Nghiên cứu khả năng bất động tế bào nấm men saccharomyces cerevisae của gel calci alginat

ĐẶT VẤN ĐỂBất động tế bào là một công nghệ mới và tiên tiến, dù chỉ mới ra đời chưa lâu nhưng nó đã thể hiện được nhiều ưu điểm vượt trội hơn so với các phương pháp truyền thống sử dụng

BỘYTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ NGỌC MAI

N G H IÊ N cúu K H Ả NÃ NG BẤ T Đ Ộ N G TÊ BÀ O N Ấ M M EN

SA C C H A R O M Y C ES CER EV ISIA E C Ủ A G E L C ALC I-Ạ LG IN AT

(Khóa luân tốt nghiêp dươc sỹ khóa 2002 - 2007) \

piỉóm í

ị u i í í W

Nơi thực hiện : Bộ môn Công nghiệp Dược

Trường Đại học Dược Hà Nội Thời gian thực hiện : Từ 12/2006 đến 5/2007

LỜI CẢM ƠN

Vói tất cả sự kính trọng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: TS Đàm Thanh

Xuân, bộ môn Công nghiệp Dược trường Đại học Dược Hà Nội - người thầy đã trực

tiếp hướng dẫn tôi thực hiện khóa luận này

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS TS Từ Minh Koóng, hiệu trưởng trường Đại học Dược Hà Nội, ThS Lê Xuân Hoành, bộ môn Công nghiệp Dược trường Đại học Dược Hà Nội đã cho tôi nhiều ý kiến quý báu và giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện khóa luận

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các anh, chị kỹ thuật viên trong bộ môn Công nghiệp Dược đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi thực hiện khóa luận

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể các thầy cô trong trường đã dạy dỗ, dìu dắt tôi trong những năm học ở trường

Cuối cùng, vói lòng biết ơn sâu sắc tôi xin gửi lòi cảm ơn đến gia đình tôi - bố,

mẹ, các anh chị và tất cả những người thân, bạn bè đã động viên, khích lệ, ủng hộ nhiệt thành và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2007

Sinh viên

Trần Thị Ngọc Mai

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN Đ Ể 1

PHẦN I -T Ổ N G Q U AN 2

1.1 SACCHAROMYCES CEREVISIAE 2

1.2 LÊN MEN SẢN XUẤT ETHANOL 3

1.2.1 Các phương pháp sản xuất alcol truyền thống từ vi sinh v ậ t 4

1.2.2 Nhược điểm của sản xuất alcol theo phương pháp truyền thống 6

1.3 PHƯƠNG PHÁP BẤT ĐỘNG TẾ BÀ O 6

1.3.1 Các phương pháp bất động tế bào 8

1.3.2 Các ứng dụng của phương pháp bất động tế bào 12

1.4 ALGINAT 14

1.4.1 Cấu trúc của alginat 14

1.4.2 Tính chất của algỉnat 15

1.4.3 ứng dụng của alginat 18

PHẦN II - THỰC NGHIỆM VÀ KẾT Q UẢ 19

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THựC NGHIỆM 19

2.1.1 Nguyên vật liệu 19

2.1.2 Phương pháp thực nghiệm 20

2.2 KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT 25

2.2.1 Sô lượng tế bào có trong hạt gel calci alginat 25

2.2.2 Số lượng tế bào có trong dịch lên men 31

2.3 BÀN LUẬN 33

KẾT LUẬN 36

ĐỂ XUẤT 36

ĐẶT VẤN ĐỂ

Bất động tế bào là một công nghệ mới và tiên tiến, dù chỉ mới ra đời chưa lâu nhưng nó đã thể hiện được nhiều ưu điểm vượt trội hơn so với các phương pháp truyền thống sử dụng tế bào tự do và so với cả kỹ thuật bất động enzym - cơ sở của phương pháp bất động tế bào Sản xuất bằng phương pháp bất động tế bào cho năng

- suất tạo sản phẩm cao hơn, sản phẩm tinh khiết hơn, và đặc biệt là có thể sản xuất

liên tục trong các qui trình được tự động hóa Bởi vậy, bất động tế bào đã thu hút được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới Ngày càng có nhiều sản phẩm sinh học được sản xuất bằng phương pháp bất động tế bào ở qui mô công nghiệp, có thể kể đến một vài ví dụ tiêu biểu như: sản xuất siro fructose từ tinh bột, sản xuất 6 - APA là tiền chất để tổng hợp nhiều kháng sinh nhóm p - lactam, sản xuất ethanol dùng trong nhiều ngành công nghiệp và năng lượng

ở Việt Nam, bất động tế bào còn là một vấn đề khá mới mẻ và mới chỉ được nghiên cứu ở qui mô phòng thí nghiệm Trong khi đó, nhu cầu của con ngưòi về những sản phẩm sinh học ngày một tăng lên đòi hỏi chúng ta phải tiếp cận với những tiến bộ của thế giói để nâng cao năng suất, chất lượng sản phẩm và tạo ra nhiều sản phẩm mới Bởi vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu kỹ thuật bất động tế bào trong lĩnh vực sản xuất liên tục ethanol với khóa luận tốt nghiệp: “Nghiên cứu khả năng

bất động tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae của gel calci alginat”

Nghiên cứu này nhằm các mục tiêu:

1 Đánh giá khả năng cố định tế bào nấm men của gel caỉci alginat ở những nồng độ algỉnat khác nhau và ở những nồng độ tế bào khác nhau.

2 Đánh giá khả năng cố định tế bào nấm men của gel calci alginat trong trạng thái lên men liên tục và lên men tĩnh.

3 So sánh khả năng cố định tế bào của calci alginat và thạch agar ở trạng thái lên men tĩnh.

PHẦN I - TỔNG QUAN

1.1 SACCHAROMYCES CEREVISIAE

Nấm men là vi sinh vật điển hình cho nhóm nhân thật, chúng phân bố rất rộng rãi

trong tự nhiên, nhất là ở các cơ chất có chứa đường, pH thấp như mật mía, ri đường, rau quả Loại nấm men để làm rượu bia thường sử dụng là s cerevỉsiae có kích

thước trong khoảng từ 2,5 - 10|im X 4,4 - 21|j.m, có thể nhìn thấy rõ dưới kính hiển

vi quang học

s cerevisiae có nhiều hình dạng: hình trứng, hình ovan, hình quả chanh Chúng

chủ yếu sinh sản theo lối nảy chồi Ở phương thức sinh sản này, từ tế bào mẹ nảy ra một chồi nhỏ lớn dần lên rồi sẽ tách ra Có trường hợp tế bào con không tách rời mà

kết thành một chuỗi tạo thành khuẩn ty giả Khi gặp điều kiện không thuận lợi s

cerevisiae còn sinh sản bằng bào tử [3], [8]

ứng dụng của s cerevỉsỉae:

Từ xa xưa, loài ngưòi đã biết sử dụng nám men để làm rượu, làm bánh mỳ, nước hoa quả và làm các loại nước có gas Ngày nay, những ứng dụng đó của nấm men vẫn tiếp tục được sử dụng rộng rãi trong đời sống Trong công nghiệp, nấm men được dùng để sản xuất các loại đồ uống chứa cồn (rượu, rượu vang, bia, nước giải khát ).Nấm men còn được nuôi cấy trong điều kiện hiếu khí để thu sinh khối Từ sinh khối nấm men người ta đã tạo ra nhiều sản phẩm rất có ích cho cuộc sống Một số ứng dụng của sinh khối nấm men có thể kể đến như:

- Sinh khối nấm men dưới dạng men ép được dùng làm men bánh mỳ, bột nở trong sản xuất bánh mỳ, bánh bao và các loại bánh làm từ bột nhào

- Men ép được dùng để sản xuất cao nấm men, bột nấm men dùng làm môi trường lên men các vi sinh vật trong phòng thí nghiệm

- Sinh khối nấm men để sản xuất protein đơn bào làm thực phẩm và cũng là một loại thức ăn tốt trong chăn nuôi

- Từ sinh khối nấm men có thể chiết tách được nhiều loại enzym như: amylase, lactase, uricase

- Sinh khối nấm men còn có chứa hàm lượng cao vitamin nhóm B, p - caroten, ergosterol, acid ribonucleic và các amino acid không thay thế như lysin, cystein và methionin được dùng làm thuốc bổ [4], [5]

Trong y dược, nhờ áp dụng những thành tựu của kỹ thuật di truyền, các nhà khoa học đã tạo ra được những chủng nấm men có khả năng siêu tổng hợp ngoại bào Những chủng này có thể sinh ra một lượng enzym ngoại bào vượt xa nhu cầu sử dụng trong trao đổi chất của chúng, lượng enzym thừa được chiết lấy để làm thuốc Những enzym được sản xuất theo cách này là amylase, glucoamylase, lipase dùng làm thuốc hỗ trợ tiêu hóa Một số biệt dược là chế phẩm đông khô của nấm men có mặt trên thị trường như Bioflor, Ultra - Levue để dự phòng và điều trị tiêu chảy, điều trị hội chứng kích thích ruột và các trường hợp ỉa chảy do loạn khuẩn đường ruột khi sử dụng kháng sinh [4]

Chủng nấm men s cerevisiae cũng có nhiều ứng dụng trong thực tế Nuôi

s cerevisiae trong những điều kiện đặc biệt chúng sẽ tạo ra hàm lượng cao vitamin D

hoặc ergosterin để bào chế thành những thuốc quí có giá trị trong y học Không những

thế, s cerevỉsỉae hiện còn đang được sử dụng như một vector để mang các AND tái tổ

hợp phục vụ cho việc sản xuất các sản phẩm sinh học có hiệu quả điều tri cao như:

insulin, interferon, kháng thể s cerevisiae cũng được dùng trong bất động tế bào để

sản xuất liên tục ethanol và một vài sản phẩm khác; nhiều nước trên thế giói đã đưa công nghệ này vào sản xuất công nghiệp thay cho phương pháp truyền thống lên men

mẻ [5], [7]

1.2 LÊN MEN SẢN XUẤT ETHANOL

Lên men rượu là quá trình biến đổi đường thành rượu và khí cacbonic dưói tác dụng của vi sinh vật, thường gặp nhất là lên men bỏi nấm men

Lên men rượu được tóm tắt theo phương trình sau:

C6H120 6 -> 2C2H5OH + 2CƠ2 + Q( glucose) ( alcol ethylic) ( cacbonic)Lên men rượu là một quá trình hóa sinh phức tạp, qua nhiều giai đoạn, ngoài sản phẩm chính là rượu thì còn tạo ra nhiều sản phẩm phụ như glycerin, aldehyd acetic, acid acetic, acid lactic, acid citric, sinh khối và rượu bậc cao [8]

Nguyên liệu dùng cho lên men rượu là những nguyên liệu chứa đường, tinh bột, cellulose và dịch thuỷ phân từ gỗ, dịch thải của các nhà máy giấy ở dạng kiềm - Sulfit Nguồn đường sử dụng là các monosaccharid như glucose và fructose; disaccharid như saccharose và maltose; các nguyên liệu chứa đường như ri đường, mía, củ cải đường Tinh bột và cellulose do không thể lên men trực tiếp được nên cần qua giai đoạn thuỷ phân thành đường rồi mới được lên men.

Nồng độ đường 10 - 20%, nhiệt độ 28 - 30°c và pH trong khoảng từ 3,5 - 4,5 là điều kiện thuận lọi nhất cho việc lên men

Rượu sinh ra được tích tụ dần trong dịch lên men và chính nó lại trở thành chất

ức chế, kìm hãm các tế bào nấm men Ở nồng độ 2 - 5%, rượu có tác dụng kìm hãm

nấm men phát triển, và ở nồng độ 5 - 6% rượu làm nấm men đình chỉ sinh sản mặc

dù sự lên men vẫn tiếp tục Các nấm men rượu vang có thể lên men được ở độ rượu 16%, riêng s ovifornis lên men được ở độ rượu tới 19 - 22%.

Kỵ khí là một yêu cầu quan trọng trong lên men rượu Trong điều kiện kỵ khí, sự lên men xảy ra rất mạnh mẽ (alcol ethylic tạo thành nhiều) vì khi đó nấm men thu năng lượng để duy trì các hoạt động sống của mình chỉ bằng cách lên men glucose thành rượu mà ít sinh sản tạo ra sinh khối Khi có không khí, nấm men chuyển sang chu trình hô hấp hiếu khí tạo ra nhiều sinh khối và sự lên men sẽ yếu đi

Lên men rượu thường dùng s cerevisiae vì chúng có khả năng sinh trưởng

nhanh, lực lên men cao và có khả năng chịu được độ cồn lớn Có chủng có thể chịu được nồng độ cồn đến 16 -18%, có khi còn cao hơn, thông thường vào khoảng 8 - 12% Trong công nghiệp lên men cồn thường sử dụng các chủng nấm men đáp ứng được các điều kiện sau:

- Lên men được nhiều loại đường khác nhau và đạt được tốc độ lên men nhanh, ít tạo

ra các tạp chất

- Chịu được độ cồn cao: 10 - 12%

- Thích nghi được với điều kiện không thuận lợi của môi trường, đặc biệt là đối với chất sát trùng [8], [11]

1.2.1 Các phương pháp sản xuất aỉcol truyền thống từ vỉ sinh vật

1.2.1.1 Đường hoá bằng bánh men thường hay bánh men thuốc bắc

Đây là phương pháp được dùng khá phổ biến trong dân gian khi nấu rượu từ các nguyên liệu có chứa tinh bột (gạo, ngô, khoai, sắn )- Trong bánh men có một tập hợp các vi sinh vật như: nấm sợi, nấm men, vi khuẩn được nuôi cấy và phát triển trên môi trường tinh bột sống Nếu là bánh men thuốc bắc thì còn có thể bổ xung thêm từ 10 - 20 vị thuốc bắc (quế, hồi, thảo quả, sa nhân ) để tạo hương vị Cho bánh men ủ với tinh bột đã được nấu chín ta thu được rượu chỉ qua một giai đoạn:

HTJ I t * 1 thủy phân „ lên men _

Tỉnh b ộ t - — -> Đường - — > Rượu

Rượu làm theo phương pháp này có mùi vị thơm ngon tự nhiên song hiệu suất thu được thấp Do vậy, hiện nay phương pháp này chỉ chủ yếu sử dụng để đường hoá tinh bột thành đường khi sản xuất rượu theo phương thức thủ công [6], [9]

1.2.1.2 Phương pháp Maltase

Phương pháp này dựa trên nguyên tắc sử dụng enzym (chủ yếu là các enzym a và

ß - amylase) của thóc đại mạch, tiểu mạch đã nảy mầm (malt) để chuyển hoá tinh

bột đã được hồ hoá thành đường rồi cho lên men rượu nhờ s cerevisiae Phương

pháp này thường được dùng trong sản xuất bia Tuy nhiên, thóc malt chủ yếu chỉ được trồng ở vùng ôn đới nên ngày nay người ta cố gắng nghiên cứu bổ xung hay thay thế dần phức hệ amylase của mâm thóc malt bằng amylase của nấm mốc và vi khuẩn để có thể sử dụng được rộng rãi hơn [6], [9]

1.2.1.3 Phương pháp Amylose

Khi sản xuất cồn theo phương pháp này, người ta cho nấm sợi Rhizopus spp hoặc

Mucor spp phát triển hẳn trong dung dịch cơ chất Trong quá trình phát triển, các

loài nấm sợi này sinh tổng hợp ra các loại enzym thủy phân tinh bột, protein và cả cellulose thành đường Nấm men có mặt trong bình lên men sẽ song song chuyển hóa đường này thành rượu Phương pháp Amylose rất có hiệu quả khi sử dụng nguồn tinh bột có độ nhớt cao trong môi trường nước để lên men [6], [9]

1.2.1.4 Phương pháp Mycomalt

Đây là phương pháp được dùng phổ biến hơn ở cả trong nước và nước ngoài Nguyên tắc của phương pháp này là dùng enzym của vi sinh vật để đường hóa tinh bột, công đoạn đường hóa hoàn toàn tách hẳn công đoạn lên men Enzym để thuỷ

phân tinh bột thường là a - amylase từ nấm mốc và vi khuẩn.

Các chủng nấm mốc sử dụng để đường hoá tinh bột được nuôi cấy theo hai phương pháp: nuôi cấy bề mặt và nuôi cấy chìm Thòi gian đường hoá dài hay ngắn tuỳ thuộc vào chủng giống nấm mốc và nguyên liệu sử dụng Sản phẩm của quá trình đường hoá

là hỗn hợp của dextrin, maltose và glucose, trong đó glucose chiếm tỷ lệ cao nhất Sau

khi đường hóa, s cerevisỉae được cho vào để lên men rượu [6], [9], [11]

1.2.2 Nhược điểm của sản xuất alcol theo phương pháp truyền thống

Tuy việc sản xuất alcol theo phương pháp truyền thống đã có nhiều cải tiến để đạt hiệu quả cao nhưng phương pháp này còn có nhiều nhược điểm:

- Thời gian lên men kéo dài nên tốn kém về nhân công, xây dựng nhà xưởng

- Lên men theo mẻ nên không tiến hành liên tục được

- Không thể sử dụng lại nấm men đã dùng

- Dịch lên men tĩnh nên không tạo ra sự chênh lệch cao về nồng độ cơ chất và sản phẩm giữa bên trong và bên ngoài tế bào nấm men, ngoài ra, alcol ethylic sinh ra ức chế ngược nấm men nên hiệu suất tạo alcol không cao

- Tế bào nấm men rất dễ bị tác động bởi các chất ức chế có trong môi trường [4], [13], [15]

Ngày nay, bất động tế bào được xem là giải pháp hữu hiệu để khắc phục những nhược điểm này của lên men truyền thống Ở nhiều nước trên thế giới, kỹ thuật bất động tế bào đã được ứng dụng nhiều trong công nghiệp sản xuất ethanol, amino acid, kháng sinh cho sản phẩm tinh khiết hơn và năng suất tạo sản phẩm cao hơn ỞViệt Nam, việc nghiên cứu về bất động enzym, bất động tế bào để sản xuất ra các chế phẩm sinh học mới chỉ được tiến hành ở điều kiện phòng thí nghiệm mà chưa được áp dụng trong thực tế

1.3 PHƯƠNG PHÁP BẤT ĐỘNG TẾ BÀO

Năm 1916, Nelson và Griffin tình cờ nhận thấy rằng enzym invertase của nấm men khi hấp phụ lên than hoạt vẫn giữ được hoạt tính xúc tác cho phản ứng thủy phân đường mía Đây là phát hiện đầu tiên về bất động enzym Sau đó, rất nhiều nghiên cứu về vấn đề này đã được thực hiện ở nhiều noi trên thế giói Năm 1969, bất

động enzym lần đầu tiên được đưa vào ứng dụng ở qui mô công nghiệp tại nhà máy Tanabe Seiyaku Co của Nhật Bản Từ đó đến nay các chất xúc tác sinh học bất động ngày càng thu hút được sự quan tâm trên toàn thế giói [13]

Nguyên tắc của phương pháp bất động enzym có thể được mô tả tóm tắt như sau: enzym đã tinh chế ở dạng tinh khiết được gắn hoặc gói trong những polymer không hòa tan trong nước Các hạt enzym này được nhồi vào các cột hình trụ có kích thước thích hợp, sau đó cho dung địch cơ chất chảy qua, enzym sẽ thực hiện phản ứng phân cắt cơ chất thành sản phẩm tương ứng [5], [15]

So với các enzym ở dạng tự do chỉ có thể sử dụng được một lần và thường bị lẫn vào sản phẩm thì các enzym đã được bất động có nhiều ưu điểm nổi bật hơn Những

ưu điểm đó là:

- Enzym được sử dụng nhiều lần để biến đổi cơ chất trong một thời gian dài

- Enzym không lẫn vào trong sản phẩm, do đó tránh được các ảnh hưỏng không tốt đến sản phẩm

- Có thể ngừng nhanh chóng phản ứng khi cần thiết bằng cách tách enzym ra khỏi cơ chất [10]

Tuy vậy, bất động enzym vẫn còn gặp phải nhiều khó khăn như:

- Việc tách chiết, tinh chế enzym phức tạp và tốn kém

- Các enzym thường bị giảm hoạt tính do bị ảnh hưởng bởi các phản ứng để cố định enzym

- Các enzym cũng thường kém ổn định hơn khi bị tách ra khỏi tế bào [5], [16]

Để khắc phục những nhược điểm này, người ta tìm cách bất động toàn bộ tế bàothay cho bất động enzym Khi đó, không cần chiết tách enzym từ các tế bào nên tránh được việc làm mất hoạt tính của enzym trong khi phá tế bào, tránh được các qui trình đắt tiền và cho phép sử dụng enzym ở trạng thái ổn định hơn [5]

Về nguyên tắc bất động tế bào là phương pháp giữ hoặc cố định tê bào ở

những vị trí xác định về mặt không gian mà không làm thay đổi hoạt tính xúc tác của chúng Các tế bào này có thể được sử dụng lại nhiều lần và sử dụng liên tục

[13], [16]

Bất động các dạng của chất xúc tác sinh học (gồm các đơn enzym, các hệ thống gồm nhiều enzym liên kết, các tế bào và cả các cơ quan của tế bào) nói chung và bất

động tế bào nói riêng giống như một cuộc cách mạng trong kỹ thuật vi sinh bởi vì nó cho năng suất tạo sản phẩm cao hơn hẳn các qui trình truyền thống, có thể áp dụng ở qui mô công nghiệp, sản phẩm sạch và còn nhiều lợi ích to lớn khác.

Tuy nhiên, bất động tế bào cũng có một số nhược điểm cần phải khắc phục để có thể đưa vào áp dụng trong thực tế:

- Nhiều sản phẩm phụ được tổng hợp cùng với sản phẩm chính bởi vì các tế bào

có chứa nhiều hệ thống chuyển hóa và nhiều enzym xúc tác cho các phản ứng không mong muốn Để khắc phục vấn đề này cần phải chọn lọc giống phù hợp, biến đổi gen hoặc cải tạo gen của cả dòng tế bào bất động để làm giảm bớt các enzym xúc tác các phản ứng không mong muốn và làm tăng hoạt tính của các enzym mong muốn

- Thành tế bào và màng nhầy của các tế bào nguyên vẹn thường cản trở sự vận chuyển của các cơ chất, sản phẩm và các chất phản ứng khác đi ra và đi vào tế bào Trong trường hợp này cần phải xử lý các tế bào trước khi bất động để phá hủy hàng rào thấm này [13]

Tuy có những nhược điểm này nhưng bất động tế bào vẫn là kỹ thuật chìa khóa

để xây dựng những qui trình sinh học có hiệu quả cao

1.3.1 Các phương pháp bất động tế bào

Có thể chia các phương pháp bất động tế bào thành bốn loại: liên kết vói chất mang, tạo liên kết ngang, bẫy và kết hợp các phương pháp Các phương pháp này đã từng được sử dụng phổ biến trong kỹ thuật bất động enzym Mỗi phương pháp có những ưu điểm và nhược điểm riêng nên khi thực hiện cần cân nhắc về mục đích bất động, đặc điểm của tế bào, dạng phản ứng, dạng của thiết bị phản ứng và các vấn đề

có liên quan khác [13], [16]

1.3.1.1 Phương pháp liên kết với chất mang

Phương pháp liên kết vói chất mang có bản chất là liên kết của các chất xúc tác sinh học với các chất mang không tan được trong nước thông qua liên kết đồng hóa trị, liên kết ion, hấp phụ vật lý hoặc liên kết sinh học đặc biệt Các vật liệu dùng làm chất mang phải có đầy đủ các đặc tính để có thể liên kết với các chất xúc tác sinh học, có đủ độ cứng cơ học, vật lý, hóa học, có độ ổn định sinh học và phải không độc Các vật liệu được sử dụng làm chất mang là các polysaccharid không tan trong

nước (cellulose, dextran, dẫn xuất của agarose ), các protein (gelatin, albumin ), các polymer nhân tạo (dẫn xuất của polystyren, nhựa trao đổi ion, polyurethan ) và các vật liệu vô cơ (cát, thủy tinh, ceramic ) Phương pháp liên kết đồng hóa trị là một trong số những kỹ thuật được sử dụng thường xuyên nhất để bất động các enzym Tuy nhiên, phương pháp này không sử dụng rộng rãi cho bất động tế bào bởi

vì các tác nhân cần cho sự hình thành liên kết đồng hóa trị lại thường là các chất độc đối với tế bào và việc tìm kiếm các điều kiện để bất động tế bào gặp rất nhiều khó khăn [13], [16]

1.3.1.2 Phương pháp tạo liên kết ngang

Phương pháp này không sử dụng các chất mang để bất động tế bào, mà mỗi tế bào được liên kết vói tế bào khác bằng các liên kết ngang tạo thành dạng pellet Tác nhân tạo ra các liên kết ngang này là một số chất như glutaraldehyd, các diisocyanat Glutaraldehyđ là một trong số những tác nhân được sử dụng phổ biến nhất, các nhóm amino của chúng tạo thành các liên kết ngang liên kết các tế bào Các tác nhân nhóm diisocyanat như toluen diisocyanat, hexa methylen diisocyanat lại tạo liên kết ngang bằng cách liên kết nhóm urea vói các nhóm amino

Escherichia coli có enzym aspertase hoạt tính cao và Bacỉỉlus coagulans cũng đã

được bất động bằng phương pháp này với glutaraldehyd hoặc toluene diisocyanat [13], [15], [16]

Phương pháp bẫy được sử dụng rất phổ biến trong kỹ thuật bất động tế bào Tế bào vi khuẩn, nấm men cũng như các tế bào động vật, thực vật đều có thể được bất

động bằng phương pháp này Tuy nhiên, phương pháp bẫy cũng có những nhược điểm riêng như: các cơ chất có khối lượng phân tử lớn sẽ rất khó tiếp cận với các tế bào bất động và khó có thể tái sử dụng lại các chất mang đã dùng để bất động tế bào.Bẫy dạng lưới là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất để bất động tế bào Một vài polysaccharid tự nhiên như alginat, k - carrageenan và agar là những vật liệu gel tốt và rất được ưa dùng Trong số đó Ca - alginat là gel được sử dụng phổ biến hơn cả Gel Ca - alginat có nhiều ưu điểm như: dễ chuẩn bi, không độc với tế bào, độ bền cơ học khá tốt, độ xốp thuận lợi cho việc khuếch tán của cơ chất và sản phẩm Việc cố định tế bào sống với gel Ca -alginat bằng phương pháp bẫy đã trở thành kỹ thuật được ứng dụng rộng rãi và được áp dụng trong qui mô sản xuất công nghiệp ở nhiều nước trên thế giới Không chỉ được sử dụng để cố định tế bào nấm men, Ca - alginat còn được dùng để cố định tế bào vi khuẩn và các tế bào động thực vật khác [13], [16]

Nguyên tắc chung của bất động tế bào trên cơ chất alginat là: trộn lẫn dung dịch

Na - alginat và dịch huyền phù chứa tế bào cần cố định, khuấy trộn để các tế bào phân tán đều Dịch huyền phù thu được cho nhỏ giọt vào một dung dịch tạo gel như calci clorid, hạt gel sẽ nhanh chóng được tạo thành Các hạt gel này có dạng hình cầu Trong mỗi hạt, gel alginat tạo thành một mạng lưói quanh các tế bào, cố định các tế bào trong đó Cấu trúc hạt gel như vậy sẽ tạo thành các lỗ xốp thuận tiện cho việc khuếch tán cơ chất vào và khuếch tán sản phẩm ra khỏi hạt gel Bằng cách này người ta có thể dễ dàng khống chế các phản ứng, tách sản phẩm ra khỏi bình phản ứng và sản xuất liên tục Mặt khác, các thông số của hạt gel như: đường kính hạt, số lượng tế bào bị gói trong hạt, độ bền gel, độ cứng của hạt là những giá trị có thể kiểm soát và thay đổi được Tuy nhiên, gel Ca -alginat cũng có nhược điểm là có thể

bị nứt vỡ dưới những tác động cơ học hoặc bị hòa tan dần khi có mặt các chất có khả năng cạnh tranh các ion Ca2+ [11], [14]

Nhiều nghiên cứu, khảo nghiêm đã được tiến hành để khắc phục nhược điểm và nâng cao tính ứng dụng của các gel alginat Thêm acid polyacrylic vào dung dịch Na

- alginat trước khi tạo gel vói CaCl2 có thể làm tăng độ cứng cơ học của các hạt gel bởi những chuỗi polyacrylat tạo cầu nối với các ion Ca2+ Khi tạo gel alginat, cũng

có thể làm tăng sự ổn định của các hạt gel bằng cách xử lý với glutaraldehyd hoặc

polyacrylamid Khi bao ngoài các hạt gel alginat bằng Eudragid RL 100 (một chất đồng trùng hợp của acrylic resin) cho kết quả là sự khuếch tán của cơ chất vào trong hạt gel tăng 15% trong khi sự thoát ra của các tế bào lại giảm đi nhiều.

Gần đây, các nhà nghiên cứu nhận thấy rằng gel Ca - pectat có thể là sự lựa chọn tốt hơn để thay thế cho Ca - alginat bởi vì gel này ít bị tác động bởi các anion chelat

và các tác nhân hoá học hơn, do đó sự ổn định của nó tăng lên đáng kể [16]

Hình 1: Các phương pháp bất động tế bào cơ bản [15]

Hấp phụ trên bề mặt

(B)

Liên kết ion trên bề mặt Liên kết hóa trị trên bề mặt

Bẫy trong khuôn

Kết tụ nhân tạo (Tạo liên kết ngang)

WÊỄÊÊÊÊÊHÊÊỄỄm t ạ o liên kết ngang

(A): bất động trên bề mặt chất mang rắn (B): bẫy trong khuồn có lỗ xốp

(C): kết tụ tế bào (D): giam giữ cơ học trong màng ngăn

CZZ3 CZZ3 c= 3 CZZ2 CZZ3

1.3.2 Các ứng dụng của phương pháp bất động tế bào

1.3.2.1 Sản xuất kháng sinh bằng phương pháp bất động tế bào

Kháng sinh rất cần thiết cho cuộc sống con ngưòi, hầu hết các kháng sinh được sản xuất bằng con đường vi sinh vật học Theo phương pháp truyền thống, kháng sinh thường được sản xuất bằng phương pháp lên men mẻ trong các bình lên men Để nâng cao năng suất, người ta tìm cách chuyển từ lên men mẻ sang lên men liên tục kháng sinh Tuy nhiên, khó có thể thực hiện được điều này với các tế bào tự do Khi đó, bất động tế bào đã trở thành giải pháp hiệu quả cho vấn đề này Nhiều kháng sinh đã được nghiên cứu sản xuất bằng con đường bất động tế bào như oxytetracyclin, penicillin, bacitracin, neomycin, candicidin, cephalosporin, erythromycin, actinomycin D Trong

số đó, các kháng sinh bán tổng hợp của Penicillin như Amoxicillin, Ampicillin là các kháng sinh có vai trò quan trọng được tổng hợp từ 6 - APA 6 - APA được sản xuất

rộng rãi ở qui mô công nghiệp bằng cách bất động tế bào E coli và Bacillus

megatherìum có hoạt tính enzym Penicillinamidase cao trên những chất mang khác

nhau, cho Penicillin G (V) chảy qua ta thu được sản phẩm vói hiệu suất đạt tói 99,5%, cao hơn rất nhiều so với phương pháp truyền thống sử dụng tế bào tự do Phần lớn các kháng sinh được sản xuất trong điều kiện hiếu khí cao, khi đó cần lưu ý đến việc cung cấp oxy cho các khung gel bởi đây là yếu tố có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất tạo thành sản phẩm [5], [16]

13.2.2 Sản xuất các acid hữu cơ bằng phương pháp bất động tế bào

Nhiều acid hữu cơ có ứng dụng trong ngành thực phẩm và làm thuốc, trong đó acid

citric có vai trò rất quan trọng Aspergillus niger là vi sinh vật chủ yếu được sử dụng để

tổng hợp acid citric theo phương pháp lên men mẻ Tuy nhiên, điểm bất lợi của phương pháp này là khó có thể cung cấp đầy đủ oxy cho tế bào nên các tế bào tạo ra tính nhớt trong quá trình phát triển, để khắc phục thì cần phải thông khí trong suốt thời gian nuôi cấy Sử dụng phương pháp bất động tế bào, việc vận chuyển oxy thuận lọi hơn nên hoạt động của bình lên men không bị ảnh hưởng bởi tính nhót này Để sản xuất acid citric,

A nỉger được bất động bằng gel alginat, agarose và polyacrylamid; hoặc còn có thể hấp

phụ lên cột bọt polyurethan, bẫy vào các sợi rỗng và dùng các chất mang cellulose xốp Bất động tế bào làm tăng đáng kể hiệu suất sản xuất acid citric

Hai acid hữu cơ quan trọng khác cũng hay được lên men bằng kỹ thuật bất động

tế bào là acid lactic và acid acetic Các chủng vi sinh vật thường được sử dụng là

Lactobacillus helveticus, Streptococus salivarius, L casei, Rhyzopus oryzae và Pedioccus halophilus để sản xuất acid lactic; và Acetobacter sp để sản xuất acid

acetic Phương pháp bất động phổ biến là bẫy vào trong gel Ca - alginat hoặc k - carrageenan và hấp phụ lên các chất mang ceramic

Lên men bằng bất động tế bào còn được ứng dụng để sản xuất một số acid hữu cơ khác như: acid itaconic, acid propionic, acid gluconic, acid fumaric, acid succinic và acid butyric [16]

1.3.2.3 Sản xuất enzym bằng bất động tế bào

Vi sinh vật là nguồn tốt nhất để sản xuất ra các enzym và bất động tế bào là kỹ thuật thích hợp để sản xuất các enzym ngoại bào

Trong số các enzym của vi sinh vật thì enzym thủy phân tinh bột a - amylase và glucoamylase được nghiên cứu nhiều nhất Trong phương pháp bất động tế bào, các

tế bào vi sinh vật được bẫy vào trong polyacrylamid, Ca - alginat, agar và vài

polymer khác Bất động Bacillus cereus vào Ca - alginat và nhồi vào thiết bị phản

ứng tầng sôi để sản xuất liên tục a - amylase chịu nhiệt cho hiệu suất phản ứng tăng gấp 24 lần so với lên men mẻ bằng tế bào tự do Ngoài ra, còn có thể sản xuất a -

amylase từ các tế bào biến đổi của E coli bất động trong k - carrageenan có bổ xung

thêm glycin

Vài enzym quan trọng khác như cyclodextrin - glycosyl - transferase (CGTase), cellulase, lipase, protease, ß - galactadase, xylanase, dextron sucrase và invertase cũng được nghiên cứu sản xuất bằng bất động tế bào [10], [16]

1.3.2.4 Sản xuất alcol bằng bất động tế bào

Các vi sinh vật được sử dụng phổ biến để sản xuất alcol bằng bất động tế bào là

s cerevỉsiae hoặc Zymomonas mobilis Tuy nhiên, một trong số các vấn đề thường

xuyên gặp phải trong lên men alcol là sự phát sinh C 02 với lượng lớn, kết quả của hô hấp kị khí trong lên men liên tục Các khí phát sinh này làm tăng áp suất trong các hạt gel nên làm nứt vỡ các hạt gel Để khắc phục nhược điểm này, một số chất mang thay thế đã được đưa vào sử dụng thử nghiêm là: khung giả ceramic cấu tạo bằng

nhôm silicat để bất động tế bào nấm men, bọt Polyurethan để bẫy z mobiỉis, các

chất dẻo có nhiều liên kết ngang

Nhiều chất đã được nghiên cứu sản xuất bằng phương pháp bất động tế bào như: sorbitol, glycerol, propane - diol, 2,3 - butanediol, các dung môi tan trong nước (aceton, butanol, ethanol), manitol và xylitol Trong đó, lên men sản xuất ethanol là một trong số các hệ thống nghiên cứu được phát triển và đưa vào ứng dụng rộng rãi nhất trong thực tế [16]

Lên men sản xuất ethanol bằng bất động tế bào thường dùng phương pháp bẫy

s cerevisiae trong gel Ca - alginat Phương pháp này cho phép lên men nhanh với

dung dịch đường nồng độ cao Các tế bào nấm men được giữ trong mạng lưói gel để không bị khuếch tán vào môi trường, trong khi đó glucose vẫn xâm nhập được vào

trong gel để biến đổi thành alcol ethylic và c o 2 đi ra ngoài Ưu điểm của phương pháp này là: hiệu suất lên men đạt được cao hơn do có thể tăng số lượng tế bào sống gói trong các hạt tạo mật độ tế bào cao; duy trì xúc tác tự nhiên của các enzym trong

tế bào; tế bào ít chịu ảnh hưởng có hại của môi trường Bên cạnh đó, alginat lại được

sản xuất với sản lượng lớn ở nhiều nước trên thế giới tạo nên nguồn nguyên liệu khá

dồi dào Bởi vậy nên nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu sâu về alginat để có thể phục

vụ tốt hơn cho kỹ thuật bất động tế bào và để đưa kỹ thuật này vào sản xuất ethanol

ở qui mô công nghiệp [13], [16]

1.4 ALGINAT

Alginat là tên gọi chung cho các muối của acid alginic Acid alginic có trong các

loài tảo nâu, rong mơ Sargassum polycystum, s kjellmanianum tồn tại chủ yếu ở

dạng muối với các ion kim loại như Ca2+, Ba2+, Mg2+, Na+ [7], [17]

1.4.1 Cấu trúc của alginat

Acid alginic là một heteropolyme saccharid mạch thẳng cấu tạo từ hai gốc uronic

là acid a- L- guluronic (G) và acid ß- D- mannuronic (M) nối với nhau bằng liên kết 1- 4 - glucosid Tuy nhiên, hai monome này không liên kết một cách ngẫu nhiên mà tạo thành ba loại block: block homopolymeguluronic gồm các gốc acid guluronic nối tiếp nhau GGGG, block homopolymemannuronic gồm các gốc acid mannuronic nối tiếp nhau MMMM, và block liên hợp MGMG

Tuỳ theo nguồn gốc của alginat mà độ dài trung bình của mạch phân tử, độ dài của mỗi block và trình tự kết hợp của chúng với nhau có khác nhau Điều này làm cho tính chất của alginat biến đổi trong một dải rộng [12], [17]

Hình 2: Cấu trúc của phân tửalgỉnat

1.4.2 Tính chất của alginat:

+ Độ hoà tan:

Các muối kim loại hoá trị I (Na+, K+ .), muối amoni và muối của các amin phân

tử lượng thấp của acid alginic tan được trong nước Còn các muối của acid alginic với các kim loại đa hoá trị (Ca2+, Ba2+ ) thì không tan được (trừ muối của Mg2+) Các muối alginat hoà tan được trong các dung mối thân nước như alcol, ceton và hoà tan dễ dàng hơn khi đun nóng

+ Độ nhớt:

Na- alginat khi tan trong nước tạo thành dung dịch có độ nhớt dao động trong khoảng từ 10 - 3.500 cps Độ nhớt này tăng tỷ lệ thuận vói khối lượng phân tử trung bình của alginat, với nồng độ của alginat sử dụng và giảm đi khi tăng nhiệt độ Khi duy trì nhiệt độ ở 50°c trong nhiều giờ alginat sẽ bị cắt mạch và giảm độ nhớt Nhưng khi hạ thấp nhiệt độ đến đông đặc rồi làm rã băng thì độ nhớt của dung dịch alginat hầu như không có sự thay đổi đáng kể Độ nhớt của dung dịch alginat còn bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của các ion kim loại có trong dung dịch

+ Độ ổn định:

Alginat khô giống như các polysaccharid tự nhiên khác rất không bền với oxy, nhiệt độ và ion kim loại ; khi có mặt các tác nhân này alginat sẽ bị rã ra Độ ổn định của các muối alginat xếp theo thứ tự: Na- alginat > amoni alginat > acid alginic; càng xếp cuối các muối càng kém ổn định Alginat có độ nhớt cao nhanh bị

rã hơn alginat có độ nhớt trung bình hoặc thấp Ở nhiệt độ thường bột Na- alginat khô chỉ bảo quản được trong vài tháng nhưng nếu hạ nhiệt độ và bảo quản nơi tối sẽ duy trì được lâu hơn Còn nếu đông sâu thì có thể bảo quản vài năm mà không giảm đáng kể khối lượng phân tử Các dung dịch alginat ổn định ở pH 5,5 - 10 và chuyển thành dạng gel ở pH< 5,5 Ngoài ra, thêm một lượng nhất định ion Ca2+ vào cũng có thể làm tăng độ ổn định của các dung dịch alginat

+ Sự gel hoá:

Dung dịch Na- alginat có khả năng tạo gel khi phản ứng với các ion kim loại hoá trị II, III Các gel này được hình thành ở các mức nhiệt độ < 100°c và cả ở nhiệt độ phòng, chúng cũng không tan chảy khi đun nóng Các nhà khoa học giải thích khả năng tạo gel này bằng mô hình cấu trúc phân tử của alginat - mô hình “vỉ trứng”: đoạn mạch của acid polyguluronic (GGGG) có dạng gấp nếp, còn các sợi acid polymannuronic (MMMM) là các dải dẹp Khi có mặt các ion hoá trị II, III ở nồng

độ thích hợp thì sự tạo gel xảy ra, các phân tử alginat sắp xếp lại song song vói nhau, các phần gấp nếp của đoạn GGGG tạo thành khoảng không gian giống như chỗ đặt quả trứng Các ion Ca2+ khớp vào khoảng trống này, liên kết vói các nhóm carboxyl

và các nguyên tử oxy ở mỗi đoạn song song, khi đó gel alginat được hình thành [12], [17]

Hình 3: Quá trình tạo gel của các phân tử calci alginat [16]

A/VWVN Đoạn GGGG block

: Đoạn MMMM block Khả năng tạo gel của các muối alginat cũng phụ thuộc vào kích thước của ion kim loại Ion Strontium có kích thước lớn hơn ion Ca2+ nên liên kết mạnh hơn và sẽ được ưu tiên giữ lại hơn nếu có sự cạnh tranh giữa Ca2+ và Sr2+ Còn ion Mg2+ có kích thước nhỏ nên không thể tạo gel vói Na - alginat Ái lực của các ion kim loại đối với alginat xếp theo thứ tự như sau: Pb2+> Cu2+> Cd2+> Ba2+> Sr2+> Ca2+> Co2+

Khi nghiên cứu gel Ca- alginat người ta thấy môđun đàn hồi phụ thuộc mạnh mẽ vào thành phần và trình tự sắp xếp của các gốc uronat Alginat có block G nhiều và dài sẽ cho gel bền hơn Môđun đàn hồi còn phụ thuộc vào loại ion tạo liên kết ngang

và ái lực giữa các cation liên kết ngang Ngoài ra, độ bền của gel còn phụ thuộc vào các yếu tố môi trường, v ề ảnh hưởng của cấu trúc phân tử tới độ bền gel: đoạn M- block thể hiện đặc tính đàn hồi, còn đoạn G- block thể hiện mức độ cứng rắn của gel Các đặc tính này được quan tâm trong nhiều ứng dụng của alginat [12], [17]