Nghiên cứu một số tác dụng dược lý của hỗn hợp coumarin toàn phần chiết tách từ khương hoạt ( notoptrygium incisum ting ex h t chang họ hoa tán apiaceae )

Thử một số tác dụng sinh hoc của hổn hợp coumarin toàn phần 12 chiết tách được... Thử sơ bộ một số tác dụng dược lý của hỗn hợp coumarin toàn 17 phần chiết tách từ khương hoạt... Để góp

BỘ Y TÊTRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

PHẠM NGỌC QUẾ

HỖN HỢP COUMARIN TOÀN PHẦN CHIẾT TÁCH

TỪ KHƯƠNG HOẠT (NOTOPTERYGIUMINCISƯM TING

EX H T CHANG HỌ HOA TÁN APIACEAE)

( KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược s ĩ KHOÁ 1998- 2003 )

Người hướng dẫn : PGS.TS Mai Tất Tô

TS Vũ Thị Trâm

Nơi thực hiện : Bộ môn Dược Lý

Bộ môn Dược Liệu

Thời gian thực hiện: 2/20003 - 5/2003.

LỜI CAM ƠN

Trong quá trình thực hiện khố luận tố t nghiệp, tơi dã nhận dược sự hướng dẫn và giúp đõ tận tình của :

PCS.TS Mai Tất Tố.

PGS.TS D ế Thị Thuấn.

TS Vũ Thị Trầm.

DS Nguỵễũ Quỷnh Chi.

Tơi xin b ả / tổ lịng b iết ơn sâu sắc tĩi các thẩỵ cơ hướng dẫn cùng tập

th ể thổ/ cơ giáo và kỹ thuật viên ổ hai bộ mơn Dược lực và Dược liệu Dồng thời tơi cũng xin cảm ơn ban giấm hiệu và cốc phịng chức nầng trường đại học Dược

Hà Nội dã tạo diều kiện cho tơi hồn thành khố luận nả/.

Cuối cùng, tơi xin dược gửi lời cảm ơn đến gia đỉnh, bạn b è đã khu/êh khích, dộng viên tơi trong suốt thời gian vừa qua.

Hà Nội tháng 5 năm 2003

Sinh viên

PUfK ẠíỷOù Q aí

1.2 Sơ bộ về coumarin và tác dụng dược lý của chúng 4

1.2.2 Tác dụng dược lý của nhóm chất coumarin 5

1.2.3 Coumarỉn có trong khương hoạt và những tác dụng dược lý đã 9 được nghiên cứu

2 PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN c ứ u 11

2.1 Nguyên vật liệu, động vật thí nghiệm và phương pháp nghiên 11

V

cứu

2.1.3.1 Chiết tách hỗn hợp coumarin toàn phần từ vị thuốc khương 11 hoạt

2.1.3.2 Thử một số tác dụng sinh hoc của hổn hợp coumarin toàn phần 12 chiết tách được

2.2.1 Chiết tách hổn hợp coumarin toàn phần từ vị thuốc khương 13 hoạt

2.2.1.2 Các phản ứng định tính và sắ kỷ lớp mỏng 15 2.2.2 Thử sơ bộ một số tác dụng dược lý của hỗn hợp coumarin toàn 17

phần chiết tách từ khương hoạt

ĐẶT VẤN ĐỂ

Những sản phẩm làm thuốc có nguồn gốc tự nhiên rất đa dạng và phong phú Gắn liền với lịch sử phát triển của loài người thì nguồn gốc tự nhiên của những sản phẩm làm thuốc không những được mở rộng từ thực vật, động vật, khoáng vật đến vi nấm, vi khuẩn, mà còn được sử dụng ngày càng tinh chất hơn Nhiều thuốc mới được phát hiện dựa trên những bài thuốc hay vị thuốc

cổ truyền đã khẳng định tính ưu việt về tác dụng điều trị qua thời gian tồn tại như morphin, quinine, artemisinin, ephedrin Phát huy nền y học cổ truyền và những kinh nghiệm dùng thuốc trong dân gian, việc nghiên cứu sàng lọc sâu hơn về các nguyên liệu làm thuốc có nguồn gốc tự nhiên nhằm làm sáng tỏ về tác dụng cũng như hoạt chất, tiến tới việc nghiên cứu để tạo ra những chế phẩm mới là một hướng đi đang dần được khẳng định

Khương hoạt là một vị thuốc đã được sử dụng trong y học cổ truyền để điều trị các bệnh cảm lạnh, đau đầu, và đặc biệt là điều trị phong tê thấp Nhiều công trình nghiên cứu đã khẳng định và làm sáng tỏ một số tác dụng điều trị của vị thuốc này như tác dụng giảm đau, tác dụng chống viêm, tác dụng chống ung thư Ngoài ra theo một nhóm tác giả Trung Quốc thì nước sắc khương hoạt còn có tác dụng chống loạn nhịp tim Để góp phần tìm hiểu hoạt chất của khương hoạt tiến tới sử dụng dược liệu này ngày một tốt hơn chúng

tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu một số tác dụng dược lý của hỗn hợp coumarin toàn phần chiết tách từ khương hoạt (Notopterygium incisum Ting ex H.T Chang)” với các mục tiêu sau:

- Chiết tách hỗn hợp coumarin toàn phần từ vị thuốc khương hoạt

- Thử sơ bộ một số tác dụng dược lý của hỗn hợp coumarin toàn phần: Tác dụng chống viêm cấp, tác dụng chống viêm mạn, tác dụng giảm đau và tác dụng chống loạn nhịp tim

Notopterygium incisum Ting ex H.T Chang (Khương hoạt)

Notopterygium forbesii Boiss (Khương hoạt lá rộng)

Họ hoa tán Apiaceae [4]

Khương hoạt lưu hành trên thị trường Việt Nam hiện nay được chế biến

từ rễ và thân rễ đã phơi khô của cây khương hoạt (N insisum) [7]

Theo Đỗ Tất Lợi [5] khương hoạt là một cây sống lâu năm, toàn cây có mùi thơm đặc biệt, thân rễ to khô, có đốt Thân cây cao từ 0,5 - lm không phân nhánh, thân phía dưới hơi có màu tím Lá mọc so le, kép lông chim, phiến lá chia thuỳ, mép có răng cưa tù, mặt trên màu tím nhạt, mặt dưới màu xanh nhạt, phía dưới cuống lá phát triển thành bẹ ôm lấy thân Hoa rất nhỏ, màu trắng, lập thành hình tán kép Quả bế đôi hình thoi dẹp, màu nâu đen, hai mép và ở lưng phát triển thành dìa

1.1.2 Đặc điểm vị thuốc

Dược điển Việt Nam III [4] đã mô tả hình thái vị thuốc khương hoạt:Thân rễ hình trụ, hơi cong queo, dài 4 - 13 cm, đường kích 0,6 - 2,5 cm, đầu rễ có sẹo gốc thân cây Mặt ngoài màu nâu đến nâu đen Nơi bị tróc vỏ ngoài màu vàng, khoảng giữa các đốt ngắn, có vòng mấu nhỏ gần liền nhau tựa như hình con tằm (quen gọi là Tàm khương), hoặc khoảng giữa các đốt kéo dài dạng đốt tre (quen gọi là Trúc tiết khương) Trên đốt có nhiều sẹo rễ

con dạng điểm hoặc dạng bướu và vẩy màu nâu Thể nhẹ, chất giòn xốp, dễ bẻ gẫy Mặt bẻ không phẳng, có nhiều kẽ nứt vỏ màu từ vàng nâu đến nâu tối,

có chất dầu, có điểm chấm dầu màu nâu Gỗ màu trắng vàng, tia ruột xếp theo hướng xuyên tâm rõ Lõi (ruột) màu vàng đến vàng nâu Mùi thơm, vị hơi đắng và cay

ẢNH 1:VỊ thuốc khương hoạt (Notopterygium incỉsum Ting ex H.T Chang)

1.1.3 Thu hái, chế biến

Trồng hai đến ba năm thì thu hoạch Thường thu hoạch vào mùa thu, đào về, rửa sạch, làm mềm, cắt thành miếng dày, phơi hoặc sấy khô

1.1.4 Thành phần hoá học

Một số nghiên cứu cho thấy trong khương hoạt có tinh dầu, coumarin phytosterol, acid hữu cơ, chất béo, đường khử, acid amin và một số thành phần khác như falcarindiol, các ferulat, methylcafeic este, pregnenolone [7, 25]

1.1.5 Tác dụng, công dụng

Theo y học cổ truyền [3] khương hoạt được xếp vào nhóm thuốc tân ôn giải biểu: Vị cay, tính ấm, quy kinh bàng quang, can, thận có tác dụng tán hàn giải biểu dùng khi cảm mạo, phong hàn, sốt không có mồ hôi, đau đầu, toàn thân đau mỏi, có tác dụng trừ thấp, chỉ thống để điều trị bệnh phong thấp Đặc biệt khương hoạt có tác dụng tốt trong các chứng đau nhức xương cốt, thần kinh từ lưng trở lên

Theo một số tác giả Trung Quốc [34] thì nước sắc khương hoạt còn có tác dụng chống loạn nhịp tim Các tác giả Nhật Bản [32] cho biết dịch chiết methanol của thân rễ khương hoạt có tác dụng ngăn cản sự hình thành các sản phẩm ôxy hóa

1.2 Sơ bộ vê coumarỉn và tác dụng dược lý của chúng

1.2.1 Sơ bộ về coumarin

Benzo a-pyron là chất coumarin đơn giản nhất tồn tại trong thực vật được biết đến từ năm 1820 trong cây Dipteryx odoreta Willd thuộc họ Đậu (Fabaceae) [1] Cây này mọc ở Brazil, có trồng ở Venezuela và có tên địa phương là "Coumarou" do đó nhóm chất này có tên là coumarin Các chất coumarin tan tốt trong cồn 90° và dung môi hữu cơ như ethylacetat, tan trong nước nóng, không hoặc ít tan trong nước lạnh

Cho đến nay người ta đã phát hiện khoảng hơn 200 chất coumarin khác nhau, có thể phân thành 3 nhóm chính:

Nhóm 1: Coumarin đơn giản là các coumarin chỉ có nhân Benzo a- pyron gắn với các nhóm thế khác như nhóm hydroxy, alkoxy, alkyl

Nhóm 2: Nhóm furanocoumarin là các coumarin có vòng furan liên kết với nhân Benzo- a- pyron có thể ở vị trí 6, 7 hoặc vị trí 7, 8

Nhóm 3: Nhóm pyranocoumarin là những coumarin có vòng pyran liên kết với nhân Benzo- a-pyron có thể ở vị trí 5, 6, vị trí 6, 7 hoặc vị trí 7, 8.

1.2.2 Tác dụng dược lý của nhóm chất coumarin

Nhóm chất coumarin có rất nhiều tác dụng dược lý như : Tác dụng giảm đau,

hạ nhiệt, tác dụng chống viêm, tác dụng chống đông máu, tác dụng chữa bệnh vẩy nến, tác dụng kháng khuẩn, tác dụng chống ung thư [8, 14, 20, 22, 23,

25, 26] Dưới đây là một số tác dụng dược lý của nhóm chất coumarin đã được biết đến:

I.22.1 Tác dụng chống đông máu

Đây là một tác dụng kinh điển của các dẫn chất coumarin như acenocoumarol, dicoumarol, ethylbicoumacetat, warfarin Tác dụng này được biết đến từ năm 1941, sau khi Link tìm ra chất dicoumarol Các dẫn chất coumarin chống đông máu tác dụng theo cơ chế kháng vitamin K, chúng ức chế sự tổng hợp 1 số yếu tố đông máu quan trọng như các yếu tố II (prothrombin), vn (proconvertin), IX (PTC), X (Stuart) ở gan nên cản trở quá trình đông máu Sau khi dùng các chất chống đông kể trên, nồng độ các yếu tố

II, VII, IX, X trong huyết tương giảm hẳn do đó quá trình đông máu bị kéo dài

1.2.2.2 Tác dụng chống viêm

Quá trình viêm là phản ứng tại chỗ mang tính bảo vệ với sự huy động của các yếu tố tế bào, thể dịch nhằm loại trừ và khu trú ổ viêm Phản ứng viêm được nhận biết bởi bốn triệu chứng chính là sưng, nóng, đỏ, đau [6]

Rất nhiều chất coumarin đã được ghi nhận có tác dụng chống viêm trên các mô hình thử nghiệm gây viêm bằng carrageenin

Carrageenin là tác nhân gây viêm theo cơ chế kích thích giải phóng một

số yếu tố trung gian hoá học của quá trình viêm như histamin, serotonin bradykinin và prostaglandin Trong một thí nghiệm khác người ta đã phát hiện

tác dụng chống viêm của coumarin và umbelliferone theo cơ chế giống như các thuốc chống viêm phi steroid với chất gây viêm là carrageenin tác dụng kéo dài ít nhất sau 3 giờ, đó cũng là thời gian mà carrageenin có tác dụng mạnh nhất [22].

Coumarin cũng có tác dụng chống phù nề trong thử nghiệm gây phù chân chuột bởi dextran Theo Garcia-Argaez [14] coumarin còn có tác dụng như một tác nhân gây viêm: Liều thấp của psoralen và imperatorin có tác dụng chống viêm nhưng liền cao chúng lại có tác dụng gây viêm

1.2.2.3 Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm

Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của nhóm chất coumarin đã được rất nhiều tác giả ghi nhận Điển hình là công trình nghiên cứu về tác dụng kháng khuẩn của dịch chiết cây Pealargonium sidoides và cây Pealargonium reniforme của hai tác giả người Đức Kayser và Kolodziej [17] Bằng phương pháp thạch pha loãng hai tác giả đã cho thấy một số thành phần coumarin trong dịch chiết có tác dụng kìm khuẩn Kết quả được tóm tắt ở bảng 1

Bảng 1 : Tác dụng kháng khuẩn của coumarỉn

Staphylococus aureus

6,8-dihydroxy-5,7dimethoxycoumarin

ScopoletinUmekalinStreptococus pneumoniae

6,8 -dihy droxy-5,7dimethoxy coumarin

5,6,7-trimethoxy coumarin

Umekalin

Haemophilus influenzae 5,6,7-trimethoxy coumarin

Kwon và cộng sự [20] đã ghi nhận 5,8-di-(2,3-đihdroxy-3- methylbuthoxy)-psoralen và Byakangelicin có tác dụng kháng nấm Asperilus

sp và Clodosporium sp

1.2.2.4 Tác dụng chống ung thư

Trên tế bào ung thư, coumarin và dẫn chất của nó làm thay đổi đáng kể

sự điều chỉnh đáp ứng miễn dịch, sự phát triển của tế bào và quá trình phân bào [27] Coumarin có thể tác động trực tiếp lên tế bào ung thư hay gián tiếp qua sự điều chỉnh hệ thống miễn dịch của vật chủ, bằng cách đó kích thích hệ thống miễn dịch hoạt động lại, chỉ huy hệ thống bảo vệ chống lại sự tái phát của tế bào ung thư Trong một nghiên cứu của Fujioka [12] thì dịch chiết của

rễ cây Angelica japonica (gồm các thành phần: Scopoletin, japoangelone, oxypeucedanin, xanthotoxin, bergapten) có tác dụng chống lại sự phát triển của tế bào ung thư dạ dày MK-1

1.2.2.5 Những tác dụng dược lý khác và độc tính

Tác dụng ức chế cytocrom P450 ở gan của coumarin đã được Koenigs

và cộng sự [18] ghi nhận do đó nó có thể gây ra tương tác thuốc đối với các thuốc chuyển hoá phần lớn qua enzym này

Trong một công trình nghiên cứu của Woo và đồng sự [29] đã cho thấy tác động của imperatorin, isoimpertorin, oxypeucedanin và isooxypeucedanin trong dịch chiết methanol của cây Angelica koreana làm chậm chuyển hoá thuốc cả trên invitro và invivo

Praeruptorin A, xanthotoxin, psoralen và bergapten trong dịch chiết cloroform của rễ cây Peucedanum japonicum có tác dụng ức chế monoamine oxidase ở não chuột [16]

v ề độc tính của nhóm chất coumarin chưa thưc sự rõ ràng, tuy nhiên hiêp hội thuốc, thực phẩm và viện ung thư quốc gia của Mỹ đã cảnh báo về độc tính và khả năng gây ung thư của một số chất coumarin [28].

Bảng2 : Một sô tác dụng dược lý của coumarin đã được ghi nhận

ịTác dụng chống viêm irivitro và

inịivo

CHEN, Y.F và cộng sự (1995) LINO, c.s và cộng sự (1997) GARCIA-ARGAEZ và cộng sự (2000)

Tác dụng ức chế 5-lipoxygenase

inịvitro

HOULT, J.R.S và cộng sự (1994) LIU, J.H và cộng sự (1998)

Tác dụng giảm đau LINO, c.s và cộng sự (1997)

OKUYAMA, E va cộng sự (1993)Tác dụng chống loạn nhịp tim ZHU, X và cộng sự (1990)

Tác dụng chống đông máu LINK (1941)

Tác dụng kháng khuẩn KAYSER, 0 và cộng sự (1997)

Tác dụng kháng nấm KWON, Y.s và cộng sự (1997)

Tác dụng chống ung thư inỊdtro

SELIGER, B (1997 )KOFINAS, c và cộng sự (1998) FUJIOKA, T và cộng sự (1999) NAM, N H (2002)

Tác dung chống ký sinh trùng sốt

rét inỵivo và inyitro YANG, U.Z và cộng sự (1992)

Tác dụng chống virut invitro FULLER, R.W và cộng sự (1994)Tác dụng đối kháng calci invitro và

invivo

YAMAHARA, J và cộng sự (1989 ) CHIU, K.W và cộng sự (1997 )Tác dụng ức chế hoạt động men gan

invitro

KOENIGS, L.L và cộng sự (1997 )

Tác dụng ức chế mono amin oxidase HUONG, D.T và cộng sự (1999 )Tác dụng ức chế protein kinase

Tác dụng chữa bệnh vảy nến LEWIS, H.M (1994)

McNEELY, w và cộng sự (1998)

1.2.3 Coumarin có trong khương hoạt và những tác dụng dược lý đã được nghiên cứu

Theo một nhóm tác giả Trung Quốc và Nhật Bản [9] thì họ đã phát hiện

ra 15 coumarin được chiết và phân lập từ khương hoạt (N.incisum), dựa trên

quang phổ cơ bản và khối phổ (UV, IR, MS, NMR và 2D- NMR).Những

coumarin đó là: Notoptolide, ethylnotopterol, anhydronotoptoloxide,

bergapten, isoimperatorin, demethylfuropinaein, bergaptol, notoptol,

notopterol, anhydronotoptol, xanthoxol, bergamottin, 7 isopentonyloxy -6-

methoxy-courmarin, 7-(3,7-dimethyl-2,6-octadenyloxy)-6-methoxy-coumarin

và nodakenin

Năm 1993, các tác giả Nhật bản [26] đã công bố notopterol là thành

phần có tác dụng giảm đau của N.incisum trên thí nghiệm gây quặn đau bởi

acid acetic trên chuột Bằng thử nghiệm trên tính thấm thành mạch các tác giả

cũng xác định đây là một trong số những thành phần có tác dụng chống viêm

của khương hoạt

Theo một số tác giả người Đức [23] thì notopterol, isoimperatorin, và

phellopterin là 3 thành phần coumarin có tác dụng ức chế 5- Lipoxygenase (5-

LOX) và cyclooxygenase (COX) là các enzym xúc tác quá trình chuyển acid

arachidonic thành prostaglandin và leucotrien (các chất trung gian hoá học

gây viêm và đau)

Theo Nguyễn Hải Nam [25], nhóm chất coumarin được chiết từ khương

hoạt Notopterygium incisum còn có tác dụng chống ung thư Công trình

nghiên cứu này đã chiết xuất, phân lập các chất coumarin từ khương hoạt và

thử hoạt lực chống ung thư của từng chất, có so sánh với một số chất như 5

Fluorouracil, Etoposide, Adriamycin cụ thể kết quả đã được tác giả ghi nhận ở

bảng 3

Bảng 3 : Tác dụng chông ung thư của coumarin chiết tách từ khương hoạt

B16: Tế bào sắc tố của chuột

P388: Tế bào ung thư bạch cầu của chuột

A549: Tế bào ung thư phổi của người

SK-OV3: Tế bào ung thư buồng trứng của người

PHẦN 2: THựC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN c ứ u

2.1 Nguyên vật liệu, động vật thí nghiệm và phương pháp nghiêncứu

2.1.1 Nguyên vật liệu

- Vị thuốc khương hoạt mua ở phố Lãn Ông - Hà Nội được rửa sạch,

sấy khô ở nhiệt độ 40°c sau đó tán thành bột (kích thước < 0,8 mm) để chiết suất

-Thuốc Aspégic (Sanofi synthelabo Vietnam) gói bột pha dung dịch uống 100 mg Thành phần: Acétylsalicylate de lysine 180 mg, tương ứng acid acétylsalicylique 100 mg

- Máy cất quay thu hồi dung môi dưới áp lực giảm Biichi 461 (Thuỵ sỹ)

- Máy đo điện tim Cardiofax của hãng Nihonkohden (Nhật Bản)

- Máy 7280 Hot plate của hãng Ugobasile (Italia)

2.1.3 Phương pháp nghiên cứu

2.1.3.1 Chiết tách hỗn hợp coumarin toàn phần từ vị thuốc khương hoạt

Chúng tôi đã sử dụng phương pháp chiết nóng bằng cồn 90° sau đó tách bằng dung môi ethylacetat [7, 25]

Sau đó dùng các phản ứng định tính coumarin kết hợp với sắc ký lớp

mỏng để chứng minh sản phẩm chiết tách được là hỗn hợp coumarin toàn

phần

2.1.3.2 Thử một số tác dụng dược lý của hổn hợp coumarin toàn phần chiết tách được

2.1.3.2.1 Tác dụng chống loạn nhịp tim

Tiến hành thí nghiệm trên 2 lô thỏ : Một giờ sau khi cho thỏ uống

thuốc, gây loạn nhịp bằng dung dịch BaCl2 2% tiêm tĩnh mạch vành tai Theo

dõi điện tim của thỏ trên ba chuyển đạo Dị, D2, D3 cho đến khi nhịp tim trở lại

bình thường, ghi thời gian loạn nhịp, so sánh giữa lô thử và lô chứng [7]

2.1.3.2.2 Tác dụng chống viêm cấp

Thí nghiệm trên 3 lô chuột cống trắng:

Lô thử, lô chứng và 1 lô cho uống Aspégic để đối chiếu Gây viêm bằng

(Carrageenin 1 %) tiêm dưới da gan bàn chân chuột, đo thể tích bàn chân chuột

trước sau khi gây viêm, so sánh tỷ lệ phù chân chuột giữa 3 lô

2.1.3.2.3 Tác dụng chống viêm mạn

Tiến hành thí nghiệm trên 3 lô chuột cống trắng như thí nghiệm chống

viêm cấp Gây viêm theo phương pháp Donop Jonlon bằng cách cấy vào mỗi

bên nách chuột một viên amian đã nhúng carrageenin 1% Cho chuột uống

thuốc liên tục trong 5 ngày Ngày thứ 6 bóc tách u hạt, so sánh trọng lượng u

hạt giữa 3 lô

2.1.3.2.4 Tác dụng giảm đau

- Phương pháp gây quặn đau bằng acid acetic:

Thí nghiệm được tiến hành trên chuột nhắt trắng, gây quặn đau bằng acid acetic 1% Theo dõi và ghi số lần quặn đau của chuột trong từng 5 phút một đến phút thứ 30.

Vậy tỷ lệ phần trăm hỗn hợp coumarin toàn phần thu được từ dược liệu khô, theo phương pháp chiết tách của chúng tôi là:

5,80/500 X 100% = 1,16%

Hình 1:

Sơ đồ quy trình chiết tách hổn hợp coumarin toàn phần từ khương hoạt

2.2.1.2 Các phản ứng định tính và sắc kí lớp mỏng

Lấy 0,1 (g) cao (hỗn hợp coumarin toàn phần) hoà tan trong 10ml cồn 90° để tiến hành các phản ứng định tính sau:

*Phản ứng mở, đóng vòng lacton:

Lấy 2 ống nghiệm, cho vào mỗi ống lml dịch chiết cồn 90°

Ống nghiệm 1: Thêm 0,5ml NaOH 10%

Ống nghiệm 2: Thêm 0,5ml nước cất

Đun cách thuỷ cả hai ống khoảng 5 phút sau đó để nguội, thêm vào mỗi ống 4ml nước cất, thấy ống nghiệm 1 trong hơn ống nghiệm 2 Thêm vào mỗi ống lml HC110% thấy cả 2 ống đều vẩn đục Chứng tỏ phản ứng dương tính

*Phản ứng diazo hoá:

Cho vào ống nghiệm lml dịch chiết cồn 90°, thêm vài giọt NaOH 10% Sau đó cho vào ống nghiệm 2 giọt thuốc thử diazo thấy xuất hiện màu đỏ sẫm chứng tỏ phản ứng dương tính

*Huỳnh quang tăng lên ở môi trường kiềm khi soi dưới ánh đèn tử ngoại:

Nhỏ một giọt dịch chiết cồn 90° lên giấy thấm, nhỏ tiếp lên đó 1 giọt NaOH 5%, sấy nhẹ Che một nửa vết với đồng xu rồi chiếu tử ngoại trong vài phút sau đó cất đồng xu đi Kết quả nửa vòng không che sáng hơn nửa vòng tròn bị che Tiếp tục chiếu thấy nửa bị che sáng dần lên

* Sắc kỷ lớp mỏng:

Chúng tôi đã tiến hành chấm sắc ký dịch chiết ethylacetat đối chiếu với dịch chiết cồn ban đầu trên bản mỏng silicagen G60F254 tráng sẵn sắc ký được khai triển trên hệ dung môi cloroform : ethylacetat (1:1) Sau khi triển khai, bản

sắc ký được để ngoài không khí cho bay hết dung môi, quan sát các vết trên sắc ký bằng huỳnh quang dưới ánh sáng u v ở bước sóng X = 254 nm và X =

( Ả = 366 nm)

Nhân xét: Kết quả sắc ký lớp mỏng cho thấy số vết chất có trong dịch chiết ethylacetat hoàn toàn tương ứng với số vết chất có trong dịch chiết cồn ban đầu cả về màu sắc lẫn giá trị Rf, kết hợp với kết quả của các phản ứng định tính đã khẳng định sản phẩm chiết tách được là hỗn hợp coumarin toàn phần có trong khương hoạt

2.2.2 Thử sơ bộ một số tác dụng dược lý của hỗn hợp coumarin toàn phần chiết tách từ khương hoạt

2.22.1 Tác dụng chống loạn nhịp tim

Để đánh giá tác dụng chống loạn nhịp tim của hỗn hợp coumarin toàn

phần, chúng tôi tiến hành thí nghiệm đo điện tim thỏ bằng máy Cardiofax của

Nhật Bản

Thỏ thí nghiệm cả hai giống đực và cái khoẻ mạnh, cân nặng từ 1,8 đến

2,3 kg chia làm 2 lô: Lô chứng và lô thử, mỗi lô 6 con

Lô chứng: Cho thỏ uống nước muối sinh lý 0,9% vào trong 3 ngày, mỗi

ngày 2ml/kg Ngày thứ 3, một giờ sau khi cho uống, đo điện tim thỏ, ghi xuất

phát điểm Sau đó, gây loạn nhịp tim thỏ bằng dung dịch Bariclorid 2% tiêm

tĩnh mạch vành tai thỏ với liều 0,2ml/kg Đo điện tim thỏ sau tiêm 2 phút, 5

phút, 10 phút và cứ sau 5 phút đo một lần đến khi điện tim trở về xuất phát

điểm

Lô thử : Làm tương tự như đối với lô chứng, thay nước muối sinh lý

bằng hỗn dịch coumarin toàn phần 1,16% pha trong nước muối sinh lý với liều

2ml/kg/ngày, tương đương với liều khương hoạt 2g/kg/ngày

Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 4 và hình 2, 3 c íkv

o l J k - Ì