Bài giảng công nghệ sinh học đại cương full đại học nông nghiệp hà nội

CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG CHƯƠNG 1: KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC 1.1. Khái niệm về công nghệ sinh học Có nhiều định nghĩa về công nghệ sinh học (Biotechnology), tùy theo từng tác giả khác nhau, nhưng tất cả đều thống nhất về khái niệm cơ bản sau đây: Công nghệ sinh học là sự sản xuất các sản phẩm trên quy mô công nghiệp, trong đó nhân tố tham gia trực tiếp và quyết định là các tế bào sống (vi sinh vật, thực vật, động vật). Mỗi tế bào sống củ a cơ thể sinh vật hoạt động trong lĩnh vực sản xuất này được xem như một lò phản ứng nhỏ. Vào những năm 1980, công nghệ sinh học đã chuyển sang một giai đoạn mới là là giai đoạn công nghệ sinh học hiện đại với việc sử dụng các thành tựu của kỹ thuật gen, là lĩnh vực công nghiệp sử dụng hoạt động sinh học của các t ế bào đã được biến đổi di truyền. Cơ sở sinh học được áp dụng ở đây bao gồm sinh học phân tử, sinh học tế bào, hóa sinh học, di truyền học, vi sinh vật học, miễn dịch học, cùng các nguyên lý kỹ thuật máy tính . Có hai cách định nghĩa công nghệ sinh học một cách tổng quát nhất: Do UNESCO (1985) định nghĩa: Công nghệ sinh học là công nghệ sử dụng một bộ phận hay tế bào riêng rẽ của c ơ thể sinh vật vào việc khai thác sản phẩm của chúng. Do Trường Luật Stanford (1995) định nghĩa: Công nghệ sinh học là công nghệ chuyển một hay nhiều gen vào sinh vật chủ nhằm mục đích khai thác sản phẩm và chức năng của gen đó.

CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG

(SH3014)

Giảng viên: Ninh Thị Thảo

CHƯƠNG II: CÁC KỸTHUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI

(10 TIẾT)

 Chức năng và ứng dụng của các enzyme giới hạn

 Giới thiệu các vector nhân dòng và kỹ thuật nhân dòng gen

 Các phương pháp lai phân tử

 Phương pháp PCR, ứng dụng

 Kỹ thuật xác định trình tự DNA

 Kỹ thuật tạo thư viện genome và cDNA

Kiến thức ôn tập

• Cấu trúc phân tử DNA

Thành phần cấu tạo của DNA- các bazơ

Purines Pyrimidines

[structure of deoxyadenosine]

Nucleoside

Nucleotide

DNA  RNA  Protein  Function

Học thuyết trung tâm:The Central Dogma

Transcription

Replication

Translation

Work

Phân loại Gene

coding genes non-coding genes

ribosomal RNA

other RNA

Chromosome

intergenic region

2.1 ENZYME GIỚI HẠN (RESTRICTION ENZYME - RE)

 Khái niệm : là các enzyme có

• 1950s: một số dòng vi khuẩn có khả năng chống lại sự xâm nhiễm của một số bacteriophages

• 1962: phát hiện các vi khuẩn này có chứa hệ thống enzyme có khả năng nhận biết và phá huỷ DNA của phage, đồng thời có khả năng tự biến đổi DNA của bản thân để tránh bị phá huỷ

• 1970: Haminton Smith at Johns Hopkins University, Phát

hiện được enzyme HindII từ Haemophilus influenzae: có

khả năng cắt đặc hiệu đồng thời tự methyl hoá DNA của

tế bào chủ để tự bảo vệ

Lịch sử phát hiện

Restriction Endonucleases

Why don’t bacteria destroy their own DNA with their restriction enzymes?

Methylation

• Loại I : Cắt tại điểm cách vị trí giới hạn khoảng 1000-5000 nucleotide

• Loại II : cắt ngay tại vị trí giới hạn

• Loại III : cắt ở vị trí cách vị trí giới hạn đó khoảng 20 nucleotide

Phân loại các RE

Genus (Tên chi)

Species (Tên loài)

Đặc điểm của trình tự nhận biết của RE loại II

Don't nod Dogma: I am God Never odd or even Too bad – I hid a boot Rats live on no evil star

No trace; not one carton Was it Eliot's toilet I saw? Murder for a jar of red rum Some men interpret nine memos Campus Motto: Bottoms up, Mac

Go deliver a dare, vile dog! Madam, in Eden I'm Adam Oozy rat in a sanitary zoo

Ah, Satan sees Natasha Lisa Bonet ate no basil

Do geese see God?

God saw I was dog Dennis sinned

Trình tự nhận biết là các

palindrome Đây là đoạn DNA

mạch kép, 2 mạch bổ sung có

trình tự giống nhau khi đọc theo

cùng chiều 5’3’ hoặc ngược lại

Nếu giả thiết trình tự sắp xếp của các loại base là ngẫu

nhiên thì xác suất để một đoạn trình tự được nhận biết sẽ

là 1/4 n (n là chiều dài (bp) của chuỗi được nhận biết)

Ví dụ một số RE loại II

• Tạo DNA tái tổ hợp

• Lập bản đồ giới hạn

Ứng dụng của RE loại II trong công nghệ gen

• DNA tái tổ hợp là các DNA được tạo thành

từ ít nhất hai đoạn DNA có nguồn gốc khác

nhau thông qua vi thao tác của con người

• Nếu như 2 (hay nhiều) DNA đều được cắt

bởi cùng một loại enzyme thì các đầu cắt

của các đoạn DNA được tạo ra hoàn toàn

khớp nhau (tương ứng theo quy tắc bổ

sung) gọi là các đầu dính và chúng rất dễ

dàng gắn lại với nhau khi có mặt enzym

ligase Từ đây xuất hiện khả năng ghép nối

các DNA có nguồn gốc khác nhau để tạo

nên DNA tái tổ hợp

Tạo DNA tái tổ hợp

Bản đồ giới hạn

• Là bản đồ thể hiện loại enzyme giới hạn, số lượng

và kích thước các đoạn DNA bị cắt bằng enzyme giới hạn

• Một phân tử khi sử dụng các loại enzyme khác nhau có thể cho nhiều đoạn cắt khác nhau hình thành nên các bản đồ giới hạn khác nhau

• Được sử dụng trong xác định nguồn gốc hoặc sự khác nhau giữa các cá thể trong loài

Sử dụng enzym 1 để cắt đoạn ADN nghiên cứu (kích thước 17kb) Kết quả cho 3 đoạn ADN (6kb, 3kb, 8kb) Điều này chứng

tỏ enzym 1 có 2 vị trí cắt trên đoạn ADN nhưng chưa rõ đoạn 3kb nằm ở giữa hay ở cuối sợi Khi cắt sợi ADN nghiên cứu bằng enzym 2, kết quả cho 2 đoạn cắt (7kb, 10kb) chứng tỏ enzym này chỉ có một điểm cắt trên sợi 17kb Khi cắt bằng tổ hợp hai enzym 1 và 2 cho thấy

có sự xuất hiện lại đoạn 6kb và 8kb, hai đoạn này là sản phẩm của sự hoạt động của enzym 1 Như vậy đoạn 3kb sẽ bị cắt bởi enzym 2 (vỡ kết quả cắt phối hợp cho 4 đoạn (6kb, 8kb, 2kb,

1 kb) Từ đây suy ra đoạn 3kb phải nằm ở giữa sợi

VÍ DỤ VỀ LẬP BẢN ĐỒ GIỚI HẠN

Restriction enzyme animation

http://www.dnai.org/b/index.html

Hãy vẽ bản đồ giới hạn từ những số liệu trên?

CHƯƠNG II: CÁC KỸTHUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI

(10 TIẾT)

 Chức năng và ứng dụng của các enzyme giới hạn

 Giới thiệu các vector nhân dòng và kỹ thuật nhân dòng gen

 Các phương pháp lai phân tử

 Phương pháp PCR, ứng dụng

 Kỹ thuật xác định trình tự DNA

 Kỹ thuật tạo thư viện genome và cDNA

• Nhân dòng DNA là kỹ thuật dùng để tái sản xuất các đoạn DNA

 Vector là các phân tử được dùng để mang các đoạn DNA/gen đã được tách dòng

 Trong thực tế, một đoạn DNA lạ không thể duy trì và nhân bản trong tế bào chủ mới nếu như nó được chuyển vào tế bào chủ mới chỉ ở dạng một đoạn DNA đơn độc

 Do enzyme DNA polymerase làm nhiệm vụ tái bản DNA không thể khởi đầu quá trình tái bản từ bất kỳ địa điểm nào trên DNA mà chỉ ở những địa điểm đặc hiệu gọi là “điểm tái bản” (origins of replication)Các đoạn DNA (các gen) muốn tái bản được trong tế bào chủ mới cần phải được gắn vào một vectơ (cloning vectors)

Vector nhân dòng thực chất là một phân tử DNA có gốc tái bản và có thể nhân lên trong tế bào chủ đã chọn

Vector nhân dòng DNA

• Chỉ có một địa điểm nhận biết cho một RE nào đó

– Nếu như số địa điểm này lớn hơn 1 sẽ gây rối loạn cho sự nhân dòng sau này Một vector nhân dòng sẽ càng có ý nghĩa hơn nếu như nó có thể được cắt nhờ nhiều loại RE và tất nhiên ứng với mỗi loại cũng chỉ có một địa điểm nhận biết

• Phải có một hoặc nhiều chỉ thị di truyền chọn lọc

– Thí dụ như tính kháng kháng sinh, tính xúc tác cho các phản ứng tạo mầu Điều này cần thiết để có thể chọn lọc được các tế bào đã được chuyển nạp, dựa trên cơ sở kháng kháng sinh, tạo phản ứng mầu của chúng

• Phải có điểm tái bản để đảm bảo sự nhân lên của chúng trong tế bào chủ mới

– Trong một số trường hợp một plasmid có thể được sử dụng làm vector nhân dòng cho hai tế bào chủ không có liên quan với nhau

như E.coli và Bacillus subtilis Các vector hai chức năng này phải

có số điểm tái bản lớn hơn 1

Tiêu chuẩn của một vector nhân dòng

Các loại vector nhân dòng DNA

• Các loại vector nhân dòng khác nhau được sử dụng cho các thí nghiệm nhân dòng khác nhau

• Việc lựa chọn vector phụ thuộc vào kích thưứoc và loại DNA cần nhân dòng

Các loại vector nhân dòng DNA

 Kích thước nhỏ (3-20kb)

 Genome đã được giải mã

 Số bản copy cao

 thấp (1 – 10) hoặc cao (100 – 1000) copies/tế bào

 Chứa gen chỉ thị hoặc chọn lọc

 kanamycin resistance gene (kanR)

 tetracycline resistance gene (tetR)

 ampicillin resistance gene (ampR)

 …

Chứa trình tự nhận biết duy nhất cho nhiều RE

Ưu điểm của plasmid vectors:

Một số plasmid vector

 pBR plasmid

 pUC

• Đây là nhóm các plasmid được phát triển từ plasmid pBR322

• Phần chứa gen kháng tetracyline (khoảng 40 % DNA) được cắt bỏ còn phần gen kháng ampicillin và gốc tái bản của pBR322 được giữ lại

• Ngoài ra, các vị trí nhân dòng hay vị trí gắn các đoạn ADN ngoại lai (cũng

là các vị trí cắt của các enzym giới hạn) của pUC được phân bố tập trung vào một vị trí gọi là vị trí đa nhân dòng (multiple cloning site-MCS)

Nhóm plasmid pUC

• Gốc tái bản

• Marker chọn lọc

• Vị trí đa nhân dòng (Multiple cloning site – MCS/polylinker)

Older cloning vector

Thành phần của một plasmid

• Là một đoạn DNA với nhiều vị trí

nhận biết duy nhất cho các

enzyme giới hạn Việc cắt

plasmids với một trong các RE

trong vùng MCS không ảnh

hưởng gì đến các đặc tình cần

thiết khác của vector

• Gene cần nhân dòng được gắn

vào vector nhân dòng ở một vị trí

giới hạn trong vùng polylinker

Vị trí đa nhân dòng (Multiple cloning site – MCS / polylinker)

• Không nhân dòng được các đoạn DNA kích thước lớn

• Thường nhân đoạn 4 - 10 kb

• Hiệu suất biến nạp thường không cao

Hạn chế của plasmid vectors

Khả năng chèn đoạn DNA ngoại lai của một số

• DNA cloning cho phép chọn lọc và sao chép bất kỳ một đoạn trình tự đặc thù của DNA (hoặc RNA) và sản xuất với một lượng không giới hạn

• Là bước đầu tiên trong một loạt các thí nghiệm về kỹ thuật di truyển

– Tạo thư viện DNA

– PCR

– DNA sequencing

Nhân dòng DNA

Các bước cơ bản của nhân dòng gen

1 Tách chiết DNA từ mẫu nghiên cứu,

cắt DNA bằng enzym cắt giới hạn để

tạo ra các đoạn DNA là nguyên liệu

cho quá trình nhân dòng (tách dòng)

2 Gắn các đoạn cắt vào một vector nhân

dòng

3 Chuyển nạp các vector nhân dòng sau

phản ứng gắn trên vào tế bào sinh vật

chủ để nhân bản các đoạn DNA đã

được gắn cùng với vector

4 Chọn lọc, tập hợp các đoạn gắn thành

từng dòng riêng hình thành thư viện

mẫu đã nhân dòng Từ đây có thể

chọn lọc ra các trình tự cần quan tâm

Xử lý vector với enzyme cắt giới hạn hình thành đoạn bổ sung với đoạn DNA cần nhân

Đoạn DNA cần nhân dòng đã được xử lý enzyme giới hạn

Nối đoạn DNA với vector nhờ enzyme DNA ligase

Phân tử DNA tái tổ hợp

Chuyển vào tế bào vi khuẩn

Nhiễm sắc thể vi khuẩn

Phân tử DNA tái

tổ hợp

Nhân dòng DNA sử dụng vector pUC19 Bước 1: Cắt DNA mẫu và plasmid bằng RE

Xử lý enzyme EcoRI

Xử lý enzyme EcoRI

Bước 2: Nối mẫu DNA vào pUC19

Mẫu DNA đã được xử lý bằng

EcoRI

Vector plasmid được xử lý bằng

EcoRI

Quá trình lai thực hiện nhờ DNA ligase

Nhân dòng DNA sử dụng vector pUC19

– Phương pháp hóa học sử dụng CaCl2 và sốc nhiệt để thúc đẩy DNA đi vào trong tế bào

– Dùng xung điện (electroporation ) để kích thích quá trình tế bào tiếp nhận DNA

Nhân dòng DNA sử dụng vector pUC19

Biến nạp theo phương pháp dùng CaCl 2 và sốc nhiệt

Khuẩn lạc mọc trên môi trường

chọn lọc

Biến nạp bằng xung điện

Xung điện

Plasmid tái tổ hợp

Cấy trải trên môi trường chọn lọc

Khuẩn lạc mọc trên môi trường chọn lọc

Đệm

Đặt trong đá

Các sản phẩm thu được sau biến nạp

plasmid + đoạn DNA

Chọn lọc trắng xanh

Dựa vào hệ thống lac Operon: điều khiển phản ứng

đối với lactose trong tế bào E coli

 - galactosidase &  -glucuronidase

Lactose Galactose + Glucose  - galactosidase

 -D-glucuronid + H2O Glucuronic acid + Glucose  - glucuronidase

LacZ gene

promotor

RNA pol

Gene LacZ ở trạng thái hoạt động

RNA pol

IPTG

IPTG IPTG LacZ

promotor operator

IPTG

IPTG

RNA pol

IPTG

X-gal beta-galactosidase X + galactose

LacZ Insert

Khuẩn lạc TRẮNG Khuẩn lạc XANH

Mô hình sử dụng gene LacZ trong chọn lọc

Như vậy:

• Chỉ các vi khuẩn nào có chứa plasmid đã chuyển nạp thì tồn tại được trên môi trường và sinh khuẩn lạc (vì có plasmid chuyển nạp thì mới có gen chịu kháng sinh )

• Do cấu trúc của plasmid, vùng gen chịu trách nhiệm sinh màu (gen mã hoá  -galactozidase) sẽ là vùng bị cắt để gắn DNA ngoại vào, cho nên các khuẩn lạc có mầu xanh

là khuẩn lạc có chứa plasmid nhưng không gắn DNA ngoại lai, còn khuẩn lạc có mầu trắng chính là khuẩn lạc

có chứa 1 đoạn DNA cần nhân dòng được ghép vào

Bước 4:

(tiếp )

• Chọn các khuẩn lạc trắng nuôi trong môi trường lỏng có

bổ sung ampicillin để nhân nhanh sinh khối

• Tách chiết plasmid và tiến hành kiểm tra kết quả nối DNA vào plasmid (khẳng định sự có mặt của đoạn DNA mong muốn trong plasmid) bằng các phương pháp như PCR, sử dụng RE

Nhân dòng DNA sử dụng vector pUC19

Movie on making recombinant DNA

CHƯƠNG II: CÁC KỸTHUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI

(10 TIẾT)

 Chức năng và ứng dụng của các enzyme giới hạn

 Giới thiệu các vector nhân dòng và kỹ thuật nhân dòng gen

 Các phương pháp lai phân tử

 Phương pháp PCR, ứng dụng

 Kỹ thuật xác định trình tự DNA

 Kỹ thuật tạo thư viện genome và cDNA

 Sự bắt cặp lai (Hybridization) theo cơ chế

Lai phân tử là quá trình kết hợp lại

của hai mạch đơn DNA hoặc

DNA-RNA

Cơ sở của việc lai phân tử là các

mối liên kết hydro giữa các base

trên hai mạch Giữa một base A và

một base T (hoặc U) hình thành

hai liên kết hydro còn giữa G và C

hình thành ba liên kết

LAI GIỮA CÁC NUCLEIC ACID

(DNA – DNA hoặc DNA – RNA)

Lai giữa các nucleic acid

LAI GIỮA CÁC NUCLEIC ACID

(DNA – DNA hoặc DNA – RNA)

• LAI SOUTHERN ( DNA – DNA )

MỘT SỐ KỸ THUẬT LAI PHÂN TỬ

So sánh sự phân tích gene X sử dụng các kỹ thuật lai

Southern, Northern và Western

• Lịch sử

– Do Edwin Southern đề xuất

năm 1975 và sau đó được tiếp

tục hoàn thiện

– Với sự phát triển của kỹ thuật

này, Southern đã nhận được

giải thưởng Lancaster trong

lĩnh vực Y học vào năm 2005

LAI SOUTHERN

Edwin Southern

• Kỹ thuật lai Southern cho biết

– Sự có mặt của đoạn DNA (gen)

– Số lượng đoạn DNA có mặt (tương ứng với số gen)

– Độ lớn của đoạn DNA

– Trình tự tương tự giữ đoạn DNA mục tiêu và mẫu dò

Các bước tiến hành

(giai đoạn này gồm nhiều bước)

Mẫu dò được phủ trên toàn bộ màng lai nhưng

Các đoạn bổ sung với mẫu dò xuất hiện như các vạch băng

Màng mang phân

tử lai giữa mẫu dò

đặt trên màng lai cho đến khi sự phát

xạ từ mẫu dò được ghi lên phim

Bước 4: Thu kết quả

Kết quả lai hiện lên phim nhờ phóng xạ tự ghi

Bước 4: Thu kết quả

LAI NORTHERN

• Lịch sử

− Được phát triển vào năm 1977 bởi James Alwine

và George Stark tại Stanford University

− Phát triển từ kỹ thuật lai Southern và được ứng dụng cho phân tích RNA

LAI NORTHERN

• Nguyên lý

– Dựa trên sự bắt cặp bổ sung giữa DNA và RNA

– Phương pháp lai Northern Blot là phương pháp lai RNA của tế bào với mẫu dò DNA Các bước tiến hành cũng tương tự như phương pháp Southern blot

• Phương pháp này cho biết

– Sự có mặt của mRNA trong mô

– Mức độ thể hiện của gen

– Độ lớn của mRNA

– Trình tự tương đồng giữa đoạn mục tiêu và mẫu dò

(E)

Vị trí xảy ra lai RNA-DNA

Phân tách RNA theo kích

thước nhờ chạy điện di

Mẫu RNA

Khay chứa dung dịch đệm

Bổ sung mẫu

dò phóng xạ mạch đơn

Túi lai

Ghi nhận kết quả bằng phóng xạ tự ghi

Vị trí không lai

Bước1 : chuẩn bị RNA mẫu

Bước 2 : Chuyển RNA lên màng lai

- Chạy điện di

- Chuyển RNA lên màng lai

Bước 3 : Lai RNA với mẫu dò

Bước 4 : Kết thúc phản ứng lai, thu kết quả lai

Các bước tiến hành

LAI WESTERN

• Lịch sử

− Phương pháp này được thực hiện đầu tiên ở phòng thí nghiệm của George Stark ở Stanford Kỹ thuật này đã được W Neal Burnette đặt tên là Western blot (1981), nối tiếp theo tên Southern blot

LAI WESTERN

• Nguyên lý

– Lai Western Blot được thực hiện giữa các protein với nhau dựa trên nguyên tắc phản ứng miễn dịch giữa kháng nguyên và kháng thể

• Phương pháp này cho biết

– Sự thể hiện của gen thông qua sự có mặt của protein trong mô

– Mức độ thể hiện của gen

– Độ lớn của protein