NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÁ BỖNG Ở SÔNG, SUỐI MỘT SỐ TỈNH MIỀN NÚI PHÍA BẮC VIỆT NAM PHỤC VỤ BẢO TỒN VÀ KHAI THÁC

... Phân tích đa dạng di truyền cá Bỗng sông, suối số tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam thị phân tử - Đa dạng di truyền vấn đề phân loại học cá Bỗng sông, suối số tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam CHƯƠNG... tài: Nghiên cứu đa dạng di truyền cá Bỗng sông, suối số tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam phục vụ cho bảo tồn khai thác Kết đề tài sở để bảo tồn phát triển loài cá quí địa Mục tiêu nghiên cứu 2.1... mẫu cá Bỗng thu thập sông, suối số tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam hình thái phân tử - Giải trình tự ADN vùng gen 16S, COI cá Bỗng Việt Nam Bước đầu đánh giá đa dạng di truyền cá Bỗng sông, suối

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI

TRIỆU ANH TUẤN

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÁ BỖNG

Ở SÔNG, SUỐI MỘT SỐ TỈNH MIỀN NÚI PHÍA BẮC VIỆT NAM PHỤC VỤ BẢO TỒN VÀ KHAI THÁC

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 60420121

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

TS Thái Thanh Bình PGS.TS Nguyễn Xuân Viết

HÀ NỘI - 2015

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn này là công trình nghiên cứu của riêng tôi.Kết quả được trình bày trong luận là hoàn toàn trung thực, chưa từngđược công bố trong bất kỳ công trình nào Những kết quả có được trong luậnvăn là do sự cố gắng làm việc, nghiên cứu và học hỏi một cách nghiêm túccủa bản thân

Những trích dẫn về bảng biểu, kết quả nghiên cứu của tác giả khác, tàiliệu sử dụng trong luận văn đều có nguồn gốc rõ ràng và theo đúng qui định,tiện cho việc đối chiếu

Hà Nội, Ngày 15 tháng 7 năm 2015

Tác giả luận văn

Triệu Anh Tuấn

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Xuân Viết –

Trưởng Bộ môn Di truyền học – Trường Đại học Sư phạm Hà Nội và TS.Thái Thanh Bình – Trưởng phòng Khoa học và Hợp tác quốc tế – Trường Caođẳng Thủy Sản, người Thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt quátrình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này

Cho tôi xin gửi lời cảm ơn tới Th.s Nguyễn Thị Hiến cán bộ làm việctại Phòng Công nghệ Sinh học – Trường Cao đẳng Thủy Sản đã nhiệt tìnhgiúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu để hoàn thành luận văn

Tôi xin gửi lời cám ơn tới Trường Đại học Sư phạm Hà Nội – Bộ môn

Di truyền học, Trường Cao đẳng Thủy Sản I – Phòng Công nghệ Sinh học đãtạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và nghiên cứu

Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, người thân, bạn bè,đồng nghiệp đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thựchiện luận văn

Hà Nội, Ngày 15 tháng 7 năm 2015

Tác giả luận văn

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

2.1 Mục tiêu chung 2

2.2 Mục tiêu cụ thể 2

3 Nội dung nghiên cứu 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 4

1.1 Tổng quan về cá Bỗng 4

1.1.1 Đặc điểm hình thái 4

1.1.2 Đặc điểm dinh dưỡng 4

1.1.3 Đặc điểm sinh trưởng và sinh sản 5

1.1.4 Giá trị của cá Bỗng 7

1.1.4.1 Giá trị khoa học 7

1.1.4.2 Giá trị kinh tế 8

1.1.4.3 Giá trị tâm linh 8

1.1.5 Nghiên cứu cá Bỗng trên thế giới và Việt Nam 8

1.2 Đa dạng sinh học và tầm quan trọng của đa dạng quần thể 10

1.3 Điều kiện tự nhiên các tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam 11

1.3.1 Địa hình 11

1.3.2 Khí hậu 12

1.3.3 Hệ thống sông ngòi 13

1.3.4 Đặc điểm nhân văn 13

1.4 Tổng quan về ứng dụng di truyền phân tử trong thủy sản 13

1.4.1 Ý nghĩa của việc lựa chọn chỉ thị phân tử 13

1.4.2 Ứng dụng của chỉ thị phân tử trong nghiên cứu thủy sản ở Việt Nam .14

1.4.3 Giải trình tự ADN ở ty thể ứng dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền 16

1.4.4 Vùng gen 16S và COI 18

1.4.5 Những nghiên cứu liên quan đến vùng gen 16S và COI trong lĩnh vực thủy sản 18

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Vật liệu nghiên cứu 21

2.1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 21

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu 22

2.2 Phương pháp nghiên cứu 22

2.2.1 Phương pháp nghiên cứu ngoài thực địa 22

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm 23

2.2.2.1 Phương pháp phân loại bằng hình thái 23

2.2.2.2 Phương pháp giải trình tự ADN cá Bỗng 25

2.2.2.3 Phương pháp định trình tự gen bằng máy giải tự động 29

2.2.2.4 Đánh giá đa dạng di truyền quần thể cá Bỗng 29

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 Phân loại cá Bỗng 31

3.1.1 Phân loại cá Bỗng dựa vào hình thái học 31

3.1.2 Kết quả phân loại cá Bỗng sử dụng chỉ thị ADN 33

3.1.2.1 Kết quả tách chiết ADN tổng số 33

3.1.2.2 Kết quả nhân đoạn gen 16S và gen COI từ mtADN của cá Bỗng 34

3.1.2.3 Kết quả giải trình tự đoạn gen 16S và COI từ mtADN ở các mẫu cá Bỗng 35

3.1.2.4 Kết quả phân loại cá bỗng bằng giải trình tự ADN vùng gen ty thể 16S và COI 36

3.2 Kết quả phân tích đa dạng di truyền trong các mẫu cá Bỗng nghiêu cứu 44

3.2.1 Đa dạng di truyền các vùng gen 16S và COI trong các quần thể cá Bỗng nghiêu cứu 44

3.2.2 Mối quan hệ di truyền giữa các quần thể cá Bỗng nghiên cứu 46

3.2.2.1 Khoảng cách di truyền giữa các cá thể 46

3.2.2.2 Khoảng cách di truyền giữa các quần thể 47

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Địa điểm thu, số lượng mẫu phân tích cá Bỗng 22 Bảng 2.2 Các chỉ tiêu hình thái 24 Bảng 2.3 Các cặp mồi sẽ được sử dụng để giải trình tự ADN của cá Bỗng 27 Bảng 3.1 Kết quả phân loại cá Bỗng ở một số tỉnh phía Bắc dựa trên các chỉ

tiêu về hình thái 31

Bảng 3.2 Khoảng cách di truyền giữ các nhóm cá bỗng nghiên cứu so với các

bỗng ở ngân hàng gen dự trên số liệu vùng gen 16S 37

Bảng 3.3 Khoảng cách di truyền giữ các nhóm cá bỗng nghiên cứu so với các

bỗng ở ngân hàng gen dự trên số liệu vùng gen COI 37

Bảng 3.4 Sự đa dạng di truyền vùng gen 16S mtADN giữa các quần thể và

trong mỗi quần thể cá Bỗng 44

Bảng 3.5 Sự đa dạng di truyền vùng gen COI mtADN giữa các quần thể cá

Bỗng và trong mỗi quần thể cá Bỗng 45

Bảng 3.6 Khoảng cách di truyền giữa các cá thể trong quần thể cá Bỗng 47 Bảng 3.7 Khoảng cách di truyền vùng gen 16S mtADN giữa các quần thể cá Bỗng 47 Bảng 3.8 Khoảng cách di truyền vùng gen COI mtADN giữa các quần thể cá Bỗng 47

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1 Bản đồ thu mẫu cá Bỗng 21

Hình 2.2 Sơ đồ đo cá bộ cá Chép (Cyprinidae) 23

Hình 3.1 Kết quả kiểm tra ADN tổng số của một số mẫu cá Bỗng thu tại Sơn La34 Hình 3.2 Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR của đoạn gen 16S mẫu mtADN cá

Bỗng thu tại Tuyên Quang (A) và của gen COI mẫu mtADN thu tại Hòa Bình (B) 34

Hình 3.3 Mối quan hệ di truyền giữa cá Bỗng (SL2) thu tại Sơn La với loài

cá Bỗng S sinensis dựa trên số liệu giải trình tự đoạn gen 16S 35

Hình 3.4 Mối quan hệ di truyền giữa cá Bỗng (SL2) thu tại Sơn La với loài

cá Bỗng S sinensis dựa trên số liệu giải trình tự đoạn gen 16S 36

Hình 3.5 Cây phân nhóm các mẫu cá Bỗng nghiên cứu dựa trên số liệu trình

tự ADN vùng gen 16S (A) và COI (B) theo phương pháp NJ

(Neighbor – Joining) 39

Hình 3.6 Cây phân nhóm các mẫu cá Bỗng nghiên cứu dựa trên số liệu trình

tự ADN vùng gen 16S (A) và COI (B) theo phương pháp MP

(Maximum Parsimony) 40

Hình 3.7 Cây phân nhóm các mẫu cá Bỗng nghiên cứu dựa trên số liệu trình

tự ADN vùng gen 16S (A) và COI (B) theo phương pháp ME

(Minimum Evolution) 41

Hình 3.8 Cây phân nhóm các mẫu cá Bỗng nghiên cứu dựa trên số liệu trình

tự ADN vùng gen 16S (A) và COI (B) theo phương pháp UPGMA (Unweighted Pain Group Method using Arithmetic mean) 42

Hình 3.9 Cây phân nhóm các mẫu cá Bỗng nghiên cứu dựa trên số liệu trình

tự ADN vùng gen 16S và gen COI theo phương pháp NJ (Neighbor – Joining) 43

CÁC KÍ HIỆU VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

ĐDDT Đa dạng di truyền

ĐDSH Đa dạng sinh học

HST Hệ sinh thái

CTV Cộng tác viên

ADN Acid desoxyribonucleic

PCR Polymerase Chain Reaction

UV Ultra Violet

PCR Polymerase Chain Reaction

TBE Tris Bonic acid

RFLP Restriction Fragment Length PolymorphismsRAPD Random Amplified Polymorphic DNA

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Cá Bỗng phân bố tự nhiên ở vùng trung và thượng lưu các sông lớn ở

các tỉnh phía Bắc Ở lưu vực sông Hồng cá phân bố tập trung từ Yên Bái trởlên, ở lưu vực sông Lô từ Tuyên Quang trở lên Cá Bỗng còn có ở sông Lam,Con Cuông, Cửa Rào Nghệ An [13]

Cá Bỗng thích sống nơi nước chảy, ở tầng giữa và tầng đáy Đây là loài

cá nước ngọt có giá trị kinh tế cao, thịt cá thơm ngon, hiện nay giá cá Bỗngbán trên thị trường dao động từ 250.000 – 300.000 đồng/kg Người dân nuôi

cá Bỗng không chỉ vì mục đích kinh tế mà còn là loài cá cảnh

Những năm 1960 – 1970, cá Bỗng đánh bắt được chiếm chủ yếu trongsản lượng cá đánh bắt trên hệ thống sông Hồng Cá Bỗng được đồng bào dântộc sống ven sông Lô, sông Gâm, sông Thao, sông Chảy - nơi có nhiều cáBỗng con đưa vào nuôi trong ao và lồng bè[16] [18]

Những năm gần đây do ảnh hưởng của môi trường suy thoái, việc đắpđập làm hồ thủy điện hoặc hồ thủy lợi đã làm cá Bỗng không di cư sinh sảnđược Thêm vào đó là việc khai thác triệt để bằng các phương tiện hủy diệtnhư dùng xung điện, thuốc nổ làm cho sản lượng cá Bỗng giảm sút nghiêmtrọng Hầu hết các sông suối thuộc hệ thống sông Hồng không còn vớt được

cá Bỗng con để nuôi Cá Bỗng vì thế thuộc diện cần bảo vệ khẩn cấp, cấp độ

V liệt kê trong Sách đỏ và được IUCN liệt trong danh sách các loài cá quíhiếm cần được bảo vệ cấp độ LC Nghiên cứu bảo tồn loài cá bản địa quíhiếm này là rất cấp thiết [49]

Mặc dù cá Bỗng đã được đưa vào nuôi phổ biến ở các tỉnh miền núi nhưngphân loại về loài cá Bỗng hiện còn nhiều điều chưa sáng tỏ Một số nhà khoa học

cho rằng ở Việt Nam có 4 loài trong giống cá Bỗng (Spinibarbus): Cá Bỗng (Spinibarbus denticulatus), cá Thần (Spinibarbus sinensis), cá Bỗng hồng (Spinibarbus sp.) và cá Bỗng thon (Spinibarbus nammauensis Hảo & Hiệp nov.sp).

Các nghiên cứu phân loại cá Bỗng ở Việt Nam chủ yếu dựa vào đặcđiểm hình thái bên ngoài Tuy nhiên hình thái ngoài của các loài động vật nóichung và cá nói riêng dễ thay đổi do điều kiện môi trường sống Sự đa dạngcủa môi trường sống có thể tạo nên sự nhiều dạng hình thái khác nhau, điềunày có thể dẫn đến những nhầm lẫn trong phân loại loài và số lượng loài cáBỗng Ngày nay các kỹ thuật phân tử được sử dụng rộng rãi trong phân tíchmối quan hệ hệ thống giữa các nhóm động vật, định danh hoặc định phân loạicác loài [44] Kỹ thuật giải trình tự ADN cho ta những thông tin chính xác vềtrình tự các nucleotide trong phân tử ADN và các mối quan hệ huyết thống[52] DNA ty thể (mtDNA) thường được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứuphân loại và phát sinh hệ thống bởi các ADN ty thể có sự di truyền theo dòng

mẹ, không bị trộn lẫn qua các thế hệ và tiến hóa nhanh (10 lần) hơn so vớiADN ở trong nhân [52] [58] [59] [64]

Xuất phát từ lý luận và thực tiễn đó chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đa dạng di truyền của cá Bỗng ở sông, suối một số tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam phục vụ cho bảo tồn và khai thác” Kết quả của đề tài sẽ là

cơ sở để bảo tồn và phát triển loài cá quí bản địa này

2 Mục tiêu nghiên cứu.

2.1 Mục tiêu chung.

Góp phần làm sáng tỏ vấn đề định loại loài và bước đầu đánh giá đadạng di truyền cá Bỗng ở sông, suối các tỉnh miền núi phía Bắc Việt Namphục vụ cho mục đích bảo tồn và thác nguồn gen, phát triển nuôi trồng thủysản loài cá Bỗng ở nước ta

2.2 Mục tiêu cụ thể.

- Phân loại được các mẫu cá Bỗng thu thập ở các sông, suối một số tỉnhmiền núi phía Bắc Việt Nam bằng hình thái và phân tử

- Giải trình tự ADN vùng gen 16S, COI cá Bỗng Việt Nam Bước đầuđánh giá được sự đa dạng di truyền cá Bỗng ở sông, suối các tỉnh miền núiphía Bắc Việt Nam bằng chỉ thị phân tử.

3 Nội dung nghiên cứu

Đề tài luận văn thực hiện các nội dung chính sau:

- Nghiên cứu phân loại cá Bỗng ở sông, suối một số tỉnh miền núi phíaBắc Việt Nam dựa trên các đặc điểm hình thái học

- Phân tích sự đa dạng di truyền cá Bỗng ở sông, suối một số tỉnh miềnnúi phía Bắc Việt Nam bằng chỉ thị phân tử

- Đa dạng di truyền và vấn đề phân loại học cá Bỗng ở sông, suối một

số tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1 Tổng quan về cá Bỗng

1.1.1 Đặc điểm hình thái

Cá Bỗng ở miền Bắc có thân dài, thấp, dẹp bên, lưng cong hơi tròn hoặchình thoi, dẹp bên nhất là cán đuôi Viền lưng và viền bụng cong tròn Đầu vừaphải, sống đầu hình cung Mõm tròn tù, hơi nhô ra phía trước Da mõm khôngche lấp môi trên Miệng ở cuối hoặc kề dưới, hình móng ngựa Môi trên phíatrong có viền liên tục ít hoặc không có, gờ ngoài tù hoặc trơn nhẵn Môi trên vàmôi dưới liền nhau ở góc miệng Có hai đôi râu to và dài Râu hàm dài bằng1,6-1,8 đường kính mắt Rãnh sau môi dưới nông Mắt vừa phải, gần mút mõmhơn viền sau nắp mang, khoảng cách trước ổ mắt nhỏ hơn khoảng cách sau ổmắt Khoảng cách hai mắt rộng, đỉnh đầu hơi lồi [16] [20]

Vây lưng của cá có khởi điểm ở trước hoặc sau khởi điểm vây bụng, có

3 – 4 tia đơn và 8 – 9 tia phân nhánh Tia đơn cuối vây lưng là tia phân mảnh,cứng không hoàn toàn hoặc gai cứng hoàn toàn, phía sau trơn láng hoặc cógai răng cưa Viền sau vây lưng lõm Trước vây lưng có 1 gai mọc ngượchướng về phía đầu và ẩn dưới da Vây hậu môn có 3 tia đơn và 5 tia phânnhánh Vây ngực không chạm vây bụng Vây bụng chưa chạm đến vây hậumôn Vây đuôi phân thùy sâu, mút nhọn và tương đương nhau Màng mangliền với eo mang Lược mang cứng, nhọn Răng hầu 3 hàng 2.3.5 – 5.3.2 hìnhdẹp bên và đỉnh hơi cong Vẩy tròn lớn, sắp xếp đều Đường bên hoàn toàn,hơi cong về phía dưới và chạy giữa cán đuôi Hậu môn sát gốc vây hậu môn[20]

Gốc vây bụng có vảy nách, dài bằng 2/5 chiều dài vây bụng Lưng cámàu xám, nhạt dần về phía bụng, bụng hơi vàng Các vây màu xám, hai máhơi hồng

1.1.2 Đặc điểm dinh dưỡng

Cá Bỗng là loài cá ăn tạp, thức ăn chủ yếu là các loại thực vật bậc caođiển hình Lúc còn nhỏ cá ăn động vật phù du, mùn bã hữu cơ, khi đạt kích cỡtrên 6cm chúng mới có thể ăn thực vật thuỷ sinh Cá càng lớn thể hiện càng rõtính ăn thực vật; cá ăn thực vật, lá cây, quả Theo nghiên cứu của Đoàn VănĐẩu và Lê Thị Lệ [17] cá Bỗng ăn khoảng 25 loại cây khác nhau như: raumuống, bắp cải, dâu tằm, bèo Ngoài ra cá còn thích ăn các loại thức ăncông nghiệp như thức ăn viên, cám hỗn hợp trong điều kiện nuôi.

1.1.3 Đặc điểm sinh trưởng và sinh sản

Phạm Thị Minh Giang [18] đã mô tả phương pháp xác định tuổi của cáBỗng dựa trên số vòng thể hiện trên vảy Đối với cá Bỗng, vòng tuổi trên vảythể hiện vừa có tính chất tiếp giáp giữa vòng vân xếp dày, thưa và vừa có tínhcắt nhau giữa các vòng vân Vòng tuổi thể hiện hoàn toàn rõ ở hai bên sườnvảy và vai vảy Cá Bỗng hình thành vòng tuổi vào cuối mùa đông đầu mùaxuân Cá Bỗng là loài cá có kích thước lớn Chiều dài của cá có thể đạt gần1m và nặng gần 15kg, con lớn nhất có thể đạt 30kg Cấu trúc tuổi của quầnthể khá phức tạp, tuổi thọ cao đến 15 năm [17] Tuy nhiên, Phạm Báu [11] khiđiều tra đã bắt gặp cá có độ tuổi 20

24,2-40,4

33,6-48,7

39,4-52,2

45,6-61,7

51,5-68,2

53,0-75,0

58,6-72,0

65,0-83,2

70,2-

76-87 90,4 >93

(Nguồn lợi thuỷ sản Việt Nam, 1996)

Tốc độ tăng trưởng của cá Bỗng thuộc loại trung bình Cá tăng chiềudài nhanh ở hai năm đầu Sự tăng trưởng nhanh về khối lượng bắt đầu từ nămthứ 3 sau đó chậm dần và thay đổi ít Sau 1 năm tuổi cá đạt kích cỡ 672g, nămthứ 2 đạt 1500g và năm thứ 3 đạt 2135g Tuổi thọ của cá là 15 năm Sự tăngtrưởng của cá đực chậm hơn cá cái khoảng 10,0-11,5cm Ở tuổi 10-15 tăngtrưởng chiều dài trung bình 4,3-5,4 cm/năm Theo Phạm Báu [11] cá Bỗng

sống trong điều kiện tự nhiên (sông Gâm) và cá nuôi trong lồng bè, ao trên cơ

sở cùng tuổi có sự tăng trưởng về chiều dài khác nhau rõ rệt Sự sai khác trênchủ yếu do điều kiện thức ăn chi phối Trong điều kiện nuôi trong ao tại Việnnghiên cứu nuôi trồng Thuỷ Sản 1, cá 1 tuổi đạt chiều dài 16,9cm và khốilượng 69,1g Khi cá nuôi được 18 tháng tuổi, chiều dài đạt 26,0cm và khốilượng đạt 261g Kết quả về tăng trưởng của cá nuôi tại Viện nghiên cứu nuôitrồng Thuỷ Sản 1 tương đương ở cá 3 năm tuổi thu ngoài tự nhiên Chế độchăm sóc và nguồn thức ăn bổ sung đối với cá Bỗng là rất quan trọng cho sựtăng trưởng của cá Bổng

Các bãi đẻ trong vực nước cạn ở vùng trung lưu sông Hồng, từ Yên Báitới Lào Cai, như các bãi: Hợp Thành, Tân An, Phan Thanh, An Dương, ĐôngThái Ở sông Nậm Thi cá Bỗng đẻ ở Bản Quần, ở sông Lô chúng đẻ rải rác

từ phía trên Vĩnh Tuy đến biên giới Việt – Trung [17] Vụ đẻ thứ 2 cá thườngvào các ngòi lớn như: Ngòi Bo (Sông Hồng), ngòi Mã (sông Lô) để đẻ Bãi đẻcủa cá Bỗng có địa hình đặc biệt, đáy có cát sỏi lớn, nước chảy mạnh (Lưutốc nước khoảng 0,22-0,54m/s), nước có độ trong cao, chảy xiết – giàu ôxyhoà tan, pH hơi kiềm Sau bãi đẻ là vực sâu cho cá trú ẩn và kiếm thức ăn.Tuy nhiên hiện nay do nguồn lợi bị suy giảm nghiêm trọng nên hầu hết cácsông suối thuộc hệ thống sông Hồng không còn gặp cá Bỗng nữa, các bãi đẻtrước đây công bố cũng không còn nữa Hiện nơi còn cá Bỗng đẻ nhiều hơn

cả là đoạn sông Gâm từ Na Hang đến Bắc Mê, nhưng do bị đánh bắt nên cá

đẻ không còn tập trung như trước đây

Đoàn Văn Đẩu và Lê Thị Lệ [17], khi nghiên cứu cá Bỗng đánh bắt từ

tự nhiên đã phát hiện tuổi thành thục của cá Bỗng khá muộn, dao động từ 5 –

6 tuổi trở lên Mùa vụ sinh sản của cá chia làm hai đợt từ tháng 2 đến tháng 6

và tháng 7 đến tháng 8 Cá Bỗng thường có lượng noãn hoàng từ 18 – 520g.Chỉ số thành thục từ 0,8 – 6,1 Khối lượng dịch hoàn 38 – 200g Chỉ số thành

thục từ 0,19 – 0,9 Trứng cá có vỏ dày, tròn căng, rời nhau, giàu noãn hoàng,khi già có màu vàng đậm Ngâm trứng trong dung dịch làm trong trứng thấynhân bắt đầu lệch và di chuyển ra ngoại biên.

Khi nghiên cứu sức sinh sản của cá Bỗng, Đoàn Văn Đẩu và Lê Thị Lệ[17] đã xác định được sức sinh sản tương đối của cá Bỗng trung bình đạt6.700 trứng/kg, sức sinh sản tuyệt đối đạt 20.700 trứng/1kg cá cái Cũng theonhận định của các tác giả trên thì sức sinh sản tương đối và sức sinh sản tuyệtđối tỷ lệ thuận với khối lượng cơ thể cá

Cá Bỗng thành thục ở năm thứ 3 (2+ tuổi) khi trọng lượng tương ứngkhoảng 2kg Trong ao nuôi cá có tỷ lệ thành thục thấp 1,54 – 4,67% Cá đẻtrứng dính vào các giá thể Cá có thể đẻ 13.000 – 142.000 trứng/kg cá cái

Từ năm 1999, Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 1 đã di giống cáBỗng từ Tuyên Quang về Trại thực nghiệm nuôi trồng thủy sản Mê Linh,Vĩnh Phúc để nghiên cứu sản xuất giống, tuy nhiên số lượng cá giống sảnxuất không nhiều và hiện nay không còn lưu giữ đàn cá bố mẹ do thiếu nguồnnước và môi trường bị ô nhiễm Việc di giống cá Bỗng về đồng bằng nuôitrong điều kiện nước tĩnh là không có tính khả thi do cá ưa thích sống trongmôi trường nước trong, sạch, giàu ôxy và có nước chảy

Chưa có công trình nghiên cứu đầy đủ về cá Bỗng, nhất là vấn đề bảotồn, khai thác và phát triển nguồn gen, mới dừng lại nghiên cứu sơ bộ về đặcđiểm sinh học và vùng gen 16S, COI đã được ứng dụng và nghiên cứu thànhcông đối với một số loài cá ở nước ta như: cá Song, cá Trích

1.1.4 Giá trị của cá Bỗng

1.1.4.1 Giá trị khoa học

Việc nghiên cứu, đánh giá đa dạng loài cá Bỗng có vai trò quan trọng,trước hết nhằm mục đích bảo tồn loài cá Bỗng tránh nguy cơ tuyệt chủngđồng thời cung cấp nguồn gen cá Bỗng vào ngân hàng gen thế giới

Từ đó đưa loài này vào phát triển, nhân giống nuôi đại trà cung cấpnguồn thực phẩm nhằm mục tiêu phát triển kinh tế địa phương.

từ 250.000 – 300.000 đồng/kg Cá Bỗng mang lại giá trị kinh tế, do vậy việcphát triển nghề nuôi cá Bỗng thương phẩm có giá thành cao góp phần nângcao đời sống đồng bào miền núi đặc biệt là người dân tộc thiểu số

1.1.4.3 Giá trị tâm linh.

Cá Bỗng hay còn gọi là cá Thần ở huyện Cẩm Thủy – Thanh Hóa khôngchỉ có giá trị về khoa học mà nó còn có giá trị về mặt tâm linh Người dân CẩmThủy tin rằng duy trì loài cá này sẽ mang lại sự may mắn, phồn thịnh cho dânbản Do yếu tố tâm linh tác động nên người ta không ăn loại cá này Điều đókhiến cho đàn cá được bảo vệ và ngày càng nhiều lên, do vậy mà suối cá CẩmLương đến giờ đã phát triển thành 2 suối cá song song Do những quan niệm củangười dân ở Cẩm Thủy mà cá Bỗng ở đây mang ý nghĩa tâm linh đặc biệt gópphần vào việc bảo vệ đang dạng sinh học loài cá này

1.1.5 Nghiên cứu cá Bỗng trên thế giới và Việt Nam

Cá Bỗng phân bố tự nhiên ở châu Á, bao gồm: miền Bắc Việt Nam,

Lào, Vân Nam và Hải Nam Trung Quốc Cá Bỗng được nuôi từ lâu ở các

nước như Trung Quốc, Lào và Việt Nam nhưng những công trình nghiên cứu khoa học về loài cá này công bố rất hạn chế Các công trình công bố chủ yếu của các tác giả Trung Quốc Các nghiên cứu tập trung điều tra các đặc điểm sinh học của cá Bỗng ở ngoài tự nhiên và các hình thức nuôi

Ở Trung Quốc, cá Bỗng phân bố ở trung và thượng lưu sông Ngọc [54][58] Ngư dân thường đánh bắt được cá có cỡ trung bình từ 1 – 1,5kg và cỡlớn nhất từ 5 – 8kg [67] Wang [54] đã điều tra tuổi của cá Bỗng thành thụctrên sông Ngọc thấy rằng cá cái thành thục ở 5 tuổi và cá đực thành thục ở 3tuổi Mùa sinh sản của cá từ tháng 4 – 6 hằng năm Cỡ cá thành thục trungbình từ 11,5 – 29,5cm, cỡ cá cái thành thục và cá đực thành thục lớn nhất lầnlượt là 69cm và 59,5cm Tác giả đã mô tả được sự phát triển của tuyến sinhdục cái và đực của cá Bỗng Một số nghiên cứu của Jiang [61] về mối quan hệgiữa tuổi và tốc độ sinh trưởng của cá trong điều kiện nuôi Yi Zushengnghiên cứu về sự phát triển phôi thai cá Bỗng Luo [58] nghiên cứu mối quan

hệ của sự phát triển phôi đến nhiệt độ và độ mặn Tuy nhiên phía Trung Quốckhông công bố chi tiết các nghiên cứu này Đây là loài cá có giá trị kinh tế[68] và nó đã trở thành loài nuôi chính ở sông, hồ ao

Ở Việt Nam những nghiên cứu về cá Bỗng thực sự được bắt đầu từ

năm 1960 Cá Bỗng là một phân họ lớn nhất trong họ cá chép (Cypridae) và có

nhiều loài cá là nguồn cung cấp thực phẩm, mang lại giá trị và lợi ích kinh tếcao nhưng hiện nay, một số loài trong phân họ có nguy cơ diệt vong vì nhiềunguyên nhân khác nhau Việc nghiên cứu hệ thống phân loại và tìm hiểu sựphân vùng địa động vật của phân họ là việc làm có ý nghĩa, chính vì thế đã cónhiều tác giả quan tâm và nghiên cứu như: Mai Đình Yên [42] công bố 50 loài

16 giống trong phân họ khu vực Bắc Việt Nam ; Nguyễn Thái Tự công bố 20loài trong phân họ ở khu hệ cá sông Lam [37]; Nguyễn Văn Hảo công bố 99loài thuộc 27 giống trong phân họ cá Bỗng của Việt Nam [20]; Nguyễn HữuDực công bố 15 giống 33 loài [14] ; Hoàng Xuân Quang công bố 12 loài ở khuvực Tây Bắc Nghệ An [27]; V.Kottelat công bố 10 loài trong phân họ [50], khuvực Bắc Trung Bộ đã điều tra được 10 giống Tuy nhiên cho đến nay chưa cócông trình nghiên cứu đầy đủ về phân loại và đánh giá đa dạng di truyền cá

Bỗng phục vụ cho bảo tồn, khai thác và phát triển nguồn gen Các nghiên cứuchỉ mới tập trung điều tra nguồn lợi tự nhiên, một số đặc điểm sinh học vàthăm dò sinh sản

1.2 Đa dạng sinh học và tầm quan trọng của đa dạng quần thể

Việc nghiên cứu đa dạng sinh học cũng như việc bảo vệ đa dạng sinh học

và những vấn đề quan trọng, cấp thiết được rất nhiều nhà khoa học quan tâm

Theo Odum tỷ lệ giữa số lượng loài và các chỉ số phong phú (số lượng,sinh khối, năng suất ) gọi là chỉ số đa dạng về loài [49]

Theo Quỹ Bảo vệ thiên nhiên Quốc tế đã định nghĩa: “ĐDSH là sự phồnthịnh của sự sống trên trái đất, là hàng triệu loài thực vật, động vật và vi sinhvật, là những gen chứa đựng trong các loài và là những HST vô cùng phức tạpcùng tồn tại trong môi trường’’ ĐDSH bao gồm 3 cấp độ: Đa dạng nguồngen, đa dạng loài và đa dạng HST Trong đó, đa dạng loài bao gồm toàn bộcác loài sinh vật sống trên Trái đất, từ vi khuẩn đến các loài động vật, thực vật

và các loài nấm Ở mức độ vi mô hơn, ĐDSH bao gồm sự khác biệt về gengiữa các loài, khác biệt về gen giữa các cá thể cùng chung sống trong mộtquần thể ĐDSH còn bao gồm cả sự khác biệt giữa các quần xã mà trong đócác loài sinh sống, và cả sự khác biệt của mối tương tác giữa chúng với nhau[5]

Theo luật ĐDSH năm 2008, ĐDSH là sự phong phú về nguồn gen, cácloài sinh vật và HST trong tự nhiên [7]

Theo Công ước đa dạng sinh học thì ĐDSH là sự phong phú các sinh vậtsống gồm các hệ sinh thái trên cạn, hệ sinh thái biển, các hệ sinh thái nước ngọt,

và tập hợp các HST mà sinh vật chỉ là một bộ phận ĐDSH bao gồm sự đa dạngtrong một loài (đa dạng gen) hay còn gọi là đa dạng di truyền, sự đa dạng giữacác loài (đa dạng loài) và sự đa dạng hệ sinh thái (đa dạng HST) Nói cách khácĐDSH là sự đa dạng của sự sống ở các cấp độ và các tổ hợp [6]

Đa dạng sinh học còn là sự đa dạng của các sinh vật trên trái đất, baogồm cả sự đa dạng về di truyền của chúng và các dạng tổ hợp Đây là mộtthuật ngữ khái quát về sự phong phú của sinh vật tự nhiên, hỗ trợ cho cuộcsống và sức khoẻ của con người Khái niệm này bao hàm mối tương tác qualại giữa các gen, các loài và các hệ sinh thái [49].

ĐDSH trực tiếp phục vụ đời sống của con người trong phát triển kinh

tế, góp phần xóa đói, giảm nghèo… Những giá trị trực tiếp đó là giá trị sửdụng, tiêu thụ, và sản xuất ra các mặt hàng phục vụ nhu cầu của con người.ĐDSH và cảnh quan là nền tảng cho sự phát triển các dịch vụ hệ sinh thái,điều tiết nguồn nước, bảo vệ môi trường đặc biệt trong giảm nhẹ các tác độngbất lợi do biến đổi khí hậu hiện nay [6] [7][8]

Như vậy đa dạng sinh học là nguồn tài nguyên vô cùng quý giá đối vớicác thế hệ hôm nay và mai sau Tuy nhiên, nguồn tài nguyên này đang bịthách thức bởi hiểm họa to lớn do các hệ sinh thái đang dần bị phá vỡ và tốc

độ tuyệt chủng của các loài động thực vật ngày càng tăng Sự tuyệt chủng củacác loài động thực vật trước đây là do quá trình tiến hóa tự nhiên còn sự tuyệtchủng của các loài động thực vật ngày nay lại chủ yếu do hoạt động của conngười gây ra với mức độ nghiêm trọng hơn bao giờ hết

1.3 Điều kiện tự nhiên các tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam

1.3.1 Địa hình

Khu vực miền núi phía Bắc Việt Nam gồm các Tỉnh: Tuyên Quang, HàGiang, Lạng Sơn, Sơn La, Hòa Bình với tổng diện tích là 33.102,19 km2 gồmcác dãy núi phía Tây Bắc và đồi núi Đông Bắc

Phía Tây Bắc là một vùng gồm chủ yếu là các núi có độ cao trung bình

và cao Đây là nơi có địa hình cao nhất, bị chia cắt nhất và hiểm trở nhất ViệtNam Các dạng địa hình phổ biến ở đây là các dãy núi cao, các thung lũng sâuhay hẻm vực, các cao nguyên đá vôi có độ cao trung bình Dãy núi cao và đồ

sộ nhất là dãy Hoàng Liên Sơn với nhiều đỉnh cao trên 2500m, đỉnh núi caonhất là Fansipan (3143m).

Vùng đồi núi Đông Bắc gồm chủ yếu là núi trung b́nh và núi thấp Khốinúi thượng nguồn sông Chảy có nhiều đỉnh cao trên dưới 2000m là khu vựccao nhất của vùng Từ khối núi này ra tới biển là các dãy núi hình cánh cungthấp dần về phía biển Có bốn cánh cung lớn là cánh cung sông Gâm, cánhcung Ngân Sơn, cánh cung Bắc Sơn và cánh cung Đông Triều [69] [70]

1.3.2 Khí hậu

Khí hậu nhiệt đới chịu ảnh hưởng của gió mùa Chế độ gió mùa có sựtương phản rõ rệt: Mùa hè chịu ảnh hưởng của gió mùa Tây Nam nóng khô,mưa nhiều, Về mùa đông chịu ảnh hưởng của gió mùa Đông Bắc lạnh, khô, ítmưa Nhiệt độ trung bình trong năm nằm trong khoảng từ 220C – 250C Sựphân hóa khí hậu theo địa hình ở các tỉnh miền núi phía bắc có sự phân hóarất rõ theo địa hình: Vùng đồng bằng, trung du , đồi núi thấp và đồi núi cao

Lượng mưa: Miền núi phía Bắc có thể chia thành 2 mùa: Mùa hè nóng

ẩm mưa nhiều và mùa đông lạnh và khô hạn Lượng mưa cũng thay đổi theo

độ cao của địa hình đồi núi

Hướng gió: Mang tính chất chung khí hậu nhiệt đới gió mùa, vùng Tây

Bắc có chế độ gió thay đổi theo mùa rõ rệt, chịu ảnh hưởng nhiều của hướngnúi dãy Trường Sơn: gió mùa đông và gió mùa hè Vùng Đông Bắc chịu ảnhhưởng của các dãy núi hướng Đông Bắc nên chịu ảnh hưởng của gió mùaĐông Bắc

Sự hoạt động của gió mùa đã tác động đến khí hậu Gió mùa đông bắclàm cho nhiệt độ hạ thấp ở vùng núi cao kèm theo hiện tượng sương muối,sương giá Gió tây nam vốn là luồng khí có hàm lượng ẩm cao, khi vượt quadãy Trướng Sơn đã trở thành luồng gió khô nóng Đó là gió Lào Gió này làmnhiệt độ của vùng lên đến 39 – 41oC, độ ẩm chỉ còn 30 – 45% [69] [70]

1.3.3 Hệ thống sông ngòi

Các tỉnh miền núi phía Bắc Tuyên Quang, Hà Giang, Lạng Sơn, Sơn La

và Hòa Bình có hệ thống sông suối dày đặc chảy theo hướng của các dãy núivới nhiều con sông lớn như Sông Lô, sông Ngâm, sông Phó Đáy, sông Đà,sông Bôi, sông Bưởi, sông Mã với tổng chiều dài lên đến hàng ngàn km vàdiện tích lưu vực lên tới hàng trăn nghìn km2

1.3.4 Đặc điểm nhân văn

Hiện nay do được vận động và sự hiểu biết thì phần lớn dân cư trongvùng đã ổn định cuộc sống định canh, định cư, nhưng còn gặp nhiều khó khănbởi dân tập trung sống trên địa hình núi cao, gặp nhiều thiên tai, ảnh hưởngđến đời sống dân trí Con người những nơi này vẫn còn phụ thuộc nhiều vàonguồn tài nguyên thiên nhiên, sử dụng bất cứ nguồn lợi thiên nhiên nào đểphục vụ cho mình Cá là đối tượng thường được săn bắt làm thực phẩm, bịkhai thác quá mức nên số lượng trong tự nhiên ngày càng giảm sút; nhiều loài

có nguy cơ khó có thể phục hồi được Hơn nữa hoạt động khai thác vàng, khaithác quặng than, sắt làm ô nhiễm nguồn nước cũng là nguyên do cá giảm sút

cả về sản lượng và số loài

1.4 Tổng quan về ứng dụng di truyền phân tử trong thủy sản

1.4.1 Ý nghĩa của việc lựa chọn chỉ thị phân tử

Sử dụng chỉ thị phân tử trong nông nghiệp và trong thủy sản có vai tròquan trọng Trong chọn giống có thể phát hiện những cá thể có chứa một genmong muốn trong quần thể phân ly dựa vào một đoạn ADN liên kết chặt chẽvới gen đó Vì vậy, có thể đánh giá từng cá thể trong quần thể phân ly ở bất

kỳ giai đoạn sinh trưởng nào, có thể chọn lọc cùng một lúc nhiều tính trạngmong muốn Mặt khác dùng chỉ thị phân tử có thể làm tăng hiệu quả và độchính xác trong việc chọn lọc các tính trạng mong muốn, loại trừ được sựtương tác giữa các alen của một locus hoặc giữa các locus khác nhau lên sửbiểu hiện tính trạng

Chỉ thị phân tử còn dùng để đánh giá đa dạng di truyền các quẩn thểsinh vật, đánh giá mức độ quan hệ giữa các cá thể Từ đó có những biện phápcần thiết để bảo vệ đa dạng sinh học các quần thể sinh vật …

Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển nhanh chóng trongnghiên cứu bộ gen thì người ta đã dùng chỉ thị phân tử để thiết lập chi tiết cácbản đồ gen về các chỉ thị phân tử liên kết với các gen quy định tính trạng quantrọng trong nghiên cứu thực vật, động vật và thủy sản Trên cơ sở đó các nhàsinh học đã chọn lọc được các giống tốt gián tiếp dựa vào các chỉ thị phân tửliên kết được các gen quy định tính trạng mong muốn, đánh giá được độ đadạng sinh học các quần thể sinh vật

1.4.2 Ứng dụng của chỉ thị phân tử trong nghiên cứu thủy sản ở Việt Nam

Những nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử tạo vật liệu khởi đầu trongchọn giống ở Tôm sú, cá Tra tại Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản I, II vàViện Công nghệ sinh học đã cho thấy những tiềm năng to lớn của việc ứngdụng công nghệ di truyền phân tử trong nuôi trồng thủy sản

Phạm Anh Tuấn và Nguyễn Hữu Ninh (2003), sử dụng chỉ thịMicrosatellite nghiên cứu biến dị về màu sắc thịt trắng và thịt vàng của cá Tra

đã công bố sự sai khác về tần số alen và xuất hiện alen đặc trưng (alen F) ởlocus Phy03 giữa hai loại cá có màu sắc thịt khác nhau, khoảng cách di truyềncủa hai loại cá thịt trắng và cá thịt vàng là khá lớn 0,145 [35]

Đào Thị Tuyết và ctv (2003) sử dụng chỉ thị RAPD để đánh giá đa hình

di truyền 4 quần thể Cá Tra nuôi (Pangasius hypophthamus) ở Việt Nam

được ký hiệu R (Trại bà Rô), D (Trại ông Dương), T (Trại ông Tường) và TN(quần thể tự nhiên) Kết quả đa hình RAPD với mồi A7 giúp phân biệt đượcquần thể R với D, T và TN ở chỉ thị băng ADN có kích thước 2400 bp, giữacác quần thể R, T với D, TN ở chỉ thị 2200 bp; Với mồi A8 giúp phân biệtđược quần thể D với 3 quần thể còn lại ở chỉ thị phân tử lớn hơn 500 bp; D, R

với T, TN ở chỉ thị phân tử 1800 – 1900 bp; Với mồi 101 giúp phân biệt quầnthể TN với các quần thể còn lại ở chỉ thị phân tử 1800 – 2200 bp [38].

Thái Thanh Bình và Christoppher Austin đã giải trình tự ADN vùnggen ty thể để đánh giá đa dạng di truyền của các quần thể cá chép đỏ thu từcác tỉnh Cao Bằng, Yên Bái, Bắc Kạn, Quảng Bình, Đắk Lắk, cá chép trắng,vàng thu từ Inđônêxia, cá chép vảy thu từ Hungari, cá chép đỏ thu từ TrungQuốc và cá chép Koi thu từ Nhật Bản cũng được giải trình tự để so sánh Mặc

dù hình thái gần giống nhau nhưng kết quả phân tích ADN cho thấy đa dạnghaplotype cao 0,80 ± 0,17, kết quả phân tích cây phân loài cho thấy cá chép

đỏ Đắk Lắk, Cao Bằng, Bắc Kạn có quan hệ gần gũi và khác xa với cá chépQuảng Bình và Yên Bái Các dòng cá chép đỏ ở Việt Nam có quan hệ với cáchép vàng Inđônêxia nhưng khác xa với cá chép đỏ thu từ Trung Quốc, cáchép Koi của Nhật Bản và cá chép vẩy Hungari Kết quả nghiên cứu bước đầucung cấp thông tin quan trọng cho việc định hướng bảo tồn các dòng cá đỏbản địa [45]

Bên cạnh những thành công của việc ứng dụng chỉ thị phân tử vàonghiên cứu Cá thì những thành công của việc ứng dụng chỉ thị phân tử vàonghiên cứu Tôm phải kể đến:

Quyền Đình Thi [34] sử dụng chỉ thị Microsatellite, mtRFLP và RAPD

để phân tích đa hình ở 20 mẫu Tôm Sú (Peneaus monodo) đã phát hiện 20

kiểu gen khác nhau với giá trị thông tin đa hình (PIC) luôn lớn hơn 0,5 Phântích RFLP của hai phân đoạn 16S rARN và 12S rARN của mtADN cho thấytính đa hình thấp

Sử dụng chỉ thị Microsatellite để đánh giá đa hình 3 quần thể Tôm Súnuôi ở Việt Nam, quần thể I có nguồn gốc ở Miền Bắc, quần thể II có nguồngốc ở Miền Trung và quần thể III có nguồn gốc nhập ngoại từ Singapore,Nguyễn Thị Thảo đã báo cáo đa hình của 6 locus CSCUPmo1, CSCUPmo2,

CSCUPmo3, CSCUPmo4, CSCUPmo5, CSCUPmo6 Tính đa hình trong mỗiquần thể là rất cao với giá trị thông tin đa hình (PIC) lớn hơn 0,829, tính đahình giữa các quần thể lớn hơn 0,913 Khoảng cách di truyền giữa các quầnthể trong khoảng 0,4693 – 0,7268 [34].

Nguyễn Thành Tâm và Phạm Thanh Liêm sử dụng chỉ thịMicrosatellite và RAPD để đánh giá đa dạng di truyền của 2 quần thể Tômcàng xanh Việt Nam và Trung Quốc cùng với 6 cặp mồi Microsatellite và 5cặp mồi ngẫu nhiên RAPD Kết quả chỉ có một vệt băng cho tất cả 6 mồiMicrosatellite giữa Tôm càng xanh Việt Nam và Trung Quốc Tuy nhiên kếtquả phân tích bằng kỹ thuật RAPD lại cho thấy sự khác biệt di truyền giữa 2quần thể Tôm với trung bình 14,9 alen ở Tôm càng xanh Trung Quốc và 12,9alen ở Tôm càng xanh Việt Nam, đa dạng haplotype ở Tôm càng xanh TrungQuốc là 0,84 – 0,88 và 0,86 – 0,88 ở Tôm càng xanh Việt Nam [35]

Trần Thị Thúy Hà và ctv sử dụng 5 chỉ thị Microsatellite để đánh giá đadạng di truyền với 2 phản ứng PCR đa mồi áp dụng trong 5 quần thể Tôm thẻ

chân trắng (Litopennaeus vannamei) nuôi ở Việt Nam Số alen trên mỗi vị trí

Microsatellite dao động từ 6 – 8 alen và có alen xuất hiện với tần số thấp (nhỏhơn 0,1) Giá trị dị hợp tử quan sát (Ho, dao động từ 0,21 – 0,50) thấp hơn so với

dị hợp tử mong đợi (He, dao động từ 0,41 – 0,72) Giá trị tương đồng (Fis) trung

bình dao động khoảng 0,18 – 0,40 và cao ở 2 vị trí TUMXL v6.23 và Lvan 01

trên các quần thể đạt 0,446 – 0,496 Giá trị Fst đạt ở mức trung bình 0,054 –0,185 và không thể hiện sự sai khác lớn về di truyền giữa các quần thể [19]

1.4.3 Giải trình tự ADN ở ty thể ứng dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền.

Các nghiên cứu trên ADN ty thể cho thấy hệ gen ty thể có những đặctrưng riêng, phân biệt với hệ gen nhân Hệ gen ty thể có đặc tính di truyềntheo dòng mẹ, có từ vài trăm đến vài nghìn bản copy trong một tế bào Phân

tử ADN ty thể mạch vòng, kép, có kích thước nhỏ nên tồn tại lâu, số lượng

bản sao lớn, bền vững hơn ADN nhân khi tách chiết và lại chứa các gen tốicần thiết cho hoạt động sống của tế bào do vậy mà ADN ty thể được coi là đốitượng lý tưởng đển nghiên cứu hệ gen phục vụ cho phân loại Các gen trong

ty thể có hệ số biến đổi nhanh hơn hệ gen trong nhân tế bào từ 10 – 15 lần nênrất thuận lợi cho việc nghiên cứu về tiến hóa và đánh giá đa dạng di truyền

ADN ty thể được ưu tiên sử dụng trong giải trình tự để xác định đadạng sinh học và biến động di truyền của sinh vật bởi vùng mã hóa lớn, khôngtái tổ hợp, di truyền theo dòng mẹ [66], cho kết quả nhanh, chính xác, thumẫu không gây hại tới động vật và số lượng bản sao lớn [66] ADN nhân ditruyền từ cả bố và mẹ và bị phân ly qua mỗi thế hệ nên việc dò tìm tổ tiên vàmối quan hệ di truyền của đoạn ADN nào đó trở nên rất khó khăn Trong khi

đó, ADN ty thể di truyền theo dòng mẹ, nên có thể hạn chế trường hợp này[60] Sự tái tổ hợp (recombination) trên ADN ty thể thường không xảy ra, nên

sẽ không hình thành các đoạn ADN tái tổ hợp [52] Một tế bào chứa vài trăm

ty thể, mà một ty thể chứa hàng chục bản sao bộ gen của nó Vì vậy,trong một tế bào có thể chứa được hàng ngàn bản sao của bộ gen ty thể,nhưng bộ gen nhân thì chỉ có hai bản sao

Hơn nữa, ở ADN nhân, vùng không mã hóa chiếm tới 93%; trong khi ở ADN ty thể, vùng không mã hóa chỉ chiếm 3% [66] Các vùngkhông mã hóa này sẽ làm cho quá trình giải trình tự thêm phức tạp vì đôi khicần phải tạo dòng để thu được đoạn gen mong muốn [64] Việc khuếch đạicác đoạn gen của ADN ty thể chỉ cần một số lượng giới hạn các đoạn mồi

Trên thực tế, sử dụng một cặp mồi chung khuếch đại đoạn gen cytochrome oxidase subunit 1 (CO1) của ADN ty thể có thể định danh được đến loài ở

hầu hết các ngành thuộc hệ thống phân loại động vật ngoại trừ ngành ruột

khoang Cnidaria ADN ty thể là một công cụ đắc lực trong xác định các loài,

đánh giá mối quan hệ của các loài với nhau và cung cấp dữ liệu di truyềntrong công tác bảo tồn các loài đang bị đe dọa và có nguy cơ tuyệt chủng.

Tuy nhiên, việc sử dụng ADN ty thể cũng có một số giới hạn Kíchthước của ADN ty thể nhỏ, nên chỉ thể hiện một phần vật chất di truyền Tỷ lệđột biến ở ADN ty thể cao hơn ADN nhân, trong khi đó kích thước ADN tythể lại nhỏ, nên đột biến có thể dễ dàng xảy ra mà không phản ánh được mốiquan hệ phát sinh loài hay lịch sử tiến hóa Hơn nữa, việc không tuân theoquy luật di truyền của Mendel không phù hợp với nhiều nghiên cứu di truyền.Người ta đề nghị nên sử dụng kết hợp các chỉ thị phân tử để có kết quả với độchính xác cao Các marker ADN ty thể được sử dụng kết hợp vớimarker ADN nhân trong một số trường hợp cho thấy mối quan hệ tiến hóa rõhơn ADN ty thể được chứng minh là công cụ hữu hiệu trong xác định cácloài, đánh giá mối quan hệ của các loài với nhau và cung cấp dữ liệu di truyềntrong công tác bảo tồn các loài đang bị đe dọa và có nguy cơ tuyệt chủng [66]

1.4.4 Vùng gen 16S và COI.

Vùng gen 16S từ lâu được biết đến như là thước đo về sự biến đổi trong

hệ gen của các sinh vật Ribosome ty thể 55S ở động vật gồm tiểu đơn vị lớn16S và tiểu đơn vị nhỏ 12S Vùng gen 16S và COI có chức năng cần thiết cho

sự sống đồng thời nó vừa có vùng bảo tồn, vừa có vùng biến động ở các cấp

độ khác nhau giúp cho gen 16S và COI luôn là sự lựa chọn trong việc xácđịnh loài, đánh giá mức độ đặc trưng cho loài Bên cạnh đó, số lượng trình tự16S và COI được nghiên cứu rất chi tiết và nhiều trình tự của các loài, giống

đã được giải mã, công bố trên ngân hàng gen Sự tiến hóa và biến đổi của cácvùng gen là rất thấp

Do có những đặc điểm riêng hình thành trong suốt quá trình tiến hóanên các vùng gen 16S và COI được dùng để giải trình tự giúp cho việc phânloại, xác định mối quan hệ giữa các loài và đánh giá đa dạng di truyền [22]

1.4.5 Những nghiên cứu liên quan đến vùng gen 16S và COI trong lĩnh vực thủy sản.

Nguyễn Anh và ctv đã xác định được trình tự gen 16S rADN và gen

Cytb hệ gen ty thể của 8 loài cá song có giá trị kinh tế cao thu thập tại vùng

biển Việt Nam, phân tích tỉ lệ tương đồng và mối quan hệ phả hệ với 16 loàicủa thế giới Tám loài nghiên cứu được phân thành 2 nhánh, nhánh 1 bao gồmcác mẫu ở Hải Phòng, Nha Trang và Đồng Nai ( EpHP, EpS1, EpS2, EpS5,EpS9, EpS10) có độ đồng nhất 100% với các loài cá Song Trung Quốc thuộc

loài E coicoides Hai mẫu cá Song Hải Phòng (EpS3, EpS8) thuộc nhánh 2, không phải là loài E Coicoides [1].

Thái Thanh Bình 2009, đã nghiên cứu phân loại cua xanh (Scylla sp) dựa trên trình tự ADN vùng gen Cytochrome oxdase subunitl (COI) đối với

33 mẫu cua xanh được thu từ 10 tỉnh ven biển Việt Nam và Úc Trình tự ADNcủa cua xanh Việt Nam cũng được so sánh với trình tự DNA của cua xanh ởcác nước Trung Quốc, Úc và Inđônêxia Kết quả nghiên cứu cho thấy vùnggen COI rất hữu hiệu trong việc nhận dạng 4 loài cua xanh có ở Việt Nam:

Scylla paramamosian, S Serrata, S Olivacea và S Tranquebaria Loài Scylla paramamosian là loài gặp phổ biến nhất Kết quả nghiên cứu góp phần

quan trọng trong việc xây dựng hệ thống phân loại, định hướng lựa chọn vậtliệu cho chọn giống và bảo tồn các loài cua xanh ở Việt Nam [12]

Trương Ngọc Trinh và ctv (2012), đã so sánh đặc điểm hình thái và ditruyền của các dòng cá rô đồng bằng giải trình tự vùng gen COI, khi so sánhtrình tự gen COI của 5 mẫu cá rô đồng tự nhiên thu từ Cà Mau (gọi tắt là cá rô

Cà Mau) với 5 mẫu cá rô đầu vuông đã báo cáo mức độ tương đồng di truyềngiữa chúng lên đến 99 – 100%, tương tự mức tương đồng độ các cá thể trongcùng dòng Trình tự vùng gen COI của 10 mẫu cá rô (kể cả mẫu cá rô đầu

vuông) trong nghiên cứu là tương đồng 97% với COI của cá rô Anabas testudineus [38]

Vũ Đặng Hạ Quyên và ctv (2014), sử dụng trình tự gen 16S của ADN

ty thể đã kiểm chứng phân loại dựa vào hình thái và xây dựng mối quan hệphát sinh chủng loại của các loài cá nghiên cứu [28]

Nguyễn Thị Anh Thư và ctv (2014), đã nghiên cứu di truyền quần thểcủa Trai tai tượng ở vùng biển Nam Trung Bộ và Nam Bộ Việt Nam, phân

tích đa dạng di truyền và cấu trúc di truyền của 2 loài trai tai tượng (Tridacna crocea thu ở vịnh Nha Trang và Côn Đảo, T squamosa thu ở vịnh Nha Trang

và đảo Phú Quốc) dựa trên chỉ thị phân tử gen COI của ADN ty thể Kết quả

cho thấy, quần thể Tridacna crocea thể hiện mức độ đa dạng trung bình với

khác biệt trình tự giữa các cá thể từ 0 – 3,5%, 10 haplotype/30 cá thể (đa dạnghaplotype = 0,846) ở vịnh Nha Trang và khác biệt trình tự gen từ 0 – 9,7%, 16haplotype/28 cá thể (đa dạng haplotype = 0,934) ở Côn Đảo Quần thể

T.squamosa thể hiện mức độ đa dạng thấp với khác biệt trình tự gen của loài

từ 0 – 2,1%, 7 haplotype/19 cá thể (đa dạng haplotype = 0,468) ở vịnh NhaTrang và khác biệt trình tự gen từ 0 – 1,72%, 5 haplotype/18 cá thể ở đảo PhúQuốc (đa dạng haplotype = 0,314) Hai quần thể trai tai tượng ở Việt Nam cómối quan hệ gần gũi về mặt di truyền với quần thể ở một số khu vực thuộcvùng biển Đông Nam Á [38]

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Cá Bỗng được thu mẫu trên các hệ thống sông, suối ở các tỉnh miền núiphía Bắc Việt Nam: Sơn La, Hòa Bình, Tuyên Quang, Hà Giang, Lạng Sơn

và Thanh Hóa (Hình 2.1)

Phân loại cá bằng hình thái, tách chiết ADN, PCR và tinh sạch sảnphẩm PCR được thực hiện phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thủy sảnthuộc Trường Cao đẳng Thủy sản – Đình Bảng – Từ Sơn – Bắc Ninh

Giải trình tự ADN được thực hiện tại Trường đại học tổng Hợp Monash

Hòa Bình Sơn La

Bảng 2.1 Địa điểm thu, số lượng mẫu phân tích cá Bỗng

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu

Nghiên cứu tiến hành trên đối tượng cá Bỗng phân bố ở các tỉnh miềnnúi phía Bắc Việt Nam (Tuyên Quang, Hà Giang, Lạng Sơn, Sơn La và HòaBình) và cá Bỗng (Cá thần) ở Cẩm Thủy Thanh Hóa

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp nghiên cứu ngoài thực địa

Phương pháp chọn địa điểm để thu mẫu: Các địa điểm thu mẫu được

thiết kế theo sự khảo sát địa hình tại các vị trí trên các sông, suối ở các tỉnh:Tuyên Quang, Hà Giang, Lạng Sơn, Sơn La, Hòa Bình và Thanh Hóa

Phương pháp thu mẫu: Cá Bỗng được thu bằng cách dùng lưới vét bắt

cá với sự hỗ trợ của người dân địa phương Mẫu vật được thu nguyên con vàđược định hình bằng formalin 5% dùng để phân loại hình thái Để phân loại

bằng chỉ thị ADN, mẫu được thu là 1cm vây cá và bảo quản trong etanol90% Mỗi địa điểm thu từ 10 – 15 mẫu Mẫu thu ở thực địa đựng trong các lọ

có ghi nhãn với các thông tin về địa điểm, thời gian, dụng cụ thu mẫu, dungdịch bảo quản

Thu thập các tài liệu:

+ Thu thập các tài liệu liên quan: Các số liệu về điều kiện tự nhiên, khíhậu, thủy văn Tài liệu nghiên cứu về phân loại và định loại cá của Việt Nam,

và các nước lân cận

+ Phỏng vấn những người dân chài, người hiểu biết về cá trong vùngthu mẫu

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm

2.2.2.1 Phương pháp phân loại bằng hình thái

Theo phương pháp phân tích hình thái của Pravdin [25], có bổ sung tài liệucủa Nguyễn Văn Hảo, Ngô Sỹ Vân [20], Kottelat [50] [49]

Hình 2.2 Sơ đồ đo cá bộ cá Chép (Cyprinidae)

ab: Chiều dài toàn thân; ac: Chiều dài theo Smith; ad: Chiều dài không có C; od: Chiều dài mình; an: Chiều dài mõm; np: Đường kính mắt; po: Phần đầu sau mắt; ao: Chiều dài đầu; lm: Chiều cao đầu ở chẩm; gh: Chiều cao lớn nhất ở thân; ik: Chiều cao nhỏ nhất của thân; aq: Khoảng cách từ mõm đến vây lưng; fd: Chiều dài thân đuôi; qs: Chiều dài gốc D; tu: Chiều dài lớn

nhất của D; yy 1 : Chiều dài gốc A; ej: Chiều cao lớn nhất của A; vx: Chiều dài P; zz 1 : Chiều dài V; vz: Khoảng cách giữa P và V; zy: Khoảng cách giữa V

và A; Ở bên phải là sơ đồ đo chiều rộng của chán: (OO)

Các chỉ tiêu hình thái bảng 2.2

Bảng 2.2 Các chỉ tiêu hình thái

Dài tiêu chuẩn (Lo) Đường kính mắt (O)

Dài toàn thân (L) Dài trước vây lưng (daD)

Dài bên đầu (T) Dài sau vây lưng (daP)

Dài lưng đầu (T) Dài trước vây hậu môn (daA)

Dài đầu sau mắt (Op) Dài trước vây ngực

Cao đầu ở gáy (hT) Dài trước vây bụng (daV)

Cao đầu ở mắt (hT) Dài trước lỗ faauj môn

Cao cơ thể ở hậu môn (Ha) Dài tia cứng vây lưng

Cao cơ thể ở vây lưng (H) Dài tia mềm vây lưng

Rộng đầu ở gáy (wc) Dài tia mềm vây hậu môn

Rộng đầu ở mắt (we) Dài gốc vây lưng (gốc D)

Rộng miệng (wm) Dài tia cứn vây hậu môn

Rộng thân ở vây lưng (wd) Dài gốc vây hậu môn (gốc A)

Rộng thân ở vây bụng Dài vây ngực

Rộng thân ở vây hậu môn (wa) Dài vây bụng

Khoảng cách hai mắt (OO) Dài thùy dưới đuôi

Khoảng cách mõm – sau mắt Dài chẻ vây đuôi

Khoảng cách P – V Dài cán đuôi (lcd)

Khoảng cách V – A Cao cán đuôi (ccd)

Các chỉ tiêu đếm: Số vảy trước vây lưng (D), Số vảy đường bên, số vảydọc cán đuôi, số vảy quanh cán đuôi, số tia vây lưng (D), số tia vây hậu môn(A), số tia vây ngực (P), số tia vây bụng (V), số tia vây đuôi (C)

Các Tỷ lệ về các chỉ số đo hình thái: L0/H, L0/T, L0/dày thân, L0/daD,

L0/dpD, L0/lcd, L0/ccd, T/Ot, T/O, T/OO, T/hT, T/rộng đầu, H/h, OO/O, P V/V/A, lcd/ccd

-Lập phiếu hình thái: Chúng tôi tiến hành lập 50 phiếu hình thái chomẫu cá nghiên cứu

 Phương pháp định loại:

Định loại dựa vào hình thái ngoài, trong quá trình định loại các mẫu tôi

có sử dụng và tham khảo các tài liệu chính trong định loại:

+ Cá nước ngọt Việt Nam Nguyễn Văn Hảo và Ngô Sỹ Vân[20]

+ Định loại cá nước ngọt các tỉnh phía Bắc Việt Nam Mai Đình Yên [43]

và có bổ sung dựa vào tài liệu của các tác giả Kottelat [50], Chen Yiyu ctv [46]

 Các bước định loại.

Sử dụng phương pháp định loại của Mayr [24] gồm các bước sau:

+ Phân chia các lô mẫu

+ Sử dụng khóa định loại để xác định taxon bậc loài (Phụ lục 3)

+ Đối chiếu đặc điểm hình thái phân loại và hình vẽ

+ Phân tích đặc điểm biến dị của quần thể loài

2.2.2.2 Phương pháp giải trình tự ADN cá Bỗng

 Phương pháp tách chiết ADN bằng bộ kít QIAGEN.

Quy trình tách chiết ADN bằng bộ kít Qiagen được thực hiện theohướng dẫn của nhà sản xuất và được tiến hành tại phòng Công nghệ Sinh học– Trường Cao đẳng Thủy Sản – Từ Sơn – Bắc Ninh

 Phương pháp điện di ADN tổng số.

Chuẩn bị 25 ml Agarose với nồng độ 1%:

Đong 25 ml dung dịch TBE 1X vào lọ, cân 25 g Agarose cho vào vàđun trên lò vi sóng cho tan hoàn toàn đưa ra ngoài khi nhiệt độ lớn hơn 55oCcho thêm 1,25μll gelred và lắc đều không để tạo bọt, để nguội khoảng 55oC

sau đó đổ dung dịch vào khuôn gel có cài sẵn lược để tạo các giếng, chờ chođông lại( xuất hiện màu đục).

Bỏ tấm lược ra và đặt gel vào buồng điện di có chứa dung dịch TBE 1X

Tra mẫu vào giếng:

Mẫu gồm 3μll ADN và 1μll Loading dye, hỗn hợp được trộn đều sau đódùng pipet hút mẫu nạp vào các giếng

Chạy điện di:

Điều chỉnh hiệu điện thế 220 V, cường độ dòng điện 110 mA và tiếnhành trong khoảng 30 phút Khi vạch chạy đến 2/3 bản gel thì dừng lại, mangbản gel sau khi chạy điện di quan sát dưới đèn UV

 Kỹ thuật PCR để nhân đại đoạn gen 16S và gen COI.

Đoạn gien 16S và COI của ADN ty thể cá Bỗng được khuếch đại bằng

sử dụng cặp mồi được trình bày ở Bảng 2.3 Hỗn hợp tạo phản ứng PCR sửdụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất Mỗi phản ứng PCR được thực hiệnvới thể tích 25 l (Nước tinh khiết 4,2 l, Top taq Maxter mix 12,5l,primers 2l, ADN khuôn mẫu 1l)

Bảng 2.3 Các cặp mồi được sử dụng để giải trình tự ADN của cá Bỗng Gen Mồi Trình tự mồi (5'-3') Tài liệu tham khảo

16S

16Sp1F CTT ACA CCG AGA ARA CAT C

Li et al [55]

16Sp1R CTT AAG CTC CAA AGG GTC

phẩm PCR theo hướng dẫn của nhà sản xuất Sản phẩm PCR được kiểm tratrên gel agarose/TAE 2%

 Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm PCR.

Chuẩn bị 25 ml Agarose với nồng độ 2%:

Đong 25 ml dung dịch TBE 1X vào lọ, cân 50g Agarose cho vào vàđun trên lò vi sóng cho tan hoàn toàn đưa ra ngoài khi nhiệt độ lớn hơn 55oCcho thêm 1,25μll gelred và lắc đều không để tạo bọt, để nguội khoảng 50oCsau đó đổ dung dịch vào khuôn gel có cài sẵn lược để tạo các giếng, chờ chođông lại (xuất hiện màu đục)

Bỏ tấm lược ra và đặt gel vào buồng điện di có chứa dung dịch TBE 1X

Cho mẫu vào giếng:

Mẫu gồm 3μll ADN và 1μll loading dye, hỗn hợp được trộn đều sau đódùng pipet hút mẫu nạp vào các giếng

Chạy điện di:

Điều chỉnh hiệu điện thế 220 V, cường độ dòng điện 110 mA và tiến hànhtrong khoảng 30 phút Khi vạch chạy đến 2/3 bản gel thì dừng lại, mang bản gelsau khi chạy điện di quan sát dưới đèn UV Kết quả điện di cho các vạch gọn,phân tách rõ ràng là ADN trong mẫu đã tinh sạch cho nghiên cứu tiếp

 Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR.

Sản phẩm PCR được làm sạch bằng QIAGEN QIAquick PCR Kit.Phương pháp làm sạch sản phẩm PCR theo hướng dẫn của nhà sản xuất Sảnphẩm PCR được kiểm tra trên gel agarose/TAE 2% Tiếp theo trình tự ADNđược giải theo phương pháp của ABI 3130XL, mỗi mẫu được giải trình tựbằng 2 mồi xuôi và ngược

Bước 1 Thêm 100μll Buffer vào sản phẩm PCR với tỉ lệ (5 : 1) PB :PCR = 100 : 20 sau đó tiến hành voltex

Bước 2 Tiến hành hút tất cả dung dịch vào ống đầu lọc đã được

Bước 5 Loại bỏ nước ở phía dưới, lắp cột lọc vào ống Eppandoss 1,5

và đánh dấu theo tỉ lệ như ống cũ

Bước 6 Thêm 30μll Buffer EB vào chính giữa màng cột lọc ( tránhkhông để chạm vào màng lọc) để ở nhiệt độ phòng 1 phút sau đó mang li tâm

13000 vòng/1 phút trong thời gian 1 phút

Bước 8 Kiểm tra sản phẩm trên Agarose.

2.2.2.3 Phương pháp định trình tự gen bằng máy giải tự động

Trình tự ADN ty thể của cá Bỗng được giải mã trên máy ABI 3130XL.Trình tự ADN ty thể của các loài cá Bỗng có sẵn trong ngân hàng genđược sử dụng để so sánh với mẫu cá Bỗng ở một số tỉnh miền núi phía Bắc ViệtNam, sử dụng phần mềm BioEdit [48] và BLAST [72] Mối liên hệ giữa cácloài cá Bỗng được xây dựng trên phần mềm MEGA6.0 [47]

2.2.2.4 Đánh giá đa dạng di truyền quần thể cá Bỗng

Đa dạng di truyền của các quần thể cá Bỗng được tính bằng:

Tổng số haplotype (k): Haplotype là một biến thể thứ tự duy nhất của mộtgen tại cùng một locus trong bộ gen Các trình tự gen có cùng số điểm đột biếnlập thành một haplotype Các haplotype khác nhau bởi một điểm đột biến

Đa dạng haplotype (h): Xác suất hai lựa chọn ngẫu nhiên các haplotypetrong một mẫu là khác nhau (tương đương với dị hợp tử được mong đợi)

Trong đó: h là đa dạng haplotype, n là số lượng haplotype trong mộtmẫu, p là tần số của từng haplotype trong mẫu.

Đa dạng nucleotide (Π): là số lượng trung bình của các vị trí nucleotidekhác nhau giữa hai chuỗi nucleotide được rút ra ngẫu nhiên từ một mẫu

η = Xác suất đột biến x (Tổng số nucleotide – Số nucleotide đã bị đột biến)

Các số liệu được xử lý bằng phần mềm DNAsp5 [56].

 Phương pháp phân tích cây tiến hóa

Phân tích đa dạng di truyền của cá Bỗng được tiến hành dựa trên 3 thuật toán Maximum parsimony (MP), Neighbor joining (NJ) và Maximum likelihood (ML), các phương pháp được phân tích bằng các phần mềm MEGA 6.0 [47] Giá trị bootstrap (BT) được tính toán để xác định tính chính

xác của thuật toán MP, ML và NJ với độ lặp lại 1.000

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân loại cá Bỗng

3.1.1 Phân loại cá Bỗng dựa vào hình thái học

Kết quả phân tích hình thái để định loại mẫu cá Bỗng thu được tại 5tỉnh: Sơn La, Hòa Bình, Tuyên Quang, Hà Giang, Lạng Sơn được trình bày ởBảng 3.1

Bảng 3.1 Kết quả phân tích hình thái cá Bỗng ở một số tỉnh phía Bắc

Vẩy trước vây lưng 8-10 9-11 9-10 9-10 9-12

Từ số liệu phân tích hình thái (Bảng 3.2) các mẫu cá Bỗng cho thấy:Vây hậu môn của cá chỉ có 5 tia phân nhánh, tia không phân nhánh cuối cùngcủa vây hậu môn mềm và không có răng cưa, răng hầu 3 hàng, vây lưng cógai cứng, râu có hai đôi, là những đặc điểm của cá thuộc phân họ cá Bỗng

Barbinae.

Thân tròn, dài hình thoi, dẹp bên phần cuống đuôi Viền lưng và viềnbụng cong tròn Đầu vừa phải, sống đầu hình cung Mõm tròn tù, hơi nhô vềphía trước Miệng ở cuối, kề dưới, hình móng ngựa Môi trên và môi dưới liềnnhau ở góc miệng Có hai đôi râu; mắt vừa phải gần mút mõm hơn viền saunắp mang Viền sau vây lưng lõm, có gai ngược trước khởi điểm vây lưng ẩndưới da Vây hậu môn có 3 tia đơn, 5 tia phân nhánh Đây là đặc điểm thuộc

giống cá Bỗng Spinibarbus (Phụ lục 3).

Khi phân tích hình thái các mẫu cá Bỗng thu tại Tuyên Quang, Hà Giang

và Lạng Sơn đều có đặc điểm (Bảng 3.2): Khởi điểm vây lưng sau vây bụng vàgần mõm hơn so với gốc vây đuôi, L0= 2,9 – 3,2, H = 4,5 – 4,7, T = 6,8 – 7,0,Lcd = 6,1 – 6,8 , L1= 32 – 33; lược mang cung mang I 10 – 12 và răng hầu 2.3.4

– 4.3.2 là những đặc điểm thuộc loài cá Bỗng Spinibarbus denticulatus (Phụ lục

3)

Các mẫu cá Bỗng thu tại Sơn La và Hòa Bình đều có đặc điểm: Khởiđiểm vây lưng cách mút mõm bằng tới mút cuối tia giữa vây đuôi, L0 = 3,5 –4,1, H = 4,2 – 4,3, T = 4,7 – 5,6, Lcd = 3,9 – 5,3, L.1 = 29 – 30; lược mang

cung mang I có 6 – 8, là những đặc điểm của loài Spinibarbus sp và có nhiều đặc điểm giống với loài cá Bỗng thon S nammauensis Nguyen & Nguyen.

Như vậy từ các phân tích về hình thái, giải phẫu, so sánh với các tàiliệu định loại hiện có, bước đầu sơ bộ kết luận như sau: