Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ diện tích bề mặt dịch lên men trên thể tích đến khả năng tạo màng BC cho vi khuẩn gluconacetobacter

... tỷ lệ diện tích bề mặt dịch lên men thê tích đến khả tạo màng BC cho vỉ khuân Gluconacetobacter ” Mục tiêu đề tài Xác định ảnh hưởng tỷ lệ diện tích bề mặt dịch lên men thể tích đến khả tạo màng. .. cellulose s Diện tích bề mặt lên men tạo màng BC( cm ) V Thể tích dịch lên men tạo màng (cm ) s/v Tỷ lệ diện tích bề mặt lên men tích dịch lên men tạo màng (cm" ) DANH MỤC BẢNG BIÊU, HÌNH ẢNH HÌNH... chủng Gluconacetobacter 2.2.5.1 Phương pháp nghiên cứu tìm tỷ lệ s/v đến khả tạo màng BC tốt từ chủng Gluconacetobacter s : diện tích bề mặt dịch lên men tạo màng BC (cm ) V: thể tích dịch lên men

TRƯỜNG ĐẠI HỌC su PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN

HOÀNG THỊ THẮM

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA TỶ LỆ DIỆN TÍCH BÈ MẶT DỊCH LÊN MEN TRÊN THẺ TÍCH ĐÉN KHẢ NĂNG TẠO MÀNG BC CHO

HÀ NỘI - 2015

LỜI CẢM ƠNTrước tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS TS Đinh Thị KimNhung và TS Phương Phú Công người đã giúp đỡ, chỉ bảo tận tình trong suốt quátrình em thực hiện đề tài.

Em xin chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa, các thầy cô giáo trong tổThực Vật- Vi Sinh Khoa Sinh - KTNN trường ĐHSP Hà Nội 2, đã tạo điều kiện thuậnlợi cho em trong suốt quá trình em thực hiện đề tài

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn bạn bè, gia đình đã giúp đỡ, tạo điều kiện chotôi nghiên cứu và hoàn thành khoá luận này

Xin chân thành cảm ơn ỉ

em xin chịu hoàn toàn trách nhiệm

Xin chân thành cảm ơn ỉ

Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Sinh viên

LỜI CAM ĐOAN

Hoàng Thị Thắm MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lí do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu của đề tài 2

3 Đối tượng nghiên cứu 2

4 Nội dung nghiên cứu của đề tài 2

5 Ý nghĩa khoa học của đề tài 2

6 Điêm mới 3

NỘI DUNG 4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1 Giới thiệu tổng quan về đối tượng 4

1.1.1 VỊ trí phân loại của Gluconacetobacter trong sinh giới 4

1.1.2 Đặc điểm hình thái, tế bào học 6

1.1.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của Gluconacetobacter 7

1.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình tạo màng BC 7

1.2.1 Nhu cầu nguồn cacbon 9

1.2.2 Nhu cầu nguồn Nitơ 9

1.2.3 Nhu cầu của nguồn MgS04

10

1.2.4 Nhu cầu của Photpho 10

1.2.5 Điều kiện nuôi cấy 10

1.3 Bacterial cellulose (BC) 11

LỜI CẢM ƠN1.3.1 Cấu trúc11

1.3.2 Một số tính chất của màng BC12

1.3.3 Quá trình tống họp BC từ vi khuẩn Glucomcetobacter12

1.4 ứng dụng của màng BC13

1.4.1 ứng dụng của BC trong một số lĩnh vực13

1.4.2 ứng dụng của màng BC trong điều trị bỏng15

1.5 Tình hình nghiên cứu về màng BC ở Việt Nam và trên thế giới 15

1.5.1 Trên thế giới15

1.5.2 Ở Việt Nam17

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cúu 20

2.1 Vật liệu20

2.1.1 Nguồn giống20

2.1.2 Thiết bị và hóa chất20

2.1.3 Môi trường21

2.2 Phương pháp nghiên cứu 222.2.1 Phương pháp phân biệt tế bào vi khuấn Gluconacetobacter bằng phương phápnhuộm Gram 222.2.2 Phương pháp hoạt hoá giống Gluconacetobacter 222.2.3 Phương pháp lên men tạo màng BC từ vi khuẩn Gluconacetobacter 232.2.4 Phương pháp bảo quản chủng giống trên môi trường thạch nghiêng 232.2.5 Phương pháp nghiên cứu tỷ lệ s/v đến khả năng tạo màng BC từ chủng

Gluconacetobacter 23

2.2.6 Phương pháp thống kê và xử lý kết quả 25CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN cứu VÀ THẢO LUẬN 27

LỜI CAM ĐOAN 3.1 Nghiên cứu khả năng lên men tạo màng BC từ chủng vi khuẩn Gluconacetobacterll

3.1.1 Đặc điểm hình thái và tế bào học của vi khuẩn Gluconacetobacter 27 3.1.2 Vi khuẩn Gluconacetobacter sinh trưởng trên môi trường thạch đĩa 28 3.1.3 Kiếm tra hoạt tính catalase của chủng Gluconacetobacter 28 3.1.5 Khảo

sát khả năng lên men tạo màng BC từ chủng vi khuẩn Gluconacetobacter 29

3.1.6 Ánh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng tạo màng BC từ chủng vi khuẩn Gluconacetobacter 30

3.1.7 Ánh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng tạo màng BC của chủng Gluconacetobacter 35

3.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ s/v tới khả năng tạo màng của vi khuẩn Gluconacetobacter 38 3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ s/v đến thời gian, khối lượng màng 38 3.2.2 Nghiên cứii ảnh hưởng của tỷ lệ s/v đên độ chịu kéo (độ dai) của màng 41 PHẦN KÉT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45

1 Kết luận 45

2 Kiến nghị 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO 46

CÁC CHŨ VIẾT TẮT

BC Bacterial cellulose

PC Plant cellulose

s Diện tích bề mặt lên men tạo màng BC(cm2)

V Thể tích dịch lên men tạo màng (cm3)

s/v

Tỷ lệ diện tích bề mặt lên men trên thế tích dịch lên men tạo màng (cm"1)

DANH MỤC BẢNG BIÊU, HÌNH ẢNH HÌNH

LỜI CẢM ƠN

Hình 1.3 Con đường chuyến hoá cacbon trong vi khuấn Gluconacetobacter Hình 3.1 Ket quả nhuộm Gram của vi khuẩn Gluconacetobacter Hình 3.2 Chủng vi khuấn Gluconacetobacter trên môi trường thạch nghiêng

Hình 3.3 Chủng vi khuấn Gluconacetobacter trên môi trường thạch đĩa Hình 3.4

Hoạt tính catalaza

Hình 3.5 Thế hiện mối quan hệ giữa thời gian với khối lượng màng

Hình 3.6 Thể hiện mối quan hệ giữa thời gian với độ bền kéo màng

Hình 3.7 Màng BC ngày thứ 4

Hình 3.8 Màng tươi sau 5 ngày nuôi cấy

Hình 3.9 Hình ảnh màng BC khô

Hình 3.10 Mối quan hệ giữa nhiệt độ với khối lượng màng

Hình 3.11 Mối quan hệ với độ kéo màng

Hình 3.13 Mối quan hệ giữa s/v với khối lượng màng

Hình 3.14 Mối quan hệ giữa s/v với độ bền kéo màng

Hình 3.15 Hình ảnh ảnh hưởng của tỷ lệ s/v tới khả năng tạo màng BC

LỜI CAM ĐOAN

Các đặc điểm phân biệt Gluconobacter và Acetobacter (So sánh với

Pseudomonas)

Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến năng suất sản xuất màng BC Tính quy đối

s/v thí nghiệm nghiên cứu Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả năng tạo

màng BC từ chủng Gluconacetobacter Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả năng tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter Tính quy đổi s/v thí nghiệm nghiên cứu Khảo sát tỷ lệ s/v với thời gian xuất hiện màng Khảo sát tỷ lệ s/v

đến khả năng tạo màng BC tốt nhất từ chủng Gluconacetobacter Ảnh hưởng

của tỷ lệ s/v đến độ dai của màng

MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Cùng với sự phát triến của khoa học thì công nghệ sinh học (CNSH) đãtrở thành một ngành kinh tế chủ đạo của nhiều quốc gia Là một bộ phận củangành công nghệ sinh học, công nghệ vi sinh đã và đang phát triến mạnh mẽ vớinhững thành tựu to lởn trong lĩnh vực công nghiệp, nông nghiệp, y học Khó

có thế tìm ra một lĩnh vực nào của công nghệ sinh học mà không liên quan tới visinh vật

Màng BC được cấu tạo bởi chuỗi polyme p - 1,4- glucopyranose mạchthẳng chuỗi polyme p - 1,4- glucopyranose mới hình thành liên kết với nhau tạo

thành sợi nhỏ (subfiril) có kích thước 1,5 nm Những sợi nhỏ kết tinh tạo thành

sợi lớn hơn- sợi vĩ mô, những sợi này kết hợp với nhau thành bó và cuối cùngthành dải lớn Những dải lớn từ tế bào này khi đấy ra ngoài sẽ liên kết vớinhững dải lớn của tế bào khác bằng liên kết hidro hoặc Vandecvan tạo thànhdạng sệt hay một lớp màng mỏng Kích thước của màng tăng lên khi quần thể vikhuẩn sinh trưởng [24]

Màng BC có cơ chế kết tinh khác hẳn cellulose của thực vật ở chỗ chúngkhông có sự kết hợp hemixellulose, lignin hay những thành phần phụ khác màđược cấu tạo từ các sợi song song thành mạng lưới cellulose Do đó BC có độbền cơ học cao hơn hắn cellulsose của thực vật [24]

Hiện nay màng BC được xem là nguồn nguyên liệu mói có tiềm năngđược ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực khác nhau như: công nghệ thựcphẩm,công nghệ giấy,công nghệ sản xuất pin,đặc biệt trong lĩnh vực y học như:mặt nạ tẩy trang, điều trị bỏng từ các chế phẩm sinh học như: màng ối, màng

da ếch Màng BC chứng minh có hiệu lực tốt [9]

Do sự đa dạng về mặt ứng dụng như trên, tôi quyết định chọn hướng đề tài:

“Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ diện tích bề mặt dịch lên men trên thê tích đến khả năng tạo màng BC cho vỉ khuân Gluconacetobacter ”

2 Mục tiêu của đề tài

Xác định được ảnh hưởng của tỷ lệ diện tích bề mặt dịch lên men trên thể

tích đến khả năng tạo màng BC cho vi khuẩn Gluconacetobacter.

3 Đối tượng nghiên cứu

Chủng vi khuẩn Gluconactobacter phân lập từ nguồn nguyên liệu bia Hà

Nội, tại phòng Vi sinh- trường ĐHSP Hà Nội 2

4 Nội dung nghiên cứu của đề tài

4.1 Nghiên cứu khả năng lên men tạo màng BC từ chủng vi khuấn Gluconacetobacter

4.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng tạo

màng BC của chủng vi khuấn Gluconacetobacter

4.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến tỷ lệ s/v đến khả

năng tạo màng BC của chủng vi khuẩn Gluconacetobacter

4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ s/v tới khả năng tạo màng của

Rút ngắn thời gian lên men tạo màng BC cho chủng vi khuẩn

Gluconacetobacter nhằm tạo màng BC được tốt nhất, có triến vọng ứng dụng vào

một số lĩnh vực trong cuộc sống, đặc biệt là lĩnh vực y học

6 Điểm mới

Tìm ra tỷ lệ s/v = 0,8 thích hợp cho khả năng lên men tạo màng, rút ngắn

thời gian lên men tạo màng BC từ chủng vi khuấn Gluconacetobacter, đáp ứng

nhu cầu thực tiễn

1.1 Giới thiệu tổng quan về đối tượng

1.1.1 Vị trí phân loại của Gluconacetobacter trong sinh giới

Đã từ lâu vi khuẩn acetic nói chung và đặc biệt là Gluconacetơbacter nói

riêng đã và đang thu hút được sự quan tâm của rất nhiều nhà khoa học trên thếgiới Ngay từ thế kỷ XIX các nhà khoa học đã tiến hành phân loại chúng, chođến nay việc phân loại vi khuẩn này vẫn có nhiều ý kiến khác nhau về vấn đềnày

Một số đặc điếm sinh lý, sinh hóa là cơ sỏ’ phân loại của nhóm vi

khuẩn Acetobacter xylinum

Quan điểm 1: Dựa vào khả năng oxy hóa acid acetic, Beijerinck phân

chia các loài trong Gluconacetobacter thành 2 nhóm:

* Nhóm 1: Có khả năng oxy hoả acid acetỉc thành co 2 và H 2 O + Sử dụng muối amonium (NH4 + ) làm nguồn nitơ duy nhất (Sinh trưởng trên môi trường Hoyer)

+ Không sử dụng muối amonium (NH4 ) làm nguồn nitơ duy nhất chia

ra làm: trên bề mặt môi trường tạo thành màng nhầy chứa cellulose như

Gluconacetobacter và trên bề mặt môi trường không tạo thành màng nhầy có

chứa cellulosenhư: Acetobacter rancens, Acetobacter pasteurianus, Acetobacter kneỉiỉgỉanus.

Nhóm 2: Không có khả năng oxy hoả acid acetỉc.

+ Tạo thành sắc tố trên môi trường glucose: sắc tố nâu với đen nhạt

(Acetobacter melanogenus); sắc tố hồng (Acetobacter resens)

+ Không tạo thành sắc tố: Nhiệt độ thích hợp nhất trong khoảng

30-35°C (Acetobacter suboxydans); nhiệt độ thích hợp nhất trong khoảng

18-21 °c {Acetobacter oxydans).

Theo quan điểm này, Gluconacetobacter là chủng thuộc chi Acetobacter, họ

Pseudomonadaceae, bộ Pseudomonadales, lớp Schizomycetes Đặc điểm phânbiệt với các loài khác trong chi bao gồm: + Có khả năng oxy hóa acid aceticthành CƠ2và H2O + Không sử dụng muối amonium làm nguồn nitơ duy nhất +

Trên bề mặt môi trường tạo lớp màng nhầy chứa cellulose

Quan điểm 2: Theo Bergey (1984 và 1992), Gluconacetobacter

được xếp vào chi Acetobacter thuộc họ Acetobacteraceae Họ vi khuấn này gồm 2 chi là Acetobacter và Gluconobacter Đặc điểm phân biệt giữa 2 chi

cụ thể là:

Bảng 1.1 Các đặc điểm phân biệt Gluconobacter và Acetobacter

(So sánh Gluconobacter , Acetobactervởi Pseudomonas )

4 Oxi hóa acid acetic

+/-Quan điểm 3: Theo Boesch và cs (1998) [13], Yamada và cs (2000),

và hiện nay vẫn có những quan điểm khác nhau về phân loại họ

Acetobacteraceactrong đó Gluconacetobacter xylinus (A xylinum) và xếp vào chi Gluconacetobacter với cơ sở của sự phân chia này là việc phân tích

trình tự chuỗi 16S rDNA Quan điếm này hiện nay có tính chính xác cao

do cơ sở là dựa vào cấu trúc phân tử nên được nhiều người công nhận[32]

Đánh giá: Mặc dù xếp chủng vi khuấn Gluconacetobacter vào những

chi, những họ, những lớp phân loại khác nhau nhưng tất cả các quan điểmtrên đều thống nhất với nhau về một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa của

Gluconacetobacter như: khả năng oxy hóa rượu etylic thành acid acetic,

khả năng oxy hóa tiếp tục acid acetic thành CƠ 2 và H2O; khả năng hìnhthành acid 5-ketogluconic từ D-glucose Đặc biệt là khả năng tống hợp

cellulose khả năng này hầu như chỉ có ỏ’ các chủng Gluconacetobacter 1.1.2 Đặc điếm hình thái, tế bào học

Gluconacetobacter là loại trực khuẩn, hình que, thẳng hay hơi cong

kích thước khoảng 2 |im đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi, không cóbào tử, xếp thành từng chuỗi, không có khả năng di động

Gluconacetobacter thuộc nhóm vi khuấn Gram âm, hiếu khí, hiếu dị dưỡng,

tế bào của chúng tìm thấy trong giấm, dịch rượu, nước ép hoa quả haytrong đất [1]

Khuấn lạc Gluconacetobacter có kích thước nhỏ(đường kính khuẩn lạc

đạt 1 -2mm),tròn, bề mặt nhầy và trơn bóng,phần giữa khuẩn lạc lồi lên vàsẫm màu hơn các phần xung quanh,rìa mép khuẩn lạc nhẵn

Theo tác giả Nguyễn Lân Dũng Vi khuẩn Gluconacetobacter có bao nhầy

cấu tạo bởi cellulose Thành phần cấu tạo chủ yếu của bao nhầy làpolysaccarit (chủ yếu là glucose) Ngoài ra, còn có các polypeptit, protein.Bao nhầy còn có tác dụng bảo vệ, cung cấp dinh dưỡng, giúp vi khuẩn bámvào giá thể” [1]

Một số tác giả cho rang, cellulose tống hợp từ vi khuấn

Gluconacetobacter có vai trò dự trữ và có thể sử dụng khi môi trường nghèo

kiệt chất dinh dưỡng, nó sẽ phân huỷ nhờ enzyme của vi khuẩn làendoglucanase và exoglucanase (Zippora G.E và cs, 1996) Nhờ đặc tính nhớt

và ưa nước của màng BC giúp cho vi khuấn Gluconacetobacter chống lại được

những thay đổi bất lợi

1.1.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của Gluconacetobacter

Vi khuẩn Gluconacetobacter phát triển ở nhiệt độ 25-35°C pH [4- 6] Vì Gluconacetobacter có khả năng chịu được pH thấp nên người ta thường bổ sung

thêm axit acetic vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuấn lạ

Các đặc điểm sinh hoá dùng định danh của Gluconacetobacter bao gồm:

oxy hoá ethanol thành axit acetic, CƠ2, H2O; phản ứng catalse dương tính,không tăng trưởng trên môi trường Hoyer, chuyến hoá glucose thành axit,chuyến hoá glycerol thành dihydroxyaceton, không sinh sắc tố nâu, tổng hợpcellulose [2]

1.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình tạo màng BC

Đe đảm bảo cho hoạt đông sống bình thường của vi khuẩn, môi trườngthức ăn ngoài rượu, nước còn phải bố xung thêm muối khoáng,

nguồn cacbon, nguồn nito dễ hấp thụ như : (NH4)2S04, MgSƠ4.7H20, KH2P04 [4]

Đe phục vụ cho nghiên cứu thạc sỹ Trần Như Quỳnh đã quvết định sử dụng

hàm lượng glucose 20g/l cho các nghiên cứu trên chủng Gluconacetobacter.

1.2.1 Nhu càu nguồn cacbon

Theo kết quả nghiên cứu của thạc sỹ Nguyễn Thị Nguyệt trên chủng

A.xylium HN5 thì nguồn cacbon có ảnh hưởng lớn đến sự hình thành màng của Gluconacetobacter [11].

Cacbon có trong tế bào chất,thành tế bào,trong tất cả các phân tử enzim,axit nucleic và các sản phấm trao đối chất Chính vì vậy,những hợp chất hữu cơ

có chứa cacbon có ý nghĩa hàng đầu trong đời sống của vi sinh vật Ảnh hưởngcủa nguồn cacbon dến năng suất màng BC được thế hiện ở bảng 1.2

Bảng 1.2 Ảnh hưởng cũa nguồn cacbon đến năng suất sản xuất

Vi sinh vật và tất cả các cơ thể sống khác đều cần Nito trong quá trìnhsống để xây dựng tế bào Vì vậy nếu nguồn Nito trong môi trường quá ít sẽ ảnhhưởng tới hoạt động sống của tế bào Vì vậy ảnh hưởng tới quá trình tạo màng

BC Ở nồng độ 2,0g cho hiệu suất màng BC cao nhất Khi nuôi cấy vi khuẩn

7-11

1.2.2 Nhu cầu nguồn Nitơ

Gluconacetobacter người ta thường sử dụng nguồn nito vô cơ là

(NH4)2S04,NH4N03, nguồn nitơ hữu cơ là peptone, cao thịt, cao nấm men [1 ]

1.2.3 Nhu cầu của nguồn MgSOặ

MgS04 ỏ' nồng độ 2g/l cho sản lượng BC cao nhất, theo PGS.TS Đinh ThịKim Nhung :“Mg là nhân tố tham gia vào việc tạo thành các enzim, những enzimnày xúc tác cho phản ứng chuyến hóa chất trong quá trình hình thành màng BC”[11]

1.2.4 Nhu cầu của Photpho

Photpho ngoài vai trò tham gia cấu trúc của tế bào, nó còn có vai trò hết

sức quan trọng trong tổng hợp cellulose ở chủng vi khuẩn Gluconacetobacter Đe

đảm bảo nguồn dinh dưỡng phospho, người ta sử dụng các loại phospho vô cơnhư: KH2PO4, K2HPO4, KNO3 Việc bổ sung phosphat (nhất là phosphat kali)vào các môi trường dinh dưỡng còn có tác dụng tạo ra tính đệm của môi trường

Đối với vi khuấn Gluconacetơbacter, nguyên liệu chủ yếu hiện nay được sử

dụng là nước dừa già, dịch hoa quả, rỉ đường , khi nuôi cấy không cần phải bổxung các nguyên tố vi lượng nữa [1], [16]

1.2.5 Điều kiện nuôi cấy

1.2.5.1 ĐộpH

Vi khuẩn Gluconacetobacter phát triển thuận lợi trên môi trường có pH thấp.

Do đó trong môi trường nuôi cấy cần bố sung thêm axit acetic nhằm axit hoá môi trường Đồng thời axit acetic còn có tác dụng sát khuấn,giúp ngăn chặn sự phát

triến của các vi sinh vật có hại [31] ỉ.2.5.2 Nhiệt độ

Theo Beyger nhiệt độ thích hợp với vi khuấn Gluconacetobacter vào khoảng

25-30°C Ở nhiệt độ cao sẽ ức chế hoạt động và đến mức nào đó sẽ đình chỉ sựsinh sản của tế bào và hiệu suất lên men sẽ giảm [29], [30]

1.2.5.3 Độ thông khí

Vi khuấn Gluconacetobacter là vi khuấn hiếu khí bắt buộc Do đó, điều kiện

tiên quyết khi lên men tạo sinh khối là điều kiện thông khí Trong thực tế độthông khí quyết định đến năng suất tống hợp BC

1.2.5.4 Thời gian nuôi cay

Trong môi trường dinh dưỡng lỏng, sau 24 giờ nuôi cấy sẽ xuất hiện mộtlớp đục trên bề mặt, phía dưới có những sợi tơ nhỏ hướng lên Sau 36-48 giờ, hìnhthành một lớp trong và ngày càng dày

Theo Thesis Holemes (2004), hàm lượng glucose trong môi trường giảmnhất sau 150 giờ nuôi cấy Sau khi glucose trong môi trường hết thì vi khuẩn bắtđầu sử dụng axit gluconic và 5-keto axit gluconic trong quá trình trao đổi chất.Tác giả cho rằng sau 6 ngày độ kết tinh của màng đạt trạng thái tốt nhất

1.2.5.5 Anh hưởng giữa bề mặt và thế tích dịch nuôi cay (tỷ lệ S/V)

Theo tác giả Đinh Thị Kim Nhung và cộng sự khả năng hình thành

màng tốt nhất ở tỷ lệ thể tích s/v= 0,8 với chiều cao môi trường dụng cụ lên menh= l,25cm [10]

1.3 Bacterial cellulose (BC)

1.3.1 Cấu trúc

BC có đường kính bằng 1/100 đường kính của cellulose thực vật (PC-plantcellulose) Màng BC được cấu tạo bởi chuỗi polyme Ị3 -1,4- glucopynanose Cóthành phần hoá học đồng nhất với cellulose thực vật, nhưng cấu trúc và đặc tínhlại khác xa nhau

Chuỗi polyme (3 - 1,4- glucopynanose mới hình thành liên kết với nhau

tạo thành sợi nhỏ (subfibril) có kích thước l,5nm Những sợi nhỏ kết tinh tạo sợi

lớn hơn - sợi vĩ mô (microfibril) (Jonas and Farah,1998), những sợi này kết hợpvới nhau tạo thành bó và cuối cùng tạo dải ribbon (Yamanakaet.al 2000) Dảiribbon có chiều dài trong khoảng từ l-9nm Những dải ribbon được kéo ra từ tếbào này sẽ liên kết với những dải ribbon của tế bào khác bằng liên kết hidro hoặclực Van Der Waals tạo thành cấu trúc mạng lưới hay một lớp màng mỏng trên bềmặt môi trường nuôi cấy [31]

1.3.2 Một số tính chất của màng BC

Brown A.J (1886), đã nghiên cứu lớp màng đặc do vi khuấn

Gluconacetobacter tạo ra trên môi trường nuôi cấy và thấy có bản chất là

hemicillulose Hemicillulose là những polysaccharid không tan trong nước nhưngtan trong dung dịch kiềm tính [16], [17]

Một số tính chất của màng BC:

Độ tinh sạch : màng BC có độ tinh sạch tốt hơn rất nhiều so với các

cellulose khác, có thế phân hủy sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn toàn

Độ bền cơ học : màng BC có độ tinh thể cao, sức căng lớn, trọng lượng thấp,

ổn định về kích thước

Tính hút nước : màng BC có khả năng giữ nước đáng kể (lên đến 99%), có

tính xốp, độ ẩm cao

1.3.3 Quá trình tổng hợp BC từ vi khuẩn Gluconacetobacter

Theo Alaban C.A và cộng sự (1967) các enzim tham gia vào quá trình sinhtổng hợp cellulose vi khuẩn gồm:

1PKF: Fructose-1 -photphate kinase PGM:

Phosphoglucomutase UGP: UDP-glucose

pyrophotphorylase Fru-6-P:

Fructose-6-phosphate Glc-l-P: Glucose-1 -Fructose-6-phosphate

UDPGlc: Uridine diphosphoglucose GK:

Theo tác giả Alina Krystynowicz và cộng sự cho rằng có 4 enzym tham

gia xúc tác tổng hợp cellulose ở chủng vi khuẩn Gluconacetobacter:

Glucokinase (GK), Phosphoglucomutase (PGM), Glucose - 1- phosphateuridylyltransferase (UDPG pyrophosphorylase hay UGP),Cellulose synthase(CS) Trong đó UGP là enzym có vai trò quan trọng nhất [31]

1.4 ứng dụng của màng BC

1.4.1 ứng dụng của BC trong một số lĩnh vực

Màng BC có nhiều lợi điếm vượt trội như: độ tinh sạch, độ kết

tinh, độ bền sức căng, độ đàn hồi, độ co giãn, khả năng giữ hình dạng ban đầu,khả năng giữ nước và hút nước cao, bề mặt tiếp xúc lớn hơn bột gỗ thường, bềdày của vi sợi dưới lOOnm, bị phân huỷ sinh học, có tính tương thích sinh học,tính trơ chuyển hoá, không độc và không gây dị ứng Màng BC có các ứng dụng

đa dạng trong nhiều lĩnh vực

1.4.1.1 Thực phâm

Sản pham cellulose được sử dụng trong nước ép trái cây và những thứcuống khác, trong mứt kẹo, trong kem, yaourt, salad, thức ăn tráng miệng có tácdụng như chất làm đặc, vật liệu on định dịch huyền phù, vật liệu làm vỏ bọcthực phẩm Các sản phẩm ứng dụng cellulose vi khuẩn trong lĩnh vực thựcphấm: Món tráng miệng (thạch dừa, kem ít calori, thức ăn nhanh, kẹo), chất nhũhóa trong nước ép trái cây và những thức uống khác, màng bao thực phẩm

Da nhân tạo: Ớ Brazil, màng BC ướt tinh sạch được sản xuất và bán ra thịtrường như một loại da nhân tạo dùng để đắp vết thương

1.4.1.3 Mỹ phâm

BC vừa có khả năng giữ ẩm cao mà không bám lại lên làn da sau khi rửa

và cũng không gây các tác dụng phụ như các chất giữ ẩm khác,

do đó được ứng dụng: Kem dưỡng da, chất làm nền cho móng nhân tạo, chấttăng độ dày và bền cho nước làm bóng móng tay.

1.4.2 ứng dụng của màng BC trong điều trị bỏng

Bỏng là một tai nạn thường gặp trong lao động và sinh hoạt hằng ngày.Ngoài tổn thương da, trường hợp bỏng nặng còn gây rối loạn nội tạng, để lại

di chứng nặng đến khả năng vận động, thẩm mỹ và sức khỏe của người bệnh

Ở Việt Nam, chỉ riêng Viện Bỏng Quốc gia (Hà Nội) mỗi năm tiếp nhậnkhoảng hơn 400 ca bỏng Các tác nhân gây bỏng chủ yếu là bỏng nước sôi.Ngoài ra các tác nhân khác là xăng, dầu, nước canh nóng, acid, vôi tôi nóng

Việc điều trị tại chỗ vết thương bỏng là một công tác có ý nghĩa đặcbiệt quan trọng Đối với vết bỏng nông điều trị tại chỗ vết bỏng có tác dụnglàm giảm đau ngăn chặn các biến chứng nhiễm khuấn, tạo điều kiện tốt choquá trình tái tạo phục hồi Đối với những trường hợp bỏng sâu, điều trị tại chỗ

có tác dụng lớn trong việc điều trị dự phòng các biến chứng của nhiễm khuẩntại chỗ, không để nhiễm khuẩn toàn thân, ngăn ngừa sự mất nước và dịchtrong cơ thế (là nguy cơ dẫn đến tử vong cao), loại bỏ nhanh các tổ chức hoại

tử, tạo điều kiện tốt cho quá trình hình thành mô hạt và biếu mô hóa hìnhthành sẹo, chuẩn bị tốt nền ghép da trong phẫu thuật

1.5 Tình hình nghiên cứu về màng BC ở Việt Nam và trên thế giới.

1.5.1 Trên thế giới

Nghiên cứu về màng BC từ vi khuẩn Gluconacetobacter và những ứng

dụng của nó đã được tiến hành ở nhiều nước trên thế giới Tác giả Brown,

1999 [16] dùng màng BC làm môi trường phân tách cho quá trình xử lý nước,dùng làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào Brown,Jonas và Farad, dùng màng như là một chất đế biến

đối độ nhớt, đế làm ra các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất trong sinhhọc, thực phẩm hoặc thay thế thực phẩm Đặc biệt Brown đã dùng BC làm vảiđặc biệt, Nogiet và cs (2005), Jonas và Farad, 1998, Soloknicki và cộng sự(2006) Sirlene M.Costa, dùng màng BC để sản xuất giấy chất lượng cao, làm cơchất đế cố định protein hay cho sắc kí Đặc biệt, trong y học, người ta đã chế tạocác phức chất (vật liệu composite) từ sự kết hợp giữa cellulose và chitosan hoặccellulose và polyvinyl, các phức chất này được sử dụng làm da tạm thời thay thế

da trong quá trình điều trị bỏng, loét da, làm mạch máu điều trị các bệnh timmạch

Các sản phẩm chế tạo từ microbial cellulose cũng được ứng dụng trongphẫu thuật và nha khoa Ngoài ra, màng BC còn được sử dụng làm mặt nạ dưỡng

da cho phụ nữ, làm giấy chất lượng cao, microbial cellulose được dùng chế tạomàn hình điện tử, vải nonwoven (vải không qua dệt), thực phẩm phụ gia, làm cơchất để cố định protein hay cho sắc kí

Trong những năm gần đây có một số công trình nghiên cứu về ảnh hưởngcủa nguồn cacbon đến khả năng hình thành cellulose Nghiên cứu chế tạo màng

từ vi khuẩn và nghiên cứu đặc tính màng, đồng thời nghiên cứu ứng dụng sảnxuất giấy điện tử chất lượng cao từ màng vi khuẩn

Tuy nhiên, những ứng dụng thường thấy trên thế giới của màng BC làdùng trong ngành dược phẩm và mỹ phẩm Các tác giả: Hamlyn và cs (1997),Cienchanska (2004), Legeza và cs (2004) Wan và Millon (2005), Czaja và cs,(2006) sử dụng màng BC đắp lên các vết thương hở, vết bỏng đã thu được kếtquả tốt Đặc biệt tác giả Wan (Canada) đã được đăng kí bản quyền về làm màng

BC từ Acetobacter xylinum dùng trị

bỏng Các tác giả Jonas và Farad (1998), Czaja và cs (2006) đã dùng màng BClàm da nhân tạo, làm mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ [24]

1.5.2 Ở Việt Nam

Ở Việt Nam những nghiên cứu về Gỉuconacetobacter và màng BC là khá

mới mẻ Hầu như có rất ít các nghiên cứu, công bố liên quan đến

của môi trường dinh dưỡng và điều kiện lên men cho vi khuẩn Acetobacter xylinum ứng dụng vào làm thạch dừa Năm2003 có nghiên cứu của nhóm tác giả Nguyễn Thuý Hường và Phạm Thành Hổ về chọn lọc dòng Acetobacter xylinum thích hợp cho các loại môi trường dùng trong sản xuất cellulose vi

khuẩn Năm 2006 nghiên cứu của nhóm tác giả Nguyễn Văn Thanh, Huỳnh

Thị Ngọc Lan và cộng sự về màng BC từ Acetobacter xylinum tẩm dầu mù u

dùng trong điều trị bỏng [5], [9] Năm 2008, có nghiên cứu của Đinh Thị Kim

Nhung đã chọn được 1 chủng vi khuẩn Acetobacter xylỉnum NHỊ [4], khảo sát

khả năng tạo tạo màng của chủng này Ngoài nguồn nguyên liệu nước hoa quảdùng cho lên men

giấm, còn có thế sử dụng nhiều nguồn nguyên liệu khác như các loại bia, rượunhạt, các nguyên liệu có chứa đường, tinh bột, acid hữu cơ, giàu vitamin từcác vùng miền khác nhau ở Việt Nam [5].

Việc nghiên cứu và sử dụng màng BC từ chủng Gluconacetobacter ngày

càng được nhiều tác giả quan tâm Ngày càng có nhiều các nghiên cứu, công bố

liên quan đến chủng A xylỉnum sự hình thành màng BC và các hướng ứng dụng

màng BC Năm 2006, tác giả Nguyễn Văn Thanh, Trưởng bộ môn Vi Sinh - KýSinh, Trường đại học

Y Dược học Tp.HCM đã chế tạo thành công màng trị bỏng sinh học dầu mù ubằng phương pháp lên men Màng BC có khả năng thấm nước cao, kết dính chặt

và trơ về mặt hóa học nên nó có vai trò như màng sinh học, có thể thay thế datạm thời Với các hoạt chất tái sinh mô và các chất sát khuẩn đều có nguồn gốcthiên nhiên không gây đau rát và không chứa các yếu tố gây kích ứng da, chính

vì vậy dùng màng sinh học để ngăn ngừa biến chứng nhiễm trùng vết thươngbỏng, tạo điều kiện che phủ sớm vết thương, qua đó, rút ngắn thời gian điều trị

và giảm thiểu sẹo xấu trên vùng bỏng sâu [5]

Gần đây, nhóm nghiên cứu của tác giả Đinh Thị Kim Nhung đã thu nhận

màng BC từ vi khuấn A xylinum, ứng dụng màng BC trong điều trị bỏng Công

tác điều trị bỏng hiện đang sử dụng phương pháp cấy ghép, phẫu thuật, hoặcdùng một số màng trị bỏng như màng ối, trung bì da lợn, da ếch, màngchitossan, sử dụng các chất có nguồn gốc từ tự nhiên có tác dụng điều trị bỏng[12] Theo tác giả Huỳnh Thị Ngọc Lan, màng trị bỏng sinh học BC với các hoạtchất tái sinh mô và các chất sát khuấn đều có nguồn gốc thiên nhiên Vì thế, nókhông chứa các yếu tố nguy cơ như không có độc tố trực tiếp, không gây dị ứng,không có yếu tố lây lan mầm bệnh, không giải phóng chất lạ vào vết thương.Màng có khả năng diệt 100% vi khuẩn thường gây ra các nhiễm trùng vết

thương hở da như vết bong Chỉ cần áp sát màng vào vết thương và không cần

sử dụng bất cứ thứ gì khác, màng đã có khả năng cản khuẩn, đồng thời làm lànhvết thương [9]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu

2.1 Vật liệu

2.1 / Nguồn giống

Nhận vi khuấn Gluconacetobacter thuần chủng từ phòng thí nghiệm vi

sinh học trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2

2.1.2 Thiết bị và hóa chất

2.1.2.1 Hoả chất

Nguồn cacbon: glucose (CèH^Oó), acid acetic

Nguồn nitơ: cao thịt, cao nấm men, pepton, (NH4)2SƠ4

Nguồn muối khoáng: NaCl, MgSƠ4.7H20, KH2PO4 Thuốc

nhuộm: Tím gentian, Fucshin, Lugol

Phenol lỏng 5%, H2S04đặc

Nước dừa già

Dung dịch Becberin clorid 0,1% (Thành phẩm được cung cấp từ Việnbỏng quốc gia)

2.1.2.2 Thiết bị

* Tại phòng Công nghệ sinh - Vi sinh, khoa Sinh học, trường Đạihọc Sư phạm Hà Nội 2 và phòng thí nghiệm Vi sinh, tổ Thực Vật- Vi sinh,khoa Sinh- KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Tủ ấm, tủ sấy Binder (Đức)

Nồi hấp Tommy (Nhật)

Box vô trùng (Haraeus)

Máy lắc Orbital Shakergallenkump (Anh)

Máy li tâm Sorvall (Mỹ)

Micropipet Jinson (Pháp) các loại từ 0.5|il - lOml

(NH4)2S04 : 3(g)

PH : 5,0-6,0 KH2PO4: 2(g) Acid acetic : 2%

Glucose : 20(g)

Peptone: 5(g)

MgS04.7H20: 2(g)

Máy so màu uv - vis (Nhật)

Máy đo pH (MP 200R - Thuỵ Sĩ)

Cân (Precisa XT 320M - Thuỵ Sĩ)

Máy cất nước 2 lần (Hamilton - Anh)

Kính hiến vi quang học Carl Zeiss (Đức)

Bộ điện di - AE - 4650 (Nhật)

Máy PCR (Applied biosystems, Mỹ)

Tủ lạnh Daewoo, tủ lạnh sâu, hộp lồng, ống nghiệm, bình tam giác,que trang, lamen, đèn cồn và nhiều dụng cụ hoá sinh thông dụng khác

2.1.3 Môi trường

(NH4)2S04 : 3(g) Thạch agar:20(g) KH2PO4: 2(g)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp phân biệt tế bào vi khuẩn Gluconacetobacter bằng phương pháp nhuộm Gram

Vi khuấn Gluconacetobacter là các vi khuẩn Gram âm, do đó có thế phân

biệt với vi khuẩn Gram dương nhờ phương pháp nhuộm Gram (nhuộm kép)

Tiến hành: Lấy chủng vi khuẩn Gluconacetobacter đem nhuộm tiêu bản

theo phương pháp Gram Sau đó soi tiêu bản dưới vật kính dầu của kính hiển viquang học Olympus với độ phóng đại 1000 lần

Mục đích của phương pháp nhuộm Gram là để phân biệt vi khuẩn Gram

âm với vi khuẩn Gram dương Neu sau khi nhuộm kép mà tế bào bắt màu hồngthì đó là vi khuẩn Gram âm Ngược lại nếu tế bào bắt màu tím thì đó là vi khuẩnGram dương Khả năng bắt màu của vi khuẩm Gram âm và Gram dương khácnhau là do chất nguyên sinh của tế bào vi khuấn Gram dương được cấu tạo từmột loại protein đặc biết chứa muối nucleatmagie có khả năng tạo màu tím vớigentian và lugol tạo ra một phức chất bền, khó bị rửa trôi bởi cồn nên khi quansát trên tiếu bản thấv tế bào vi khuấn Gram dương bắt màu tím của gentiantrong khi đó những vi khuấn Gram âm không có khả năng tạo phức chất bền vớithuốc nhuộm gentian và lugol nên dễ bị rửa trôi bởi cồn Do đó, khi nhỏ fucshinlên tế bào vi khuấn Gram âm bắt màu hồng - màu của fucshin

2.2.2 Phương pháp hoạt hoá giống Gluconacetobacter

Giống từ ống nghiệm được bảo quản trong tủ lạnh trước khi đem sửdụng phải hoạt hoá giống “làm thức tỉnh giống”, nhân giống đảm bảo đủ sốlượng tế bào vi sinh vật cho quá trình lên men Phương pháp hoạt hoá giống

sử dụng môi trường tiêu chuẩn không có thạch agar, đem hấp thanh trùng ở121°c trong 20 phút Sau đó đem sử lý trong đèn tím 15 phút để khử khuẩn,

sau đó cấy chuyển giống từ ống thạch nghiêng vào và nuôi lắc 135 vòng/phúttrong 24 giờ.

2.2.3 Phương pháp lên men tạo màng BC từ vi khuẩn Gluconacetobacter

Sử dụng môi trường lên men tạo màng đem hấp thanh trùng ở 110°ctrong 20 phút để tránh phân dã đường Sau đó khử ở đèn cực tím trong 15phút Sau đó tiến hành lên men tạo màng BC bằng cách bố xung vào môitrường lên men 5% giống đã hoạt hoá Nuôi cấy ở điều kiện tĩnh trong 1-7ngày

2.2.4 Phương pháp bảo quản chủng giống trên môi trường thạch nghiêng

Các chủng giống sau khi nhận từ phòng vi sinh sẽ được cấy trên môitrường thạch nghiêng (MT1 đã loại bỏ CaCƠ3), nuôi trong tủ ấm 3-4 ngày ở30°c Sau đó giữ giống trên môi trường thạch nghiêng mỗi tháng một lần

2.2.5 Phương pháp nghiên cứu tỷ lệ s/v đến khả năng tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter

2.2.5.1 Phương pháp nghiên cứu tìm tỷ lệ s/v đến khả năng tạo màng BC tốt nhất từ chủng Gluconacetobacter

s : diện tích bề mặt dịch lên men tạo màng BC (cm2)

V : thể tích dịch lên men tạo màng (cm3)

Với phương pháp cố định diện tích bề mặt lên men tạo màng, thay đổithể tích dịch lên men để tìm tỷ lệ s/v thích hợp đến khả năng tạo màng BC tốt

nhất từ chủng Gluconacetobacter, chúng tôi tiến hành theo các bước sau:

Bước 1: Tính diện tích bề mặt lên men tạo màng BC Quy đối thế tích từđơn vị ml sang đơn vị cm3 Sau đó tính tỷ lệ s/v.

Dụng cụ lên men tạo màng là khay nhựa hình chữ nhật có đường kính là

15x10x4 cm từ đó ta tính được diện tích bề mặt len men tạo màng BC là s=

15x10= 150 (cm 2 )

Thể tích dịch lên men được đo bằng ml nhưng để tính được tỷ lệ s/v thì

ta phải quy đổi ml sang cm3 Ta đã biết lml = 1 cra3 Ta có bảng sau:

Bảng 2.1 Tính quy đối s/v thí nghỉệm nghiên cửu

Độ chịu kéo (độ dai): Lực kéo lớn nhất mà mẫu thử chịu được trước khiđứt trongđiều kiện xác định của phương pháp thử tiêu chuẩn

Độ bền kéo (độ dai) có thế được hiếu như là khi một lực kéo tác độngtăng dần đến khi vật liệu dạng sợi hay trụ bị đứt Ở giá trị lực kéo giới hạn cho

sự đứt của vật liệu được ghi lại được ký hiệu ak Độ bền kéo giới hạn cho sựđứt của vật liệu trong các lĩnh vực như thiết kế chế tạo máy, xây dựng, khoahọc vật liệu

Đế xác định độ dai của màng tôi đã tiến hành đo độ dai bằng cách: Cố định đầu trước của màng Tiếp đến lấy lực kế lò xo cố định vào đầu sauKéo màng xem tối đa màng đó có độ bền kéo đạt được bao nhiêu N

2.2.5.3 Phương pháp nghiên cứu thời gian đến tỷ lệ s/v thích hợp nhất đến khả năng tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter

Tiến hành thí nghiệm nghiên cứu thời gian từ 1-7 ngày đến tỷ lệ s/v

thích hợp nhất đến khả năng tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter theo các

tiêu chí: khả năng xuất hiện màng, màu sắc, độ nhẵn, độ dày, độ dai, khốilượng tươi, khối lượng khô từ đó tìm thời gian thích hợp tạo màng BC tốtnhất

2.2.5.4 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến tỷ lệ s/v thích hợp nhất đến khả năng tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter

Tiến hành thí nghiệm nghiên cứu nhiệt độ từ 20-40°C đến tỷ lệ s/v

thích hợp nhất đến khả năng tạo màng BC từ chủng Gỉuconacetobacter theo các

tiêu chí: khả năng và thời gian xuất hiện màng BC từ chủng

Gỉuconacetobacter, màu sắc, độ nhẵn, độ dày, khối lượng tươi, khối lượng khô

từ đó tìm nhiệt độ thích hợp nhất cho khả năng tạo màng BC

2.2.6 Phương pháp thống kê và xử lý kết quả

Xử lý thống kê các kết quả thí nghiệm theo một số phương pháp trongcuốn “ứng dụng tin học trong sinh học” và “Thống kê và ứng dụng” như:

*số trung bình cộng: Dùng để tính giá trị trung bình của các lần

Z(X,-X )2

*Trung bình bình phương các sai lệch 5=

*Sai số diện của trung bình cộng ±m = —r=

yỊn

*Hệ số biến thiên trung bình cộng:

3.1 Lên men tạo màng BC từ chủng vi khuấn Gluconacetobacter

3.1.1.Đặc điểm hình thái và tế bào của vi khuẩn Gluconacetobacter

Chủng vi khuấn Gluconacetobacter được phân lập từ nguồn nguyên

liệu bia Hà Nội, tại phòng thí nghiệm khoa Sinh- KTNN, trường đại học sưphạm Hà Nội 2

1 ^

Ĩ=Ị

Quan sát tế bào vi khuấn Gluconacetobacter dưới kính hiến vi quang

học (olympus CX41, Nhật) ở độ phóng đại 1000 lần, cho tôi xác định được

vi khuấn Gluconacetobacter có dạng hình que thẳng hay hơi cong, có thể

đứng riêng lẻ hoặc xếp thành chuỗi, không sinh bào tử, là vi khuẩn Gramâm

Hình 3.1 Kết quả nhuộm Gram Hình 3.2 Chủng vi khuẩn

của vi khuấn Gluconacetobacter Gluconacetobacter trên môi

trường thạch nghiêng

3.1.2 Vi khuẩn Gluconacetobacter sinh trưởng trên môi trường thạch đĩa

Khuẩn lạc của Gluconacetobacter có kích thước nhỏ, đường kính

khuẩn lạc đạt từ tròn, bề mặt nhày, trơn bóng

Hình 3.3 Chủng vi khuẩn Gluconacetobacter trên môi trường thạch đĩa 3.1.3 Kiểm tra hoạt tính catalase của chủng Gluconacetobacter

Khi nhỏ H2O2 3% lên bề mặt khuẩn lạc thấy có hiện tượng sủi bọt khí,

chứng tỏ có khí O2 giải phóng ra, chứng tỏ vi khuấn Gluconacetobacter có

khả năng sinh enzyme catalaza

3.1.4 Kiểm tra khả năng chuyển hóa glucose thành acid gluconic

Vòng sáng xuất hiện xung quanh khuẩn lạc trên môi trường

CaCƠ3 điều này chứng tỏ có sự xuất hiện của axit gliconic:

H + + CaCOs ->• Ca 2+ + H 2 0 + CO 2

3.1.5 Khảo sát khả năng lên men tạo màng BC từ chủng vi khuẩn

Gluconacetobacter

Dựa theo kết quả nghiên cứu của nhóm tác giả PGS TS Đinh Thị KimNhung, TS Dương Minh Lam và cs, quá trình lên men tạo màng BC từ chủng

Gluconacetobacer được tiến hành theo 4 bước cơ bản như sau:

Bước l:Nhân giống ịBước 2: Hoạt hóa ịBước 3: Lên màng ịBước 4: Thu màng

Cụ thể tôi thực hiện các bước lên màng như sau:

Bước 1: Nhân giống

Quy trình nhân giống được tiến hành cấy truyền liên tục chủng

Gluconacetobacter trên môi trường thạch nghiêng.

Bước 2: Hoạt hóa

Tiến hành hoạt hóa bằng cách thu sinh khối vi khuấn từ các ống giống

Gluconacetobacter nuôi trong bình chứa dịch nhân giống cấp 1 theo tỷ lệ 1 ống

giống 250ml dung dịch Sau đó lắc các bình nhân giống cấp 1 trong khoảng thời

gian 24h để thu sinh khối vi khuẩn Gluconacetobacter.

Sau thời gian 24 giờ lắc, các bình giống vi khuấn

Gỉuconacetobacter có màu trắng đục có hệ sợi trắng lơ lửng trong dung dịch, đó

là các soi cellulose mà vi khuẩn sinh ra trong quá trình sinh trưởng

Bước 3: Tạo màng môi trường lên men

Tiến hành lên men tĩnh trong 4-7 ngày

Dùng micropipette cấy dịch nhân giống cấp 1 vào môi trường lên mentheo tỷ lệ 10ml dịch giống/ 100ml

Bước 4: Thu màng

Dùng cồn 90° bảo quản màng, dùng găng tay cao su vớt màng tronghộp lên men, tiến hành kiếm tra đặc tính của màng.

Như vậy, đã lên men tạo màng BC ổn định cho chủng Gluconacetobacter.

3.1.6 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng tạo màng BC từ chủng vi khuẩn Gluconacetobacter

Nuôi cấy chủng vi khuẩn Gluconacetobacter trong môi trườngdịch thế, ở nhiệt độ phòng với tỷ lệ trong điều kiện nuôi cấy tĩnh có biếnđổi của thời gian nuôi cấy tương ứng từ 1 -7 ngày

Khảo sát khả năng xuất hiện màng, màu sắc, độ nhẵn, độ dày, độ dai,khối lượng tươi, khối lượng khô Ket quả được thể hiện ở bảng 3.1, hình 3.5;hình 3.6

Bảng 3.1 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả năng

Màngtrắngtrong,nhẵn

Màngtrắngtrong,nhẵn

Màng trắng trong, nhẵn

Màngtrắngtrong,nhẵn

7 Thòi gian

Hình 3.6 Mối quan hệ giữa thời gian với độ bền kéo màng