Phát triển quy trình nhân giống in vitro hoa cẩm chướng đơn (dianthus mix)

... tài Phát triển quy trình nhân giống in vitro hoa cẩm chƣớng đơn (Dianthus Mix) Mục đích nghiên cứu Xây dựng quy trình nhân nhanh giống hoa cẩm chƣớng đơn (Dianthus Mix) kỹ thuật nuôi cấy in vitro. .. trƣởng cẩm chƣớng in vitro - Ra rễ tạo in vitro hoàn chỉnh - Rèn luyện vƣờn ƣơm - Khảo sát sinh trƣởng phát triển hoa cẩm chƣớng đơn giống Mix đƣợc nhân kỹ thuật nuôi cấy in vitro Ý nghĩa khoa học... tài Nguyễn Thị Thanh Vân LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết nghiên cứu đề tài Phát triển quy trình nhân giống in vitro hoa cẩm chƣớng đơn (Dianthus Mix) kết riêng em dƣới hƣớng dẫn thầy PGS.TS

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH - KTNN

NGUYỄN THỊ THANH VÂN

PHÁT TRIỂN QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG

IN VITRO HOA CẨM CHƯỚNG ĐƠN

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận em đã được nhận sự giúp đỡ tận tình của tập thể và cá nhân

Trước tiên em xin gửi lời cám ơn chân thành đến thầy Lê Văn Sơn và

La Việt Hồng đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và tạo điều kiện tốt nhất giúp em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Em xin trân trọng cám ơn ban lãnh đạo trường Đại học Sư phạm Hà Nội

2, Ban chủ nhiệm Khoa Sinh - KTNN, Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật Khoa Sinh - KTNN, Trung tâm hỗ trợ nghiên cứu khoa học và chuyển giao công nghệ Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện tốt nhất cho

em thực hiện đề tài

Em xin cảm ơn những lời động viên, quan tâm, khích lệ và giúp đỡ của gia đình, bạn bè trong suốt thời gian nghiên cứu

Em xin chân trọng cám ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2015

Sinh viên thực hiện đề tài

Nguyễn Thị Thanh Vân

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan kết quả nghiên cứu đề tài “Phát triển quy trình nhân

giống in vitro hoa cẩm chướng đơn (Dianthus Mix)” là kết quả của riêng

em dưới sự hướng dẫn của thầy PGS.TS Lê Văn Sơn, số liệu đạt được là trung thực và không trùng lặp với các công trình đã công bố

Hà Nội, ngày tháng năm 2015

Sinh viên thực hiên đề tài

Nguyễn Thị Thanh Vân

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lí do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 2

3 Nhiệm vụ nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3

4.1 Ý nghĩa khoa học 3

4.2.Ý nghĩa thực tiễn 3

NỘI DUNG 4

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1.ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CÂY HOA CẨM CHƯỚNG 4

1.1.1 Đặc điểm phân loại 4

1.1.2 Đặc điểm sinh học 4

1.1.3 Điều kiện sinh thái của cây hoa cẩm chướng [2] 5

1.2 GIÁ TRỊ KINH TẾ CỦA NGÀNH SẢN XUẤT HOA TRÊN THẾ

GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM 7

1.2.1 Sản xuất hoa trên thế giới 7

1.2.2 Sản xuất hoa ở Việt Nam 8

1.3 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT TRONG NHÂN GIỐNG CÂY HOA CẢNH 12

1.3.1 Nhân giống bằng chồi chính hoặc chồi bên 14

1.3.2 Nhân giống bằng chồi bất định 15

1.4 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

TRONG NHÂN GIỐNG CÂY HOA CẨM CHƯỚNG 17

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 19

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 19

2.1.1 Mẫu vật 19

2.1.2 Thời gian và địa điểm thực hiện 19

2.1.3 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm 19

2.1.3.1 Thiết bị 19

2.1.3.2 Dụng cụ 19

2.1.4 Môi trường nuôi cấy 20

2.1.5: Điều kiện nuôi cấy 20

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.2.1 Phương pháp khử trùng 20

2.2.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm 21

2.2.3 Phương pháp phân tích số liệu 27

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 28

3.1 TẠO VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU 28

3.2 GIAI ĐOẠN TÁI SINH VÀ NHÂN NHANH CHỒI THÔNG QUA SỰ PHÁT TRIỂN CỦA CHỒI NÁCH 32

3.3 RA RỄ TẠO CÂY CẨM CHƯỚNG IN VITRO HOÀN CHỈNH 35

3.4 ẢNH HƯỞNG CỦA NƯỚC DỪA ĐẾN SINH TRƯỞNG PHÁT TRIỂN CỦA CÂY 41

3.5 RÈN LUYỆN CÂY THÍCH NGHI VỚI MÔI TRƯỜNG VÀ KHẢO SÁT SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA CÂY HOA CẨM

CHƯỚNG ĐƯỢC GIỐNG IN VITRO NGOÀI ĐIỀU KIỆN TỰ NHIÊN.48

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52

1 Kết luận 52

2 Kiến nghị 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

Agar  - indole - acetic acid

MS Indode - 3 - butyric acid

H2O2 Hydro peroxide (nước oxy già)

HgCl2 Thủy ngân Clorua

DANH MỤC HÌNH

Hình 3.1: Ảnh hưởng của nồng độ khử trùng đến tạo vật liệu in vitro 30

Hình 3.2: Mẫu sạch sau 7 ngày 31

Hình 3.3: Mẫu và chồi in vitro sạch 31

Hình 3.4: Ảnh hưởng của BAP đến quá trình tái sinh chồi bên của cây

cẩm chướng in vitro (sau 4 tuần nuôi cấy) 33

Hình 3 5: Sự tạo chồi dưới ảnh hưởng của BAP 34

Hình 3.8: Ảnh hưởng α-NAA đến sự hình thành số lượng rễ của cây 37

Hình 3.9: Ảnh hưởng của α-NAA đến chiều dài rễ của cây 37

Hình 3.10: Ảnh hưởng α-NAA ở các công thức khác nhau trong nghiên cứu 39

Hình 3.11: Rễ ở nồng độ α-NAA 0,2 mg/l (sau 7 ngày nuôi cấy) 40

Hình 3.12: Chiều dài rễ ở nồng độ α-NAA 0,2 mg/l (sau 7 ngày nuôi cấy) 40 Hình 3.13: Ảnh hưởng của nước dừa đến sự phát triển chồi của cây 43

Hình 3.14: Ảnh hưởng của nước dừa đến sự tạo chồi 43

Hình 3.15: Ảnh hưởng của nước dừa đến sự tạo rễ 44 Hình 3.16: Ảnh hưởng của nước dừa đến trọng lượng tươi 44

Hình 3.17: Chiều cao cây nuôi cấy trong môi trường MS đối chứng sau 6 tuần 45

Hình 3.18: Chiều cao cây nuôi cấy trong môi trường nước dừa 5% - 6 tuần 46

Hình 3.19: Chiều cao cây nuôi cấy trong môi trường nước dừa 25% - 6 tuần 46

Hình 3.20: Khối lượng tươi cây cẩm chướng ở môi trường MS - 9 tuần.47 Hình 3.21: Khối lượng tươi cây cẩm chướng ở nước dừa 5% - 9 tuần 47

Hình 3.22: Khối lượng tươi cây cẩm chướng ở nước dừa 25% - 9 tuần 48

Hình 3.23: Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây trong vườn ươm 49 Hình 3.24: Một số hình ảnh rèn luyện cây thích nghi với môi trường tự nhiên 50

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Danh mục thiết bị thí nghiệm 19 Bảng 2.2: Các công thức thí nghiệm xác đinh hiệu quả của chất khử trùng 21 Bảng 2.3: Các công thức nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến sự tái sinh chồi 23 Bảng 2.4: Các công thức nghiên cứu ảnh hưởng của α-NAA đến sự tạo rễ của cây 24 Bảng 2.5: Các công thức nghiên cứu ảnh hưởng của nước dừa đến sự sinh trưởng và phát triển của cây hoa cẩm chướng đơn giống Mix 25

Bảng 2.6: Công thức nghiên cứu sự thích nghi của cây in vitro qua các giá

thể 26 Bảng 3.1: Hiệu quả khử trùng bề mặt của dung dịch javel đến tạo vật liệu

in vitro 29

Bảng 3.2: Ảnh hưởng của BAP đến quá trình tái sinh chồi bên của cây

cẩm chướng in vitro (sau 4 tuần nuôi cấy) 32

Bảng 3.3: Ảnh hưởng của α-NAA đến quá trình tạo rễ cây cẩm chướng Mix (sau 7 ngày nuôi cấy) 36 Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nước dừa bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến

một số chỉ tiêu sinh trưởng của cây cẩm chướng in vitro 41

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây trong vườn ươm 48

Ở Việt Nam trong những năm gần đây xuất khẩu hoa tươi đã trở thành một ngành sản xuất có thu nhập cao và ổn định cho người sản xuất Tuy nhiên xuất khẩu hoa tươi đòi hỏi phải có những điều kiện chặt chẽ từ giống, gieo trồng, chăm sóc…đến thu hoạch, công nghệ bảo quản, đóng gói, vận chuyển,

an toàn thực phẩm và thị trường nhập khẩu Trong điều kiện hiện nay, ít có doanh nghiệp Việt Nam có thể đáp ứng được các yêu cầu này vì hoa xuất khẩu đòi hỏi mẫu mã đẹp, kích thước đồng đều, đặc biệt là sạch bệnh Vì vậy,

để có được những giống hoa sạch bệnh thì hướng vận dụng các công nghệ cao như nuôi cấy mô; kỹ thuật canh tác và bảo vệ thực vật tiên tiến; áp dụng công nghệ nhà lưới có mái che sáng đang được áp dụng rộng rãi ở một số cơ sở sản xuất như Đà Lạt và một số vùng khác

Nuôi cấy mô và tế bào đã có những đóng góp quan trọng để cải tiến giống cây trồng và còn nhiều tiềm năng ứng dụng trong tương lai Trong một vài năm gần đây, vi nhân giống đã trở thành một kỹ thuật đầy hứa hẹn để nhân nhanh và mở rộng sản xuất của những đối tượng thực vật được con người chọn lựa Vi nhân giống thực tế là phiên bản thu nhỏ của nhân dòng được thực hiện trong điều kiện vô trùng Kỹ thuật vi nhân giống hay nhân

giống in vitro được thực hiện dựa trên khái niệm về tính toàn năng của tế bào

được nhà khoa học Harberlandt đưa ra Mỗi tế bào của cơ thể thực vật đều có tính toàn năng, chẳng hạn như khả năng phát triển thành cây mới dưới điều kiện nuôi cấy cụ thể Tính đến nay, đã có rất nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy

mô tế bào thực vật được hình thành, đặc biệt là ở các nước đang phát triển, nơi có nhân công rẻ

Các quy trình vi nhân giống đã được phát triển trên nhiều đối tượng cây cảnh, chẳng hạn như cây hoa lay ơn [10], [15], hoa hồng, [30], [37], hoa cúc [33], [35], hoa cẩm chướng [21], [26] và cây hoa lan [7], [13] Giống hoa cẩm

chướng Dianthus Mix là một trong những giống hoa đẹp đang được trồng khá

phổ biến ở khu vực Mê Linh – Hà Nội, nhu cầu về giống tốt, sạch bệnh là rất lớn Vì vậy, để đáp ứng nhu cầu sản xuất thì cần thiết phải có một qui trình nhân giống có hiệu quả cao, đáp ứng thị trường, chính vì vậy chúng tôi chọn

đề tài “Phát triển quy trình nhân giống in vitro hoa cẩm chướng đơn (Dianthus Mix)”

2 Mục đích nghiên cứu

Xây dựng quy trình nhân nhanh giống hoa cẩm chướng đơn (Dianthus Mix) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Tạo vật liệu khởi đầu in vitro từ đốt thân của cây cẩm chướng ngoài tự

nhiên

- Tái sinh và nhân nhanh cây hoa cẩm chướng thông qua phát triển chồi chính và chồi nách

- Tìm hiểu ảnh hưởng của nước dừa bổ sung vào môi trường nuôi cấy tới

một số chỉ tiêu sinh trưởng của cây cẩm chướng in vitro

- Ra rễ tạo cây con in vitro hoàn chỉnh

- Rèn luyện cây con ngoài vườn ươm

- Khảo sát sinh trưởng và phát triển của cây hoa cẩm chướng đơn giống

Mix được nhân bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

4.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu của đề tài góp phần bổ sung các qui trình nhân

giống các loại cây trồng bằng kĩ thuật in vitro

4.2.Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu của đề tài góp phần đưa ra qui trình nhân nhanh hoa cẩm chướng đơn Mix tạo ra nguồn giống cho sản xuất

NỘI DUNG Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CÂY HOA CẨM CHƯỚNG

1.1.1 Đặc điểm phân loại

Cây cẩm chướng (Dianthus carryophyllus) thuộc họ Cẩm chướng (Caryophyllaceae) có nguồn gốc từ Trung Quốc, Nhật Bản Họ Cẩm chướng

với khoảng từ 82 đến trên 120 chi với khoảng 3.000 loài [16] Họ này phổ biến rộng khắp thế giới này chủ yếu là cây thân thảo, đa dạng nhất tại khu vực

ôn đới, với một vài loài sinh sống trong miền núi tại khu vực nhiệt đới Một vài thành viên của họ được biết đến nhiều nhất có các loài cẩm chướng

(Dianthus), nhiều loài được trồng làm cây cảnh

1.1.2 Đặc điểm sinh học

a Đặc điểm hệ rễ cây hoa cẩm chướng: Cẩm chướng có bộ rễ chùm, phát triển rất mạnh vào vụ chính để hút nước, dinh dưỡng Chiều dài của rễ 15-20 cm Khi vun gốc, cây cẩm chướng sẽ ra rễ phụ ở các đốt thân Rễ phụ cùng với rễ chính tạo thành bộ rễ khoẻ mạnh để giữ cây và hút thức ăn nuôi cây tươi tốt, ra hoa nhiều, đẹp và thơm

b Đặc điểm thân cây hoa cẩm chướng: Thân thảo, nhỏ, mảnh mai, thân mang nhiều đốt và rất dễ gãy ở các đốt Thân cẩm chướng thường có màu xanh nhạt, bao phủ 1 lớp phấn trắng xung quanh có tác dụng quan trọng chống thoát hơi nước và bảo vệ cây khỏi bị sâu bệnh hại Trên mỗi đốt mang

lá và mầm nách

c Đặc điểm bộ lá cây hoa cẩm chướng: Lá kép, mọc từ các đốt thân Lá mọc đối, phiến lá dày, hình mũi mác, mép lá trơn Mặt lá nhẵn, không có độ

bóng Trên mặt lá có phủ một lớp phấn trắng, mỏng và mịn Lớp phấn trắng

có tác dụng làm giảm bốc hơi nước

d Đặc điểm hoa cây cẩm chướng: Cây cẩm chướng có 2 dạng: Hoa đơn

và hoa kép Hoa mọc đơn, từng chiếc một Hoa nằm ở đầu cành và mang nhiều màu sắc Ngay cả trên một hoa cẩm chướng kép cũng có từ 2 màu khác nhau trở lên Nụ hoa có đường kính 2-2,5 cm Hoa khi nở hoàn toàn có đường kính khoảng 5-8 cm Hạt cẩm chướng nhỏ, nằm trong quả Mỗi quả thường có

từ 100- 600 hạt

e Công dụng y học:

Hoa cẩm chướng còn được cho là có tác dụng chống nhiễm trùng, chống

co thắt, trợ tim, loàm thoát mồ hồi và bổ trợ thần kinh (Chopra et al, 1986) Ngoài ra, nụ hoa và hoa trị chứng khó tiêu, sinh nở khó, lợi tiểu Lá làm thuốc cho trẻ nhỏ chữa bệnh về ruột, các lá già nghiền ra chữa bệnh về mắt

1.1.3 Điều kiện sinh thái của cây hoa cẩm chướng [2]

- Đất trồng: Cẩm chướng ưa đất thịt nhẹ, tơi xốp, nhiều mùn, giàu dinh dưỡng, đất thoát khí, giữ ẩm tốt nhưng không ứ nước pH thích hợp từ 6-7, độ

ẩm 60-70%

- Nhiệt độ: Nhiệt độ thích hợp cho hoa cẩm chướng sinh trưởng và phát triển tốt là 18oC – 25oC Nếu nhiệt độ vượt qua ngưỡng thích hợp này, cây sẽ sinh trưởng và phát triển kém, cho hoa với chất lượng kém, màu sắc không tươi, tuổi thọ trung bình giảm…

- Ánh sáng: Ánh sáng thích hợp 1500-11000 lux, tối thích 2000-2500 lux Trong quá trình phân hoá mầm hoa, nếu cường độ ánh sáng cao > 11000 lux, cây sẽ có hoa sớm; nếu cường độ ánh sáng thấp < 1000 lux cây sẽ có hoa muộn

- Độ ẩm: Độ ẩm thích hợp 60-70 % , tối thích 70 % Độ ẩm tương đối của không khí và đất ảnh hưởng trực tiếp đến sự quang hợp và hô hấp của cây

cẩm chướng Nếu độ ẩm được ổn định sẽ tạo điều kiện cho cây hút dinh dưỡng và muối khoáng thuận lợi, cây sinh trưởng tốt, năng suất và phẩm chất hoa cao

- Dinh dưỡng: Nếu thiếu dinh dưỡng cây sẽ còi cọc, hoa nhỏ và sâu bệnh hại dễ xâm nhập và phát triển Nếu bón phân không cân đối, thừa dinh dưỡng đạm, cây phát triển vóng cao, dễ bị lốp đổ và khả năng chống chịu kém + Đạm: Có tác dụng thúc đẩy quá trình sinh trưởng và phát triển của cây, tham gia vào cấu tạo diệp lục Thiếu đạm cây sinh trưởng kém, cho hoa nhỏ, nhanh tàn, lá vàng úa, nếu thiếu trầm trọng cây sẽ ngừng sinh trưởng và chết Tuy nhiên, thừa đạm cây sẽ mọc um tùm, lá nhiều và yếu ớt dễ phát sinh bệnh Hoa cũng yếu dễ bị gục ngã và nhanh tàn

+ Lân: Giúp cho bộ rễ cây phát triển khoẻ mạnh là tiền đề cho quá trình sinh trưởng và phát triển của cây sau này Lân giúp cho hoa bền, đẹp Thiếu lân lá thường có màu tím, màu tím từ mép lá lan dần vào bên trong Hoa nhỏ, chóng tàn, màu sắc nhợt nhạt Trong quá trình sinh trưởng của cây, cây cần lân nhiều vào giai đoạn sinh trưởng sinh thực tức là khi ra hoa kết quả Vì vậy, cần phải hiểu nhu cầu của cây để cung cấp lân vào các giai đoạn hợp lý + Kali: Giúp cho cây cứng cáp, chống chịu tốt với điều kiện bất lợi của môi trường và sâu bệnh hại Cây cần kali nhiều vào lúc ra hoa, giúp cành hoa cứng cáp, màu sắc hoa tươi, bền lâu Nếu thiếu kali thì đầu chóp lá già, bắt đầu vàng và chết khô, sau đó là phần thịt lá

+ Canxi: Giúp cho cây chống chịu tốt với điều kiện bất lợi Thiếu canxi trên lá non xuất hiện những đốm màu xanh nhạt, nghiêm trọng hơn là bị chết khô

1.2 GIÁ TRỊ KINH TẾ CỦA NGÀNH SẢN XUẤT HOA TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM

1.2.1 Sản xuất hoa trên thế giới

Ngành trồng hoa được bắt đầu từ những năm 1800 ở nước Anh khi mà cây hoa được trồng trên những cánh đồng mênh mông [39] Ngày nay, ngành trồng hoa là một trong những ngành công nghiệp chính ở cả nước đang và đã phát triển Sản xuất của ngành trồng hoa trên thế giới tăng nhanh với tốc độ 10% trên năm Hiện này có trên 50 quốc gia đã chủ động sản xuất hoa ở quy

mô công nghiệp Tổng diện tích của ngành trồng hoa trên thế giới (tính cả diện tích được bảo vệ và diện tích không được bảo vệ) khoảng 628.972 ha Trong số các nước trồng và sản xuất hoa, Hà Lan, Mỹ, Nhật Bản, Italia, Đức

và Canada là những nước sản xuất hoa lớn nhất thế giới, đặc biệt là hoa cắt cành Một số nước đang phát triển ngành trồng hoa (gồm cả trồng và xuất khẩu) như Columbia, Hàn Quốc, Kenya, Itxaren, Ecuado, Ba Lan, Etiopia, Costarica, Thái Lan, Ấn Độ, Trung Quốc, Zimbabue và Mexia Trung Quốc với 286.068 ha, Ấn Độ với 161.000 ha đang là hai nước có diện tích trồng hoa cắt cành chủ yếu trên thế giới, Vùng Châu Á-Thái Bình Dương chiếm khoảng 75% tổng diện tích trồng hoa của thế giới [32]

Châu Âu, Mỹ và Nhật Bản là những nước tiêu thụ hoa lớn nhất Các siêu thị tiêu thụ hoa ở các nước lớn lần lượt là Đức (22%), Mỹ (15%), Pháp (10%), Anh (10%), Hà Lan (9%), Nhật Bản (6%), Thụy Sĩ (5%) và Italia (5%) Trong trường hợp hoa cắt cành, tính trên khả năng tiêu dùng thì Nhật Bản là quốc gia sử dụng nhiều hoa nhất thế giới, sau đó là Châu Âu và Mỹ Cả Liên minh Châu Âu tiêu thụ trên 50% lượng hoa của thế giới, trong đó Đức là quốc gia đóng vai trò chủ yếu, sau đó là Anh, Pháp và Italia [12]

Mức thương mại toàn cầu hàng năm được công bố vào khoảng trên 100

tỷ đô la Trong đó hoa cắt cành chiếm phần lớn lợi nhuận, sau đó là hoa trồng

chậu, cây giống, củ hoa… Ở các nước phát triển của Châu Âu, Châu Mỹ và Châu Á chiếm trên 90% sản lượng thương mại của ngành trồng hoa Đức là quốc gia nhập khẩu chủ yếu trong khi đó Hà Lan là nước xuất khẩu hoa chủ yếu, sau đó là Colombia, Italia, Itxaren Các nước Châu Á-Thái Bình Dương

là những nước cung cấp hoa chủ yếu cho Nhật Bản và Hồng Kông

Sản phẩm xuất khẩu của ngành trồng hoa tính cả thế giới vào khoảng 17

tỷ đô la (2007) Hoa cắt cành tươi và hoa trang trí (bằng bộ lá) ước tính chiếm khoảng 49,1% (khoảng 8,31 tỷ đô la), thực vật tươi, củ và cành giâm chiếm khoảng 50,9% (khoảng 8,60 tỷ đô la) vào năm 2007 Trong đó, hoa hồng chiếm khoảng 70% sản lượng hoa thương mại Hà Lan là nước có ngành công nghiệp hoa phát triển vào bậc nhất thế giới, ước tính sản lượng thương mại của ngành trồng hoa nước này vào khoảng 49,6% (tương đương 8,56 tỷ đô la) tổng giá trị của ngành hoa xuất khẩu của thế giới năm 2007 Colombia là nước xuất khẩu hoa lớn thứ hai trên thế giới, chiếm khoảng 6,5% (tương đương 1,12 tỷ đô la) Đức là nước nhập khẩu hoa lớn nhất trên thế giới khoảng 2,59 tỷ đô la, sau đó là Anh (1,89 tỷ đô la), Mỹ (1,81 tỷ đô la), Hà Lan vừa là nước sản xuất vừa là nước nhập khẩu hoa, hàng năm Hà Lan nhập khoảng 1,55 tỷ đô la, Pháp nhập khoảng 1,43 tỷ đô la [32] Trong số các sản phẩm của ngành trồng hoa được các nước nhập khẩu thì hoa hồng là loại hoa chủ yếu được nhập khẩu bởi các nước Châu Âu, ngoài ra còn nhập khẩu các loại hoa mùa hè, hoa vùng nhiệt đới và hoa lan Nhật Bản là một nước nhập khẩu hoa lớn nhất ở vùng Châu Á-Thái Bình Dương

1.2.2 Sản xuất hoa ở Việt Nam

Thực trạng của ngành sản xuất hoa và cây cảnh ở Việt Nam

Hoa tươi xuất khẩu của các nước Đông Nam Á nói chung và Việt Nam nói riêng khó có thể thâm nhập vào thị trường khu vực Bắc Mỹ hoặc Trung

Âu vì các thị trường này đã có truyền thống nhập khẩu hoa tươi từ các khu

vực khác như vùng Nam Mỹ và Trung Mỹ, các nước Nam Âu, Itxaren và Châu Phi Những thị trường này cũng khá xa về khoảng cách địa lý nên chi phí vận chuyển sẽ không phải là lợi thế Các yếu tố liên quan đến việc đạt được những mục tiêu trung hạn này chỉ có thể là giá cả và các dịch vụ khách hàng

Đối với xuất khẩu hoa, mục tiêu ngắn hạn là phát triển sang các nước Châu Á như Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan, Singapore Những thuận lợi khi bán hàng cho những nước này chính là vị trí địa lý gần, các yêu cầu vận chuyển và chi phí cho việc bảo quản sau khi thu hoạch thấp và sự liên hệ để tìm khách hàng thường có thể dựa vào các mối quan hệ kinh doanh hiện tại Thị trường trong nước rộng lớn và phong phú, bên cạnh đó tiềm năng xuất khẩu cũng đầy hứa hẹn, hoa và cây cảnh Việt Nam nếu được tổ chức tốt

từ khâu sản xuất, quảng bá đến tiêu thụ sẽ tạo tiềm lực kinh tế lớn cho ngành sản xuất nông nghiệp Việt Nam trong tiến trình chuyển đổi cơ cấu cây trồng Với khí hậu và thổ nhưỡng thuận lợi để có thể trồng được nhiều loại hoa

và cây cảnh, hiện Việt Nam đang sở hữu một nguồn tài nguyên hoa rất đa dạng, từ các loại hoa xứ nhiệt đới được trồng ở các vùng đồng bằng đến hoa

xứ lạnh trồng trên các cao nguyên như Lâm Đồng, Pleiku và vùng núi như Sapa, Hoàng Liên Sơn Sự phát triển của ngành hoa Việt Nam trong thời gian qua đã mang lại cho các sản phẩm hoa của Việt Nam sự đa dạng và chất lượng vượt bậc so với thời gian trước

Phương hướng phát triển sản xuất và xuất khẩu hoa tươi thời kỳ đến

Dự kiến đến năm 2015 vùng hoa TP Hồ Chí Minh có 1500 ha, diện tích tập trung chính ở các huyện Củ Chi, Thủ Đức; diện tích hoa được trồng theo quy trình công nghệ cao chiếm tỷ lệ lớn (khoảng 60-70% diện tích)

Vùng Đông Nam Bộ: Dự kiến đến năm 2015 vùng hoa Lâm Đồng 3000

ha, diện tích tập trung chính ở TP Đà Lạt (chiếm 1/3 diện tích toàn tỉnh); chủ yếu hoa ôn đới được trồng theo quy trình công nghệ cao

Vùng Tây Nguyên: Dự kiến đến năm 2015 vùng hoa hàng hoá tập trung

ở Vùng Trung du Miền núi Bắc bộ có khoảng 500 ha, tập trung chính ở Lào Cai, Hà Giang, Sơn La

Vùng Trung du Miền núi Bắc bộ: Dự kiến đến năm 2015 Hà Nội có

3000 ha, diện tích tập trung chính ở huyện Từ Liêm (Tây Tựu), Đông Anh, Quận Tây Hồ, Mê Linh v.v

Sản xuất của ngành hoa ở Việt Nam

Đà Lạt là vùng sản xuất hoa nổi tiếng và là vùng có tiềm năng lớn nhất

về sản xuất hoa của cả nước Hiện nay công ty TNHH Đà Lạt - Hasfarm 100% vốn nước ngoài đang áp dụng công nghệ sản xuất hoa tiên tiến với qui

mô diện tích 15 ha sản xuất trong nhà kính và 2 ha nhà thép; có hệ thống tự động điều chỉnh nhiệt độ, ẩm độ, hệ thống tưới nhỏ giọt bằng nguồn nước sạch hòa tan với phân bón, thuốc bảo vệ thực vật Các chủng loại hoa Công ty

Đà Lạt - Hasfarm đang sản xuất bao gồm hoa hồng, cúc, cẩm chướng, ly ly, đồng tiền và lá hoa trang trí Sản lượng hoa xuất khẩu sang các nước Hồng Kông, Nhật, Đài Loan, Singapore chiếm 55%, phần còn lại dành cho tiêu thụ nội địa

Hiện nay, sản xuất hoa ở nước ta được thực hiện bởi 2 đối tượng chính: Nông dân sản xuất tự phát theo xu hướng nhu cầu thị trường trong nước và bởi các doanh nghiệp tư nhân trong nước, liên doanh với nước ngoài hoặc 100% vốn nước ngoài sản xuất hoa chủ yếu cho xuất khẩu Hoa tiêu thụ trong

nước chủng loại đa dạng và cung cấp ra thị trường theo mùa vụ, chất lượng từ thấp đến cao, giá cả vừa phải, hiệu quả kinh tế không cao, sản xuất nhỏ lẻ và thiếu ổn định Các doanh nghiệp sản xuất hoa xuất khẩu lượng hoa nhiều hơn mang tính hàng hoá, chất lượng hoa cao hơn và được sản xuất trong điều kiện

kỹ thuật cao, sản phẩm được tiêu thụ theo hợp đồng Hiện nay, Việt Nam đã xuất khẩu được các sản phẩm hoa cắt cành như hồng, phong lan, cúc, đồng tiền, cẩm chướng, ly ly, sao tím sang Trung Quốc, Hồng Kông, Đài Loan, Nhật bản, Singapore Australia, Ả rập; vạn niên thanh, mai chiếu thủy, mai cảnh sang Trung Quốc, Hoa Kỳ, Nhật Bản Tuy nhiên, số lượng xuất khẩu không nhiều, với doanh thu hơn 10 triệu USD/năm Sở dĩ, sản phẩm hoa, cây cảnh của Việt Nam khó thâm nhập thị trường thế giới là do chủng loại, chất lượng, kích cỡ không đồng đều, chưa đáp ứng được thị hiếu của khách hàng quốc tế Trong khi đó, tiêu thụ trong nước lại có xu hướng chạy theo mùa vụ (rằm, lễ, Tết, các ngày kỷ niệm) là chính

Sản xuất và xuất khẩu hoa tươi đòi hỏi phải có những điều kiện chặt chẽ từ giống, gieo trồng, chăm sóc…đến thu hoạch, công nghệ bảo quản, đóng gói, vận chuyển, an toàn thực phẩm và thâm nhập vào các kênh phân phối của thị trường nhập khẩu Trong điều kiện hiện nay, ít có doanh nghiệp Việt Nam có thể đáp ứng được các yêu cầu này Vì vậy, trước mắt cần tập trung phát triển một số loại hoa Việt Nam có tiềm năng xuất khẩu và tương đối dễ đáp ứng yêu cầu của đối tác nước ngoài

Về ứng dụng công nghệ cao: Đã được cải thiện đáng kể, như thay đổi cơ cấu giống, nuôi cấy mô, kỹ thuật canh tác và bảo vệ thực vật tiên tiến; áp dụng công nghệ nhà lưới có mái che sáng Tuy nhiên, sự thay đổi này diễn ra không đồng đều giữa các vùng sản xuất vì nhiều lý do (khí hậu thời tiết, trình

độ thâm canh, khả năng đầu tư, khả năng tiếp cận kỹ thuật tiến bộ và thị

trường…) Đà Lạt có thể coi là địa bàn có tiến bộ nhanh nhất trong cả nước về phát triển sản xuất hoa cắt cành

Kỹ thuật trồng hoa: Ở nhiều nơi vẫn chủ yếu dựa vào kinh nghiệm và phương pháp nhân giống cổ truyền như gieo từ hạt, trồng từ củ, mầm, nhánh Các phương pháp này dễ trồng, giá thành cây giống thấp nhưng chất lượng giống không cao, dễ bị thoái hóa, làm giảm chất lượng hoa vì vậy tuy chủng loại hoa của Việt Nam khá phong phú nhưng thiếu giống hoa đẹp, chất lượng cao

Về quy mô và tổ chức sản xuất: Hầu hết những cơ sở sản xuất hoa cắt cành ở nước ta còn ở quy mô nông hộ nhỏ, tổ chức sản xuất đơn lẻ, với diện tích trung bình từ 2.000 đến 3.000 m2/hộ Hộ sản xuất hoa lớn cũng chỉ từ 1 đến 2 ha Ở quy mô sản xuất này không thể áp dụng những kỹ thuật tiến bộ như nhà kính, nhà lưới, sân bãi, mặt bằng, dây chuyền chế biến, bảo quản vận chuyển lạnh…để đưa ngành sản xuất hoa trở thành sản xuất công nghiệp Từng hộ nông dân sản xuất cá lẻ, thiếu hợp tác là trở ngại lớn cho việc tạo nguồn hàng hóa lớn và đa dạng với chất lượng cao, đồng nhất Trên thực tế,

đã có nhiều hợp đồng xuất khẩu không thể thực hiện được do không thể tổ chức cung cấp sản phẩm theo yêu cầu, trong khi tiềm năng sản xuất là rất lớn [38]

1.3 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT TRONG NHÂN GIỐNG CÂY HOA CẢNH

Sản xuất thương mại các loại cây trang trí (cây cảnh, cây hoa…) đang phát triển trên thế giới Đây là một ngành mang lại lợi nhuận cao và không ngừng phát triển trong hai thập kỉ qua, hứa hẹn là một ngành công nghiệp tiềm năng trong tương lai [18] Quá trình nhân giống và cải tiến chất lượng sản phẩm cây cảnh chẳng hạn như kiểu lá, màu hoa, mùi hương, độ bền của sản phẩm đang là những mục tiêu quan trọng của ngành công nghiệp này

Nuôi cấy mô và tế bào đã có những đóng góp quan trọng để cải tiến giống cây trồng và còn nhiều tiềm năng ứng dụng trong tương lai Trong một vài năm gần đây, vi nhân giống đã trở thành một kỹ thuật đầy hứa hẹn để nhân nhanh và mở rộng sản xuất của những đối tượng thực vật được con người chọn lựa Vi nhân giống thực tế là phiên bản thu nhỏ của nhân dòng được thực hiện trong điều kiện vô trùng Kỹ thuật vi nhân giống được thực hiện dựa trên khái niệm về tính toàn năng của tế bào được nhà khoa học Harberlandt đưa ra Mỗi tế bào của cơ thể thực vật đều có tính toàn năng, chẳng hạn như khả năng phát triển thành cây mới dưới điều kiện nuôi cấy cụ thể

Nền công nghiệp cây cảnh đã được ứng dụng rất nhiều phương pháp

nhân giống in vitro nhằm mở rộng quá trình nhân giống ở quy mô công

nghiệp Tính đến nay, đã có rất nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật được hình thành, đặc biệt là ở các nước đang phát triển, nơi có nhân công rẻ

Các quy trình vi nhân giống đã được phát triển trên nhiều đối tượng cây cảnh, chẳng hạn như cây hoa lay ơn [10], [15], hoa hồng [30], [37], hoa cúc [33], [35], hoa cẩm chướng [21], [26] và cây hoa lan [7], [13]

Quá trình vi nhân giống là một quá trình phức tạp, được phân chia thành

ba nhóm phương pháp chính:

1/ Nhân giống bằng chồi chính hoặc chồi bên

2/ Nhân giống bằng cách phát sinh chồi bất định

3/ Quá trình phát sinh phôi sôma

Hai phương pháp nhân giống đầu tiên có cây con được hình thành thông quá trình phát sinh cơ quan: Các chồi đơn cực được hình thành (cực chồi), sau

đó các chồi này được chuyển sang môi trường ra rễ để hình thành nên cực còn lại (cực rễ) Ngược lại, quá trình phát sinh phôi sôma dẫn đến sự hình thành

phôi lưỡng cực thông qua một số bước tương tự như quá trình phát triển của phôi hữu tính Tất cả các phương pháp này được sử dụng để sản xuất cây cảnh

trong điều kiện in vitro

1.3.1 Nhân giống bằng chồi chính hoặc chồi bên

Chồi chính và chồi bên ở trạng thái nghỉ hoặc trạng thái hoạt động, tùy thuộc vào trạng thái sinh lý của mẫu Vi nhân giống thông qua hình thành chồi chính hoặc chồi bên là một trong những kỹ thuật tốt nhất để nhân nhanh giống cây trồng bởi vì sự ổn định di truyền của các dòng được nhân ra Một đỉnh chồi và một chồi bên khi được sinh trưởng trong điều kiện có nồng độ cytokinin cao thường phát triển chồi bên tạo thành cụm chồi, từ đó có thể được nhân lên thành các cụm chồi theo cách tương tự Quá trình nhân lên này

có thể là vô hạn, từ đó có hàng triệu cây giống có thể được nhân lên từ một chồi chính hoặc chồi bên Phương pháp này có độ di truyền ổn định cao bởi vì các tế bào của mô phân sinh đồng nhất lưỡng bội, các tế bào có độ đồng đều cao Hệ số nhân giống bằng kỹ thuật này khác nhau, tùy thuộc vào kiểu gen

và lượng cytokinin sử dụng Theo tác giả Udom và cộng sự (2009), hệ số nhân chồi từ đoạn thân trưởng thành của cây hoa hồng lai Rosa hybrida trên môi trường bổ sung BAP (13,2 µM) kết hợp với NAA (0,022 µM) cho tỷ lệ hình thành số chồi trên mẫu là cao nhất [34] Còn tác giả Waseem và cộng sự

(2009) đưa ra quy trình nhân giống in vitro cây hoa cúc từ đỉnh chồi trên môi

trường bổ sung IAA với nồng độ 0,48 µM cho tỷ lệ hình thành chồi cao nhất (86,6%) [35] Sự hình thành đa chồi cũng được nghiên cứu trên đối tượng hoa hồng Rosa rugosa từ đốt thân trên môi trường MS có bổ sung BAP (2,2 µM) + NAA (0,054 µM) + GA3 (2,0 µM) với lượng đường sacarozơ 3% [37] Tác giả Haouala và cộng sự (2012) đã phát triển một quy trình để nhân giống in vitro cây hoa lay ơn từ chồi đỉnh trên môi trường MS có bổ sung IBA (2,46 µM) và BAP (9,84 µM) [15] Trên đối tượng cây hoa cúc, tác giả Nalini

(2012) đưa ra kết luận sự hình thành chồi từ chồi đỉnh trên môi trường MS có

bổ sung Kinetin (13,85 µM) và IAA (9,6 µM) [29] Tác giả Shirdel và cộng

sự (2013) thông báo quá trình nhân dòng cây hoa hồng Rosa canina từ chồi bên trên môi trường MS có bổ sung BAP (26,4 µM) là phù hợp nhất [30]

1.3.2 Nhân giống bằng chồi bất định

Có rất nhiều loại cây cảnh đã được nhân giống in vitro thành công bằng

việc hình thành các chồi bất định Các chồi bất có thể được:

- Phát triển trực tiếp từ các loại mẫu như rễ, thân, cuống lá, phiến lá và các bộ phận của hoa

- Phát triển gián tiếp từ mô sẹo callus thu được từ các nguồn mẫu thực vật

Việc lựa chọn loại mẫu và hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng thực vật

là hai nhân tố quan trọng nhất trong quá trình phát sinh chồi bất định

Phát triển trực tiếp từ nguồn mẫu thực vật: Theo nghiên cứu của nhóm tác giả Kantia và cộng sự (2002) đã đưa ra một quy trình phát sinh chồi bất

định có hiệu quả cao từ lá cây hoa cẩm chướng Dianthus chinensis được nuôi

cấy trên môi trường MS có bổ sung BAP (13,2 µM) kết hợp với NAA (7,35 µM) [19] Tác giả Martin và cộng sự (2003) đã tái sinh trực tiếp chồi từ phiến

lá của hai giống hoa hồng môn (Anthurium andraeanum) cắt cành, hiệu quả

tái sinh chồi cao nhất là 67% từ lá với hệ số đạt 7 chồi/mẫu [27] Nhóm nghiên cứu của tác giả Chen và cộng sự (2004) cũng phát triển một quy trình

nhân giống hiệu suất tái sinh trực tiếp chồi từ lá của cây lan Paphiopedilum

Ba công thức nghiên cứu (2,4-D 4,52 µM; TDZ 22,71 µM và 2,4-D (4,52 µM) kết hợp TDZ (4,54 µM)) đã cho số chồi trung bình/mẫu cao từ mẫu lá [7] Nhóm nghiên cứu Waseem và cộng sự (2009) đã chứng minh ảnh hưởng của các loại auxin đến khả năng tái sinh chồi bất định trực tiếp từ mảnh lá của cây hoa cúc [35] Quá trình phát sinh cơ quan đã được thực nghiệm trên một

số loại cây cảnh, ví dụ các tế bào sôma của cây thuốc lá cảnh [8], cây san hô

xanh (Euphorbia tirucalli) [14], cây Hygrophila polysperma [22]

- Phát triển gián tiếp thông qua mô callus

Tác giả Kantia và Kithari (2002) đã nghiên cứu quá trình hình thành chồi bất định trên môi trường MS có bổ sung BAP (2,2 µM) và 2,4-D (4,87 µM) từ

mô sẹo callus được hình thành nhiều trên bề mặt lá của loài cẩm chướng

Dianthus chinesis [19] Nhóm nghiên cứu Smaranda (2005) đã thực hiện quá

trình vi nhân giống gián tiếp của cây hoa cúc thông quá nuôi cấy callus thu được từ các đốt thân [31] Kaviani và cộng sự (2011) đã hoàn chỉnh một quy trình cảm ứng hình thành callus và hình thành chồi và rễ từ mẫu lá ở cây

Matthiola incana [23]

- Phát sinh phôi sôma

Sự hình thành cấu trúc lưỡng cực chứa cả mô phân sinh chồi và mô phân sinh rễ tương tự như quá trình phát triển phôi hữu tính (được hình thành từ hợp tử) Các thể phôi này có thể phát triển thành thực vật đủ chức năng dưới

điều kiện thích hợp

Theo nhóm nghiên cứu Tanaka (2004), sự phát sinh phôi sôma cao nhất

từ mẫu lá của cây hoa cúc (Dendranthema grandiflorum) trên môi trường MS

có chứa IAA (57,08 mM) + kinetin (0,465 mM) [33] Phôi được phát sinh trên môi trường không chứa kinetin Tác giả Kumar và cộng sự (2002) đã thông báo rằng sốc nhiệt cảm ứng quá trình phát sinh phôi sôma ở mô sẹo callus được nuôi cấy và tái sinh cây từ callus nuôi cấy ở một số loài Tricyrtis [25] Tác giả Datta và cộng sự (2001) đã phát sinh trực tiếp phôi sôma từ mẫu là các cánh hoa hình tia ở chi hoa cúc trên môi trường MS có bổ sung 2,4 - D và BAP [9]

1.4 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT TRONG NHÂN GIỐNG CÂY HOA CẨM CHƯỚNG

Nhóm nghiên cứu Brar và cộng sự (1996) đã nghiên cứu ảnh hưởng của TDZ và BAP đến quá trình tạo đa chồi từ chồi bên ở các giống cẩm chướng

khác nhau (Dianthus caryophyllus) [6] Số chồi được tạo ra phụ thuộc vào

bản chất và nồng độ của cytokinin được sử dụng Giống cẩm chướng Barlo II Nora có số chồi cao nhất trên môi trường MS bổ sung BAP nồng độ 8,8 µM BAP Với kết quả tương tự, nhóm nghiên cứu của tác giả Ali và cộng sự (2008) cho rằng môi trường MS bổ sung BAP 4,4 µM có hiệu quả tạo đa chồi lớn nhất từ nguồn mẫu là mô phân sinh đỉnh chồi sau 7 ngày nuôi cấy [3] Nhóm nghiên cứu của Kharrazi và cộng sự (2011) đã đánh giá ảnh hưởng các chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến quá trình tạo đa chồi từ chồi bên ở cây hoa cẩm chướng, kết quả là trên môi trường có bổ sung BAP 4,4 µM + NAA 1,47 µM cho số chồi/mẫu cao nhất, đạt 5 chồi/mẫu [24]

Theo nghiên cứu của nhóm tác giả Altvorst và cộng sự (1992) đã hoàn

chỉnh quy trình phát sinh chồi bất định từ mẫu lá in vitro của cây hoa cẩm

chướng Số chồi bất định cao nhất trên môi trường chứa BAP 4,4 µM và NAA 2,205 µM [4] Tác giả Watad và cộng sự (1996) đã đưa ra phương pháp tái sinh cây cẩm chướng hoàn chỉnh trên môi trường có bổ sung TDZ (4 mg/l)

và NAA (7,35 µM) [36] Nhóm nghiên cứu Arici và cộng sự (2009) đã phát

triển một quy trình để vi nhân giống in vitro cây hoa cẩm chướng, hệ số tái

sinh chồi tốt nhất trên môi trường có bổ sung BAP 4,4 µM và NAA 0,36 µM [5]

Kanwar và Kumar (2009) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các loại chất điều hòa sinh trưởng thực vật, nguồn mẫu và tương tác giữa chúng lên quá

trình hình thành chồi in vitro từ callus của cây hoa cẩm chướng, đã có trên 27

loại môi trường nuôi cấy đã được nghiên cứu, chỉ môi trường chứa riêng lẻ

TDZ 2 mg/l và zeatin hoặc kết hợp giữa TDZ hoặc zeatin với NAA với sự có mặt của IAA mới có khả năng biệt hóa các cụm callus, trong đó, môi trường

có bổ sung TDZ 2 mg/l kết hợp IAA 4,8 µM cho hệ số tái sinh chồi cao nhất

từ mô sẹo callus [20]

Một quy trình hiệu quả đã được phát triển và hoàn thiện để tái sinh cây hoàn chỉnh thông qua phát sinh phôi sôma ở cây hoa cẩm chương từ nụ hoa

đã cảm ứng thành callus [26] Năm 2006, tác giả Karami và cộng sự đã nghiên cứu một phương pháp hiệu quả để phát sinh phôi sôma ở cây hoa cẩm

chướng và nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ đường saccarozơ đến quá trình

này Tỷ lệ cao nhất phát sinh phôi sôma là môi trường có bổ sung đường saccarozơ ở 9% và 12% có bổ sung 2,4-D 9 µM và BAP 0,8 µM [21] Tác giả Iantcheva và cộng sự (2008) đã công bố quá trình phát sinh phôi sôma từ mẫu

lá của cây hoa cẩm chướng Phôi sôma khỏe thu được trên môi trường hình

thành phôi có bổ sung BAP 2,2 µM và casein hydrolysate 250mg/l ở cây hoa

cẩm chướng [17] Kết quả tương tự vậy, tác giả Frey và cộng sự (1991) đã phát triển quy trình tối ưu để cảm ứng quá trình phát sinh phôi sôma từ callus trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3,0 µM [11]

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1 Mẫu vật

Hoa cẩm chướng đơn Mix (Dianthus carryophyllus) được chọn làm vật

liệu thí nghiệm và do Phòng Sinh lý thực vật (Khoa Sinh-KTNN, ĐHSPHN 2) cung cấp

2.1.2 Thời gian và địa điểm thực hiện

Đề tài nghiên cứu được thực hiện tại Phòng Sinh lý thực vật trường ĐHSPHN 2 từ tháng 11-2013 đến tháng 9-2014

2.1.3 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm

2.1.3.1 Thiết bị

Bảng 2.1: Danh mục thiết bị thí nghiệm

Tên thiết bị Hãng sản xuất

Cân kĩ thuật GM612, Đức

Máy đo pH HM30G/TOA, Đức

Nồi hấp khử trùng HV – 110/HIRAYAMA, Nhật

Tủ lạnh Hitachi 31AG5D, Thái lan

Máy cất nước hai lần Trung Quốc

Buồng cấy vô trùng AV – 110/TELSTAR

Máy khuấy từ gia nhiệt ARE/VELP, Italia

2.1.4 Môi trường nuôi cấy

Các nghiên cứu in vitro thường sử dụng môi trường nuôi cấy cơ bản

(Murashige và Skoog, 1962) MS + 30g saccarozơ+ 7,5 g agar + các chất điều hòa sinh trưởng

Môi trường thạch được đựng trong bình thủy tinh hoặc túi nilon

pH môi trường: 5,8

Môi trường được khử trùng trong nồi vô trùng ở 117o

C với thời gian 15 phút

2.1.5: Điều kiện nuôi cấy

Toàn bộ các thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện nhân tạo

Ngoài tủ cấy vô trùng:

Từ đoạn thân cây hoa, cắt thành đoạn 3-4 cm bao gồm cả chồi nách Sau

đó, lau sạch bằng cồn, rửa bằng nước rửa bát, cho chảy dưới vòi nước sạch

Trong tủ cấy vô trùng:

+ Chuẩn bị: nước cất, bình đựng, Fancol 50ml, giấy thấm đã khử trùng + Làm sạch mẫu: Rửa lại bằng nước cất, lắc cồn 70o trong 2 phút khử trùng sơ bộ Sau đó rửa lại từ 3-5 lần bằng nước cất vô trùng và đặt lên môi trường MS đựng sẵn trong bình tam giác

2.2.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm 1: Giai đoạn vật liệu khởi đầu

- Mục đích: Tạo được mẫu sạch in vitro

- Mẫu vật: Cây cẩm chướng chăm sóc , sàng lọc ở trong Phòng Sinh lý thực vật (ĐHSPHN 2) cao khoảng 15-20 cm, sau đó cắt những đoạn thân dài 3-5 cm

- Phương pháp tiến hành: Theo các công thức bảng 2.2

- Môi trường nuôi cấy: MS + 3% sacarozơ + 7,5 g agar, pH 5,8

- Bố trí thí nghiệm: Các thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại được thực hiện ở các công thức trong bảng 2.2

Bảng 2.2: Các công thức thí nghiệm xác đinh hiệu quả của chất khử

- Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ mẫu sạch , tỷ lệ mẫu nhiễm, tỷ lệ mẫu sống ,

tỷ lệ mẫu chết sau 7 ngày theo dõi

+ Tỷ lệ mẫu sạch (mẫu vô trùng):

ô

+ Tỷ lệ mẫu nhiễm:

+ Tỷ lệ mẫu vô trùng nhưng chết:

Thí nghiệm 2: Giai đoạn tái sinh và nhân nhanh cẩm chướng thông qua sự phát triển của chồi chính và chồi nách

- Mục đích: Tìm ra nồng độ BAP thích hợp cho sự phát triển chồi ngủ

- Mẫu vật: Vật liệu khởi đầu đã có sẵn

- Phương pháp tiến hành: Từ vật liệu khởi đầu cắt những đoạn dài khoảng 1-2 cm, nuôi cấy trên môi trường nghiên cứu theo bảng 2.3

- Môi trường: MS cơ bản( 3% sacarozơ+ 7,5 g agar, pH5,8) bổ sung BAP có nồng độ thay đổi 0,5; 1,0; 1,5 và 2,0 mg.L-1 Điều kiện chiếu sáng

2000 lux, chu kỳ 12 giờ/ngày, độ ẩm 70%

Thí nghiệm được tiến hành ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại, yếu tố ngoại cảnh gần như tương đối theo các công thức trong bảng 2.3

Bảng 2.3: Các công thức nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến sự tái