells were washed in pre‐warmed 

medium,  and  trypsin  was  removed  by  centrifugation  at  200  RCF  for  5  minutes  in  RT.  The  cell 

pellet  was  resuspended  in  fresh  medium  and  viable  cells  were  counted  prior  to  seeding  onto 

new flasks.