Thu thập, phân loại dưới loài, tách chiết ADN để giải mã GENOME một số giống lúa bản địa có khả năng chịu hạn của việt nam

Tuy nhiên, những nghiên cứu có ứng dụng công nghệ sinh học để phân tích, đánh giá đặc tính chịu hạn của các giống lúa bản địa chưa nhiều.. Việc nghiên cứu đánh giá nguồn gen các giống lú

Trang 1

TRƯỜNG ĐẠI HỌC sư PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN

===£T)£ŨỊ|Ga===

NGÔ THỊ THANH HÒA

THU THẬP, PHÂN LOẠI DƯỚI LOÀI, TÁCH CHIẾT ADN ĐẺ GIẢI MÃ GENOME MỘT SỐ GIỐNG LÚA BẢN ĐỊA CÓ KHẢ NĂNG CHỊU

HẠN CỦA VIỆT NAM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Di truyền học

Ngưòi hướng dẫn khoa học

TS KHUẤT HỮU TRUNG

HÀ NỘI - 2015

Trang 2

Ngô Thị Thanh Hòa K37A SP Sinh

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành được khóa luận này tôi đã nhận được nhiều sựgiúp đỡ từ các thày cô

Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới

TS Khuất Hữu Trung, ThS Đặng Thị Thanh Hà và tập thể cán bộ thuộc

Bộ môn Kĩ thuật Di truyền - Viện Di truyền Nông nghiệp đã hướng dẫntận tình và tạo điều kiện tốt nhất giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này

Tôi cũng xin gửi lời cảm om tới TS Nguyễn Như Toản và toàn

bộ các thầy cô giáo ừong Khoa Sinh - KTNN Trường Đại học Sư phạm

Hà Nội 2 đã giúp đỡ và dạy bảo tôi trong quá trình học tập

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn cha mẹ, anh chị em tronggia đình, bạn bè đã luôn sát cánh hỗ trợ và động viên về cả vật chất lẫntinh thần để tôi có thể toàn tâm, toàn ý cho công việc

Trong quá trình hoàn thành bản khóa luận này không tránh khỏinhững thiếu sót, rất mong được sự đóng góp ý kiến của các thầy cô đểbản khóa luận được đày đủ hơn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 5 năm 2015 Sinh viên

Trang 3

Ngô Thị Thanh Hòa

Trang 4

Tôi xin cam đoan khóa luận được hoàn thành là kết quả nghiên

cứu của riêng tôi, những số liệu trong luận văn là trung thực, không

sao chép, không trùng lặp với các kết quả nghiên cứu trước

Hà Nội, tháng 5 năm 2015 Sinh viên

Ngô Thị Thanh Hòa

DANH MUC CÂC CHCTVIÉT TÂT

ABA : Axit abcisic ADN : Add deoxyribonucleic AFLP : Amplified fragment length polymorphism ARN : Acid ribonucleic

CTAB : Cetyl trimetyl amonium bromit dNTP : Dideoxyribo nucleozit triphosphat EDTA : Etylen diamine tetra acetic acid LEA : Late embryogenesis abundant protein DEAE : diethylaminoethyl cellulose

PCR : Polymerase chain reaction RFLP : Restriction fragment length polymorphism EtBr : Ethidium Bromide

CsCl : Cesium Chloride

MỤC LỤC

Mở đầu 1Chương 1 TÔNG QUAN TÀI LIỆU 31.1 Tổng quan về cây lúa 31.1.1 Nguồn gốc và phân bố địa lý, phân loại của cây lúa

Trang 5

1.1.2 Đặc điểm, sự phân bố của các giống lúa Indica, Japonica và

Javanica 5

1.1.3 Lúa chịu hạn 9 1.2 Tổng quan về tách chiết ADN 13

1.2.1 Lịch sử nghiên cứu tách chiết ADN 13 1.2.3 Các phương pháp tách chiết ADN 17 1.2.4 Định hướng tương lai về tách chiết ADN 21 1.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết ADN từ mô, tế bào thực vật 22

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 28

2.1 Vật liệu nghiên cứu 28

2.2 Phương pháp nghiên cứu 29

2.2.1 Phương pháp điều tra thu thập mẫu

29

2.2.2 Phương pháp ngâm ủ và gieo hạt

30

2.2.3 Phương pháp tách chiết ADN

30

2.2.4 Phản ứng PCR với mồi ORPIOO

32

2.2.5 Điện di, nhuộn và chụp ảnh sản phẩm PCR

33

2.2.6 Phương pháp kiểm tra nồng độ và chất lượng ADN

33

Trang 6

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN cứu 34

3.1 Kết quả điều ữa thu thập các giống lúa chịu hạn ở Việt Nam 34

3.2 Kết quả chọn lọc các nguồn gen theo các tính trạng, thu thập các mẫu hạt, xây dựng tập đoàn các dòng/giống lúa bản địa có khả năng chịu hạn 51

3.3 Kết quả gieo ữồng và thu mẫu lá chuẩn bị cho tách chiết ADN 55

3.4 Kết quả tách chiết ADN từ các mẫu giống lúa 56

3.4.1 Kiểm tra nồng độ và chất lượng ADN trên gel Agarose 56

3.4.2 Kết quả kiểm ữa nồng độ và độ tinh sạch ADN bằng máy đo quang phổ 57 3.5 Kết quả phân loại dưới loài tập đoàn lúa chịu hạn 61

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 65

TÀI LIỆU THAM KHẢO 66

DANH MỤC BẢNG * Bảng 1.1 Các loài lúa Oryza, nhiễm sắc thể, nhóm genome và sự phân bố 3

Bảng 1.2 Đặc tính của các loài lúa Japonica, Javanica và Indica 7

Bảng 3.1 Kết quả điều tra khả năng chịu hạn và một số đặc điểm chính .34

của một số giống lúa thu thập 34

Bảng 3.2 Kết quả điều tra khả năng chịu hạn và một số đặc điểm chính .39

của một số giống lúa nếp, nương thu thập 39

Bảng 3.3 Tập đoàn giống lúa có khả năng chịu hạn phục vụ 51

cho công tác giải mã genome 51

Bảng 3.4: Nồng độ và độ tinh sạch của ADN các mẫu lúa chịu hạn sau quá trình tách chiết 59

Trang 7

dựa trên đoạn ADN lục lạp 63

Hình 3.2: Hình ảnh các giống lúa của tập đoàn chịu hạn trong giai đoạn

mạ 56 Hình 3.3: Hình ảnh kiểm ứa chất lượng ADN của tập đoàn giống

Trang 8

Mở đầu

1 Lí do chon đề tài:

•Kết quả nghiên cứu sơ bộ trên một số giống lúa cho thấy nước ta có nguồn gen

chịu hạn phong phú từ các giống lúa địa phương Tuy nhiên, những nghiên cứu có ứng dụng công nghệ sinh học để phân tích, đánh giá đặc tính chịu hạn của các

giống lúa bản địa chưa nhiều Việc đẩy mạnh năng suất lúa ở các vùng thâm canh

và vùng khó khăn luôn là định hưởng chiến lược và mục tiêu cụ thể cho công tác chọn tạo và phát triển giống lúa Đặc biệt trong thời gian tới, những dự báo về biến đổi khí hậu, nguồn nước tưới trong nông nghiệp có thể giảm đi, diện tích đất khô hạn hoặc thiếu nước có thể tăng lên Do vậy, việc nghiên cứu và phát triển các

giống lúa cho vùng khô hạn, thiếu nước là vấn đề rất quan trọng, góp phần đảm bảo

an ninh lương thực và xoá đói giảm nghèo cho người nông dân ở những vùng có

điều kiện khó khăn về nguồn nước tưới Thành công trong công tác chọn tạo giống phụ thuộc rất nhiều vào số lượng và chất lượng của vật liệu khởi đầu Vật liệu khởi đầu càng nhiều và chất lượng càng tốt cơ hội để tạo ra giống mới càng nhanh Với mục đích đưa ra nguồn thông tin hữu ích phục vụ cho những nghiên cứu về tạo lập

cơ sở dữ liệu cho nguồn gen lúa bản địa của Việt Nam

Việc nghiên cứu đánh giá nguồn gen các giống lúa bản địa có khả năng chịu hạn

được xem là công việc khởi đàu và cần tiến hành thường xuyên cho những chương trình chọn giống lúa chịu hạn, vì vậy, công đoạn tách chiết ADN với số lượng lớn, nồng độ cao, tinh sạch và chất lượng tốt (ADN không bị đứt gãy) để xây dựng thư viện hệ gen phục vụ cho quá trình giải mã là rất quan ừọng

Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “thu thập,phân loại dưới loài,tách chiết AND để giải mã genome một số giống lúa bản địa có khả năng chịu hạncủa Việt Nam”

2 Mục đích nghiên cứu: Phân loại dưới loài dựa trên sự khác biệt ADN

lục lạp của hai loài phụ Indica và Japonica của tập đoàn lúa bản địa có khả năng

Trang 9

chịu hạn nhằm mục đích phục vụ cho công tác giải mã hệ gen lúa của tập đoàn

nói ữên

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

3.1 Ý nghĩa khoa học

Cung cấp thêm nhiều dữ liệu, thông tin khoa học hữu ích cho công tác nghiên

cứu giải mã gen của các nguồn gen lúa chịu hạn tạo cơ sở lý luận cho việc chọn

lọc, phục ừáng để nâng cao tiềm năng di truyền của các giống lúa chịu hạn

trong sản xuất

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Nghiên cứu, giải mã gen của những loại lúa có khả năng chịu hạn góp phần nâng cao hiệu quả công tác bảo tồn và chọn tạo giống lúa có phẩm chất gạo tốt, năng

suất cao, có khả năng chịu hạn, phù hợp với điều kiện canh tác lúa và cơ cấu sản

xuất lúa ở những vùng khô hạn của Việt Nam

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tỗng quan về cây lúa

1.1.1 Nguồn gốc và phân bố địa lý, phân loại của cây lúa

Cây lúa trồng thuộc họ Poaceae (Graminea hay họ Hoà Bản), phụ họ Pryzoideae, tộc Oryzae, dòng Oryza, và loài Oryza sativa và Oryza glaberrỉma Loài Oryza satỉva là lúa ừồng ở Châu Á và Oryza glaberrỉma lúa ừồng ở châu Phi.

Ngoài ra, còn có 20 hoặc nhiều hơn loài lúa dại sống rải rác trên thế giới như ĐôngNam Á, Nam Á, Châu úc, New Guinea, Châu Phi, Trung và Nam Mỹ (bảng 1.1)

Sự xếp loại cho cây lúa trải qua một thời gian gần 200 năm, với rất nhiều tranh luậngiữa các nhà nghiên cứu vì không có một hệ thống xếp loại duy nhất được đặt ra

Do đó, có nhiều loài lúa dại được xếp cùng tên hoặc lẫn lộn nhau, tùy theo các nhà

nghiên cứu, ngoại trừ hai loài lúa trồng (satỉva và glaberrima) và 7 loài lúa dại (australiensis, eỉchỉngeri, latifolia, mỉnuta, schlechten, ridleyi và brachyanthà) (Nayar, 1973) [29] Chẳng hạn, loài spontanea và perennỉs được xem như rất gần

Trang 10

với lúa trồng sativa; nên có tên: loài oryza dưới dạng spontanea, hàng niên, xem như một loài độc lập o fatua, hay o sativa \ai.fatua hoặc o rufipogon (Sampath.,

1962) [46] Loài đa niên

o perennỉs đươc xem như o rufipogon Griff và loài hàng niên như o nivara.

Bảng 1.1 Các loài lúa Oryza, nhiêm săc thê, nhóm genome và sự phân bô

Loài lúa Oryza x=12 Nhóm

genome

Phân bố

0 alta Swallen 48 CCDD Trung và Nam Mỹ

0 australiensis Domin 24 EE Châu Uc

0 barthii Chev (ơ. 24 AU A° Tây và Đông Châu Phi

breviligulata) 24 FF Tây và Trung Châu Phi

0 brachyantha A Chev.

& Roehr

BBCC

Tây, Đông và Trung Châu Phi

0 eichingeri A Peter 24 AU A U Đông và Tây Châu Phi

0 glaberrima Steud. 48 CCDD Tây Châu Phi

CCDDAA

Châu Phi Trung và Nam Mỹ

0 latifolia Desv. 24 AW Châu Uc, Trung và Nam Mỹ

0 longiglumis Jansen 48 MMRR+

Đông Nam A, Nam TrungQuốc, New Guinea

Trang 11

0 longgistaminata A.

Chev & Roehr (0 barthii)

0 meridionalis N.Q Ng

0 meyeriana (Zoll &

Morrill ex Steud.) Baill

4824

24

BBCCAA

cc

Đông Nam châu A Nam vàĐông Nam Á và Nam TrungQuốc Nam và Đông Nam Á vàNam Trung Quốc, New Guinea

Trang 12

1.1.2 Đặc điểm, sự phân bố của các giống lúa Indỉca, Japonica và Javanica

Dựa trên đặc điểm bất thụ của con lai F1 và các đặc điểm hình thái, sinh thái

và sinh lý, loài lúa trồng Châu Á (O satỉva) được chia thành ba loài phụ: Indica, Japonica và Javanica đặc trưng cho ba vùng địa lý tương ứng là Ân Độ, Trung Quốc - Nhật Bản và Indonesia Hiện nay lúa Indỉca được trồng trên 80% của diện

tích trồng lúa ừên thế giới và cung cấp thức ăn cho hơn 3 tỷ người, chủ yếu các

nước đang phát triển Lúa Japonica là một trong những loại ngũ cốc chính của 5

nước trên thế giới: Triều Tiên, Hàn Quốc, Nhật Bản, Trung Quốc (miền Bắc ôn đới)

0 nivara Sharma &

Shastry (0 fatua, 0 sativa

f

I)

AA

Đông Nam châu A, Nam

và Đông Nam Á và Nam Trung Quốc

0 officinalis Wall, ex Watt 24 AA Châu A

0 punctata Kotschy ex

Steud

24 BB New Guinea, Châu Phi

0 ridleyi Hook f. 48 MMRR+ Đông Nam A

0 rufipogon W Griffith

(0 perennis, 0 fatua, 0.

perennis subsp balunga)

24 AA Đông Nam A và Nam A

Trang 13

và Ai Cập; và là thức ăn phụ của nhiều nước khác ở Trung Đông gồm Thổ Nhĩ Kỳ,Iran, Iraq, Morocco, Syria , ở Nam Mỹ như Argentina,

Chile và các nước tiến bộ Âu Mỹ Cây lúa Japonica chỉ được trồng ở các vùng ôn

đới hoặc những nơi có nhiệt độ thấp ở miền núi cao của Vân Nam (Trung Quốc),

Nepal, Burundi, Rwanda và Madagascar, nên được gọi là lúa Japonica ôn đới về

phương diện di truyền, còn có một loại gần giống lúa Japonica được trồng trên các vùng đồi núi (lúa rẫy); đó là lúa Japonica nhiệt đới (javanica - loại lúa trung gian giữa Japonica và Indica), loại này thường được trồng ở đảo Java và Sumatra của Indonesia Vì địa dư hạn hẹp của vùng ôn đới, lúa Japonica chỉ giữ vai trò khiêm

nhường trên thế giới, về sản xuất và thị trường tiêu thụ Nhờ Hiệp Ước GATT, sản

xuất lúa Japonica của Trung Quốc đã tăng lên rất nhiều, từ 11% ừong 1980 lên

29% tổng số diện tích lúa toàn quốc trong năm 2000 (Crook và cs., 2002) [13]

Lúa Japonica có diện tích trồng khoảng 11% tổng số diện tích trồng lúa cả

nước, được ừồng trong điều kiện thâm canh tưới tiêu và dùng các phương tiện trợnông khác, nhất là phân hóa học và thuốc diệt cỏ Phần lớn loại lúa này được cơgiới hóa hoàn toàn hoặc bán phần Ở Nhật Bản, Hàn Quốc và Đài Loan, ngành canhtác lúa được thực hiện dưới hình thức trang trại nhỏ với các máy móc và công cụnhỏ, chẳng hạn như máy cày, máy cấy bằng tay Các nước công nghệ như Mỹ,Brazil, Uruguay, Venezuela, Argentina, Pháp, Ý, Tây Ban Nha, v.v , canh tác lúađại qui mô với các trang trại từ 10 đến trên 1.000 ha và cơ giới hóa từ khâu làm đấtđến bảo quản và tồn trữ Do đó, giá thành sản xuất của loại lúa này tương đối cao

Hầu hết ngành sản xuất lúa Japonica được chính phủ bao cấp rất lớn không những

ở khâu sản xuất mà còn cả thị trường Ngành nghiên cứu lúa Japonica dẫn đầu thế giới, tiến bộ hơn lúa Indỉca vì được canh tác trong các nước tiến bộ có đủ điều kiện

vật chất; tuy nhiên, không có một tổ chức hay một nhóm chính thức để điều họp các

công tác nghiên cứu về loại lúa này trên thế giới Ngành trồng lúa Japonica hiện

nay có vẻ phát triển chậm lại sau những bước tiến nhảy vọt về kỹ thuật vào các thập

Trang 14

niên 1950, 1960 và 1990 Dù đã thực hiện được nhiều tiến bộ kỹ thuật, ngành sảnxuất lúa còn gặp nhiều

Trang 15

Ngỏ Thị Thanh Hòa K37A SP Sinh

trở ngại lớn, chủ yếu về mặt kinh tế (giá thành cao, bao cấp lớn), kỹ thuật (thiếunước, nhiệt độ thấp, sâu bệnh và năng suất ngưng đọng) và môi trường (xói mòn ditruyền, ô nhiễm không khí do đốt cháy rơm rạ sau khi gặt)

Lúa Javanica có diện tích trồng khoảng 9% tổng diện tích ừồng lúa toàn quốc, phân

bố chủ yếu ở Indonesia và các quần đảo Thái Bình Dương và các nước Đông Nam Á

Ba loại lúa này khác nhau về hình dạng của cây, thân, lá và hạt, thành phần cấu tạohạt, đặc biệt hàm lượng amylose và amylosepectin, khả năng chống hạn, kháng lạnh, v.v (bảng 1.2).

- Lúa Japonica: Có hạt ừòn, ngắn, hàm lượng amylose thấp (14 - 17%), thường không có

đuôi, gié ngắn, nhiều chồi thẳng đứng, cây thấp giàn, dễ chịu lạnh và không kháng hạn

Lúa Japonica được trồng ở các vùng ôn đới.

- Lúa Indỉca: Có hạt dài thon, hàm lượng amylose cao (trên 21%), không có đuôi, gié

trung bình, thân cây tỏa rộng, cao giàn, không chịu lạnh và có thể chịu hạn hán Lúa

Indica rất phổ biến ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới.

-Lúa Javanica ựaponica nhiệt đới): Có tính chất trung gian giữa lúa Japonica và lúa Indica Loại lúa này có hạt to rộng, hàm lượng amylose cao, thường có đuôi, trấu có lông

dài, ít chồi, gié dài, thân cây dày thẳng đứng, cây rất cao giàn, không chịu lạnh, chịu hạn

hán Lúa javanica được ữồng ở Indonesia, chủ yếu Java và Sumatra.

Bảng 1.2 Đặc tính của các loài lúa Japonica, Javartica và Indica

Câu trúc của các thành

phần cây lúa

Trang 16

Đuôi lúa

Thường không có Thường có Thường không có

Nguồn: Theo Matsuo (1952) [31] và Chandraratna (1964) [10]

Ngoài ra, trong thập niên 1980, Glaszmann (1987) đã áp dụng kỹ thuật “isozyme

loci” trong nghiên cứu sâu hơn giữa các nhóm lúa nói trên Ông đã có thể phân biệt o satỉva ra làm 6 nhóm: Nhóm I (thuộc Indica), II, m, IV, V và VI (thuộc Japonica); nhưng nhóm II và III gần giống với nhóm I (Indica) và nhóm IV và V gần giống nhóm VI Ụaponỉca) Đa số các giống lúa thơm như Basmati 370, Khao dawk mali 105 và lúa

nương thiên về nhóm VI

1.1.3 Lúa chịu hạn

1.1.3.1 Vài nét sơ lược về cây lúa chịu hạn

Theo điều kiện sinh thái, cây lúa chia làm hai loại, lúa cạn và lúa nước Lúa cạn,được trồng vào mùa mưa ừên đất cao, đất thoát nước tự nhiên, trên những chân ruộngkhông đắp bờ hoặc không có bờ và không có nước dự trữ trên bề mặt Theo nghiên cứucủa nhiều tác giả thì lúa cạn do lúa nước biến đổi thành và những giống lúa này có khả

Trang 17

năng trồng được ở những vùng khô hạn, vẫn có khả năng sinh trưởng phát triển bìnhthường trên ruộng có nước Đây là một đặc tính nông học của lúa cạn, khác với cây trồngkhác Hiện nay có thể chia lúa cạn thành hai nhóm: Nhóm lúa cạn cổ truyền, bao gồmnhững giống lúa cạn địa phương, thích nghi cao và tồn tại lâu đời, tính chống chịu cao, tuynhiên giống lúa này có hạn chế là năng suất thấp

Cây lúa (Oryza satỉva L.) là một trong những cây lương thực có khả năng chịu hạn

kém và khá nhạy cảm với môi trường bên ngoài (Đinh Thị Phòng, 2001) [1] Tính trạngchịu hạn là một tính trạng đa gen phức tạp, những nghiên cứu về sinh lý học đã chỉ ra rằngtính chịu hạn của lúa phụ thuộc vào các yếu tố sau: thứ nhất, khả năng đâm xuyên của rễtìm nước dưới tầng đất sâu phục vụ nhu càu nước của cây khi lớp nước trên bề mặt bị bốchơi; thứ hai, khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu của tế bào lá giúp cây duy trì được sứccăng bề mặt bảo vệ cho mô phân sinh khỏi bị mất nước; thứ ba, cơ chế điều khiển thoáthơi nước ở khí khổng Hiện nay, các nhà khoa học cho rằng có khoảng 200 gen tham giavào cơ chế kháng hạn ở cây nhưng các gen này không quy tụ vào một giống cố định

Khô hạn là yếu tố chính làm giảm năng suất của lúa (Oryza satìva L.), dưới điều

kiện canh tác nước trời (rainfed) và sự kiện thiếu nước tưới ngày càng nghiêm trọng hơn ởvùng có nước tưới cũng như vùng lúa rẫy Do vậy người ta tập trung sự chú ý vào đốitượng khô hạn và đặt ra mục tiêu hướng tới để cải tiến giống lúa trên qui mô toàn cầu.Khô hạn sẽ là yếu tố quan trọng bậc nhất

ảnh hưởng đến an ninh lương thực của thế giới, nó có thể làm giảm 70% năng suấtcây trồng nói chung (Bray và ctv 2000) [8] Sự khan hiếm về nước tưới phục vụ cho nôngnghiệp đã được báo động trong nhiều hội nghị khoa học của thế giới gần đây Sản xuất lúanước ở Việt Nam không phải là ngoại lệ Sử dụng biện pháp chọn tạo giống lúa chốngchịu khô hạn bằng chỉ thị phân tử (MAS) đã được thảo luận ừong nghiên cứu này Chọngiống truyền thống chống chịu khô hạn là cách tiếp cận rất cơ bản trong một thời gian dài,một vài thành công đã được ghi nhận ừên cây ngô (Hoisington và cs., 1996) [27], cây lúa (Zhang và cs., 2006) [58], cây lúa mì (Zhao và cs., 2000) [59] Tuy nhiên, một lỗ hổng lớn

giữa các mức độ chống chịu hạn vẫn chưa được xác định ừong hầu hết các loài cây trồng

Trang 18

Đặc biệt là sự ổn định về năng suất vô cùng nhạy cảm với sự thiếu nước (Xiao và cs.,

2007) [56] Đáp ứng lại hiện tượng sừess do khô hạn, cây trồng có một cơ chế rất tiến bộ

từ việc nhận tín hiệu đến truyền nó đi vào hệ thống tinh vi của tế bào, kích thích hoạt độngcủa gen mục tiêu Chống chịu khô hạn là tính trạng cực kỳ phức tạp, bị ảnh hưởng bởi sựthể hiện đồng thời cả một hệ thống gen mục tiêu (Thomashow, 1999) [51] và bị ảnhhưởng bởi các yếu tố về mội trường, vật lý, hóa học (DE và Soltis PS., 2003) [48] Điềunày làm cho những tiến bộ nhất định về cải biên di truyền tính chống chịu khô hạn xảy rarất chậm chạp Sự phát triển nhanh chóng của ngành genome học chức năng và công nghệsinh học trong thời gian gần đây đã cung cấp cho các nhà khoa học cơ hội mới để cải tiếntính trạng chống chịu khô hạn Chiến lược có hiệu quả đã được ghi nhận là làm gia tănglượng đường dễ hòa tan, các họp chất cần thiết thông qua tiếp cận với kỹ thuật chuyển nạpgen Những hợp chất đó là: proline, trehalose, betaine và mannitol, đóng vai trò nhưnhững thể bảo vệ thẩm thấu (osmoprotestants); trong vài trường hợp, chúng ổn định được

các phân tử chức năng dưới điều kiện bị stress (Garg và cs., 2002) [18] Protein LEA (late embryogenesis abundant) cũng được chú ý trong điều kiện bị stress do thiếu nước (Xu và cs., 1996) [57] Protein LEA được phân chia thành 5 nhóm chính

Trang 19

trên cơ sở chuỗi trình tự amino acid của nó (Dure và cs., 1989) [15] và chúng được

xét nghiệm lại thông qua công cụ tin sinh học (Wise 2003) [55] Những protein như vậy

đã đóng góp phàn nào vào sự tiến hóa của nhóm protein có tên gọi là “hydrophilins” khi

chúng đáp ứng với điều kiện thẩm thấu cực ừọng (hyperosmotic) (Garay - Arroyo và cs.,

2000) [17] Vai trò chính của protein LEA là hoạt hóa những amino acid ưa nước và đãnạp năng lượng Sự thể hiện của các gen LEA thường xảy ra dưới dạng abscisic acid độclập Nó không những chỉ được phát hiện trong hạt mà còn trong các mô tăng trưởng khi

cây bị sừess do thiếu nước, do mặn, và do lạnh (Grelet và cs., 2005) [20] Sự thể hiện của

protein LEA và đặc điểm cấu trúc đại phân tử của nó cho thấy vai trò bảo vệ cây chốngchịu sự kiện mất nước Mặc dù chúng ta có nhiều số liệu về cấu trúc và sự thể hiện củaprotein này, nhưng rất ít công trình đề cập đến thao tác của các gen LEA nhằm cải tiến

tính chống chịu khô hạn trong điều kiện đồng ruộng (Xiao và cs., 2007) [56] Thí dụ, gen HVA1 mã hóa nhóm protein 3 LAE của cây lúa mạch (Hordeum vulgareL.) Người ta đã

chuyển nạp gen này thành công vào cây lúa để tăng cường tính chống chịu khô hạn và

chống chịu mặn, chỉ trong điều kiện ở nhà lưới (Xu và cs., 1996) [57] Một clone cDNA

có độ dài phân tử đày đủ chứa gen OsLEA3-l đã thể hiện tính chống chịu khô hạn trongđiều kiện đồng ruộng, nhờ promoter kiến trúc CaMV35S (Xiao VÀ cs., 2007) [56] Đây có

thể nói là sự kiện nổi bật trong thời gian gần đây, nhờ kết quả của thí nghiệm đồng ruộngmang lại

1.1.3.2 Ảnh hưởng của yếu tổ hạn đến cây lúa

Để nhận biết cây lúa kháng hạn hay khả năng chịu hạn của chúng cần nghiên cứuđặc điểm hình thái và hoạt động sinh lí của lúa chịu hạn để tạo ra các giống lúa chịu hạnđạt năng suất cao, mang lại hiệu quả kinh tế lớn và phù họp với địa hình của nước ta, đặcbiệt là trong bối cảnh biến đổi khí hậu hiện nay Các đặc điểm hình thái và sinh lí biểuhiện giống lúa có khả năng chịu hạn là:

Khi gặp điều kiện khỏ hạn, bộ lá ngừng sinh trưởng hoặc sinh trưởng

Trang 20

chậm lại để hạn chế sự thoát hơi nước Đồng thời phiến lá mỏng hơn, nhiều lônghơn để hạn chế sự tích tụ nhiệt, hạn chế sự thoát hơi nước Một phản ứng thiết thực nhất ởlúa là đóng khí khổng khi gặp điều kiện hạn Điều này có tác dụng hạn chế sự thoát hơinước và đồng thời cũng làm hạn chế khả năng quang hợp Vì yậy, đối với lúa chịu khôhạn, một đặc điểm thích nghi của nó là nâng cao hiệu suất quang họp trước khi xảy ra hiệntượng đóng khí khổng Lá có xu hướng cuộn lại và giảm góc độ lá Điều này có tác dụnggiảm cường độ bức xạ trên bề mặt lá, tăng cường ánh sáng đi xuống phía dưới và giúp duytrì ttạng thái thoát hơi nước ở bề mặt lá ở mức tối thiểu

Khi gặp điều kiện hạn, ABA được tăng cường tổng họp ở rễ, sau đó vận chuyển lên

lá, đẩy nhanh tốc độ già hóa của lá, đóng khí khổng làm giảm sự thoát hơi nước Bên cạnh

đó, ABA được tăng cường trên lá làm mức độ héo tăng lên giúp cây tránh bớt được bức

xạ mặt tròi, giảm sử dụng nước và tăng sử dụng bề mặt lá

Rễ mọc dài hơn, phân bố rộng và sâu hơn vào các lớp đất giúp cây lúa tận dụngnước dưới sâu Khi bắt đầu gặp điều kiện hạn ở giai đoạn cây con, khối lượng rễ và tỷ lệrễ/thân, sinh nhiều rễ đốt vì rễ đốt có khả năng đâm xuyên vào các lớp đất tốt hơn để tăngcường khả năng hút nước

Khi gặp hạn, cây có phản ứng giảm chiều cao cây để hạn chế nhu cầu sử dụngnước, đồng thời hạn chế sự tác động của bức xạ mặt trời Phản ứng thấp cây cũng làmtăng khả năng chống đổ ở cây lúa

Trổ bông muộn hơn cũng là một phản ứng của lúa chống chịu khô hạn Khi gặp hạnhán trong giai đoạn sinh trưởng dinh dưỡng, với những giống không nhạy cảm với quangchu kỳ có thể trổ bông muộn hơn lúa bình thường 3 đến 4 tuần Nhạy cảm nhất là khi câylúa gặp hạn ở giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng còn giai đoạn sinh trưởng sinh thực thì ítmẫn cảm hơn

Trong giai đoạn đẻ nhánh và trổ bông, nếu gặp hạn thì số nhánh và số bông sẽgiảm Tuy nhiên, ở lúa chịu hạn điều đó không ảnh hưởng nhiều đến năng suất do sốbông/khóm ít được bù lại bởi sự gia tăng số hạt chắc/bông và sự gia tăng khối lượng hạt

Trang 21

Hạn vào lúc cây đang sinh trưởng mạnh thì chỉ ảnh hưởng đến sinh trưởng Nhưngnếu hạn vào giai đoạn làm đòng đến trỗ thi rất hại vĩ ngăn trở sự phát triển của các bộphận ra hoa, gây ảnh hưởng rõ rệt đến năng suất lúa., thời kỳ đẻ nhánh, cây lúa chịu hạnkhá hơn nhưng cũng bị giảm khả năng đẻ nhánh, chiều cao cây và diện tích lá Thời kỳngậm đòng mà gặp hạn thì rất có hại Thời gian 11 ngày đến 3 ngày trước trỗ, chỉ cần hạn

3 ngày đã làm giảm năng suất rất nghiêm trọng, gây nghẹt đòng, các bộ phận hoa bị tổnthương mạnh, mầm hoa bị chết, dẫn đến sự bất thụ hoặc quá trình phơi màu thụ tinh khókhăn và hình thành nhiều hạt lép (Awoderu V A, 1984) [5]

Nhận thức được vai trò của tính chịu hạn của cây lúa cũng như đi đầu trong côngnghệ, nghiên cứu, sản xuất lúa các nhà khoa học của IRRI đã tiến hành khảo sát hàng trămdòng lúa trong mùa khô cho phép việc xác định của một số dòng có tiềm năng về tínhchịu hạn ở vùng cao, ngoài ra còn được xác định được một vài giống chịu hạn Ở điềukiện đồng bằng, các tác giả đã xác định một số dòng hứa hẹn có khả năng chịu hạn Từviệc thử nghiệm ở nhiều địa điểm khác nhau tại Ấn Độ, nhiều dòng đã được xác định là

có khả năng chịu hạn ở các vùng đồng bằng Nhiều dòng đã được dùng vào các chươngtrình hạt giống để cải tiến tính chịu hạn

Việc xác định nguồn gen triển vọng của cây lúa cùng với những đặc tính có lợi làmột hoạt động quan trọng trong chương trình cải tiến giống lúa Tiềm năng di truyền củacác nguồn thực liệu lai tạo

1.2 Tổng quan về tách chiết ADN

1.2.1 Lịch sử nghiên cứu tách chiết ADN

ADN được tách chiết lần đầu tiên năm 1869 bởi một thầy thuốc người Thụy Sĩ tên

là Friedrich Miescher Ông mong muốn giải thích những quy luật cơ bản nguồn gốc sựsống nhờ vào việc xác định các thành phần hóa học trong tế bào Ông đã cố gắng phân lậpcác tế bào lympho cho các thí nghiệm của ông nhưng để tinh sạch được các tế bào lympho

là rất khó và không thể thu được đủ số lượng cần thiết Do vậy, ông đã chuyển hướngsang các tế bào bạch cầu, ông thu chúng từ mủ của các vết thương phẫu thuật Ban đầu,Miescher tập chung vào các loại protein khác nhau có trong cấu trúc của bạch cầu và ông

Trang 22

thấy rằng protein là thành phần chủ yếu có ừong tế bào chất của tế bào Trải qua cácnghiên cứu, ông nhận ra rằng có một vật chất kết tủa khi bổ sung axit và tan trở lại khi bổxung muối kiềm Đó được xem là lần đầu tiên ông thu được ADN kết tủa dạng thô

Để tách rời ADN khỏi các protein dịch chiết tế bào, Miescher đã xây dựng một quytrình mới để tách riêng nhân của tế bào khỏi tế bào chất sau đó sẽ phân lập ADN Tuynhiên, quy trình đầu tiên của ông không thành công, do thu không được đủ vật liệu chonhững thí nghiệm tiếp theo Sau đó, ông đã tạo ra quy trình thứ hai để thu được nucleictinh sạch với số lượng lớn hơn, sau này được gọi là “axit nucleic” bởi học trò của ông tên

là Richard Altman (R Dahm và cs., 2004) [43]

Sau những thành công bước đàu của Miescher để thu ADN từ tế bào, nhiều nhànghiên cứu sau này đã đưa ra nhiều quy trình tách chiết và tinh sạch ADN phát triển hơnnữa

Nhiều phương pháp tách chiết ADN đã được sử dụng như phương pháp SDS truyềnthống, phương pháp CTAB (Stewart c N Jr và cs., 1993) [49] Ngoài ra, một số phươngpháp đơn giản hơn cũng được trình bày và áp dụng như phương pháp SDS đã cải tiến,phương pháp đun sôi với kiềm alkali (Wang H w và cs., 2002) [52]

1.2.2 Sơ ỉược về phương pháp tách chiết ADN Mỗi thí nghiệm thao tác gen đều

đòi hỏi phải có nguồn axit nucleic ở dạng ADN hoặc ARN Vì vậy, điều quan trọng là cần

có những phương pháp thích hợp để tách chiết các thành phần này từ tế bào

Trang 23

Bước đầu tiên trong bất cứ bản hướng dẫn kĩ thuật nào là phá vỡ vật liệu ban đầu(virut, vi khuẩn, tế bào thực vật hay động vật) Phương pháp dùng để mở tế bào càng nhẹnhàng càng tốt, tốt nhất nên phân hủy thảnh tế bào (nếu có) bằng enzym và dùng hóa chấtlàm tan màng tế bào Nếu cần phải sử dụng các phương pháp mạnh hơn, chẳng hạn nhưdùng máy nghiền, trong trường họp vật liệu ban đầu là các tế bào thực vật, thì các phân tửADN luôn có nguy cơ bị đứt gãy cơ học, và điều đó có thể gây trở ngại cho việc tạo ra cácphân tử tái tổ họfp trong quá trình xử lí tiếp theo

Đối với việc phá vỡ tế bào, phần lớn các phương pháp chuyển sang khâu loại bỏprotein Bước này được thực hiện bằng cách chiết suất một lần hoặc vài lần với phenolhoặc hỗn hợp phenol/chloroform

Sau khi hình thành huyền phù dạng dịch sữa, bước tiếp theo là tiến hành ly tâm đểtách riêng các pha, các phân tử protein sẽ nằm ở pha phenol và tập trung ở mặt phân cách

2 pha Các axit nucleic chủ yếu nằm lại trong pha nước ở phía ừên và có thể kết tủa bằngisopropanol hoặc ethanol Nếu ta cần có chế phẩm ADN thì có thể dùng enzymribonuclease để làm phân hủy ARN trong chế phẩm Nếu càn có chế phẩm mARN để tổnghợp cADN, thì có thể tinh sạch tiếp mARN bằng oligo (dT)-cellulose, chất này sẽ bámvào các đuôi poly (A) của các phân tử mARN nhân chuẩn Làm như thế sẽ tăng được hàmlượng mARN lên rất nhiều, còn các phân tử ADN, rARN và tARN lẫn vào sẽ được loạibỏ

Kĩ thuật ly tâm gradien thường được sử dụng để tạo ra sản phẩm ADN, đặc biệt làADN plasmid Khi đó, dung dịch caesium chloric có chứa ADN được ly tâm với tốc độcao trong máy siêu ly tâm Sau một thời gian dài (đôi khi tới 48 tiếng), một gradien nồng

độ được hình thành và các phân tử pADN tạo thành một pha ở một vị trí xác định trongống ly tâm Pha này có thể lấy ra và CsCl được loại bỏ qua màng bán thấm, do vậy thuđược chế phẩm pADN tinh khiết

Kết tủa axit nucleic là một kĩ thuật thiết yếu được sử dụng phố biến trong nhiều thínghiệm Hai chất kết tủa thường dùng nhất là isopropanol và ethanol, nhưng ethanol được

sử dụng rộng rãi hơn Khi đưa vào dung dịch ADN với tỉ lệ theo thể tích là 2:1 khi ừong

Trang 24

dung dịch có 0,2M muối thì ethanol làm cho axit nucleic thoát ra khỏi dung dịch Mặc dùngười ta thường nghĩ rằng, nhiệt độ thấp (-20°c hay -70°C) là cần thiết, nhưng đó khôngphải là điều kiện tuyệt đối, thường chỉ cần 0°c là đủ Sau khi kết tủa, axit nucleic có thểthu lại ở dạng cặn lắng xuống đáy ống khi ly tâm Cặn lắng này có thể làm khô, sau đó,hòa vào dung dịch đệm thích họp để dùng cho các thí nghiệm tiếp theo

Trên thực tế, thường phải sử dụng những số lượng axit nucleic rất nhỏ (thường làmicro-, nano- hoặc picogram) khi tiến hành các thí nghiệm tách dòng Rõ ràng, không thểxác định số lượng này một cách trực tiếp, mà phần lớn các phép đo đều dùng các dungdịch axit nucleic Nồng độ của dung dịch axit nucleic được xác định bằng cách đo độ hấpthụ tại bước sóng 260 nm trong máy quang phổ kế Một đơn vị (1.0) giá trị hấp thụ bướcsóng 260 nm (A 2 6o) tương đương với nồng độ 50 |j,g/ml của ADN mạch kép hoặc tươngđương với nồng độ 10 |!g/ml của ADN hoặc ARN mạch đơn Nếu giá tri hấp thụ bướcsóng 280 nm (A28o) cùng được xác định, thì tỉ số A26o/A28o là chỉ số cho thấy độ nhiễmcác chất như phenol hoặc protein Tỉ số A 2 6o/A 2 8o là 1,8 đối với ADN tinh khiết, và là 2,0đối với ARN tinh khiết

Ngoài các phương pháp đo quang phổ, nồng độ của ADN có thể được xác địnhthông qua độ phát sáng huỳnh quang khi ADN liên kết với ethidium bromid Chất nhuộmnày xen vào giữa các bazơ của ADN và fluoresces orange, phát huỳnh quang dưới ánhsáng cực tím So sánh độ phát huỳnh quang của mẫu với độ huỳnh quang của một loạtmẫu chuẩn ta có thể đánh giá được nồng độ của mẫu Phương pháp này cho phép pháthiện được 1 -5 ng ADN và có thể sử dụng khi mẫu bị nhiễm các chất khác đến mức không

đo được quang phổ Sau khi xác định được nồng độ của dung dịch axit nucleic, thì ta cóthể lấy bất kỳ số lượng ADN nào, kế cả nanogram hay picogram bằng cách pha loãngdung dịch gốc với độ pha loãng thích họp

Trang 25

1.2.3 Các phương pháp tách chiết ADN

1.2.3.1 Các phương pháp truyền thống

a) Phương pháp tách chiết bằng Guanidinium Thiocyanate-Phenol-Chloroform

Muối là chất gây nhiễm phổ biến ở trong dung dịch ADN Trước khi thực hiện cácbước thí nghiệm đối với ADN thì đòi hỏi cần phải loại bỏ muối ra khỏi dung dịch mẫu Vìvậy, bước tinh sạch là rất cần thiết để loại bỏ muối ra khỏi mẫu chứa ADN (S V

Smarason và cs., 2003) [45] Các bước chính để tinh sạch axit nucleic bao gồm phân giải

tế bào (phá vỡ các cấu trúc tế bào), ức chế sự hoạt động của các nucleases trong tế bào

như DNase và Rnase, tách rời axit nucleic khỏi các mảnh vỡ tế bào (K Doyle và cs.,

1996) [24] Hòa tan các tổ chức như dung dịch phenol-chloroform thường được sử dụngphổ biến trong tách chiết axit nucleic

Mặc dù vậy, phenol là một axit cacbon dễ cháy, ăn mòn, và độc nhưng có thể làmbiến tính protein nhanh chóng, nó không ức chế hoàn toàn hoạt động của RNAse (J.Sambrook and D Russel., 2001) [23] vấn đề này có thể giải quyết được nhờ sử dụng hỗnhọp phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1) Các phân tử như Protein, lipit,cacbonhydrat và các mảnh vụn tế bào sẽ được loại bỏ thông qua hỗn hợp dung dịch tách

chiết của phenol và chloroform (J Sambrook và cs., 2001) [23] Dung dịch sẽ chia thảnh

các lớp tách rời khi bổ sung phenol và chloroform Lớp kỵ nước sẽ lắng xuống dưới đáy,lớp chứa nước sẽ nổi lên trên sau khi được ly tâm Lớp dịch nổi phía trên có chứa ADN vàđược kết tủa bởi ethanol hoặc isopropanol với tỉ lệ 2:1 hoặc 1:1 và dung dịch muối nồng

độ cao Thu tủa của ADN nhờ ly tâm, và muối còn tồn đọng sẽ được rửa bởi dung dịchethanol 70%, sau đó ly tâm để loại bỏ ethanol ở trên Cặn ADN thu được sẽ hòa tan trở lại

trong đệm TE hoặc nước cất vô trùng (L Buckingham và cs., 2007) [34].

b) Phương pháp tách chiết nhờ CTAB

Đối với tách chiết ADN thực vật, bước đầu tiên cần làm là nghiền mẫu sau khi đãlàm đông cứng bởi Nitơ lỏng Mục đích của bước này là phá vỡ thành tế bào để tiếp cậnđược với axit nucleic đồng thời làm ức chế sự hoạt động của các enzym có hại trong tếbào Sau khi nghiền mẫu, sẽ bổ sung một loại đệm chiết thích hợp, ví dụ như СТАВ

Trang 26

Cetyltrimethylammonium bromide (СТАВ) là một chất tẩy không ion, có thể kếttủa axit nucleic và cacbonhydrat có tính axit có nồng độ ion thấp ừong dung dịch Trongkhi đó, protein, và cacbohydrat trung tính còn lại trong dung dịch thì không ở trong điềukiện này Trong dung dịch có nồng độ ion cao, СТАВ sẽ không không kết tủa axit nucleic

và hình thành hỗn hợp với protein Bởi vì vậy, СТАВ rất hữu dụng đối với tinh sạch axitnucleic từ các tổ chức mà có số lượng lớn các polysaccharide như thực vật và một số vikhuẩn Gram âm (J Sambrook and D Russel., 2001) [23]

Trong phương pháp này cũng sử dụng các dung môi hữu cơ và alcohol để kết tủa ởnhững bước sau Những vật chất không hòa tan có thể tách rời nhờ ly tâm để tinh sạch axitnucleic

Protein và những chất khác hòa tan sẽ được tách rời khi bổ sung chloroform và loại

bỏ nhờ ly tâm Axit nucleic sẽ được thu từ dịch nổi và kết tủa, sau đó rửa để loại bỏ hoàntoàn muối còn dư lại Axit nucleic được hòa tan và bảo quản ừong đệm TE hoặc nước cấtkhử trùng

c) Phương pháp Ethidium Bromide (EtBr)-Cesium Chloride (CsCl) ly tâm gradient

Phương pháp CsCl ly tâm gradient là một phương pháp phức tạp, tốn kém và tốnnhiều thời giam so với các pương pháp tách chiết và tinh sạch khác Nó đòi hỏi phải cólượng vật liệu mẫu lớn Do đó, nó không thích hợp sử dụng cho những thí nghiệm nhỏ đối

với plasmid ADN (L J Cseke vafc s., 2004) [35] Axit nucleic sẽ được cô đặc lại nhờ ly

tâm gradient cùng với EtBr-CsCl sau đó được kết tủa bởi alcohol

1.2.3.2 Các bộ kit thương mại

Ngày nay phần lớn các nhà sinh học phân tử rất cần những phương pháp cho kếtquả nhanh, chi phí rẻ và cho sản phẩm ADN chất lượng Một bước tiến đáng chú ý gầnđây là sự đa dạng và sẵn có của các bộ kit tách chiết ADN trên thị trường mà sử dụng đơngiản, quy trình nhanh gọn và cho kết quả tốt Những bộ kit này cùng với máy phá vỡ tếbào (để các mô đảm bảo được nghiền nhỏ mịn), lysis buffers, ARNase các protein và

các polysaccharides kết tủa với muối và được ly tâm để loại bỏ (Bhattacharjee R và cs.,

Trang 27

Promega, Epibio, Cartagen, Roche, Epicentre biotechnologies Do vậy, ADN tinh sạch

có thể thu được chỉ trong vòng khoảng 1 giờ khi sử dụng những bộ kít này, nhưng giá cảtương đối đắt nên không thể sử dụng cho tất cả các quy mô phòng thí nghiệm thôngthường Kết quả nhờ sử dụng các bộ kit có thể tốt, nhưng có lúc cho hiệu quả kém khi màthực hiện đối với những cây chứa nhiều polyphenol và polysaccharide như cây lạc

(Arachỉs hypogea) và các bộ phận của loài Asteraceae (Cichorioideae), như Cichorium intybus, Taraxacum officinale and Lactuca sativa (Sharma, K K và cs., 2000) [47].

1.2.3.3 Tách chiết nhiều dạng phân tử sinh học cùng lúc

Thông thường các qui trình tách chiết hay cả những bộ kit bán sẵn ngoài thị trườngchỉ có thể tách được 1 loại axit nucleic như ADN hoặc ARN hoặc protein từ sinh vật đích.Khi vật liệu tế bào ít, nó có thể tách được cả ADN, ARN và protein từ cùng 1 nguồn

Chomczynski và Cacchi đã phát triển phương pháp tách chiết 1 bước vào năm

1897 Guanidinium thyicyanate đã được đồng hóa và được chiết ra với phenol:chloroform

ở pH thấp, cho phép phân tách ADN, ARN và protein từ mô hoặc tế bào Phương phápnày bao gồm lysis tế bào với guanidinium isothyicyanate và phenol dung dịch một pha.Pha thứ hai hình thành sau khi thêm chloroform vào dịch chiết khiến ARN được đẩy lênpha trên ADN và protein được tủa lại bằng ethanol hoặc isopropanol còn ARN trên dịch

trong phía trên được tủa bằng isopropanol (J Sambrook và cs., 2001) [23] Một số kit

dạng này đã được bán ngoài thị trường như kít tách chiết dùng cột lọc được dùng để táchADN, ARN và protein tổng số từ 1 mẫu sinh phẩm mà không cần các hóa chất độc hạinhư phenol, chloroform, cồn Các mẫu cần tách chiết không cần phải tách riêng thành 3công đoạn trước khi cần tinh sạch cả ADN, ARN và protein (QIAGEN Inc) [42] Kit đanăng bán nhiều ngoài thị trường, qui trình có ba bước cơ bản, thời gian thực hiện chỉkhoảng 15 đến 30 phút Vì vậy, sẽ thu được nhiều sản phẩm hom nếu đưa vào tách 1 khốilượng mẫu xác định vì tránh được hao phí qua các bước trung gian [14]

1.2.3.4 Hệ thống tách chiết tự động

Hệ thống tách chiết tự động là một thiết bị khá phức tạp, cồng kềnh và đắt đượcthiết kế để tách lượng mẫu đầu vào lớn, giúp đơn giản hóa quá trình tách chiết các axit

Trang 28

nucleic Hệ thống này được thiết kế cho những phòng thí nghiệm vừa và lớn hiện nay (J

Loeffler và cs., 2004) [22] Quá trình tách chiết axit nucleic tự động được tin dùng vì nó

tiết kiệm thời gian làm việc, giảm công lao động, tăng an toàn lao động và tạo khả năngtái sản xuất và cải thiện chất lượng sản phẩm (J Boyd., 2002) [21] Bên cạnh đó nó là giảipháp hiệu quả làm tăng năng suất phòng thí nghiệm

Trong các phòng thí nghiệm lâm sàng, việc tinh sạch các phân tử sinh học nhưADN, ARN và protein từ các mẫu bệnh phẩm là cần thiết Điều quan trọng là phải thuđược các phân tử sinh học ở dạng tinh khiết và chất lượng tốt [39] Hệ thống tách chiết tựđộng vì thế rất phù hợp và hiệu suất cao Tốc độ, tính chính xác và độ tin cậy của quátrình tách chiết nên được tối đa hóa và tiến hành cùng một thời điểm để tránh nhiễm chéo

(J Loeffler và cs., 2004) [22] Giải pháp được đặt ra là phải chuẩn bị mẫu tốt để tránh

giảm chất lượng sản phẩm thu được Để ừánh tối đa khả năng nhiễm chéo và nhầm lẫn, hệthống mẫu nên được đánh dấu bằng mã vạch (G Watkins) [16]

Hệ thống được chào bán ở các phòng thí nghiệm có thể tách chiết ADN nhanhchóng và đáng tin cậy một cách tự động Hệ thống dùng các chất thuận từ để tách mẫucung cấp một lượng mẫu ổn định và tinh khiết vì không thấy phát hiện sự nhiễm chéogiữa các mẫu Toàn bộ quá trình tách chiết mất khoảng 20 phút bởi qui trình chỉ gồm 3bước đơn giản: cho mẫu vào máy ở dạng lỏng vào hộp chứa mẫu, đặt hộp mẫu vào máy,nhấn nút Start ADN được thôi lại trong dung dịch thôi mẫu ở cuối quá trình [38]

Một đại diện khác của hệ thống tự động linh hoạt và hiệu quả đối với việc tách chiếtaxit nucleic và protein cũng đã được giới thiệu Vật liệu đàu vào rất đa dạng vẫn có thể sửdụng hệ thống này Thiết bị thiết kế phù họp với lượng mẫu nhỏ và vừa Chúng lợi dụng

bề mặt hạt từ để hấp phụ các axit nucleic đã được phân lập Khả năng linh hoạt của hệthống cho phép tách chiết số lượng mẫu lên đến 20 Quá trình tách chiết cũng chỉ mất 20đến 40 phút tùy vào mẫu Kit này tối ưu hóa đươc quá trình tách chiết ADN hệ gen, ARNnội bào, các axit nucleic của vi khuẩn và vi rút [3]

1.2.4 Định hướng tương lai về tách chiết ADN

Trang 29

Tách chiết các phân tử sinh học là bước đầu tiên và cần thiết nhất để thực hiện chocác quá trình thao tác và phân tích tiếp theo sau Đòi hỏi quan trọng nhất đó là các quátrình phải được tiến hành đơn giản, nhanh và chính xác Vì vậy, các quy trình tách chiếtkhông những đòi hỏi phải đáp ứng các điều kiện về trang thiết bị tự động cho mỗi bướctách chiết mà cần phải tự động hóa các khâu chuyển hóa chất tách chiết Tự động hóa cầntăng cường trong cả quá trình và cải thiện độ tin cậy của quá trình, nhưng những thiết bịnhư này mới chỉ ừong quá trình thiết kế và thí nghiệm Một số thiết bị tách chiết axitnucleic đã có mặt ở trên thị trường đòi hỏi phải xử lý thủ công trước được sử dụng ở một

số phòng thí nghiệm Vì vậy, việc tách chiết axit nucleic cần tối đa việc tự động hóa nhờmáy móc Một thiết bị tách chiết tự động hóa toàn bộ quá trình cùng với dung dịch táchchiết các phân tử sinh học all-in-one có thể sẽ được tạo ra trong tương lai Việc tinh sạchADN, ARN, protein từ những tổ chức khác nhau với chỉ một cách thức tách chiết đơngiản

Chúng ta thường gặp khó khăn đối với các mẫu động vật, thực thật, thậm chí mẫumầm bệnh luôn phải gửi tới phòng thí nghiệm để tách chiết và phân tích Những mẫu này,đặc biệt là các mẫu y học như máu, cần bảo quản lạnh và chuyển đến phòng xét nghiệmgần nhất để tách chiết và phân tích Do đó, một thiết bị tách chiết các phân tử sinh học diđộng, có thể di chuyển một cách thuận tiện, giảm bớt công sức, giảm lãng phí, tăng tốc độcủa quá trình tách chiết là rất có tiềm năng để hình thảnh trong tương lai Thiết bị táchchiết di động có thể kết họp với việc phân tích các ADN, ARN, protein có thể sẽ đượcthiết kế hình thành trong tương lai sẽ giúp các nhà nghiên cứu giảm thời gian làm việc vàtăng hiệu quả công việc

Liên tục cải tiến nhằm tự động hóa tối đa là xu hướng tương tai trong các phòng thínghiệm Nhiều phòng xét nghiệm y học đang thực hiện và tìm ra những thiết bị nhỏ hơnvới tốc độ nhỏ hơn phù hợp với yêu càu phòng xét nghiệm y học Bên cạnh đó, thiết bị tựđộng có thể được cung cấp với giá thành rẻ hơn, cải thiện thời gian xử lí và cũng nhưgiảm chi phí nhân công

1.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết ADN từ mô, tế bào thực văt

Trang 30

về cơ bản, một quy trình tách chiết ADN hệ gen từ bất kỳ tế bào prokaryotic hayeukaryotic đều gồm ba bước cơ bản, (1) Phá vỡ lớp bao phủ quanh ADN (màng/thành tếbào), (2) Phân lập ADN khỏi tất cả các thành phần khác trong tế bào (mảnh vỡ thành tếbào và các vật chất trao đổi chất), (3) Duy trì tính toàn vẹn của ADN trong suốt quá trình

Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quy trình tách chiết ADN

1.2.5.1 Nguồn vật liệu và quá trình thực hiện

Sự có mặt của thành tế bào polysaccharide cứng trong cấu trúc các tế bào thực vậtgây tương đối khó khăn trong việc tách chiết ADN Do vậy, trước khi

Trang 31

quyết định lựa chọn quy trình tách chiết từ nguồn vật liệu thực vật cần phải quantâm đến một số yếu tố sau:

Loại mô và độ già của mô

Độ già của mô là loại mô ảnh hưởng rất lớn đến số lượng và chất lượng trong việctách chiết ADN Những mô non, khỏe mạnh, mềm, đặc biệt là những lá đang trong thời

kỳ phát triển là một sự lựa chọn lí tưởng để có thể thu được ADN có chất lượng tốt và sốlượng lớn do có lượng tế bào nhiều, trong khi tinh bột và các chất chuyển hóa thứ cấp có

ít (Peterson, D G et al., 1997) [36] Những lá non héo vàng cũng là một nguồn vật liệu rất

tốt cho việc tách chiết ADN Để các cây sinh trưởng trong bóng tối 3-4 ngày trước khi thu

lá để tách chiết giúp cho quá trình tách chiết hiệu quả hơn (Puchooa, D et aỉ., 2004) [40].

Ngược lại, ADN tách chiết từ những lá trưởng thành thu được số lượng và chất lượngADN kém hơn do có nhiều các polyphenol, tannin, polysaccharide và các chất chuyển hóathứ cấp, những chất đó gắn với ADN tạo thành một hỗn hợp nhày hoặc tạo nên sản phẩm

có màu nâu không phù họp và gây khó khăn cho những thí nghiệm sau (Sarwat, M et ah,

2006) [46] Ngoài lá ra, những phần khác của cây như thân, rễ, hạt, phôi, .đều có thểcũng sử dụng được phụ thuộc vào tùy loại cây và sự sẵn có của mô

Cách thu thập và bảo quản

Cách xử lý và bảo quản các mô thực vật thích hợp sau khi thu thập là một yếu tốcàn phải được quan tâm trong quy trình Đối với tách chiết ADN, vật liệu từ cây thườngđược thu thập lúc tươi và xử lý trực tiếp trong quy trình, hoặc được bảo quản ở -18°c, -

cản sự hoạt động của nuclease nếu không sẽ làm giảm ADN ừong mô đã rã đông Trongtrường hợp không thể làm lạnh ngay các mẫu thu thập được như ở trên đồng ruộng, haynhững vùng xa xôi, thì có thể bảo quản mô trong những dung dịch như

cetyltrimethylammonium bromide bão hòa (CTAB)-NaCl-NaN3 (Bhattacharjee, Rv et al.,

2004) [7], hoặc những vật liệu đã được làm khô như silica gel và sau đó bảo quản để tránh

bị nhiễm bẩn do nước đọng lại Các mẫu được bảo quản dưới hình thức đông lạnh là lựa

Trang 32

chọn tốt nhất cũng như cho phép bảo quan trong nhiều năm mà chất lượng ADN giảm đikhông nhiều

Đồng họp chất hóa

Trong các tế bào thực vật, sự có mặt của thành tế bào polysaccharide cứng khiến sựphá vỡ các mô có một chút phức tạp, chiếm khoảng 30-70% tổng thời gian yêu cầu choquá trình xử lý mẫu Trong trường họp này, mức độ sử dụng các yếu tố vật lý tác độngvào ADN làm giảm sản phẩm, lực tác động vật lý để phá vỡ thành tế bào đủ để làm đứt

gãy ADN có trọng lượng phân tử cao (Muưay, M G et al., 1980) [32] Đồng họp chất hóa

là rất cần thiết để làm giảm độ nhớt do các hợp chất có trọng lượng phân tử cao như các

carbohydrate phức tạp (Wilson, K et al., 1994) [54] Một sự khác biệt lớn của các phương

pháp phá vỡ theo vật lý được sử dụng như nghiền mô bằng máy nghiền, chày cối, quethủy tinh hoặc kim loại, bi thủy tinh Nghiền mô trong Nitơ lỏng làm lạnh đột ngột làmột biện pháp được ưa chuộng và phổ biến hơn, phương pháp này nhanh, áp dụng đượccho cả mô mềm và mô cứng lại cũng tránh được sự tạp nhiễm khi thực hiện với số lượng

mẫu lớn (Kuta, D D et al, 2005) [26] Hạn chế lớn nhất đối với Nitơ lỏng đó là phương

pháp lưu trữ đặc biệt và giá thảnh cao, khiến chúng không thích hợp cho những phòng thí

nghiệm còn thiếu thốn trang thiết bị (Kang, T J et al., 2004) [25].

Bên cạnh những phương pháp phá vỡ mô nhờ vật lý cho những mô có đồng hợpchất, thì những phương pháp phá võ nhờ hóa chất thích hợp cũng có thể rất hữu dụng.Phương pháp này cũng tốn kém và cũng có thể làm phá vỡ và làm đứt gãy ADN thu được

do tác động của những hóa chất được sử dụng Các hóa chất phá vỡ mô chủ yếu bao gồmcác enzym thủy phân như cellulases, pectinases hoặc chất làm tan giã thành tế bào Nhiềuenzym carbohydrases cũng được cho là thích họp để sử dụng trong trường hợp này như

Ilex aquifolium,

Vitìs vinifera, Humulus lupulus, Geranium sp (Manen, J F et al., 2005) [30] Một

phương pháp khác sử dụng hợp chất xanthateforming như sodium/potassium ethylxanthogenate cũng đã được báo cáo trong trong vấn đề này Những hợp chất này tạo nên

Trang 33

bào và phá hủy nó Ngoài phá hủy thành tế bào, các tế bào thực vật cũng như mọi tế bàokhác có thể phá hủy màng của chúng Phương pháp này đặc biệt hữu dụng với những ládai như lá lúa, có chứa lượng lớn cellulose, pectin, silica cells, chất sáp (Williams, C E

et al., 1994) [70] Tuy nhiên, phương pháp này đã được đánh giá là cho số lượng ADN khá ít (Manen, J F et al., 2005) [30].

1.2.5.2 Sự có mặt của các yếu tổ gây nhiễm

Vấn đề khó khăn thường gặp nhất ở hầu hết các quy trình là sự có mặt của cácthành phần gây nhiễm ừong mẫu ADN, thường là các ARN, proteins, polysaccharides,polyphenolics và non-nuclear ADN Các chất chuyển hóa thứ cấp cũng là yếu tố gây khókhăn có trong các tế bào thực vật, đặc biệt là khi sử dụng các nguồn cây dược liệu Dướiđây là một số các yếu tố gây nhiễm

Các Polysaccharide

Polysaccharides là mối quan tâm hàng đầu trong trong quy trình tách chiết ADN dochúng khó loại bỏ Sự có mặt lượng lớn các polysaccharides trong các cây có độ nhầy cao

như Sedum telephỉum (Barnwell, p et ah, 1998), [7], làm cho các mô homogenate rất

nhầy, khiến biểu thị sai số lượng ADN có trong đó Polysaccharides thường kết tủa cùngvới ADN và cũng gây cản trở đối với sự hoạt động của các enzym như polymerases,ligases và enzym giới hạn endonucleases Polysaccharides là chất gây nhiễm có thể gây ranhững động lực học liên kết bất thường, và làm cho ADN khó có thể sử dụng cho nhữngthí nghiệm sau Các ADN bị nhiễm có xu hướng bám vào giếng trong khi điện di

(Chakraborty, D et al., 2006) [9].

Sử dụng NaCl nồng độ cao (>0.5 M) cũng có thể loại bỏ Polysaccharides khỏi dungdịch chứa ADN đã được hòa tan bởi ethanol Nồng độ của NaCl khác nhau tùy thuộc vàomỗi loài cây Tác giả Zidani đã sử dụng NaCl 1.4M với cây kê (Pennisetum glaucum)(Zidani, s et al., 2005) [60]; Tác giả Aljanabi đã sử dụng NaCl 6M với cây lúa mì (Triticum aestivum) và lúa mạch (Hordium vulgaris) có nhiều polysaccharide (Aljanabi,

s M et al., 1997) [4] NaCl kết họp với các cation trong CTAB cũng đã cho thấy đc hiệu

quả trong quy trình tách chiết đối với những cây giàu polysaccharide (Syamkumar, s et

Trang 34

al., 2003) [50] CTAB giúp kết lắng ADN nhờ hình thành phức hợp trong môi trường

nồng độ ion thấp, và nồng độ muối cao, hình thành phức chất không hòa tan cùng vớiprotein và hàu hết axit polysaccharides, bỏ lại ADN trong dung dịch, sau đó có thể dễdàng thu thập được ADN Có những bộ phận ừên cây chứa quá nhiều polysaccharide, như

ở củ, hạt polysaccharide dính với nhựa cũng có thể áp dụng được để loại bỏ các chất tạpnhiễm Tác giả Rogstad đã sử dụng các enzym thủy phân như pectinase để phá hủy pectin như là một yếu tố gây nhiễm trong thực vật như Quercus rubra, Castanea dentate {Rogstad, s H et al., 2001) [44] Một cách đơn giản và hiệu quả để giảm bớt

chất gây nhiễm polysaccharide bằng cách sử dụng đệm tách chiết để rửa 2 hay 3 làn

(Sharma, K K et al., 2000) [47] Các Polyphenol

Có lẽ vấn đề gặp phải thường xuyên ừong quy trình phân lập ADN thực vật làmgiảm sản phẩm ADN thu được do sự có mặt của các Polyphenol Các Polyphenol rất phứctạp và nhiều loại Trong khi dung giải các tế bào, các Polyphenol cũng được giải phóng rangoài không bào và dễ dàng bị oxi hóa bởi oxidases của tế bào Các Polyphenol bị oxi hóa

có thể tương tác được với axit nucleic và gây nên sự vón cục cho ADN, do đó nó cản ừởrất nhiều trong quá trình tách chiết Các Polyphenol như flavonoids, terpenoids andtannins, mà tất cả chúng đều chứa rất nhiều trong thực vật và không thể tách rời chúngkhỏi axit nucleic bởi những quy trình tách chiết bình thường Để giải quyết vấn đề củachất gây nhiễm Polyphenol, các chất chống oxi hóa được bổ sung vào dung dịch đệm táchchiết để ngăn chặn sự oxi hóa các phenol trong quá trình dung giải tế bào Polyvinylpyrollidone (PVP) và polyvinyl polypyrollidone (PVPP) là các chất hóa học thường được

sử dụng nhất để loại trừ các Polyphenol, chúng hoạt động bằng cách liên kết và bám vớicác Polyphenol, đặc biệt là ở pH thấp Chúng hình thành nên các phức chất với các hợpchất Polyphenol thông qua liên kết Hydro, làm cho các Polyphenol tách ra khỏi ADN,bằng cách đó sẽ làm giảm hàm lượng của chúng trong sản phẩm thu được Mỗi họp chấthoặc cả hai họp chất đó có thể được sử dụng với một tỉ lệ thích hợp như đã được thử

nghiệm bởi Basak (Basak, J et al., 2004) [6] với loài Vigna Mungoand Bambusa balcoa

Trang 35

lắng với ADN, do đó chúng cũng như một chất làm nhiễm (Puchooa, D et al., 2004) [41].

Các chất chống oxi hóa như ß-mercaptoethanol, BSA, sodium azide, axit ascorbic, DTT,sodium sulfite, sodium iso-ascorbate, etc.,cũng như PVP thường được sử dụng để xử lícác vấn đề liên quan đến các phenolic, ß- Mercaptoethanol thường được sử dụng rộng rãi

để ngăn chặn sự polyme hóa các tannin mà gây cản trở cho quá trình tách chiết mà gâyảnh hưởng tương tự như đối với các polysaccharide Trong các cây có chứa nhiều

polyphenol như cà chua, nho, Arabidopsis, canola, dừa, vv , một chất ức chế sự oxi hóa polyphenol rất hiệu quả đó là DIECA cũng đã được công bố (Chen, D H et al., 1999)

[12], Permingeat đã sử dụng glucose như một chất để làm giảm sự tạp nhiễm bởi

polyphenol trên đối tượng cây bông (Gossypium hirsutum).

Protein và ARN

Một lượng lớn protein và ARN có thể kết lắng với ADN Phân tử ARN thườngđược loại trừ nhờ sử dụng Rnase; nếu cách này không phù hợp có thể dùng lithiumchloride cũng cho hiệu quả tốt (Ahmad, s M et al., 2004) [2] Protein thường được loại

bỏ bởi các hóa chất tách chiết như SDS, chloroform và chất kết tủa etanol sau khi dunggiải nhân tế bào để thu ADN tinh sạch

Chương 2 VẶT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu

2.1 Vật liệu nghiên cứu

Vật liệu nghiên cứu là 47 giống lúa bản địa có khả năng chịu hạn của Việt Nam đã

được thu thập/ gieo trồng và thu hoạch theo từng cá thể (bảng 2.1)

Bảng 2.1 Danh sách 47 giống lúa chịu hạn nghiên cứu

TT SDK Tên giống Nguồn gốc TT SDK Tên giống Nguồn gốc

-3 1784 Lúa râu

4 1785 Lúa lài Yên Bái 23 3478 Trì trì đỏ Quảng Ngãi

5 1787 Lúa sắt Yên Bái 24 3482 Nep đuôi nai Quảng Ngãi

6 1789 Kén trắng Yên Bái 25 3483 Lúa muối Quảng Ngãi

Trang 36

7 1790 Nếp thái Yên Bái 26 3485

Lúa trì đỏ dạng 2 Bình Định

8 1794 Nếp mây Yên Bái 27 3496

Nep quạ có râu dạng 1

Bình Định

-11 1811 Lúa lốc tẻ Lào Cai 30 3947 Khâu bò khá Lai Châu

-13 1832

Khẩu nuột cung

Hà Giang 32 4123 Khẩu lẩy khao

-14 1836 Lúa lai rai Hà Giang 33 4666

IR64 (tham khảo)

-15 1837

Lúa mộ trắng

Hà Giang 34 4723 Chăm soóng Thanh Hóa

Trang 37

Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng cặp mồi đặc hiệu C)RF100 để tiếnhành phân loại 47 giống lúa thuộc tập đoàn chịu hạn nghiên cứu và 2 giống đối

chứng là Nipponbare (lúa Japonica) và Kasalath (lúa Indỉca).

* Mồi đặc hiệu C)RF100:

5’- AGTCCACTCAGCCATCTCTC-3’

3 ’-GGCCATCATTTTCTTCTTTAG-5 ’

2.2 Phưong pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp điều tra thu thập mẫu

- Thu thập tài liệu, tìm hiểu về sự phân bố của các giống địa phương của Việt Namqua các tài liệu khoa học liên quan;

- Điều tra thực tế, phỏng vấn, lấy ý kiến của cộng đồng dân cư nơi lấy mẫu Nhậndạng, mô tả tại chỗ những đặc điểm nổi bật và kế thừa các nghiên cứu có trước;

- Thu thập các mẫu hạt, bảo quản ở điều kiện phòng thí nghiệm để phục vụ các thínghiệm ở mức phân tử

2.2.2 Phương pháp ngâm ử và gieo hạt

Các mẫu hạt trong tập đoàn 47 giống lúa có khả năng chịu hạn sau khi được thutheo từng khóm được phơi khô, sau đó, tiến hành ngâm ủ (20-30 hạt/giống), gieo, thu mẫu

lá ở giai đoạn mạ để tách chiết ADN

Các bước tiến hành:

+ Chọn hạt chắc, đều (20-30 hạưgiống);

+ Sau đó ngâm hạt giống trong môi trường nước sạch 18-20 giờ, khi hạt giống hút

no nước đem rửa sạch mùi chua, chất nhờn ( 4 - 5 giờ đãi chua thay nước một lần), đãisạch để ráo nước của hạt lúa trước khi đem ủ;

+ Tiến hành ủ ấm ngay từ ban đầu (khi thóc chưa nứt nanh) ở nhiệt độ 40°C.Trong quá trình ủ, kiểm tra nếu hạt thóc khô phải tưới thêm nước Khi thóc đã nứtnanh phải nhanh chóng đảo nhẹ, rải mỏng (hạ nhiệt độ xuống khoảng 25°C).Khi hạt thóc

Trang 38

35-Ngô Thị Thanh Hòa K37A SP Sinh

ra mộng và rễ đều, mộng mập, khô ráo (hạt giống nảy mầm dài bằng 1/3 chiều dài hạtthóc) thì đi gieo Gieo đều và chìm mộng

2.2.3 Phương pháp tách chiết AND theo CTAB Ngày

7 Bỏ dịch nổi, hòa tan tủa vào 20ml SEB-M

8 Li tâm ở 650 X g, 10 phút, 4°c trong Falcon 15ml.

9 Bỏ dịch nổi, hòa tan tủa vào 20ml SEB-M

10 Li tâm ở 650 X g, 10 phút, 4°c ưong Falcon lml.

11 Bỏ dịch nổi, hòa tan tủa vào 7,5 ml SEB-M

12 Bổ sung 20% SDS (w/v) (đến nồng độ cuối cùng là 2% ) Đảo nhẹ đều

13 ủ trong bể ổn nhiệt 60°c trong 10 phút, để về nhiệt độ phòng.

14 Bổ sung 5M sodium perchlorate (20°C) đến nồng độ cuối cùng là IM

15 Li tâm 400 X g trong 20 phút để loại tinh bột.

Trang 39

22 Chuyển dịch từ màng sang falcon 15ml

23 Bổ sung RNase TI 50U/ml ADN RNase A 50 ug/ml, ủ ở 37°c trong 45 phút

24 Bổ sung Proteinase K đến nồng độ 150 |Lig/ml ủ ở 37°c trong 45 phút

25 Bổ sung tỉ lệ 1:1 thể tích Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1) lắc nhẹ trong

15 phút

26 Li tâm ở 3000 X g ừong 10 phút.

27 Chuyển dịch nổi sang Ốngl5ml

28 Bổ sung tỉ lệ 1:1 thể tích Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1) lắc nhẹ 15 phút, Li tâm ở 3000 X g trong 10 phút.

29 Bổ sung tỉ lệ 1:1 thể tích Chloroform/Isoamyl alcohol (24:1) lắc nhẹ 15 phút

30 Li tâm ở 3000 X g trong 10 phút.

31 Chuyển dịch nổi sang Ốngl5ml

Định dạng
Số trang	79
Dung lượng	257,1 KB