Xây dựng ứng dụng phương pháp định lượng bằng HPLC nhằm đánh giá sinh khả dụng viên ketoprofen 200 mg tác dụng kéo dài

3335 ‘T999 10 12141414141516171818181824252525 Một số khái niệm về sinh khả dụng ự Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao l Lịch sử Phương pháp sắc ký Đặc điểm của phương pháp Sơ lược vè

w — 8 M

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC • • Dược • HÀ NỘI •

TRẦN KIỂU DUYÊN

BẰNG HPLC NHẰM ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG

VIÊN KETOPROFEN 200mg TÁC DỤNG KÉO DÀI

KHOÁ LUẬN TÓT NGHIỆP Dược sĩ KHOẢ1998 - 2003

TH.S NGUYỄN THỊ KIÊU ANH

LỜI CẢM ƠN

Tôi xỉn chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới

THS NGUYỄN THỊ KlỀư ANH

PGS TS TRẦN TỬ AN

đã tận tình hướng dẫn tôi hoàn thành khoá luận này.

Tôi cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới các thầy cô trong bộ môn hoá phân tích đã tận tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện khoá luận này.

Tôi xin chân thành cảm ơn

Hà nội, ngày 20/5/2003.

Sinh Viên

TRẦN KIỀU DUYÊN

3335

‘T999

10

12141414141516171818181824252525

Một số khái niệm về sinh khả dụng ự

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao l

Lịch sử

Phương pháp sắc ký

Đặc điểm của phương pháp

Sơ lược vè chương trình tối ưu Modde 5.0

ĐÔÌ TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u l

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Thiết bị

Phương pháp nghiên cứu

Khảo sát lựa chọn dung môi ckiết

Xăy dựng phương pháp định lượng trong huyết tương

Phương phấp xử lý kết quả

KẾT QUẢ THựC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN V

Chọn dung môi chiết

Khảo sát điều kịên chạy sắc ký

3.3.1 Xây dựng đường chuẩn trong huyết tương 25

3.4 Sơ bộ đánh giá sinh khả dụng của viên ketoprofen 200mg 29

TDKDPhần 4 k ế t l u ậ n v à đ ề x u ấ t 31

ĐẶT VẤN ĐỂ

Trên thế giới cũng như ở Việt Nam, song song với nghiên cứu tìm ra thuốc mói thì việc nghiên cứu bào chế dạng thuốc sao cho đạt sinh khả dụng cao, dùng tiện lợi đơn giản và đưa ra cách hướng dẫn sử dụng thuốc đạt hiệu quả và an toàn trong điều trị là vấn đề quan trọng của ngành Dược

Do đó việc đánh giá sinh khả dụrig tương đương sinh học , dược động học của thuốc là một đòi hỏi hết sức cấp thiết Để đạt được điều này,thì vấn đề phân tích thuốc trong dịch sinh học , đặc biệt là trong huyết tương là một khâu quyết đ ịn h

Các phương pháp phân tích thường dùng để xác định nồng độ thuốc trong huyết tương là sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc ký khí (GC), sắc

ký khí gắn vói khối phổ(GC- MS) phóng xạ miễn dịch, điện đi mao quản Trong đó, phương pháp HPLC được sử dụng nhiều do nó có tính ưu viêt nổi trội như độ chính xác đảm bảo, tách chất trong mẫu rất t ố t , vừa có khả năng tách vừa định tính, định lượng , có thể ứng dụng với nhiều loại chất khác nhau

Ketoprofen là thuốc giảm đau,chống viêm có nhu cầu lớn ở nước ta Nhưng nhược điểm của nhóm thuốc này là hay gây kích ứng dạ dày và phải dùng nhiều lần trong ngày [1], [6] Để hạn chế tác dụng phụ, tăng khả năng điều trị và tiện lọi cho người sử dụng, người ta đã và đang nghiên cứu, sản xuất các dạng thuốc tác dụng kéo dài (TDKD) của nó Chưa có sản phẩm thuốc TDKD nào do các cơ sở trong nước sản xuất Dạng bào chế này mói đang ở giai đoạn nghiên cứu và thử nghiệm Đây là một trong những hướng nghiên cứu quan trọng tại Trường Đại học Dược Hà Nội Trong Dược điển Việt Nam i n năm 2002 vẫn chưa có chuyên luận thuốc tác dụng kéo dài

[2].Để đóng góp một phần nhỏ vào sự nghiệp phát triển chung của ngành Dược tôi đã chọn đề tài khoá luận tốt nghiệp là:

“ Xây dựng ứng dụng phương pháp định lượng bằng HPLC nhằm đánh giá sinh khả dụng của vỉên Ketoprofen 200 mg

TDKD ”

❖ Đề tài nhằm hai muc tiêu sau :

> Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng Ketoprofen trong huyết tương bằng HPLC

> Bước đầu đánh giá sinh khả dụng invivo của viên Ketoprofen 200

mg TDKD

hoạt chất Viên qui ước ketoprofen giải phóng hoạt chất nhanh ở dạ dày, còn viên TDKD điều khiển sự giải phóng hoạt chất ở pH cao hơn (trong ruột).

Dạng viên qui ước, ketoprofen được hấp thu tốt và nhanh, thòi gian đạt nồng

độ cực đại trong máu là từ 0,5 đến 2 giờ Sau khi uống viên ketoprofen 200mg TDKD thời gian đạt nồng độ cực đại trong máu khoảng 7 giờ, nồng độ cực đại trung bình khoảng 3 - 4 mg/1; nồng độ duy trì ở ở mức khá cao sau khi uống 24 giờ

- Chuyển hoá: chủ yếu, liên kết vói acid glucuronic tạo thành acyl - glucuronic không ổn định Một nửa chất chuyển hoá có thể chuyển lại thành dạng hợp chất ban đầu do đó chuyển hoá cung cấp dạng chất có hiệu lực.

8 % thải trừ qua phân 80% thải trừ qua thận ở dạng liên kết glucuronic; thời gian bán thải của dạng viên qui ước là 2 - 4 giờ, dạng viên TDKD là từ 4 -7 giờ Đối vói người lớn tuổi, hấp thu không thay đổi, thời gian bán thải kéo dài và giảm sự thanh thải toàn phần Ở ngưòi suy gan và thận, giảm độ thanh thải huyết tương và tăng thời gian bán thải

1.1.3 Chỉ định [3].[6],:

- Thấp khớp mãn tính, đặc biệt viêm đa khớp dạng thấp

- Dạng viên nang còn dùng để giảm đau

1.14 Chống chỉ định :[3] [6],

- Dị ứng vói ketoprofen, aspirin và các thuốc chống viêm phi steroid cùng loại

- Loét dạ dày - tá tràng tiến triển

- Suy thận nặng, suy gan tế bào nặng

- Phụ nữ có thai (3 tháng cuối) và cho con bú

1.1.5 Tác dụng không mong muô'n[3][6],

- Đường tiêu hoá, khó chịu vùng dạ dày ruột, đau dạ dày, buồn nôn, nôn mửa, tiêu chảy; nặng thì loét dạ dày, xuất huyết đường tiêu hoá, thủng ruột

- Viên nang TDKD 100 mg; 150 mg; 200mg.

- Thuốc tiêm 100 mg

- Thuốc mỡ 2,5%

1.2 Các phương pháp định lượng [11] [13].

* Phương pháp định lượng ketoprofen dạng nguyên liệu và dạng bào ch ế:

- Phương pháp acid - base: [13], [14], [20].

Nguyên tắc : Ketoprofen là một acid yếu, ta có thể định lượng ketopofen trong bằng phương pháp acid - bazơ phát hiện điểm tương đương bằng phương pháp đo điện thế hoặc bằng chỉ thị đỏ phenol Phương pháp này thường áp dụng định lượng ketoprofen nguyên liệu

Phương pháp HPLC pha đảo: [11], [12], [13], 15].

Sắc ký HPLC pha đảo có đặc điểm pha tĩnh ít phân cực hơn pha động Ketoprofen

ít phân cực nên cần chọn pha động phân cực mạnh để rửa giải, pha tĩnh phải có tính chất gần giống ketopofen Vì vậy lựa chọn HPLC pha đảo là hợp lý để định tính, định lượng chất Áp dụng định lượng ketoprofen trong huyết tương [7], [10], [12], [14], [15], và xác định tạp chất trong nguyên liệu [9], [11],

- Phương pháp quang phổ: [12], [13]

Trong công thức cấu tạo của Ketoprofen có nhân phenyl, nhiều liên kết đôi nên có khả năng hấp phụ ánh sáng tử ngoại Nó có cực đại hấp thụ ở 255 ran trong Methanol 75% ứng dụng điều này để định lượng ketoprofen trong chế phẩm bào chế và đánh giá độ hòa tan của viên [9]

- Phương pháp điện di mao quản và điện di mao quản kết hợp với khối

phổ (CE - MS): Định lượng ketoprofen trong huyết tương, trong nước tiểu và tách đồng phân của ketoprofen [12], [13]

* Phương pháp HPLC định lượng ketoprofen trong huyết

tương[ll],[15].

Để đánh giá sinh khả dụng viên ketoprofen, chúng ta phải xác định được nồng

độ thuốc trong máu ngưcã sau khi uống thuốc trong một khoảng nồng độ nào đó Do

đó phương pháp được lựa chọn phải vừa có khả năng định tính, định lượng, có độ nhậy cao, đồng thòi đáp ứng được độ chính xác và tin cậy cho định lượng Có nhiều tác giả đã nghiên cứu và đã sử dụng các điều kiện để định lượng ketoprofen trong huyết tương bằng phương pháp HPLC.

Dung môi chiết và các điều kiện sắc ký định lượng ketoprofen trong huyết tương được trình bày ở bảng 1.1

Bảng 1.1 Các điều kiện định lượng KET trong huyết tương

12 ACN ACN - amoni

acetat 20 mM pH 7,0 (20:80)

Econosphere CN

150 X 4,6 mm 10

|j,m

Isobutyl methylxan

C18 jxBondapak

300 X 3,9 mm 10

|4.m

Isopropylphenazon

254

15 Ethyl acetat ACN - Đệm

phosphat pH 3,2 (40: 60)

1.3 Một số khái niệm về sinh khả dụng [7], [17].

Để đánh giá được chính xác chất lượng của thuốc, người ta phải nghiên cứu sự giải phóng của dược chất ra khỏi dạng thuốc, sự hấp thu dược chất khi vào cơ thể, tức là nghiên cứu sinh khả dụng của thuốc

1.3.1 Các khái niệm cơ bản [7], [17].

Sinh khả dung

Sinh khả dụng là mức độ và tốc độ hấp thu của hoạt chất từ dạng bào chế của

nó vào đại tuần hoàn.

- Mức độ hấp thu được xác định bằng diện tích dưói đường cong (Area Under Curve, AUC) của đường biểu diễn nồng độ dạng hoạt tính trong máu biến đổi theo thời gian

AUC thường được tính theo phương pháp hình thang:

Trong đó:

C i: là nồng độ dược chất trong huyết tương ở thời điểm Ti

c t : là nồng độ dược chất trong huyết tương đo được tại thời điểm cuối cùng,

k : là hằng số tốc độ thải trừ

0,693-^1/2

T1/2 là thời gian bán thải của thuốc (thòi gian cần thiết để nồng độ thuốc trong máu giảm 50%) được xác định bằng đồ thị bán logarit của nồng độ dược chất trong máu của pha thải trừ theo thòi gian

Thông thường thòi gian lấy mẫu > 10 T1/2tùy theo từng thuốc

Việc theo dõi nồng độ thuốc trong máu rất quan trọng vì giữa nồng độ thuốc trong máu và hiệu lực điều trị có liên quan chặt chẽ vói nhau Ta phải biết được nồng độ thuốc trong máu để đảm bảo thuốc nằm trong khoảng phát huy hiệu lực điều tri và dưói mức độc để chỉ định liều dùng và tần xuất sử dụng thuốc hợp lý.+ Tốc độ hấp thu của thuốc được xác định bằng nồng độ cực đại ( Cmax) thuốc trong máu và thời gian đạt được nồng độ cực đại (Tmax).

Thuốc tác dụng kéo dài thường nằm trong đường tiêu hóa trong thời gian dài,

vì vậy môi trường hấp thu (dịch trong đường tiêu hóa) có ảnh hưởng lớn tới các giá trị SKD

1.3.2 Xác định SKD in vivo của thuốc.[7],[17].

Đối tương thử:

- Động vật: Thuốc mói, thuốc đang nghiên cứu thường được thử sơ bộ trên động vật như chó, khỉ, thỏ, chuột tuỳ theo dạng bào chế trước khi thử trên người

- Người tình nguyện khoẻ mạnh:

+Tuổi: 18-50 Nếu là nữ phải kiểm tra để đảm bảo họ không mang thai khi tham gia nghiên cứu

+ Kiểm tra sức khoẻ: thể trạng, tiền sử bệnh tật, các phép thử lâm sàng (huyết

- Nước có thể được dùng ít nhất là trước và sau khi dùng thuốc 1 giờ

- Thức ăn được tiêu chuẩn hoá và cho các cá thể thử dùng với lượng như nhau

- Thòi gian giữa hai lần thử thuốc phải đủ để thuốc được thải trừ hoàn toàn khỏi cơ thể Thời gian tối thiểu là 10 lần thời gian bán thải của thuốc

- Nếu là đánh giá tương đương sinh học: Thử theo mô hình chéo ngẫu nhiên (two treatments, two periods, two sequences crossover).

Lấv mẫu

Mẫu máu được lấy từ mạch máu tại thời điểm 0 và ít nhất là 4 lần ở pha hấp thu và 6 lần ở pha thải trừ sau khi dùng thuốc Máu được để lạnh ngay sau khi lấy mẫu, sau đó ly tâm và để lạnh -30° c tói khi phân tích

Theo dối các cá thể

Các cá thể được đo huyết áp, đếm nhịp tim llần/ giờ

Phân tích mẫu máu

Dùng các phương pháp phân tích thích hợp để định lượng hoạt chất trong mẫu thử Đường chuẩn dùng để tính kết quả phải được xây dựng theo từng ngày phân tích

Các số liêu nghiên cứu

Tính AUC, tmax, c max

2 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NÃNG CAO

(HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY)

2.1 Lịch sử

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) được phát triển mạnh vào năm 60 của thế kỷ

.Ngày nay cùng vói sự phát trển của khoa học kỹ thuật phương pháp này đã đóng

một vai trò quan trọng trong định lượng thuốc với ưu điểm phát hiện được ở nồng

độ rất nhỏ và có khả năng tách tố t, độ lặp lại cao

2.2 Các phương pháp săc ký

Sắc ký phân bố hiệu năng cao

+ Sắc ký lỏng lỏng + Sắc ký liên kết Sắc ký hấp phụ hiệu năng cao

Sắc ký trao đổi ion hiệu năng cao

sắc ký lỏng - lỏng

Mỗi một loại sắc ký có những ưu điểm khác nhau, vì vậy ứng với mỗi một yêu

cầu của mục đích sử dụng mà ta chọn phương pháp nào cho thích hợp

Trong lĩnh vực phân tích sinh dược học và kiểm nghiệm thuốc thì phương pháp

sắc ký lỏng hiệu năng cao được ứng dụng nhiều

2.3 Đặc điểm của phương pháp.

Trong sắc ký lỏng phân bố pha liên kết, pha tĩnh được gắn hoá học( liên kết) vói chất mang (silicagel), pha tĩnh là chất nhồi cột là các hạt có kích thước cực nhỏ,

có diện tích tiếp xúc lớn

*Điều kiện chọn pha tĩnh :

Trơ và bền vững với điều kiện chạy sắc ký , không phản ứng với dung môi rửa giải hay chất phân tích

Có khả năng tách chọn lọc vói các chất có trong mẫu thử

Quá trình cân bằng động học khi tách phải nhanh và có sự lặp lại tốt

Cấu tạo của pha tĩnh;

Thường dùng hạt thủy tinh nhỏ chất bao phủ bề mặt là silicagel vì có ưu điểm chịu áp lực tố t, độ trương nở nhỏ , bền vững vói nhiệt độ

của silicagel clorosilan siloxan

- Nếu R là một nhóm ít phân cực như octyl (Cg), octadecyl (C18) hay phenyl và dung môi phân cực như methanol, acetonitril thì có sắc ký pha đảo (sắc ký pha ngược)

- Nếu R là nhóm khá phân cực như alkylamin -(CH2)n- NH2 hay alkyl nitril -(CH2)n - CN và dung môi là ít phân cực như hexan thì ta có sắc ký pha thuận

- Cách chọn pha: thường chọn pha tĩnh có tính phân cực giống các chất cần tách

và khác với pha động

* Điều kiện chọn pha động.

Phải hòa tan hoàn toàn chất phân tích

Trơ với pha tĩnh và các điều kiện thực hiện sắc ký

Nếu pha động là hỗn hợp thì các thành phần phải tan hoàn toàn vói nhau

Độ nhớt nhỏ, tinh khiết ít ảnh hưởng tói độ chính xác, độ nhạy của Dectector

Nhanh đạt được trạng thái cân bằng động học khi chạy sắc ký

* Môt sô' thône số đăc trưns của HPLC.

- Thòi gian lưu tp (phút) là thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào hệ thống sắc ký đến lúc xuất hiện đỉnh của pic So sánh thòi gian lưu của mẫu thử và mẫu chuẩn làm

trong cùng điều kiện ta sẽ định tính được chất đó.

- Thời gian chết tx£ (phút) là thời gian lưu của một chất không bị lưu giữ (tức là chất có tốc độ bằng tốc độ di chuyển trung bình của các phân tử dung môi khi đi qua cột)

- Thừa số dung lương k’: dùng để mô tả tốc độ di chuyển của một chất

Trong đó : WB : chiều rộng pic ở đáy pic

W1/2 : chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của đỉnh

R s ~

Í r , b * r , a

v + i * ' , )

Để tách riêng 2 chất, Rs phải >1,5 (khi hai sắc đồ có độ lớn cùng cỡ).

- Chiều cao pic hay diện tích pic là đại lượng đặc trưng cho định lượng của chất Khi so sánh chiều cao pic hay diện tích pic của mẫu thử và chuẩn trong cùng điều kiện làm ta tính được hàm lượng hoạt chất trong mẫu thử

* Cách tính kết quả trone phươns pháp HPLC

- Phương pháp chuẩn ngoại (External Standard method):

Nồng độ chất cần định lượng được xác định bằng cách so sánh đáp ứng (diện tích hoặc chiều cao pic) của dung dịch thử với đáp ứng thu được của dung dịch chuẩn

Hòa tan chất cần định lượng (chuẩn hoặc thử) và chất chuẩn nội với một lượng bằng nhau Nồng độ chất thử được xác định bằng cách so sánh tỉ số giữa chiều cao hay diện tích pic của chất cần định lượng và chuẩn nội của dung dịch thử và dung dịch chuẩn

Hàm lượng phần trăm chất định lượng được tính bằng cách bằng % diện tích pic của chất đó chia cho tổng diện tích các pic, trừ pic dung môi, thuốc thử và pic thấp hơn giới hạn phát hiện

Lập mối quan hệ giữa đáp ứng (diện tích hoặc chiều cao pic) y và lượng chất X trong dãy dung dịch chuẩn Tính kết quả của chất phân tích dựa trên đồ thị của mối

quan hệ giữa y vào X Yêu cầu đáp ứng của dung dịch định lượng phải nằm trong

khoảng đáp ứng của dãy dung dịch chuẩn

Trong phân tích sinh dược học ta hay sử dụng cách tính kết quả dựa theo chất chuẩn nộivà việc xây dựng đường chuẩn

2.4 Sơ lược về chương trình tối ưu Modde 5.0 (Mô hình bậc 2 )

2.4.1 Lựa chọn các thông sô' và khoảng biến thiên.

Thông số có hai loại:

Đầu vào là biến độc lập.

Đầu ra là biến phụ thuộc

Xác định khoảng biến thiên của biến độc lập theo các mức : dưới ,cơ sở, trên Bố trí thí nghiệm thêo mô hình toán học bậc hai đầy đủ (tâm trực giao) có số thí

nghiệm :N = 2 n-q+2n + N0

Tiến hành thí nghiệm theo mô hình đã lựa chọn ta xác định được biến phụ thuộc Phân tích kết quả thu được Nếu kết quả thu được có ý nghĩa, dựa trên mặt mục tiêu của biến phụ thuộc,vói sự trợ giúp của chương trình tối ưu Modde5.0 , chương trình sẽ thực hiện phép tối ưu bằng phương pháp đơn hình, sẽ dự đoán được điều kiện tối ưu cho biến độc lập và cho kết quả tối ưu của biến phụ thuộc

Tiến hành thực hiện tối ưu của các biến độc lập, tính kết quả của biến phụ thuộc

so sánh vói dự đoán của chương trình tối ưu từ đó đưa ra được điều kiện hợp lý nhất cho thí nghiệm

ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ủ u

2.1 Đối tượng - Nguyên vật liệu

Ketoprofen 99,3% (Chất đối chiếu đạt theo USP 24)

Viên nén ketoprofen TDKD 200 mg (SKS: 1297 của Công ty Dược phẩm nước ngoài)

Acetonitril, methanol (HPLC grade - Merck),diclaromethan;

Kali dihydrophosphat, natri hydroxyd (PA grade - Merck)

Và tất cả các nguyên liệu và hoá chất khác đều đạt tiêu chuẩn yêu cầu, PA, HPLC, do các nguồn tin cậy cung cấp

Người tình nguyện khỏe mạnh

2.2 Thiết bị

- Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao

+ Bơm cao áp của Merck - Hitachi L - 6000 Pump

+ Detectơ u v của Merck - Hitachi L - 4000 u v detector

+ Máy tích phân của Merck - Hitachi D - 2500 chromato

+ Van tiêm mẫu Rheo dyne 1725 (Mỹ)

- Máy quang phổ Beckman DU 640 Spectrophotometer (Mỹ)

- Máy ly tâm Jouan (Pháp)

- Tủ lạnh sâu (-50°C) Frigor (Đan mạch)

- Máy lắc (Labinco - Hà Lan)

- Máy siêu âm Branson.

- Cần phân tích Mettler AB 204 Toledo (Thuỵ Sỹ)

- Máy đo pH Jenway (Anh)

- Máy khuấy từ Ikamag

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Khaỏ sát chọn phương pháp chiết ketoprofen trong huyết tương

Thực hiên chiết ketoprofen trong huyết tương bằng một số dung môi như ACN, acid tricloroacetic 5% , diclomethan Quan sát sắc đồ vào dựa vào các chỉ tiêu hiệu suất chiết, thời gian làm m ẫu, hiệu quả kinh tế để lựa chọn dung môi,thấy chiết Dicloromethan là hợp lý

0.2ml H3P04 1 M 4ml Dỉcloromethan

0.25ml pha động

Tiêm mẫu Sơ đồ 1.1 Quá trình chiết ketoprofen

bằng dung môi Dicloromethan