GÓP PHẦN NGHIÊN cứu lên MEN TỔNG hợp KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 173 113

... hóa học để nâng cao khả sinh tổng hợp kháng sinh chủng xạ khuẩn 2.2.2 Lên men, chiết tách kháng sinh - Từ MT lên men bề mặt tốt nhất, chọn MT lên men chìm tốt - Thực lên men từ dạng chủng biến... lần tác nhân hoá học hoạt tính kháng sinh Streptomyces 173. 113 tăng lên đáng kể  Kháng sinh Streptomyces 173. 113 sinh tổng hợp có số đặc điểm sau:  Là kháng sinh có phổ tác dụng rộng, vi khuẩn... bình lên men + Lên men liên tục: Thiết bị cấu tạo đặc biệt cho VSV phát triển đến giai đoạn thích hợp lấy thể tích dịch lên men bổ sung thêm MT vào bình + Lên men bán liên tục: trình lên men,

GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ

STREPTOMYCES 173.113

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SI

HÀ NỘI - 2012

Chương 1 : TỔNG QUAN 2

1.1 Đại cương về kháng sinh 2

1.1.1 Lược sử nghiên cứu kháng sinh 2

1.1.2 Định nghĩa kháng sinh 2

1.1.3 Phân loại kháng sinh 3

1.1.4 Cơ chế tác dụng của kháng sinh 3

1.1.5 Các ứng dụng của kháng sinh 4

1.2 Đại cương về xạ khuẩn 4

1.2.1 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn 4

1.2.2 Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces 5

1.3 Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh (Hình 6) 7

1.4 Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn 8

1.4.1 Mục đích 8

1.4.2 Chọn chủng có HTKS cao bằng phép chọn lọc ngẫu nhiên 8

1.4.3Đột biến cải tạo giống 8

1.4.4 Bảo quản giống xạ khuẩn 9

1.5 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 9

1.5.1 Khái niệm lên men 9

1.5.2 Các phương pháp lên men 10

1.5.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men 11

1.6 Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men 11

1.6.1 Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh 11

1.6.2 Các phương pháp chiết tách 12

1.7 Bước đầu nghiên cứu cấu trúc kháng 12

1.7.1 Phổ tử ngoại - khả kiến 12

1.7.2 Phổ hồng ngoại 13

1.7.3 Khối phổ (MS) 13

1.8 Một số nghiên cứu liên quan 13

1.8.1 Sản xuất 4,5-epoxy–8-demethylgeldanamycin có tác dụng điều trị ung thư vú từ Streptomyces hygroscopicus [18] 13

1.8.2 Nghiên cứu hoạt chất có tác dụng ức chế enzym lipoxygenase từ Streptomyces sp.[19] 14

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị 15

2.1.1 Nguyên vật liệu 15

2.1.2 Máy móc thiết bị 16

2.3 Phương pháp thực nghiệm 18

2.3.1 Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn 18

2.3.2 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán 18

2.3.3 Sàng lọc ngẫu nhiên 19

2.3.4 Phương pháp đột biến 19

2.3.5 Lên men chìm tổng hợp kháng sinh 21

2.3.6 Xác định độ bền của kháng sinh trong dịch lọc 22

2.3.7 Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ 22

2.3.8 Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng 22

2.3.9 Thu kháng sinh thô bằng cất quay chân không 23

2.3.10 Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột 23

2.3.11 Sơ bộ xác định kháng sinh tinh khiết thu được 24

Chương 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT 24

3.1 Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên 24

3.2 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 1 25

3.3 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2 26

3.4 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 3 27

3.5 Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh 28

3.6 Kết quả chọn chủng lên men 29

3.7 Kết quả thử độ bền pH 30

3.8 Kết quả chọn dung môi và pH chiết 30

3.9 Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi 31

3.10 Kết quả sắc ký cột 31

3.11 Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy, đo phổ của kháng sinh tinh khiết 35

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36

1 Kết luận 36

2 Kiến nghị 37

P mirabilis Proteus mirabilis

SKLM Sắc ký lớp mỏng

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1: Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn 15

Bảng 2: Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định 16

Bảng 3: Các dung môi đã sử dụng 16

Bảng 4: Kết quả thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên 25

Bảng 5: Kết quả thử HTKS đột biến lần 1 26

Bảng 6: Kết quả thử HTKS đột biến lần 2 27

Bảng 7: Kết quả thử HTKS đột biến lần 3 28

Bảng 8: Kết quả chọn môi trường lên men 29

Bảng 9: Kết quả lên men của các dạng chủng, biến chủng trên MT2dt 30

Bảng 10: Ảnh hưởng của pH đến độ bền của KS sau 1 ngày và sau 5 ngày 31

Bảng 11: Kết quả chiết kháng sinh bằng 4 DMHC ở 5 pH khác nhau 31

Bảng 12: Kết quả chọn hệ dung môi chạy sắc ký 32

Bảng 13: Kết quả thử HTKS của các phân đoạn sau chạy cột lần 1 33

Bảng 17: Kết quả thử hoạt tính KS của các phân đoạn sau chạy cột lần 3 36

Bảng 18: Kết quả SKLM các phân đoạn 1-4 (hiện hình bằng P mirabilis) 36

Bảng 19: Biện giải các nhóm chức của phổ IR 37

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1: Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn

Hình 2: Cơ chế và vị trí tác dụng của kháng sinh lên tế bào vi khuẩn

Hình 3: Cơ chế tác dụng của kháng sinh ức chế tổng hợp protein của vi khuẩn.Hình 4: Sơ bộ phân loại xạ khuẩn

Hình 5: Sự phát triển của khuẩn ti ở xạ khuẩn

Hình 6: Sơ đồ tổng quát lên men sản xuất kháng sinh

Hình 7: Đường cong sinh trưởng phát triển của xạ khuẩn

Hình P1: Thử HTKS bằng phương pháp khối thạch

Hình P2: Thử HTKS bằng phương pháp khoanh giấy lọc

Hình P5: Phổ hồng ngoại của kháng sinh tinh khiết thu được.Hình P6: Phổ tử ngoại của kháng sinh tinh khiết thu được.

Hình P7: Phổ MS của kháng sinh tinh khiết thu được

ĐẶT VẤN ĐỀ

Kháng sinh ngay từ khi ra đời đã mở ra một kỷ nguyên mới trong lịch sửngành y - dược Hiện nay, kháng sinh đã trở thành một nhóm thuốc thiết yếu trongnền y học hiện đại Nhờ nhóm thuốc này mà nhân loại đã chống lại được các dịchbệnh nguy hiểm đã từng cướp đi sinh mạng của hàng trăm ngàn người trên thế giớinhư : dịch hạch, tả, viêm phổi… Đặc biệt, nhóm thuốc này giữ 1 vị trí hết sức quantrọng ở những nước đang phát triển khi mức sống thấp, điều kiện vệ sinh yếukém… nên thường xuất hiện và có nguy cơ bùng phát các dịch bệnh nhiễm khuẩn

hô hấp, nhiễm khuẩn tiêu hóa Không dừng lại ở điều trị nhiễm khuẩn, nhiễm nấm,ngày nay phạm vi điều trị của kháng sinh còn đang được mở rộng trong cả điều trịung thư và HIV/AIDS và cũng cho nhiều kết quả khả quan

Bên cạnh đó, tình hình sử dụng kháng sinh chưa hợp lý dẫn tới tình trạngVSV kháng thuốc diện rộng, kháng cả với những kháng sinh thế hệ mới Đặc biệt,hiện nay xuất hiện nhiều chủng vi sinh vật có khả năng kháng chéo với nhiều loạikháng sinh có cấu trúc tương tự nhau.Vì vậy, đẩy mạnh nghiên cứu sản xuất khángsinh mới có hiệu quả điều trị cao, độc tính thấp, ít bị kháng đang là một nhu cầu cấpthiết trong công cuộc chăm sóc và bảo vệ sức khỏe cộng đồng Do đó, bên cạnh việcnghiên cứu sản xuất kháng sinh bằng phương pháp tổng hợp, bán tổng hợp thì việctìm kiếm những kháng sinh có nguồn gốc tự nhiên cần được chú trọng hơn nữa

Trong khoảng 15.000 chất kháng sinh được biết đến hiện nay thì có 55% cónguồn gốc từ xạ khuẩn và 75% số đó thuộc chi Streptomyces Đây là cơ sở để tôi

lựa chọn đề tài: “Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ

Streptomyces 173.113” làm khóa luận tốt nghiệp Khóa luận mong muốn đạt được

các mục tiêu sau đây:

- Chọn lọc, cải tạo giống để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh

- Xác định điều kiện lên men, chiết tách kháng sinh tốt nhất

- Sơ bộ xác định một số tính chất lý, hóa của kháng sinh thu được

Chương 1 : TỔNG QUAN

1.1 Đại cương về kháng sinh

1.1.1 Lược sử nghiên cứu kháng sinh

Tháng 10 – 1928 bác sỹ, nhà sinh vật học người Scotland – Alexander

Fleming tình cờ phát hiện ra khả năng kháng khuẩn của nấm Penicillium notatum.

Năm 1938, Ernst Boris Chain và Howard Walter Florey đã đề nghị được hợp tác vớiFleming để tiếp tục nghiên cứu về penicilin Năm 1941, nhóm đã chọn được chủng

Penicilliumchrysogenium ưu việt nhất để chiết penicillin Từ 1943, Anh và Mỹ đãsản xuất penicilin với quy mô công nghiệp Đến năm 1945, giáo sư Fleming đượctặng giải thưởng Nobel về y học, cùng với Chain và Florey [21]

Penicillin xuất hiện đã mở đầu một kỷ nguyên mới trong lịch sử ngành y –dược: kỷ nguyên kháng sinh Trong vòng 20 năm tiếp theo đó (1940 – 1960) là thời

kỳ “hoàng kim” trong lịch sử nghiên cứu kháng sinh với sự ra đời của hàng loạt cáckháng sinh liên tiếp: streptomycin (1944), cloramphenicol – neomycin (1949)…Tuynhiên, ngay sau khi kháng sinh được đưa vào ứng dụng điều trị trong thực tế khônglâu thì bắt đầu phát hiện các chủng VSV kháng thuốc Năm 1953, trong một trậndịch bệnh tả ở Nhật, lần đầu tiên xuất hiện hiện tượng vi khuẩn đề kháng vớicloramphenicol, tetracycline Đến năm 1955, các nhà khoa học phát hiện vi khuẩnlao kháng streptomycin… (Tham khảo phụ lục - Hình 1)

Bên cạnh con đường nghiên cứu tìm kiếm các kháng sinh mới có nguồn gốc

tự nhiên thì công nghệ lên men sản xuất kháng sinh cũng ra đời và dần hoàn thiện.Đồng thời, việc tổng hợp, bán tổng hợp kháng sinh từ những khung hóa học sẵn cócũng đạt được những thành tựu đáng kể với sự xuất hiện của cloramphenicol vàcephalosporin…

1.1.2 Định nghĩa kháng sinh

Kháng sinh là những sản phẩm đặc biệt nhận được từ VSV hay các nguồn tựnhiên khác có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt một cáchchọn lọc lên một nhóm VSV xác định (vi khuẩn, nấm, nguyên sinh động vật, …)hay tế bào ung thư ở nồng độ thấp.[10]

1.1.3 Phân loại kháng sinh

Danh sách các chất KS được phát minh đang ngày càng dài thêm (Thamkhảo Phụ lục 1) và việc phân loại chúng trở nên thật sự cần thiết

Có nhiều cách phân loại KS: theo nguồn gốc, theo cơ chế tác dụng…Tuynhiên phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học là khoa học nhất vì người nghiêncứu có thể nhanh chóng định hướng được các đặc điểm của chất kháng sinh mớiphát hiện khi biết được cấu trúc hóa học của nó [10]

 Phân loại KS theo cấu trúc hóa học thường chia ra các nhóm sau đây [8]:

- Các kháng sinh có cấu trúc β-lactam (penicillin, cephalosporin…)

- Các kháng sinh chứa nhân thơm (chloramphenicol…)

- Các kháng sinh có cấu trúc aminoglycosid (streptomycin, gentamicin…)

- Các kháng sinh có cấu trúc 4 vòng (tetracyclin…)

- Các kháng sinh polypeptid (polymyxin, bacitracin…)

- Các kháng sinh macrolid (erythromycin, spiramycin…)

- Các kháng sinh polyen (nystatin, amphotericin B…)

- Các kháng sinh nhóm antracyclin (daunorubicin…)

- Các kháng sinh nhóm actinomycin (actinomycin D…)

1.1.4 Cơ chế tác dụng của kháng sinh

Các kháng sinh tác dụng chủ yếu qua việc ức chế các phản ứng tổng hợpkhác nhau của tế bào VSV gây bệnh bằng cách gắn vào receptor trên tế bào vi sinhvật, làm biến đổi phản ứng sinh hóa trong tế bào VSV đó Mỗi nhóm kháng sinh tácdụng lên các đích khác nhau [4]

 Có 6 kiểu chủ yếu: (Tham khảo phụ lục - Hình 2) [17]

- Tác dụng lên việc tổng hợp thành tế bào

- Tác dụng lên màng nguyên sinh chất

- Tác dụng lên sự tổng hợp ADN

- Tác dụng lên sự tổng hợp protein (Tham khảo phụ lục - Hình P3)

- Tác dụng lên sự trao đổi hô hấp

- Tác dụng lên sự trao đổi chất trung gian

1.1.5 Các ứng dụng của kháng sinh

Ngoài lĩnh vực y học, kháng sinh còn được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnhvực khác nhau [10]:

- Trong chăn nuôi: kháng sinh dùng để chữa bệnh cho động vật:

Griseoviridin điều trị viêm phổi cấp, viêm vú cho trâu bò… Kháng sinh còn được

sử dụng như chất kích thích tăng trọng đàn gia súc, gia cầm, giảm chi phí thức ăn,tăng sản lượng trứng ở gà, vịt

- Trong trồng trọt: Hiện nay có khoảng 30 chất kháng sinh đã được sử dụng

để đấu tranh với các bệnh của cây trồng do vi khuẩn, virus, nấm gây ra.Ví dụ:

Herbicidin A và B là kháng sinh do S.saganonensis tạo ra kìm hãm sự phát triển của

Xanthomonas oryzae gây bệnh cho lúa.

- Trong công nghiệp thực phẩm: KS cũng được sử dụng trong công nghiệp

thực phẩm để bảo quản thực phẩm đóng hộp: kháng sinh subtilin (do Bacillus

subtilis tạo ra), nisin (từ Bacillus licheniformis).

1.2 Đại cương về xạ khuẩn

Xạ khuẩn (Actinomcetes) là những vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rộng

rãi trong tự nhiên Phần lớn xạ khuẩn là các tế bào Gram (+), hiếu khí, hoại sinh, cócấu tạo dạng sợi phân nhánh có G + C > 55%.[4]

Xạ khuẩn có thể sinh tổng hợp được nhiều sản phẩm TĐC quan trọng như

KS, vitamin, acid hữu cơ, các enzym nên được các nhà khoa học nghiên cứu rấtnhiều.[4]

Xạ khuẩn được sử dụng để sản xuất kháng sinh và nhiều loại enzyme(amylase, celllulase, protease…), cũng như các hợp chất khác.[4]

1.2.1 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn

- Xạ khuẩn thuộc nhóm các vi khuẩn thật nhưng phát triển thành dạng sợi, hệsợi của xạ khuẩn chia thành khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh Khuẩn lạc xạkhuẩn khá đặc biệt: không trơn ướt như vi khuẩn, nấm men mà thường có dạng thôráp, dạng phấn, không trong suốt, có các nếp gấp tỏa ra theo hình phóng xạ.[6]

- Đường kính khuẩn ty xạ khuẩn thay đổi trong khoảng 0,3-1,0 μm đến 2-3

μm Đa số khuẩn ty xạ khuẩn không có vách ngăn Màu sắc khuẩn ty xạ khuẩn hếtsức phong phú: vàng, xám, da cam, đen đỏ, nâu, trắng, …[7]

Hình 4: Sơ bộ phân loại xạ khuẩn

1.2.2 Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces

Bên cạnh những đặc điểm chung của xạ khuẩn, Streptomyces cũng có những

trong suốt quá trình phát triển, bề mặt nhẵn hoặc sần sùi

Actinomycetes

VSV giống xạ khuẩn Actinomycetales

Streptomyces

• Khuẩn ty khí sinh: Do khuẩn ty cơ chất phát triển dài ra trong khôngkhí Sau một thời gian phát triển trên đỉnh khuẩn ty khí sinh sẽ xuấthiện các chuỗi bào tử (Hình 5) [7]

Chuỗi bào tử: Có thể mọc đơn hoặc mọc vòng gồm các hình thái cơ bản nhưthẳng, cong, móc câu, xoắn đơn hoặc kép, xoắn lò xo.Chuỗi bào tử phân cắt tạothành các bào tử trần, là cơ quan sinh sản chủ yếu của xạ khuẩn Bề mặt bào tử cóthể có dạng trơn nhẵn (sm), xù xì da cóc (wa), có gai (sp) hoặc có tóc (sp).[4]

`Hình 5: Sự phát triển của khuẩn ty ở xạ khuẩn

- Đặc điểm sinh lý:Streptomyces là sinh vật dị dưỡng, có tính oxi hóa cao Để

phát triển, chúng phân giải các hydratcarbon làm nguồn cung cấp vật chất và nănglượng, đồng thời thủy phân các hợp chất như gelatin, casein, tinh bột, khử nitrat

thành nitrit Streptomyces là loại xạ khuẩn hô hấp hiếu khí Nhiệt độ tối ưu của

chúng là 25-30°C, pH tối ưu thường là 6,8-7,5.[11]

- Khả năng tạo sắc tố: Sắc tố tạo thành từ Streptomyces được chia làm 4 loại:

sắc tố hòa tan, sắc tố của khuẩn ty cơ chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh, sắc tốmelanoid.[11]

1.3 Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh (Hình 6)

Hình 6: Sơ đồ tổng quát lên men sản xuất kháng sinh

Giống xạ khuẩn lưu giữ trong phòng thí

nghiệmNhân giống quy mô thí nghiệmNhân giống trong thiết bị nhân giốngLên men tổng hợp kháng sinh

Dịch lên men

Dịch lọcSinh khối

Sinh khối thô

Dịch chiết sinh khối

Sản phẩm tinh chế

Dịch chiết kháng sinhDịch chiết đậm đặcSản phẩm tinh chế

Sản phẩm đã kiểm nghiệmSản phẩm được đóng gói

1.4 Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn

1.4.1 Mục đích

Các VSV thuần chủng được phân lập từ các nguồn tự nhiên (bùn, đất, nước,

mô thực vật…) thường có HTKS không cao, hiệu suất sinh tổng hợp thấp Do đó,

để thu được các chủng có HTKS và hiệu suất sinh tổng hợp cao đưa vào sản xuấtđòi hỏi phải cải tạo, chọn giống bằng các phương pháp khác nhau và nghiên cứuđiều kiện nuôi cấy, bảo quản thích hợp.[14]

1.4.2 Chọn chủng có HTKS cao bằng phép chọn lọc ngẫu nhiên

Các VSV có sự biến dị tự nhiên theo tần số khác nhau trong ống giống thuầnkhiết, có cá thể có hoạt tính kháng sinh tăng lên 20 - 30 % so với những cá thể khác.Cần phải chọn lấy cá thể có hoạt tính cao nhất trong ống giống để nghiên cứu tiếp

Trong thực tế, việc chọn lọc tự nhiên các cá thể có HTKS cao chỉ để nghiêncứu ban đầu, nó không có giá trị áp dụng vào sản xuất Để thu được những chủng cókhả năng siêu tổng hợp kháng sinh, người ta áp dụng các phương pháp đột biếnnhân tạo.[10]

1.4.3 Đột biến cải tạo giống

Để tạo ra các chủng có hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh cao phải tiến hành độtbiến bậc thang, kết hợp các phương pháp di truyền phân tử như tái tổ hợp cân hữutính, kỹ thuật tách dòng gen, kỹ thuật tạo và dung hợp tế bào trần

 Phương pháp: Các tác nhân gây đột biến có thể được chia làm 3 nhóm:[12]

- Tác nhân hóa học: ethylenimin, acid nitroro (HNO2), hydroxylamin,dimethylsulphat…

- Tác nhân vật lý:

+ Ánh sáng UV, tia X, tia hay electron

+ Tác nhân vật lý hay được dùng nhất là ánh sáng tử ngoại (UV) Ánh sáng

UV có khả năng đâm xuyên kém nhưng với những tế bào VSV có kích thướcnhỏ thì nó có thể xuyên thấu tới nhân

+ Khả năng đột biến còn phụ thuộc vào khoảng cách chiếu, thời gian chiếu,cường độ bức xạ.

+ Một đặc điểm trong tác động của tia UV là hiện tượng quang phục hoạt(photoreactivation) : Sau khi chiếu tia UV lên tế bào nếu để ngoài ánh sángthường thì các tổn thương do tia UV gây ra phần lớn được phục hồi

- Tác nhân sinh học: Các transposons, phage Mu

1.4.4 Bảo quản giống xạ khuẩn

Bảo quản giữ giống VSV là một việc cần thiết do các giống rất dễ bị thoáihóa, nhầm lẫn, mất mát nếu không được lưu giữ một cách khoa học Mục đích cụthể là: giữ giống VSV có tỷ lệ sống sót cao, các đặc tính di truyền không bị biến đổi

và không bị tạp nhiễm bởi các VSV lạ.[15]

Thông thường, có thể sử dụng 4 phương pháp sau để bảo quản các chủngVSV: cấy chuyền (bảo quản trong lọ hoặc ống môi trường, định kỳ cấy chuyền sangmôi trường mới), làm khô (trộn tế bào VSV với giá mang và làm khô ở nhiệt độphòng), đông khô (phân tán tế bào VSV trong MT chất bảo quản rồi đông lạnh, làmkhô mẫu đông lạnh), đông lạnh (huyền dịch tế bào trong chất bảo quản được đônglạnh nhanh và bảo quản ở nhiệt độ thấp).[13]

Để giữ giống xạ khuẩn trong phòng thí nghiệm, cách đơn giản nhất là nuôicấy xạ khuẩn trên môi trường thạch nghiêng thích hợp, cất ống thạch nghiêng trong

tủ lạnh và định kỳ 3 - 6 tháng cấy lại 1 lần.[13]

1.5 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh

1.5.1 Khái niệm lên men

Lên men là quá trình nuôi cấy VSV trong các điều kiện tối thích để sản xuất

ra các sản phẩm TĐC nhờ chính các VSV hoặc các thành phần tế bào của chúng.[10]

Kháng sinh là một trong những sản phẩm của quá trình lên men xạ khuẩn

Cụ thể hơn, kháng sinh là sản phẩm trao đổi bậc hai, được tạo thành gần vào lúc kết

thúc quá trình sinh trưởng của xạ khuẩn, thường vào gần hoặc vào chính pha cânbằng.[16]

Hình 7: Đường cong sinh trưởng phát triển của xạ khuẩn

1.5.2 Các phương pháp lên men

- Phương pháp lên men bề mặt: MT dùng trong phương pháp này ở thể rắn

hay thể lỏng tùy loài VSV VSV hấp thu dinh dưỡng từ MT và sử dụng oxi khôngkhí để hô hấp trên bề mặt MT Phương pháp này tuy có ưu điểm là thao tác đơngiản, không đòi hỏi thiết bị quá tân tiến nhưng lại có nhược điểm là tốn mặt bằng,hiệu suất sử dụng môi trường thấp, khó tự động hóa Do đó, ngày nay chỉ sử dụngphương pháp lên men bề mặt trong chọn giống và giữ giống.[5]

- Phương pháp lên men chìm: VSV được nuôi trong MT lỏng, phát triển cả 3

chiều nên khắc phục được tất cả các nhược điểm kể trên của lên men bề mặt nhưngđòi hỏi đầu tư trang thiết bị ban đầu lớn.[5]

Có 4 kiểu lên men chìm như sau:

+ Lên men mẻ (lên men chu kỳ): VSV được nuôi cố định trong bình lên menvới 1 thể tích MT xác định VSV phát triển theo giai đoạn và tạo ra sản phẩm Kếtthúc quá trình, người ta thu lấy sản phẩm Trong lên men sinh tổng hợp kháng sinhhay sử dụng phương pháp này.[10]

+ Lên men có bổ sung: trong quá trình nuôi cấy có bổ sung thêm môi trườngdinh dưỡng để làm cho mật độ tế bào trong bình tăng lên Do đó, nâng sao hiệu quả

sử dụng bình lên men

+ Lên men liên tục: Thiết bị được cấu tạo đặc biệt sao cho khi VSV đã pháttriển đến một giai đoạn thích hợp thì sẽ lấy đi một thể tích dịch lên men và bổ sungthêm MT mới vào bình

+ Lên men bán liên tục: trong quá trình lên men, việc bổ sung thêm MT dinhdưỡng và rút bớt dịch lên men không được thực hiện liên tục mà định kỳ sau nhữngkhoảng thời gian nhất định

1.5.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men

- pH môi trường: ảnh hưởng đến quá trình lên men có thể do tác dụng trực

tiếp của các ion H+ hay OH- đến tính chất keo của tế bào, hoạt lực của enzyme hoặc

là tác dụng gián tiếp.[13]

- Độ hòa tan oxy và sự thông khí: thiếu oxy nhất thời sẽ phá vỡ trao đổi chất

trong tế bào Vì thế, phải cung cấp oxy sao cho tốc độ hòa tan oxy bằng tốc độ sửdụng oxy của VSV Đối với nhiều VSV, sự thông khí sẽ làm tăng tốc độ sinhtrưởng, rút ngắn pha tiếm phát Bên cạnh đó, nhu cầu oxy của VSV trong các giaiđoạn sinh trưởng cũng không giống nhau: trong thời kỳ đầu, sinh khối còn ít tốc độhòa tan oxy lớn nên thông khí vừa phải là tốt.[13]

Như vậy, trong sản xuất, cần nghiên cứu cụ thể ảnh hưởng của các yếu tố tớiquá trình lên men để có thể tối ưu hóa quá trình này nhằm tạo điều kiện thuận lợinhất cho sinh tổng hợp chất mong muốn

1.6 Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men

1.6.1 Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh

Đây là giai đoạn có vai trò rất quan trọng bởi vì sản phẩm thu được sau quátrình lên men thường không bền vững, hàm lượng kháng sinh trong dịch lên menđôi khi thấp Do đó, cần tách riêng kháng sinh khỏi các tạp chất khác và tinh chế

sản phẩm đạt được các tiêu chuẩn dược điển Công đoạn tinh chế sẽ góp phần quyếtđịnh tới giá thành của sản phẩm.[10]

1.6.2 Các phương pháp chiết tách

- Lọc: là quá trình phân riêng hỗn hợp không đồng nhất qua lớp giấy lọc

(hoặc bông), bã được giữ lại trên lớp lọc, dung dịch chui qua do chênh lệch áp suấttrên và dưới lớp lọc.[15]

- Ly tâm: là phương pháp tách các phân tử có khối lượng riêng khác nhau,

thường là tách pha rắn khỏi pha lỏng nhờ lực ly tâm.[15]

- Chiết bằng dung môi hữu cơ: chuyển kháng sinh cần tách (đang hòa tan

trong dịch lọc) sang pha dung môi hữu cơ không đồng tan.[15]

- Các phương pháp sắc ký:

+ Sắc ký lớp mỏng: Là phương pháp tách các chất trong hỗn hợp dựa trênkhả năng bị hấp phụ (là chủ yếu) khác nhau của chúng trên các bề mặt một chất rắn(chất hấp phụ) Chất hấp phụ ở đây được tráng đều thành một lớp mỏng trên giá đỡ

+ Sắc ký lỏng trên cột: Là phương pháp tách xác định các chất dựa trên sựphân bố khác nhau của các chất giữa hai pha: pha tĩnh là chất lỏng bao bọc tạothành tấm phim màng mỏng trên bề mặt một chất rắn trơ (gọi là chất mang có cỡ hạtnhỏ) được nhồi vào cột, pha động là dung môi thấm qua toàn bộ bề mặt pha tĩnh.[1]

1.7 Bước đầu nghiên cứu cấu trúc kháng

1.7.1 Phổ tử ngoại - khả kiến

Các bức xạ UV-VIS có năng lượng khá lớn nên có khả năng làm thay đổimức năng lượng của các electron từ trạng thái cơ bản lên trạng thái kích thích Giữacấu trúc hóa học của phân tử chất cần nghiên cứu với quang phổ hấp thụ có mốiquan hệ chặt chẽ [9] (Ví dụ: Những phân tử nào càng có nhiều liên kết đôi thì sựhấp thụ càng chuyển về bước sóng dài hơn, đặc biệt là các hệ liên hợp) Các phân tử

có đặc điểm: nối đôi liên hợp, nhân thơm, dị tố N, S, O có khả năng hấp thụ nănglượng ánh sáng UV-VIS [1]

Nguyên tắc: Khối phổ là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của

ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu Dùngchùm điện tử có năng lượng trung bình (50-100eV) để bắn phá phân tử hữu cơ ở

vỡ thành mảnh Các tín hiệu thu được tương ứng với các ion sẽ thể hiện bằng một

số vạch (pic) có cường độ khác nhau tập hợp thành một khối phổ đồ [1]

Nó cung cấp thông tin định tính (khối lượng phân tử, nhận dạng các chất)xác định cấu trúc và định lượng các chất

1.8 Một số nghiên cứu liên quan

1.8.1 Sản xuất 4,5-epoxy–8-demethylgeldanamycin có tác dụng điều trị ung th ư vú

từ

Streptomyces hygroscopicus [18]

Gendanamycin thuộc họ kháng sinh benzoquinon gần đây đã được sự thu hútbởi những đặc tính dược lý học của nó như: ức chế tạo thành tiểu cầu, ức chế enzymsao mã ngược, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus, kháng ung thư… với nồng độ

kháng ung thư của gendanamycin do ức chế mạnh ATP, làm bất hoạt sinh tổng hợpprotein của tế bào gây ung thư Các nghiên cứu cũng cho thấy sử dụnggendanamycin để điều trị ung thư sẽ tăng tính hiệu quả của phương pháp điều trịđồng thời như xạ trị Hiện nay, gendanamycin đang ở trong giai đoạn 2 giám sátlâm sàng

Gendanamycin được sinh tổng hợp bởi Streptomyces hygroscopicus

var.geldanus, trong quá trình sinh tổng hợp còn tạo ra 4,5-epoxy-8-demethyl

gendanamycin, được tinh chế từ dịch lên men bằng sắc ký cột và sắc ký lỏng hiệunăng cao.

Gendanamycin và 4,5-epoxy-8-demethylgendanamycin là những kháng sinh

có khả năng ứng dụng cao đối với mô hình bệnh tật hiện nay được sinh tổng hợp từStreptomyces sp

1.8.2 Nghiên c ứu hoạt chất có tác dụng ức chế enzym lipoxygenase từ Streptomyces

sp.[19]

Nhóm các hoạt chất có tác dụng ức chế enzym lipoxygenase gồmtetrapetalone B (2, C28H35NO9), C (3, C26H34NO8), D(4, C28H36NO10) từ

Streptomyces sp USF – 4227, một chủng đồng thời cũng sinh tổng hợp

tetrapetalone A HLO (Human lipoxygenase) và COX (cyclooxygenase) là nhữngenzym xúc tác đầu tiên tương ứng tạo acid arachidonic, là sản phẩm sinh ra một loạtcác chất gây bệnh cho người như leukotrien, lipoxin, prostaglandin Nghiên cứuđược tiến hành trên lipoxygenase của đậu nành (SBL: Soybean Lipoxygenase)

Streptomyces sp USF – 4727 được nuôi cấy trong môi trường thích hợp,

bằng MeOH và aceton được gộp lại và làm bốc hơi dưới áp suất giảm, sau đó tinhchế bằng sắc ký cột silicagel, dung môi rửa giả là n-hexan (1), n-hexan: ethylacetate

=3:7 (2), n-hexan: acetone = 3:7 (3), và acetone (4)

Tetrapetalone B được tìm thấy ở phân đoạn dung môi (1) và (2) , sau đó sắckhí trao đổi ion bằng cột Sephadex LH – 20, dung môi rửa giải là MeOH, tinh chếphân đoạn dung môi (1) thu được 10mg bột từ 7,2 lit môi trường Tetrapetalone A

có IC50 là 190 (µM)

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị

2.1.1 Nguyên vật liệu

 Chủng xạ khuẩn: chủng Streptomyces 173.113 do Bộ môn Vi sinh – Sinh học

trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp

 Chủng vi sinh vật kiểm định: do Bộ môn Vi sinh – Sinh họctrường ĐH

Dược Hà Nội cung cấp:

Vi khuẩn Gram(+): Bacillus subtilis ATCC 6633

Vi khuẩn Gram(-): Proteus mirabilis BV 108

 Môi trường: Gồm các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn, VSV kiểm định

+ Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn (Bảng 1)

Bảng 1: Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn

Chú thích: - Đơn vị tính theo gram

- Tiệt khuẩn môi trường bằng hơi nước ở 120°C/20 phút

- Các môi trường lên men dịch thể (MTdt): thành phần tương ứng nhưmôi trường nuôi cấy xạ khuẩn nhưng không có thạch

+ Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định (Bảng 2):

Bảng 2: Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định Thành phần

(%) Môi trường

- Dung môi chạy sắc ký: Các dung môi trong bảng 4 ở trên

- Bình chạy sắc ký, buret, Silicagel 60 F254 hạt có đường kính 0,06-0,1mm

2.1.2 Máy móc thiết bị

- Tác nhân gây đột biến: ánh sáng UV (λ=254nm), nguồn phát Toshiba 60W,điện thế 220V

- Máy lắc Taitec Bio – Shaker BR 300 Lf

- Tủ ấm Memmert, Binder, Trung Quốc

- Tủ lạnh Samsung

- Tủ cấy vô trùng Aura VF 48

- Tủ sấy SL shellab

- Lò vi sóng Whirlpool

- Nồi hấp vô trùng Hirayama Model HL3030

- Cân kỹ thuật Sartorius TE 210

- Cân phân tích Sartorius BP 121 S

- Máy đo nhiệt độ nóng chảy E2-Melt

- Máy cất quay Buchi Waterbath B480

2.2 Nội dung nghiên cứu

Để đạt được các mục tiêu ban đầu của đề tài, chúng tôi tiến hành các nộidung nghiên cứu cụ thể như sau:

2.2.1 Chọn lọc, cải tạo giống

- Tiến hành sàng lọc ngẫu nhiên, lựa chọn 3 dạng chủng có HTKS cao nhất

- Đột biến bằng ánh sáng UV và tác nhân hóa học để nâng cao khả năng sinhtổng hợp kháng sinh của chủng xạ khuẩn

2.2.2 Lên men, chiết tách kháng sinh.

- Từ 3 MT lên men bề mặt tốt nhất, chọn 1 MT lên men chìm tốt nhất

- Thực hiện lên men từ các dạng chủng và biến chủng thu được, lựa chọn biến chủng (dạng chủng) có khả năng lên men tạo kháng sinh mạnh nhất

- Tìm dung môi hữu cơ chiết dịch lọc của dịch lên men và pH chiết tốt nhất

- Tìm hệ dung môi khai triển có khả năng tách hỗn hợp kháng sinh tốt nhất

- Tách, tinh chế kháng sinh từ dịch chiết dung môi hữu cơ

2.2.3 Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được

- Xác định nhiệt độ nóng chảy

- Đo phổ IR, phổ UV, phổ MS

2.3 Phương pháp thực nghiệm

2.3.1 Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn

- Cấy zigzac xạ khuẩn trên ống thạch nghiêng có chứa MT nuôi cấy thíchhợp, ủ cho phát triển ở 28-29°C

- Sau 6-10 ngày, xạ khuẩn đã phát triển tốt, cho các ống giống vào tủ lạnhbảo quản ở 2-4°C, định kỳ 3-6 tháng cấy chuyền

2.3.2 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán

- Nguyên tắc: Mẫu thử được đặt trên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy VSV kiểm

định, kháng sinh từ mẫu thử khuếch tán vào MT thạch sẽ ức chế sự phát triển củaVSV kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn

- Tiến hành:

+ Tạo hỗn dịch VSV: Lấy một vòng que cấy VSV kiểm định cấy vào 2,5 ml

MT canh thang, ủ ở 37°C trong 18-24h (đối với vi khuẩn) để tạo thành hỗn dịchVSV có nồng độ 106-108 tế bào/ml

+ Cấy hỗn dịch VSV vào môi trường thạch thường đã tiệt trùng và để nguội

trùng với thể tích 20ml/đĩa

+ Đưa mẫu thử vào môi trường kiểm định theo 1 trong 3 cách sau:

sau đó đặt lên bề mặt môi trường đã cấy VSV kiểm định (Xem hình P5 ở phụ lục)

sinh kháng sinh lên bề mặt MT đã cấy VSV kiểm định (Xem hình P3)

• Phương pháp giếng thạch: Đục các giếng thạch (Φ=6,0mm) trên MT

đã cấy VSV kiểm định Nhỏ 0,05ml dịch thử vào mỗi giếng (Xem hình P4)

+ Các đĩa Petri có mẫu thử được ủ trong tủ ấm ở 37ºC trong 18-24h (đối với

vi khuẩn) Mỗi mẫu được thử song song trên 3 đĩa với cùng 1 loại VSV kiểm định

+ Đánh giá kết quả: Đo đường kính vòng vô khuẩn bằng thước kẹp Palmer

có độ chính xác 0,02mm Kết quả được đánh giá dựa trên đường kính vòng vôkhuẩn xử lý theo công thức:

s: Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh

n: Số thực nghiệm tiến hành song song (thông thường n=3)

2.3.3 Sàng lọc ngẫu nhiên

- Pha hỗn dịch bào tử: Lấy một vòng que cấy bào tử Streptomyces 173.113,

cho vào ống nghiệm chứa 10ml nước cất vô trùng, lắc cho bào tử phân tán đều, thu

đến nồng độ 10-6 bằng nước cất vô trùng

- Cấy bào tử: Dùng pipet vô trùng hút chính xác 0,1ml hỗn dịch bào tử ở các

trang vô trùng dàn đều hỗn dịch bào tử lên bề mặt thạch Tiến hành trên 3 đĩa Petricho mỗi nồng độ pha loãng Cho các đĩa vào tủ ấm 28°C trong 6 ngày cho xuất hiệncác khuẩn lạc mọc riêng rẽ

- Phép chọn lọc tự nhiên: Chọn các khuẩn lạc phát triển đặc thù, mọc riêng rẽsau 6 ngày rồi lấy ra cấy thử HTKS bằng phương pháp khối thạch

2.3.4 Phương pháp đột biến

 Bằng ánh sáng UV

 Pha hỗn dịch bào tử: Lấy 1 vòng que cấy bào tử Streptomyces 173.113

cho vào ống nghiệm chứa 10 ml nước cất vô trùng, lắc đều, thu được hỗn dịch bào

nước cất vô trùng

môi trường thạch, dàn đều bằng que chang vô trùng, để vào tủ ấm làm mẫu chứng

tối 2 giờ, rồi dùng pipet vô trùng pha loãng đến nồng độ 10-5

bằng que chang vô trùng rồi cho vào tủ ấm Sau 6 ngày, đếm số khuẩn lạc, xác định

Nm: Số khuẩn lạc sau đột biến

N0: Số khuẩn lạc trong mẫu chứng

10-k : Nồng độ pha loãng của hỗn dịch bào tử sử dụng

Petri Làm song song cả mẫu chứng Sau 6 ngày để trong tủ ấm, thử hoạt tính khángsinh Tính % biến đổi hoạt tính theo công thức:

% biến đổi hoạt tính =

có % biến đổi hoạt tính cao nhất dùng cho các nghiên cứu tiếp theo

Nguyên tắc: HCl + NaNO2 = NaCl + HNO2

cho vào ống nghiệm chứa 10 ml nước cất vô trùng, lắc đều, thu được hỗn dịch bào