Tạo vật liệu khởi đầu và bước đầu tái sinh cây lùng nghệ an bằng phương pháp vi nhân giống in vitro

... tài Tạo vật liệu khởi đầu bước đầu tái sinh Lùng Nghệ An phương pháp vi nhân giống in vitro Mục đích nhiệm vụ nghiên cứu 2.1 Mục đích nghiên cứu Tạo vật liệu khởi đầu bước đầu tái sinh Lùng Nghệ. .. KHOA SINH - KTNN PHẠM THỊ HUYỀN TẠO VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU VÀ BƯỚC ĐẦU TÁI SINH CÂY LÙNG NGHỆ AN BẰNG PHƯƠNG PHÁP VI NHÂN GIỐNG IN VITRO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh. .. tiêu sinh trưởng 32 3.2.1 Tái sinh nhân nhanh Lùng Nghệ An phương pháp tạo cụm chồi từ cành 32 3.2.2 Tái sinh nhân nhanh Lùng Nghệ An phương pháp tạo cụm chồi từ đốt than

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH - KTNN -

PHẠM THỊ HUYỀN

TẠO VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU VÀ BƯỚC ĐẦU TÁI SINH CÂY LÙNG NGHỆ AN BẰNG

PHƯƠNG PHÁP VI NHÂN GIỐNG IN VITRO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật

HÀ NỘI, 2015

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH - KTNN -

PHẠM THỊ HUYỀN

TẠO VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU VÀ BƯỚC ĐẦU TÁI SINH CÂY LÙNG NGHỆ AN BẰNG

PHƯƠNG PHÁP VI NHÂN GIỐNG IN VITRO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật

Người hướng dấn khoa học ThS LA VIỆT HỒNG

HÀ NỘI, 2015

LỜI CẢM ƠN

Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến ThS La Việt Hồng đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành khóa luận

Tôi chân thành cảm ơn ban Lãnh đạo trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, Ban chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN, đã tạo mọi điều kiện cho tôi học tập và hoàn thành đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Phòng Nuôi cấy mô tế bào thực vật, Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu và Chuyển giao Công nghệ, Phòng thí nghiệm sinh lí thực vật, khoa Sinh - KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội

2 đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài

Cuối cùng tôi xin cảm ơn những người thân và bạn bè đã động viên, tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi học tập cũng như hoàn thành khóa luận

Tôi xin chân thành cảm ơn

Hà Nội, ngày 20 tháng 04 năm 2015

Sinh viên thực hiện

Phạm Thị Huyền

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan kết quả nghiên cứu đề tài: “Tạo vật liệu khởi đầu và bước đầu tái sinh cây Lùng Nghệ An bằng phương pháp vi nhân giống in vitro”: là kết quả nghiên cứu của riêng tôi do ThS La Việt Hồng hướng dẫn

và không trùng lặp với kết quả của tác giả khác

Hà Nội, ngày 20 tháng 04 năm 2015

Sinh viên thực hiện

Phạm Thị Huyền

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Các công thức tạo vật liệu khởi đầu 23

Bảng 2.2 Công thức nghiên cứu tạo cụm chồi mẫu cành và đốt thân cây Lùng 25

Bảng 3.1 Hiệu quả chất khử trùng trên mẫu giống cây Lùng 27 Bảng 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ BAP, nước dừa, Kinetin đến hệ số nhân

chồi, số lá, chiều dài mẫu cành cây Lùng 32 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ BAP, nước dừa, Kinetin đến hệ số nhân

chồi, số lá, chiều dài mẫu đốt thân cây Lùng 35

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cây Lùng (Bambusa sp.) 4

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu tạo vật liệu in vitro ở cây Lùng 22

Hình 3.1 Sơ đồ thể hiện tỷ lệ mẫu sống của cây Lùng 28

Hình 3.2 Mẫu cành vô trùng nhưng không có khả năng phát triển (mẫu chết) 30

Hình 3.3 Mẫu cành vô trùng sống phát sinh chồi 30

Hình 3.4 Mẫu thân vô trùng nhưng không có khả năng phát triển (mẫu chết)30 Hình 3.5 Mẫu thân vô trùng( mẫu sống) 30

Hình 3.6 Các bước đơn giản tạo vật liệu in vitro từ cành có chứa mắt ngủ của cây Lùng 31

Hình 3.7 Sơ đồ ảnh hưởng của BAP, nước dừa và Kinetin đến hệ số nhân nhanh

chồi mẫu cành cây Lùng 33

Hình 3.8 Mẫu cành sau 2 tuần nuôi cấy 34

Hình 3.9 Mẫu cành sau 3 tuần nuôi cấy 34

Hình 3.10 Mẫu cành sau 5 tuần nuôi cấy 34

Hình 3.11 Chồi mới tạo ra chết 34

Hình 3.12 Sơ đồ ảnh hưởng của BAP, nước dừa và Kinetin đến hệ số nhân nhanh chồi mẫu đốt thân cây Lùng 35

Hình 3.13 Mẫu đốt thân sau 2 tuần nuôi cấy 37

Hình 3.14 Mẫu đốt thân sau 3 tuần nuôi cấy 37

Hình 3.15 Mẫu đốt thân sau 5 tuần nuôi cấy 37

Hình 3.16 Mẫu đốt thân sau 7 tuần nuôi cấy 37

MỤC LỤC

LỜI CÁM ƠN

LỜI CAM ĐOAN

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục đích và nhiệm vụ nghiên cứu 2

2.1 Mục đích nghiên cứu 2

2.2 Nhiệm vụ nghiên cứu 3

3 Ý nghĩa của đề tài 3

NỘI DUNG 4

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Giới thiệu về cây Lùng (Bambusa sp.) 4

1.1.1 Phân loại 4

1.1.2 Mô tả 4

1.1.3 Phân bố 5

1.2 Sơ lược về nhân giống cây in vitro 5

1.2.1 Khái niệm về nuôi cấy mô tế bào 5

1.2.2 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật 5

1.2.3 Ưu, nhược điểm của phương pháp nhân giống in vitro 6

1.2.4 Các giai đoạn vi nhân giống (nhân giống in vitro) 8

1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật 10

1.3.1 Vật liệu nuôi cấy 10

1.3.2 Môi trường nuôi cấy 10

1.3.3 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy 15

1.4 Các nghiên cứu vi nhân giống về họ tre trên thế giới và ở Việt Nam 16

1.4.1 Vi nhân giống họ tre trên thế giới 16

1.4.2 Vi nhân giống họ tre ở Việt Nam 19

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 20

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 20

2.2 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu 20

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 20

2.2.2 Trang thiết bị và dung cụ 20

2.3 Môi trường nuôi cấy 21

2.4 Điều kiện nuôi cấy 21

2.5 Phương pháp nghiên cứu 22

2.5.1 Bố trí thí nghiệm 22

2.5.2 Phương pháp nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu 22

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

3.1 Tạo vật liệu khởi đầu 26

3.2 Tái sinh và nhân nhanh cây Lùng Nghệ An bằng phương pháp tạo

cụm chồi và đánh giá một số chỉ tiêu sinh trưởng 32

3.2.1 Tái sinh và nhân nhanh cây Lùng Nghệ An bằng phương pháp tạo cụm chồi từ cành 32

3.2.2 Tái sinh và nhân nhanh cây Lùng Nghệ An bằng phương pháp tạo cụm chồi từ đốt than 35

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38

TÀI LIỆU THAM KHẢO 39

PHỤ LỤC 44

MỞ ĐẦU

2 Lý do chọn đề tài

Cây Lùng (Bambusa sp.) thuộc họ Tre – Bambusoideae là một loại cây

trồng quan trọng được quan tâm trong nhiều lĩnh vực nông nghiệp, lâm nghiệp

và công nghiệp tại Việt Nam và nhiều nước khác Tại rừng Nghệ An có gần 20 loài tre trúc các loại, trong đó Lùng là loại có giá trị kinh tế đặc biệt nhất với các tính năng ưu việt như: độ dẻo, màu sáng bóng, thớ mịn, lóng dài (dài nhất trong các loài tre trúc của Việt Nam) Trong điều kiện đất tốt, mật độ thích hợp, Lùng có thể cho lóng dài tới 1,5m, cho phép đan những vật dụng có kích thước lớn, đảm bảo độ thẩm mỹ cao, hoặc sản xuất nhiều mặt hàng thủ công

mỹ nghệ xuất khẩu hiện đang rất được ưa chuộng 42

Lùng có giới hạn bền khi nén dọc thớ và giới hạn bền khi kéo dọc thớ, hơn hẳn nhiều loại gỗ Chính vì vậy dùng Lùng làm cột chống, xà đỡ trong xây dựng, giao thông vận tải, chèn hầm lò, sản xuất giấy là rất tốt Mặt khác với hình dáng đẹp, màu sáng bóng, long dài, độ bền cao Lùng được ưa chuộng dùng làm nhà ở, cửa hàng, Những ngôi nhà được làm từ Lùng rất bền lại có vẻ đẹp trang nhã, thích hợp cho những khách sạn, nhà hàng, hay những quán ăn,… hơn nữa nếu kết hợp toàn bộ đồ nội thất, mỹ nghệ cũng được làm từ Lùng như: Bàn, ghế, tủ đựng hàng, đèn chiếu sáng thậm chí là cả

lọ cắm hoa,… sẽ tạo nên một khung cảnh cực kì lãng mạng và sang trọng, chính vì vậy những đồ nội thất, mỹ nghệ làm từ Lùng đang là mặt hàng xuất khẩu rất có giá trị Ngoài ra, trong nông nghiệp, trong sinh hoạt hàng ngày cây Lùng cũng được sử dụng khá rộng rãi như: làm neo, giá đỡ cho nhiều cây lương thực, làm chiếu, mành, đũa, xiên thịt, ván sàn, than hoạt tính, mây tre đan, tăm, chân hương,…

Lùng cũng thể hiện nhiều ưu điểm như sinh trưởng phát triển nhanh, dễ trồng, dễ khai thác Được sử dụng làm cây trồng phủ xanh rừng ở Việt Nam

và một số nước khác

Với những lợi ích kinh tế to lớn cây Lùng đang dần dần xóa đói giảm nghèo cho nhiều hộ nông dân nghèo ở Nghệ An và một số tỉnh khác trong cả nước, từ những người trồng Lùng, người thu hoạch và thợ thủ công, tuy nhiên chính những lợi ích kinh tế này hiện người dân với mục đích thu được lợi nhuận kinh tế cao đã khai thác quá mức, không đúng kĩ thuật, dẫn đến các khu rừng Lùng đang đứng trước nguy cơ giảm về diện tích cũng như sản lượng và chất lượng Chính vì vậy việc đưa Lùng vào trồng trọt và khai thác hợp lí là một giải pháp lâu dài và cực kì cấp thiết 42, 43

Nhưng với các kĩ thuật nhân giống hiện nay như: Ươm, chiết, không đáp ứng được nhu cầu cung cấp giống cho trồng trọt

Để góp phần đẩy mạnh sử dụng có hiệu quả nguồn nguyên liệu, vật liệu trong nước và xuất khẩu Đáp ứng nhu cầu về giống cây Tre nói chung và cụ thể là cây Lùng nói riêng Một hướng nghiên cứu mới đã và đang được quan tâm đó là áp dụng công nghệ sinh học thực vật để tạo nguồn giống đồng nhất, năng suất cao

Việc tạo ra cây Lùng ổn định và đồng nhất là vấn đề cần thiết để phục

vụ cho nhu cầu trồng trọt và nghiên cứu khai thác, sử dụng Vì vậy, chúng tôi

tiến hành nghiên cứu đề tài “Tạo vật liệu khởi đầu và bước đầu tái sinh cây Lùng Nghệ An bằng phương pháp vi nhân giống in vitro”

2 Mục đích và nhiệm vụ nghiên cứu

2.1 Mục đích nghiên cứu

Tạo vật liệu khởi đầu và bước đầu tái sinh cây Lùng Nghệ An bằng

phương pháp vi nhân giống in vitro

2.2 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Tạo vật liệu khởi đầu

- Tái sinh và nhân nhanh cây Lùng Nghệ An bằng phương pháp tạo cụm chồi

- Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái, số lá, chiều cao của chồi cây

Lùng in vitro

3 Ý nghĩa của đề tài

- Ý nghĩa khoa học: Nhằm góp phần bổ sung vào tài liệu nghiên cứu

nhân giống in vitro về cây Lùng

- Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả của đề tài có thể sử dụng nghiên cứu trong nuôi cây mô tế bào cây gỗ Góp phần sản xuất cây giống đồng bộ có hiệu quả cao, chất lượng tốt, ứng dụng vào sản xuất sẽ góp phần nâng cao hiệu quả nghiên cứu khai thác nguyên liệu, vật liệu và măng từ cây Lùng

NỘI DUNG CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về cây Lùng (Bambusa sp.)

Lùng là loại tre to, không gai, lá nhỏ, mọc cụm – thân ngầm dạng củ,

thưa cây, thân khí sinh có ngọn cong ngắn

Thân tre cao, ngọn cong, đường kính lớn (40-50 cm), lóng dài (ngắn

nhất là 1m), vách thân dầy Phiến lá thuôn hình ngọn giáo, hai mép có răng

sắc rất nhỏ, đầu nhọn đuôi hình nêm

hay gần tù Lá khi non mầu xanh

thẫm, mềm mại; khi già mầu xanh

nhạt có những chấm nhỏ mầu gỉ sắt

Bẹ mo hình chuông Tai mo phát

triển và có nhiều lông mầu nâu Thìa

lìa xẻ răng sâu thành dạng lông Lá

mo hình mũi giáo, có lông cả 2 mặt,

hơi lật ngửa – cụp về phía ngoài Mo

sớm rụng, khi cây măng toả đuôi én

thì mo trên thân cũng rụng gần hết

Măng ở giai đoạn thấp có mầu tím

Hình 1.1 Cây Lùng (Bambusa sp.)

nâu, lên cao có mầu tím hồng hay tím đỏ; lên cao hơn nữa có mầu tím da cam hay đỏ hồng; khi cây măng vượt ra ánh sáng măng có mầu xanh vàng hay xanh xám nhạt

Hoa tự cành nhiều chuỳ, các bông chét tập hợp thành cụm thành hình cầu ở các đốt của trục hoa tự Bông chét hình trái xoan nhọn

1.1.3 Phân bố

Lùng là một loài cây bản địa thuộc bộ tre trúc, ở Việt Nam Lùng phân

bố tương đối hẹp ở 5 xã của huyện Quỳ Châu, 3 xã của huyện Quế Phong (Nghệ An) và một số xã của huyện Thường Xuân (Thanh Hóa), hiện nay đang được trồng mở rộng thêm ở một số địa phương khác 42

1.2 Sơ lược về nhân giống cây in vitro

1.2.1 Khái niệm về nuôi cấy mô tế bào

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi cấy từ nguyên liệu hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường nhân tạo trong điều kiện vô trùng Cho đến nay, nuôi cấy mô tế bào thực vật được xem là giải pháp công nghệ quan trọng trong công nghệ sinh học nói chung Trên môi trường nhân tạo, từ các hoocmon các cơ quan thực vật ban đầu có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh và chỉ trong một thời gian ngắn có thể tạo ra một lượng lớn cây trồng có cấu trúc di truyền và các đặc điểm sinh học giống hệt nhau

1.2.2 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.2.2.1 Tính toàn năng của tế bào thực vật

Năm 1902, Haberlandt (Đức) là người đầu tiên đề xướng học thuyết về tính toàn năng của tế bào trong cuốn sách “Mỗi tế bào của một cơ thể đa bào đều mang trong mình đầy đủ các thông tin di truyền để kiến tạo nên một cơ thể hoàn chỉnh Vì vậy khi đặt tế bào vào trong điều kiện thuận lợi, nó có thể phát triển thành một cơ thể” Tính toàn năng của một tế bào cho phép từ

những cơ quan, bộ phận của cơ thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh đồng thời về mặt di truyền giống với cây mẹ

1.2.2.2 Sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào

Sự phân hóa là sự chuyển các tế bào từ dạng phôi sinh sang tế bào chuyên hóa để đảm nhận chức năng sinh lý, sinh hóa khác nhau

Sự phản phân hóa là sự chuyển từ tế bào chuyên hóa sang tế bào phôi sinh để thực hiện chức năng phân chia

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực vật là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào dựa trên tính toán năng của tế bào thực vật

1.2.3 Ưu, nhược điểm của phương pháp nhân giống in vitro

1.2.3.1 Ưu điểm

Phương pháp nhân giống in vitro có khả năng khắc phục được nhiều trở

ngại mà các phương pháp khác thường gặp, sau đây là những ưu điểm chính:

- Cây con được trẻ hóa và sạch bệnh, vì vậy có tiềm năng sinh trưởng và phát triển cao

- Tạo cây con đồng nhất về mặt di truyền, bảo tồn được các tính trạng đã chọn lọc

- Tạo được dòng thuần của các cây tạp giao

- Tạo được cây có gen mới (đa bội, đơn bội)

- Bảo quản và lưu trữ tập đoàn gen

- Có khả năng sản xuất quanh năm

- Có thể nhân nhanh nhiều cây không kết hạt trong những điều kiện sinh thái nhất định hoặc hạt nảy mầm kém

- Hệ số nhân giống cực cao, rút ngắn thời gian đưa một giống mới vào sản xuất đại trà

Về phương diện hệ số nhân giống, nhân giống in vitro là phương pháp

không gì có thể so sánh kịp, kể cả phương pháp nhân giống bằng hạt Thí dụ: Mai Thị Tân và cộng sự đã đạt được hệ số nhân 532 trong vòng một năm đối với cây khoai tây bằng phương pháp này Đặc biệt, cây Cọ dầu thường phải mất 10 – 15 năm mới cho thu hoạch, việc chọn, tạo và nhân nhanh được một

giống mới rất khó khăn Bằng phương pháp nhân nhanh in vitro, người ta có

thể cung cấp được 500.000 cây con giống hệt nhau trong vòng một năm 1.2.3.2 Nhược điểm

Nhược điểm chính của phương pháp nuôi cấy in vitro là đòi hỏi trang

thiết bị đắt tiền và kĩ thuật cao nên chỉ có hiệu quả đối với những cây có giá trị cao hoặc khó nhân giống bằng phương pháp khác Ngoài ra, phương pháp này còn có những nhược điểm sau:

- Mặc dù số lượng cây giống thu được có thể rất cao nhưng cây non có kích thước nhỏ, đòi hỏi phải có chế độ chăm sóc đặc biệt ở giai đoạn sau ống nghiệm

- Cây có thể có những đặc tính không mong muốn

- Khả năng tạo đột biến tăng

- Khả năng tái sinh có thể mất đi do cấy truyền callus, hay huyền phù tế bào nhiều lần

- Cây giống có thể nhiễm bệnh đồng loạt

Tuy nhiên phương pháp nhân giống in vitro ngày càng được sử dụng

- Nhân nhanh và kinh tế các kiểu gen quý hiếm của giống cây lâm nghiệp và gốc ghép trong nghề trồng cây ăn quả, cây cảnh thuộc nhóm thân gỗ

- Nhân nhanh ở điều kiện vô trùng và cách ly tái nhiễm kết hợp với làm sạch virus

- Bảo quản và lưu giữ các tập đoàn giống, nhân giống vô tính và các loài giao phấn trong ngân hàng gen

1.2.4 Các giai đoạn vi nhân giống (nhân giống in vitro)

Vi nhân giống (Micropropagation) hay còn gọi là nhân giống in vitro (in vitro propagation) là phương pháp ứng dụng các kĩ thuật nuôi cấy mô để

nhân giống thực vật, bắt đầu từ nhiều bộ phận khác nhau của thực vật có kích thước nhỏ, sinh trưởng ở điều kiện vô trùng trong các ống nghiệm hoặc các loại bình nuôi cấy khác

Sự thành công của việc nhân giống in vitro đạt được khi trải qua các

giai đoạn sau:

1.2.4.1 Giai đoạn 1: Khử trùng mô nuôi cấy

Đây là giai đoạn tối quan trọng, thậm chí quyết định toàn bộ quy trình

nhân giống in vitro Mục đích của giai đoạn này là tạo ra được nguyên liệu thực vật vô trùng để đưa vào nuôi cấy in vitro Khử trùng mô thực vật, người

ta thường dùng một số chất hoá học như HgCl2, Ca(OCl)2, NaOCl, H2O2 Tùy thuộc vào từng loại mô thực vật mà lựa chọn nồng độ và thời gian xử lý hoá chất thích hợp

1.2.4.2 Giai đoạn 2: Tái sinh và nhân nhanh chồi

Toàn bộ quá trình nhân giống in vitro xét cho cùng là nhằm mục đích

tạo ra hệ số nhân cao nhất Chính vì vậy giai đoạn này được xem là giai đoạn then chốt của quá trình

Để tăng hệ số nhân người ta thường phải đưa thêm vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo các chất điều hòa sinh trưởng (auxin, xytokynin, gibberellin, ) Các chất bổ sung khác như nước dừa, nước chiết nấm men, dịch thủy phân casein,… kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp Tùy thuộc vào từng đối tượng nuôi cấy người ta có thể nhân nhanh bằng kích thích sự hình thành các cụm chồi (nhân cụm chồi), hay kích thích sự phát triển của chồi nách (vi giâm cành) hoặc thông qua việc tạo cây từ phôi vô tính

1.2.4.3 Giai đoạn 3: Tạo cây hoàn chỉnh

Khi đạt kích thước nhất định các chồi được chuyển từ môi trường ở giai đoạn 2 sang môi trường tạo rễ Thường sau từ 1 - 2 tuần, từ những chồi riêng

lẻ này sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh Ở giai đoạn này, người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy các auxin vì auxin là hoocmon thực vật quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy Trong nhóm này, các chất IAA, IBA,  - NAA và 2,4 - D được sử dụng, nghiên cứu nhiều nhất 1.2.4.4 Giai đoạn 4: Đưa cây ra đất

Giai đoạn đưa cây hoàn chỉnh (có đủ thân, rễ, lá) từ ống nghiệm ra đất

là bước cuối cùng của quá trình nhân giống in vitro và là bước quyết định khả

năng ứng dụng quá trình này trong thực tiễn sản xuất Cây lấy ra từ ống nghiệm phải được rửa sạch agar bám trên bề mặt rễ để tránh sự xâm nhập của côn trùng và nấm mốc

Đây là giai đoạn chuyển cây con từ trạng thái sống dị dưỡng sang sống hoàn toàn tự dưỡng Do đó, để đảm bảo cho cây có tỷ lệ sống cao thì cần phải đưa cây ra vườn ươm, ươm trên các giá thể thích hợp từ 10 - 15 ngày Lúc này

rễ mới được sinh ra, lá non bắt đầu hình thành Sau đó chuyển cây ra đất với chế độ chăm sóc bình thường

1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.3.1 Vật liệu nuôi cấy

Cơ thể thực vật đa bào đều có tính toàn năng nghĩa là đều có khả năng phân hóa tái sinh thành một cây hoàn chỉnh từ một tế bào, mô, cơ quan trong môi trường dinh dưỡng nhân tạo và môi trường có điều kiện thích hợp Do vậy về nguyên tắc bất kỳ một bộ phận nào của cây cũng có thể sử dụng làm vật liệu nuôi cấy, có thể là cơ thể thực vật nguyên vẹn như cây con, mầm non, các mô sẹo, các tế bào đơn, tế bào trần,

Tuy nhiên, khả năng này phụ thuộc vào từng loài, có loài dễ tái sinh từ

mô nuôi cấy như khoai tây, cà chua, thuốc lá,… có loài rất khó như hoa đồng tiền, trầm hương, Thông thường các giai đoạn sinh trưởng khác nhau của

mô cũng như các bộ phận khác nhau của cây, khi nuôi cấy sẽ cho những kết

quả khác nhau Điều đáng chú ý là những mô nuôi cấy có nguồn gốc từ cây in vitro có khả năng phát sinh, phát triển tốt hơn so với những mô nuôi cấy có

nguồn gốc là những cây ngoài tự nhiên hay trong nhà kính Nhìn chung, tất cả các bộ phận như thân, lá, rễ, cuống lá, đều có thể sử dụng để nuôi cấy, nhưng các cơ quan này do có sự chuyển hoá khác nhau nên quá trình giải mã các thông tin di truyền trong đó để tạo mô, tạo chồi, tạo rễ, tái sinh cây, là cũng rất khác nhau

Kích thước mô nuôi cấy khác nhau sẽ cho các phản ứng không giống nhau và có liên quan mật thiết với tỷ lệ sống, cũng như mức độ ổn định về mặt di truyền của mô cấy Do đó, tuỳ từng đối tượng, từng loại mô và mục đích sử dụng mà người ta nuôi cấy mô có kích thước khác nhau cho phù hợp 1.3.2 Môi trường nuôi cấy

Mô nuôi cấy bị tách rời ra khỏi cơ thể mẹ nên mất khả năng tự dưỡng

Vì vậy, để cho mô tồn tại và phân hóa thì trong các giai đoạn nuôi cấy phải tạo ra được môi trường có đủ các chất dinh dưỡng mà cây cần thiết Thành

phần hoá học của môi trường dinh dưỡng gồm chủ yếu là muối khoáng, nguồn cacbon, chất điều hoà sinh trưởng, Cho đến nay, đã có nhiều loại môi trường dinh dưỡng được tìm ra: môi trường Murashige và Skoog (l962)

26 viết tắt là MS, môi trường Linsmainer và Skoog (1965) [23], môi trường Gamborg (1968) [15]… Đây là những môi trường cơ bản và sẽ được cải biến

ra nhiều loại môi trường khác nhau cho phù hợp với mỗi đối tượng nghiên cứu và mục đích thí nghiệm Trong số đó, môi trường MS được đánh giá là phù hợp nhất cho đa số loài thực vật 2

Thành phần của môi trường nuôi cấy tế bào thay đổi tùy theo từng loại thực vật, loại tế bào, mô, cơ quan được nuôi cấy, các giai đoạn sinh trưởng, phát triển của mẫu cấy cũng như mục đích nuôi cấy Tuy nhiên môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật đặc trưng đều chứa các thành phần sau:

- Các nguyên tố đa lượng (muối nitơ, phốt pho, magie, canxi, kali, lưu huỳnh) là thành phần không thể thiếu được vì chúng tham gia cấu thành các

cơ quan tử trong cơ thể thực vật

- Các nguyên tố vi lượng (muối sắt, kẽm, đồng, mangan, coban, molipden, bo, iot) Các nguyên tố này tuy có hàm lượng thấp nhưng có vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy sự phát triển của thực vật ở giai đoạn xuân hóa, ngoài ra chúng còn là thành phần của enzym, xúc tác cho các phản ứng sinh hóa trong cơ thể Ví dụ thiếu sắt tế bào mất khả năng phân chia, thiếu bo gây thừa auxin làm mô nuôi cấy có biểu hiện mô sẹo hóa mạnh nhưng lại xốp, mọng nước và tái sinh kém, molipđen tác động trực tiếp lên quá trình trao đổi đạm trong tế bào thực vật 1

- Nguồn cabon: khi nuôi cấy in vitro thì các tế bào thực vật không có khả

năng quang hợp nên đòi hỏi phải cung cấp nguồn cacbon để tạo năng lượng cho các quá trình sinh lí, sinh hóa diễn ra bình thường trong tế bào Đường sucrose là nguồn cacbon tốt nhất thường được sử dụng với nồng độ 2 - 3%

Đường có thể bị caramen hóa nếu bị hấp khử trùng quá lâu và sẽ ức chế phản ứng với các hợp chất melanoidin, một chất sẫm màu có phân tử lượng cao, ức chế sự phát triển của tế bào 2

- Các vitamin: mô và các tế bào nuôi cấy tuy có tổng hợp được vitamin nhưng không đủ nên thường phải bổ sung vitamin vào môi trường nuôi cấy chủ yếu là: thiamin (B1) đóng vai trò quan trọng trong quá trình biến đổi cacbon và tham gia vào thành phần tổ hợp enzim xúc tác quá trình oxi hóa khử dehydrogenase xúc tác việc tách hydro ra khỏi các axit hữu cơ; pyridoxin (B6) tham gia vào thành phần các enzym khử cacbon và thay đổi vị trí nhóm amin trong các axit amin; myo - insitol giúp cải thiện sự tăng trưởng của mô,

có vai trò trong sinh tổng hợp thành tế bào Vitamin rất nhạy cảm với sự tăng trưởng của mô nuôi cấy, vitamin được sử dụng ở nồng độ thấp, nó có vai trò quan trọng trong sự tổng hợp tế bào 1

- Các chất có nguồn gốc tự nhiên phức tạp: nước dừa, dịch chiết muối, dịch chiết cà chua, dịch chiết nấm men, dịch thủy phân cazein,… cũng được

sử dụng trong nuôi cấy in vitro vì thành phần của chúng có nhiều chất thúc

đẩy tăng trưởng tế bào và mô nuôi cấy Nước dừa bổ sung vào môi trường các loại đường, protein, các axit hữu cơ, các axit amin, các chất kích thích sinh trưởng, các vitamin và các chất quan trọng khác có tác dụng tốt trong tăng trưởng của mô 5

- Các chất làm rắn môi trường: agar là một polysaccarit thu được từ một số tảo thuộc ngành tảo đỏ Agar được sử dụng để làm rắn môi trường, tạo giá thể nâng đỡ cây Tùy đặc điểm nuôi cấy và chất lượng agar mà nồng độ sử dụng thay đổi từ 0,8 - 1,0% Nếu sử dụng với nồng độ quá cao sẽ làm môi trường quá cứng và ảnh hưởng tới sự khuếch tán cũng như hấp thụ dinh dưỡng của mô, tế bào Nếu như agar không tinh sạch thì nó có thể làm đục màu môi trường do các chất cặn trong agar gây nên Agar có thể ảnh hưởng

đến kết quả thí nghiệm bởi vì agar là một sản phẩm lấy từ tảo biển, nó có thể

có những tác động sinh lí trên mô thực vật Ngoài agar, một số hợp chất khác cũng đã được thử nghiệm thành công để làm rắn môi trường như Gerlit (là một polysaccarit tinh và trong suốt được hình thành trong quá trình lên men của Pseudomonas 5

- Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật: phytohoocmon là thành phần quan trọng bậc nhất của môi trường nuôi cấy Nhờ những chất này mà các nhà

nghiên cứu có thể điều chỉnh quá trình phát sinh hình thái thực vật in vitro

Trong nuôi cấy mô tế bào hai nhóm chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng rộng rãi là auxin và xytokynin:

*Auxin là chất điều khiển sinh trưởng chủ yếu kích thích sinh trưởng tế bào làm tăng phân bào, gây hiện tượng ưu thế ngọn, kích thích sự hình thành

rễ 1 Nhóm auxin bao gồm IAA, IBA,  - NAA, 2,4 - D có hiệu quả sinh lý

ở nồng độ thấp kích thích ra rễ, ở liều lượng cao auxin sẽ phát động sự tạo mô sẹo và thường gây nên các đột biến 5 2,4 - D thường được sử dụng rộng rãi trong việc phát sinh mô sẹo; IAA, IBA,  - NAA thường được sử dụng trong việc phát sinh rễ 2

*Xytokynin là nhóm các phytohoocmon dẫn xuất của adenin nó liên quan chặt chẽ đến quá trình phân bào, kích thích phân hóa chồi từ mô cấy Các xytokynin thường dùng trong nuôi cấy là kinetin, BA, zeatin giúp tạo số lượng chồi nhiều nhưng có kích thước nhỏ 2, có thể gây ra hiện tượng mọng nước (thủy tinh thể và kìm hãm sự tạo rễ) Theo Skoog và Miller, tỷ lệ auxin/xytokynin cao thường có xu thế kích thích quá trình tạo rễ bất định, kéo dài chồi, ngược lại tỷ lệ trên thấp thì sẽ đẩy mạnh biệt hóa chồi và ức chế sự phát triển chồi, nếu tỷ lệ trung bình thì mô sẹo sẽ được hình thành 5

Ngoài ra trong nuôi cấy mô tế bào người ta còn sử dụng nhóm phytohoocmon khác là GA (Gibberellic axit) Gibberelin điển hình là GA3 có

tác dụng kích thích kéo dài lóng đốt và sự sinh trưởng của cây, phá vỡ trạng thái ngủ nghỉ của cây,… Nhưng so với auxin và xytokynin thì nhóm GA rất ít được sử dụng vì có biểu hiện ức chế sinh trưởng và phát sinh hình thái thực

vật in vitro, đặc biệt là với mô thực vật một lá mầm, GA3 được đưa vào môi trường trong những trường hợp cần thiết để kéo dài những chồi bất định hoặc kích thích tái sinh chồi ở một số loài thực vật 5

*pH của môi trường là một yếu tố quan trọng Sự ổn định pH của môi trường là yếu tố duy trì trao đổi các chất trong tế bào Ngoài ra sự bền vững

và hấp thụ các chất phụ thuộc vào pH môi trường, đặc biệt mẫn cảm với pH môi trường là NAA, gibberellin và các vitamin Sự hấp thụ các hợp chất sắt cũng phụ thuộc vào pH pH môi trường thường ở 5,5 - 5,8 trước khi khử trùng

4 Giá trị pH đầu tiên của môi trường ảnh hưởng không nhỏ tới sự sinh trưởng và tổng hợp của tế bào Khi pH môi trường thấp sẽ hoạt hóa các enzym hydrolase, dẫn tới kìm hãm sinh trưởng đồng thời kích thích sự già hóa của tế bào trong mô nuôi cấy 3 Giá trị pH đầu tiên của môi trường nuôi cấy luôn luôn ở trong khoảng 5,5 - 5,9 Vì hầu hết trong môi trường nuôi cấy đều không có chất đệm nên giá trị pH sẽ thay đổi trong quá trình khử trùng môi trường và trong quá trình nuôi cấy Giá trị pH giảm nhanh chóng xuống 4,0 - 4,5 trong vòng 24 - 28 giờ sau khi cấy tế bào vào môi trường nuôi Những thay đổi này liên quan đến sự hấp thụ amonium của tế bào Tuy nhiên, giá trị

pH sẽ tăng lên sau vài ngày và giữ ở mức độ ổn định 5,0 - 5,5 do có liên quan đến sự hấp thụ nitrate

*Ảnh hưởng của than hoạt tính

Nồng độ thường dùng là từ 0,2 – 3% Than hoạt tính có các tác dụng sau:

- Hấp thụ độc tố nâu/đen (hợp chất phenol và melanin) và các độc tố không màu khác

- Hấp thụ các hợp chất hữu cơ khác (auxin, cytokinin, ethylene, vitamin, chelate Fe và Zn…)

- Thúc đẩy sự tạo phôi soma

- Ổn định độ pH

1.3.3 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy

Nhiệt độ: nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phân chia tế bào và quá trình trao đổi chất trong mô nuôi cấy, ảnh hưởng đến sự phát triển của từng tế bào riêng

lẻ và khả năng tạo các cơ quan của mô nuôi cấy Nhiệt độ thích hợp sẽ ảnh hưởng tích cực đến quá trình sinh trưởng của đa số các loại thực vật nuôi cấy Nhiệt độ rất thấp còn được sử dụng làm chậm hay ngừng sinh trưởng hẳn của

mầm nuôi cấy nhằm mục đích bảo quản giống ở điều kiện in vitro Trong thực

tế, nhiệt độ của phòng nuôi cấy thường được điều chỉnh ổn định 250C  10C, điều này là do nhiệt độ thật của các mô nuôi cấy trong bình nuôi cấy có thể cao hơn 2 - 40C so với nhiệt độ của phòng Thông thường, người ta điều chỉnh nhiệt độ phòng nuôi cấy trung bình Các loại cây sống ở vùng ôn đới thường quen với nhiệt độ thấp hơn là cây nhiệt đới, chính vì vậy mà người ta sẽ có lợi hơn khi có những phòng nuôi cấy có nhiệt độ 200C  10C dành cho cây nhiệt đới 2

Ánh sáng: bao gồm cường độ, thời gian và chất lượng ánh sáng Khi chuẩn bị cho cây con ra ngoài vườn ươm nếu gia tăng cường độ ánh sáng thì

sẽ “tăng sức “cho cây con Trong thực tế ở phần lớn các phòng thí nghiệm thời gian chiếu sáng 16 - 18 giờ/ngày được coi là tốt nhất cho nuôi cấy mô

2 Chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng không nhỏ đến quá trình sinh trưởng của mô nuôi cấy và có liên quan đến sự thay đổi nồng độ hoocmon nội sinh Các kết quả này cùng với các kết quả nghiên cứu khác cho thấy quá trình phát sinh hình thái của thực vật được điều chỉnh bởi các sắc tố nhận ánh sáng: chất phytochrom và các chất khác

Không khí: Các chất khí có tác động lên sự phát triển chồi trong nuôi

cấy in vitro bao gồm oxy, carbon dioxide và ethylene Các nhà trồng cây

thương mại không nỗ lực làm thay đổi mức không khí trong nuôi cấy, tuy nhiên tất cả sự đóng kín và nắp đậy sử dụng cho nuôi cấy mô là trao đổi khí được ở một vài mức độ khác nhau, thường có sự thúc đẩy tăng trưởng qua lỗ không khí bị đóng kín hoặc cung cấp qua màng lọc trao đổi khí (Hartmann và ctv, 1997)

1.4 Các nghiên cứu vi nhân giống về họ tre trên thế giới và ở Việt Nam 1.4.1 Vi nhân giống họ tre trên thế giới

Trong khi một loạt các phương pháp có thể sử dụng để nhân giống tre, hầu hết các phương pháp chủ yếu là hạn chế với các loài cụ thể và điều kiện địa phương (vi dụ như về nguồn hạt giống) Nói chung thì không thể áp dụng được phương pháp này

Ngoài ra để phổ biến giống với quy mô lớn (> 500.000 cây/1 năm) kĩ thuật cổ điển chủ yếu là không đủ và không hiệu quả

Hầu hết các kĩ thuật cổ điển nhân giống vô tính chỉ hữu ích cho việc sản xuất trên quy mô nhỏ hơn (lên đến 100.000 cây/1 măm) mặc dù tối ưu hóa hoặc các kĩ thuật như nhân giống phổ biến vi mô (Adarsh Kumar, 1991) 6

có thể cho năng suất sản xuất cao hơn nhiều khi phụ thuộc vào sự sẵn có của cây mẹ Nhân giống quy mô lớn (từ 10.000 và 500.000 cây mỗi năm) đòi hỏi

kĩ thuật cao và rất nhiều cây mẹ Cho nên nuôi cấy mô nhân giống quy mô lớn (> 500.000 cây mỗi năm) là phương pháp duy nhất khả thi Do vậy, vật liệu khởi đầu đóng vai trò quan trọng đối với vi nhân giống (Gielis, 1998 Subramaniam, 1994) 16, 35

Kể từ 4 thập kỉ qua, nhiều nhà khoa học và các công ty trên thế giới đã thực hiện nghiên cứu để phát triển công nghệ vi nhân giống hiệu quả cho tre nhiệt đới và ôn đới

Đầu tiên bài báo về nuôi cấy mô tre là sự nảy mầm của hạt giống trong ống nghiệm (Alexander và Rao, 1968) 7 Trong bài báo cổ điển của Vasil về việc sử dụng 2,4-D trong khởi phát phôi soma, đầu thập niên 80 của thế kỷ 20

vi nhân giống đã thành công dựa trên phôi soma của tre nhiệt đới từ hạt của

cây Dendrocalamus strrictus và Bambusa bambos (Metha et al., 1982) 24

Đối với những loài tương tự cũng trồng bằng nách nhánh đã thành công (Nadgir et al.,1984) 29 Trong đó nhóm thập kỷ đã sản xuất tre thông qua

nách nhánh, sinh cơ quan hoặc các phôi, từ chi như Bambusa, Phyllostachys

và Sasa kết quả đã được đăng trong hàng loạt 5 bài báo cổ điển của Huang và đồng nghiệp, Guadua angustifolia (Manzur, 1988) 25, Bambusa beecheyana

và Bambusa oldhamii (Yeh và Chang, 1986) 37, 38 Nhiều nghiên cứu đã

tập trung vào phôi soma cây tre nhiệt đới (INBAR, 1991) 20 Một thống kê (BIC, 1994) cho thấy rằng ít nhất 21 phòng thí nghiệm ở Đông Nam Á đã tham gia vào nuôi cấy mô tre, chủ yếu là ở Ấn Độ Còn các nước khác như Singapore (Dekkers và Rao, 1987) 12 và Thái Lan (Prutpongse và Gavinlertvatana, 1992) 30, nghiên cứu nuôi cấy mô tre rất tích cực Ở châu

Âu và châu Mỹ nhiều nghiên cứu và phòng thí nghiệm thương mại đã cố gắng phát triển các công thức vi nhân giống bằng cành tre Trong nuôi cấy mô thời gian gần đây là không chỉ được sử dụng để nhân giống tre, những nghiên cứu cũng bao gồm nuôi cấy tế bào, lựa chọn mô sẹo chịu mặn và cảm ứng ra hoa Đặc biệt nuôi cấy mô hoa của tre mở ra hướng nghiên cứu hớp dẫn vì nó mở đường, ít nhất là về mặt lí thuyết cho lai tre (Gielis, 1999; Nadgauda et al, 1990) 17, 27 Bây giờ ít nhất có 130 bài viết về vi nhân giống tre đã được xuất bản, bài viết gốc cũng như đánh giá và một số trong đó nuôi cấy mô được mô tả trong một khía cạnh tổng quát hơn (Compendium của nghiên cứu trên tre, 1970-2003, Fernandez và Goelis, 2003) 14 Đánh giá khác về nuôi

cấy mô tre có thể tìm thấy trong Gielis, 1999; INBAR, 1991; Nadgauda et al.,

1997; Saxena và Dhawan, 1994 và Zamora năm 1994; năm 2001) 17, 20,

28, 34, 39, 40

Ít nhất có 50 bài viết có chi tiết rất cụ thể về phương pháp phát triển Các tài liệu tham khảo có thể tìm thấy trong danh sách tham khảo, đó là danh sách đầy đủ nhất về nuôi cấy mô tre ngày nay Khi xem xét những dữ liệu này một số xu hướng được quan sát liên quan đến thương mại nhân giống:

1 Mục tiêu chính đã đạt được trên tre nhiệt đới của các chi Bambusa và Dendrocalamus Các loài nguyên liệu là Bambusa bambos (trong hầu hết các bài viết như B arundinaceae), B balcooa, B oldhamii, B ventricosa, B vulgaris, B.tulda, Dendrocalamus asper, D giganteus,

D hamiltonii, D latiflorus, D longispathus, D.membranaceus và D strictus, với Bambusa bambos và Dendrocalamus strictus đều thích

hợp

2 Các loài khác như Guadua angustifolia (Manzur, 1989) 25 đã được thử nghiệm, nhưng các chi tre quan trọng như Gigantochloa, Schizostachyum, Melocanma, hoặc tre châu Phi là các đối tượng đã

không được nghiên cứu thành công Chỉ có ba nhóm tập trung vào tre

ôn đới và tre bán khỏe mạnh, với Thamnocalamus spathiflorus (Bag et al., 2000); Phyllostachys aurea (Huang và Huang, 1989) và Sasa pygmaea (Pleioblastus pygmaeus; Huang và Huang, 1989; Watanabe

và cộng sự, 2000) 8, 18, 19, 36 Ngoài ra, nghiên cứu đã tập trung vào chỉ một hoặc hai loài Rất ít nhóm có tập trung vào nhiều hơn một loài Chỉ có một bài viết đề cập đến một phạm vi rộng lớn của các loài thử nghiệm (Prutpongse và Gavinlertvatana, 1992) 30

3 Rất ít các công thức có được đủ thành công để chuyển sang thương mại Phương án sản xuất, đặc biệt là đối với nách nhánh Vấn đề có thể