Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng mo trong dược liệu bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử

Để định lượng các nguyên tố trên có rất nhiều phương pháp, song vì các nguyên tố vi lượng thường có mặt trong các mẫu sinh học, dược liệu với hàm lượng thấp nên hiện nay phương pháp AAS

BỘ Y TÊ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THU

QUANG PHỔ HẤP THỤ NGUYÊN TỬ

(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHOÁ 2002-2007)

Người hướng dẫn: PGS.TS PHAN TUÝ

TS LÊ THỊ KIỂU NHI

Nơi thực hiện : VIỆN KIỂM NGHIỆM - BỘ Y TÊ

BỘ MÔN HOÁ ĐẠI CƯƠNG -VÔ c ơ TRƯỜNG ĐẠI HỌC D ư ợ c HÀ NỘI

Thòi gian thực hiện: 27/2/2007 - 31/5/2007

Hà Nội, 5-2007

LỜ3 cảm 0®

Sau ba tháng thực hiện khóa luận, nhờ sự hướng dẫn tận tình của các thầy cô giáo cùng với sự giúp đỡ mọi mặt của toàn thể cán bộ, nhân viên phòng Mỹ Phẩm - Viện Kiểm nghiệm, em đã hoàn thành mục đích và nội dung đề ra của khóa luận trong thời gian quy định

Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo:

PGS.TS Phan Túy

TS Lê Thị Kiều Nhi

những người đã tin tưởng giao đề tài và trực tiếp hướng dẫn em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Trong thời gian thực hiện khóa luận, em đã nhận được sự giúp đỡ của

cô ThS Lê Thị Hường Hoa, trưởng phòng Mỹ Phẩm cùng toàn thể cán bộ,

nhân viên phòng Mỹ Phẩm - Viện Kiểm nghiệm Qua đây em xin chân thành cảm ơn toàn thể các cán bộ của phòng đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ Đồng thời, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tớ i:

ThS Nguyễn Văn Hà

DS Nguyễn Thanh Bách

những người đã hết lòng hướng dẫn em hoàn thành tốt khóa luận

Em xin cảm ơn các thầy cô trong bộ môn Hóa Đại Cương - Vô Cơ cùng các anh chị kỹ thuật viên đã hết sức giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng em xin cảm ơn bố mẹ, anh chị và bạn bè đã ở bên, động viên, giúp

đỡ trong suốt quá trình nghiên cứu để em có thể hoàn thành tốt luận văn này

Hà nội, ngày 19 tháng 05 năm 2007

Sinh viên Nguyễn Thị Thu

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN Đ Ể

-1-PHẦN 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Khái quát về nguyên tô vi lượng sinh h ọ

c -3-1.2 Nguyên tố Molybdenum (Mo): đặc điểm và vai tr ò

1.2.1 Đặc điểm, tính chất lý hóa của M o

-3-1.2.2 Nguồn gốc, hàm lượng và nhu

cầu -3-1.2.3 Vai trò của Mo đối với cơ th ể -6

-1.2.4 Độc tính -8

-1;3 Các phương pháp định lượng Mo trong các mẫu sinh học

1.3.1 Phương pháp đo quang

-9-1.3.2 Phương pháp động học xúc t á c

1.3.3 Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử

-10-1.4 Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS)

1.4.1 Đối tượng và phạm vi ứng dụng của A A S

-11-1.4.2 Cơ sở lý thuyết và trang bị của phương pháp

AAS -11-1.4.3 Kỹ thuật nguyên tử hoá

-16-1.4.4 Phương pháp xử lý mẫu trước khi phân tíc h

-17-PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT

QUẢ -19-2.1 Nguyên vật liệu và phương p háp

-19-2.1.1 Dược liệu nghiên

cứu 2.1.2 Mẫu chuẩn

-19-2.1.3 Trang thiết bị và hoá

chất -19-2.1.4 Nội dung nghiên cứu

-20-2.1.5 Phương pháp nghiên cứu

-21-2.1.6 Phương pháp xử lý số

liệu -21-2.2 Kết quả thực nghiệm và nhận

xét -23-2.2.1 Xác định độ ẩm của dược

liệu -23-2.2.2 Khảo sát các điều kiện đo phổ hấp thụ nguyên tử của Mo

-24-2.2.3 Kết quả định lượng hàm lượng Mo trong các mẫu dược liệu— -33-2.3 Bàn

luận 2.3.1 Về phương pháp vô cơ hoá mẫu

2.3.2 Về kỹ thuật nguyên tử hoá mẫu

-38-2.3.3 Về kết quả định lượng

-39-PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUÂT 40

3.1 Kết luận

-40-3.2 Đề x u ấ t -41-TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHU LUC

CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT

1 AAS Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử

(Atomic Absorbtion Spectrophotometry)

2 F - AAS Phép đo phổ hấp thụ nguyên tử trong ngọn lửa

(Flame - Atomic Absorbtion Spectrophotometry)

3 ETA - A AS Phép đo phổ hấp thụ nguyên tử không ngọn lửa

(Electro - Thermal Atomic Absorbtion Spectrophotometry)

4 PL Phụ lục

5 Mo Nguyên tố Molybdenum

6 ppm Tỷ lệ phần triệu (part per million)

7 ppb Tỷ lệ phần tỉ (part per billion)

DANH MỤC CÁC BẢNG

1 Bảng 1: Hàm lượng Mo trong một số thực phẩm

2 Bảng 2: Kết quả nghiên cứu hàm lượng Mo trong các cơ quan động vật

(ppm/khối lượng khô)

3 Bảng 3: Hàm lượng Mo trong các loài động vật

4 Bảng 4: Lòi khuyên chế độ cung cấp Molybdenum

5 Bảng 5: Kết quả đo độ ẩm trong các mẫu dược liệu

6 Bảng 6: Các thông số máy áp dụng để đo hàm lượng Mo

7 Bảng 7: Chương trình nhiệt độ được áp dụng

8 Bảng 8: Hàm lượng Mo đo khi thay đổi VHNO , giữ nguyên VHCI0

9 Bảng 9' Ham liTỢQ|ị Mo khi thciy đoi Vjjqq^ ) §111 n§uycn Vỵf]Q^.

10 Bảng 10: Kết quả xây dựng đường chuẩn định lượng

11 Bảng 11: Kết quả khảo sát độ lặp lại trên mẫu Hoàng Cầm

(phương pháp đường chuẩn)

12 Bảng 12: Kết quả đánh giá độ thu hồi trên mẫu Hoàng Cầm

13 Bảng 13: Kết quả Mo đo được bằng phương pháp đường chuẩn

14 Bảng 14: Kết quả Mo đo được bằng phương pháp thêm đường chuẩn

15 Bảng 15: So sánh phương pháp đường chuẩn và phương pháp thêm đường chuẩn

16 Bảng 16: Tên khoa học, nhóm tác dụng dược lý của các vị dược liệu

17 Bảng 17: Kết quả định lượng Mo trên 20 mẫu dược liệu

DANH MỤC PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Cấu hình hệ thống loại máy quang phổ hấp thụ nguyên tử Hitachi

Z-5000

Phụ lục 2: Hệ thống quang học của loại máy Hitachi Z-5000

Phụ lục 3: Điều kiện đo phổ hấp thụ nguyên tử của Mo bằng phương pháp

ETA - AAS

Phụ lục 4: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của nguyên tố Mo

(phương pháp ETA - AAS)

Phụ lục 5: Kết quả khảo sát tỷ lệ acid phù hợp để vô cơ hóa ướt

Phụ lục 6: Kết quả khảo sát độ thu hồi Mo của quy trình vô cơ hóa ướt

(phương pháp ETA - AAS)

Phụ lục 7, 8,9 ,1 0 : Kết quả đo hàm lượng Mo trong các mẫu dược liệu

ĐẶT VẤN ĐỂ •

Ở nước ta những năm gần đây, thuốc Đông dược và các sản phẩm làm từ dược liệu đang được sử dụng rộng rãi Vì vậy việc quản lý, kiểm soát chất lượng dược liệu là một vấn đề đáng được quan tâm

Như chúng ta đã biết, trong dược liệu ngoài những hoạt chất hữu cơ có tác dụng sinh học còn có rất nhiều các nguyên tố vi lượng Các nguyên tố này có vai trò rất quan trọng, chúng đóng vai trò đồng xúc tác trong các phản ứng enzyme sinh hoá trong cơ thể Hiện nay chúng ta biết được 14 nguyên tố vi lượng cơ bản rất cần thiết cho cuộc sống và 7 nguyên tố khác có thể là cần thiết Khả năng phát huy tác dụng của mỗi nguyên tố vi lượng phụ thuộc vào hàm lượng của chúng trong cơ thể Tuy nhiên trong mọi trường hợp, thừa hay thiếu các nguyên tố vi lượng đều không tốt Cơ thể hấp thu các nguyên tố vi lượng qua nhiều con đường: thức ăn, nguồn nước, không khí, Dược liệu cũng là một trong những nguồn cung cấp nguyên tố vi lượng quan trọng Vì vậy việc khảo sát hàm lượng của các nguyên tố vi lượng trong dược liệu nói chung cũng là một trong những yêu cầu được đặt ra trong nghiên cứu thuốc đông dược

Để định lượng các nguyên tố trên có rất nhiều phương pháp, song vì các nguyên tố vi lượng thường có mặt trong các mẫu sinh học, dược liệu với hàm lượng thấp nên hiện nay phương pháp AAS hay được sử dụng vì có độ chính xác cao, độ ổn định cao, cần lượng mẫu ít và có thể xác định nhanh, hàng loạt mẫu Kỹ thuật AAS được sử dụng khá rộng rãi vì nó đáp ứng được các nhu cầu đối với việc xác định chính xác vi lượng nguyên tố, đặc biệt là các nguyên tố kim loại trong các đối tượng sinh học, y học, môi trường

Xuất phát từ các yêu cầu nói trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu

xây dựng phương pháp định lượng Mo trong dược liệu bằng phương pháp Quang phổ hấp thụ nguyên tử” với mục tiêu sau:

- Xây dựng quy trình định lượng Mo trong dược liệu

- Định lượng được hàm lượng Mo trong một số dược liệu

PHẦN 1: TỔNG QUAN

1.1 Khái quát về nguyên tố vỉ lượng sinh học [5],[6],[9],[10],[12].

Nguyên tố vi lượng sinh học thuộc hệ các chất hoạt hoá sinh học Chúng tham gia các quá trình chuyển hoá, đồng xúc tác các phản ứng sinh hoá trong cơ thể con người, tham gia vào thành phần cấu tạo các enzyme, protein

Có nhiều khái niệm về nguyên tố vi lượng sinh học Tuy nhiên chúng ta

có thể hiểu: nguyên tố vi lượng sinh học là những chất dinh dưỡng vô cơ (kim loại và phi kim loại), chúng thiết yếu cho sự phát triển bình thường của cơ thể người và động vật, nhưng chỉ với hàm lượng rất nhỏ, khoảng 10'2 - 10'3 % khối

lượng khô của cơ thể [5],[6],[1 0]

Từ thập kỉ 60 của thế kỉ XX, nhờ xuất hiện ngành hoá học mới- sinh hoá vô cơ - có nhiệm vụ chính là làm rõ chức năng sinh học của các kim loại ở mức độ nguyên tử, phân tử, các nhà sinh hoá đã dựa vào những yếu tố sống còn của 1 nguyên tố giúp phát triển hoặc làm suy yếu cơ thể mà chia nguyên

tố vi lượng thành 3 nhóm cơ bản: nhóm tối cần thiết, nhóm có thể cần và nhóm độc tố [9], [1 0]

Tất cả các nguyên tố vi lượng khi vào cơ thể đều phải tồn tại dưới dạng phức chất, không được tồn tại dưới dạng ion tự do thì mới có tác dụng và không gây độc cho cơ thể Chúng có thể liên kết rất bền hoặc lỏng lẻo với các phân tử hữu cơ, đây chính là những dạng trung gian để các nguyên tố vi lượng được vận chuyển, phát huy tác dụng và giảm độc tính xuống tối thiểu Hàm lượng của mỗi nguyên tố vi lượng trong cơ thể rất khác nhau, nó phụ thuộc vào nhu cầu của cơ thể và lượng dự trữ trong các mô Do có hàm lượng rất nhỏ trong cơ thể, lại phân bố ở nhiều cơ quan khác nhau nên việc xác định hàm lượng của mỗi nguyên tố rất khó khăn Chỉ khoảng 20 năm gần đây nhờ áp dụng những tiến bộ của khoa học kỹ thuật, các nhà nghiên cứu mới tìm ra

được một vài phương pháp định lượng với sai số có thể chấp nhận được [1 0],[1 2].

1.2 Nguyên tô'Molybdenum (Mo): đặc điểm và vai trỏ.

1.2.1 Đặc điểm, tính chất lý hóa của Mo [10],[16],[18].

Mo là kim loại thuộc nhóm V I , phân nhóm B, nguyên tử lượng 95,94

Mo có số thứ tự 42 trong bảng Hệ thống tuần hoàn, cấu hình e lớp ngoài cùng

là [Kr]4d55s1 Vì vậy trong các hợp chất, Mo có thể có mức độ oxy hoá +2, +3, +4, +5, +6 Vạch phổ hấp thụ 313,3 nm là nhạy nhất, được sử dụng trong

kỹ thuật đo phổ hấp thụ không ngọn lửa

Mo được tìm thấy ở dạng vết trong nhiều vùng đất (núi đá lửa, đá vôi, than) và ở dạng cố định nhiều hơn trong một số khoáng, v ỏ trái đất chỉ chứa khoảng 0,0014% Mo

Mo được sử dụng nhiều dưới dạng hợp kim Các dẫn xuất của nó được

sử dụng để sản xuất dầu bôi trơn, chất xúc tác, sơn và phân bón

1.2.2 Nguồn gốc, hàm lượng và nhu cầu.

I.2.2.I Nguồn gốc, hàm lượng [10],[12],[15],[27],[28].

Trong thực phẩm có nguồn gốc từ thực vật, hàm lượng Mo thay đổi phụ thuộc vào giống loài và điều kiện thổ nhưỡng Trong thực vật, cây họ Đậu (đậu đũa, đậu Hà Lan) chứa hàm lượng Mo cao Ngũ cốc chứa ít Mo hem Hoa

quả, các loại quả mộng, cây có củ, rau đều chỉ chứa Mo ờ dạng vết.

Sữa bò có chứa hàm lượng Mo cao (khoảng 50 |J.g/l), nước sông chứa

khoảng 1 \igl\ Vài vitamin và chất khoáng chứa Mo ở dạng vết và đáp ứng

được gần như đầy đủ nhu cầu Mo hàng ngày khi được cung cấp vào cơ thể[12],[27]

Một số nghiên cứu về hàm lượng Mo trong thực phẩm cho kết quả được nêu trong bảng 1 như sau:

Theo kết quả đựơc nêu trong bảng 2 và bảng 3 sau đây, ta thấy với mỗi loài động vật thì Mo có nhiều trong gan, thận và tỳ, còn nếu so sánh các loài động vật khác nhau thì động vật thân mềm có hàm lượng Mo cao nhất.

Bảng 2: Kết quả nghiên cứu hàm lượng Mo trong các cơ quan động vật

(ppm/khối lượng khô) [28]

Bảng 3: Hàm lượng Mo trong các loài động vật [28].

Động vật Hàm lượng (ppm/ khối lượng khô)

I.2.2.2 Nhu cầu cơ thể đối với Mo.

Tùy theo từng đối tượng, thể trạng cơ thể và lứa tuổi mà có nhu cầu Mo hàng ngày khác nhau [1 0]

Lượng Mo thường được các bác sĩ chỉ định cho các đối tượng cần được

bổ sung như sau:

5

-Bảng 4: Lời khuyên chế độ cung cấp Molybdenum [27].

Nhu cầu hàng ngày Og/ngày)

Những người cần được bổ sung thêm Mo gồm: người bị các chứng bệnh

dị ứng, hen, bệnh đường ruột, trẻ sinh non, người có tỷ lệ acid uric trong máu quá thấp hoặc tỷ lệ aldehyd quá cao [15]

1.2.3.Vai trò của Mo đối với cơ thể [5],[10],[12],[15],[17],[22],[27].

Mo được hấp thụ rất nhanh và trực tiếp trong ruột Sau đó nó được vận chuyển dưới dạng Molybdat nhờ hợp chất trung gian của huyết thanh và hồng cầu Mo không cố định trên protein [10]

Cơ thể dự trữ Mo chủ yếu trong thận và gan Quá trình hấp thụ kim loại này phụ thuộc vào các hệ số lương thực khác nhau, đặc biệt là hàm lượng Cu

và Sulfat khoáng trong lương thực Khả năng hấp thụ Mo đối nghịch với hàm lượng Sulfat vô cơ trong thức ăn Mo được bài tiết ra ngoài qua đường nước tiểu và qua phân Thời gian Mo ở trong cơ thể kể từ khi được hấp thu tới khi bị thải ra ngoài được coi là ngắn nhất so với hành trình của các nguyên tố khác, chỉ khoảng vài giờ đến vài ngày [27]

Mo rất cần thiết đối với động vật và thực vật Nó có vai trò cố định đạm cho cây trồng Đối với con người, Mo có tác động đến nhiều quá trình chuyển hoá.

Tác dụng chính của Mo đối với cơ thể là thực hiện việc giải độc, như:

dự phần chuyển các chất muối độc Sulfit thành muối Sulfat không độc, vô hiệu hoá một số aldehyd độc được hình thành trong quá trình chế biến và nấu thức

ăn, điều hoà sự hình thành acid uric Acid uric có khả năng chống lão hoá nhưng nếu có nhiều quá mức bình thường sẽ gây nên bệnh Gout, làm đau nhức ngón chân, ngón tay, các khớp và một số bệnh về tim mạch

Ngoài ra Mo còn có tác dụng:

- Cố định chất Fluor (F) vào men răng, giúp răng chắc bền và chống bệnh sâu răng

- Kích thích việc hấp thụ Fe trong thành ruột và sản xuất tế bào máu

- Đào thải Cu khi lượng nguyên tố này vượt quá mức cần thiết

- Tham gia hình thành nhiều enzyme xúc tác phản ứng oxy hoá khử Đối với cơ thể người có 3 enzym chứa Mo rất đặc trưng:

+ Xanthine oxydase: có trong tất cả các mô, có tác dụng điều hoà một số phân tử vào trong hợp chất acid nucleic Không có xanthine oxydase kéo theo sự phân hủy rất nhanh thận do tích lũy nhiều hợp chất độc

+ Sulfite oxydase: có trong ty lạp thể, xúc tác chuyển hoá 2 acid amin chứa lưu huỳnh(S) là methionin và cystein, hoạt tính của nó rất cần thiết đối vói ruột và phổi

+ Aldehyde oxydase: có chủ yếu trong gan, ở đó nó có thể phân huỷ một số phân tử gây độc cho cơ thể

Tồn tại mối liên hệ giữa sự thiếu Mo và xuất hiện một số bệnh ung thư

ở Trung Quốc, thường là ung thư thực quản, dạ dày Theo một nghiên cứu mới

đây [27], Mo có khả năng ngăn ngừa bệnh ung thư thực quản, dạ dày Vùng

Linxian ở phía bắc Trung Quốc là vùng có tỷ lệ người mắc bệnh ung thư thực quản và dạ dày khá cao (lớn hơn 10 lần so vói các vung khác ở Trung Quốc và

gấp 100 lần so vối Mĩ ) Đất đai ở vùng này chứa rất ít Mo và các nguyên tố

khoáng khác, do đó Mo được cung cấp vào cơ thể người rất thấp Việc này làm tăng cao hàm lượng nitrosamine - được biết đến như một chất làm phát sinh bệnh ung thư, và được coi như một trong những nguyên nhân làm tăng cao bệnh ung thư dạ dày, thực quản ở người dân vùng này Thực vật có nhiệm

vụ cung cấp Mo cho quá trình tổng hợp enzym nitrat reducíase - là loại enzym cần thiết cho sự biến đổi nitrat thành amino acid Nhưng khi nồng độ Mo trong đất thấp, thực vật ưu tiên chuyển nitrat thành nitrosamine thay vì sử dụng nitrat để tổng hợp amino acid Như vậy, nếu cung cấp Mo cho đất dưới dạng amonium molybdenate có thể làm giảm nguy cơ ung thư dạ dày, thực quản bằng cách kìm hãm khả năng gây bệnh của nitrosamine

Cũng theo một nghiên cứu [17], người ta thấy rằng Mo có vai trò làm giảm tác dụng của acetaminophen bằng cách làm giảm đi các gốc sulfate của acetaminophen sulfate Theo nghiên cứu này, vói hàm lượng Mo 7,5mmol/kg

có thể làm giảm đến 50,65,62,81% tác dụng của gốc sulfate khi sử dụng acetaminophen với các liều tương ứng lần lượt là 0,1; 0,3; 1 và 3 mmol/kg Như vậy, Mo có thể làm giảm tác dụng của gốc sulfate đi rất nhiều lần so với việc giảm liều của acetaminophen

1.2.4 Độc tính [10],[27],[28].

Độc tính của Mo tương đối yếu, ngộ độc Mo rất hiếm, ngay cả đối với công nhân làm việc trong công nghiệp luyện kim Khi không bị ngộ độc, hàm lượng Mo trong máu tăng lên trong trường hợp có bệnh lý về gan và hệ thống mật, đặc biệt trong trường hợp gan bị nhiễm virus cấp tính [1 0]

* Triệu chứng bệnh Gout được phát hiện thấy ở những người Mĩ khi họ được cung cấp 10-15mg Mo/ngày[10]

* Theo một báo cáo khác [28], hàm lượng acid uric trong máu và nước tiểu không tăng lên nhiều khi Mo được đưa vào cơ thể vói lượng 1,5 mg/ ngày

* Mo cũng có thể làm ảnh hưởng đến hệ thần kinh Theo kết quả nghiên cứu trên 1 người đàn ông trưởng thành, khi được cung cấp tổng cộng 13,5 mg

Mo trong suốt 18 ngày (khoảng 300 - 800 |Lig/ ngày), người ta thấy những triệu chứng nghiêm trọng của bệnh loạn thần kinh với những ảo giác, lên cơn và những triệu chứng thần kinh khác [27].

1.3 Các phương pháp định lượng Mo trong các mẫu sinh học[l 3],[14],[24],[25].

Các phương pháp phân tích công cụ đã được phát triển và ứng dụng trong nhiều năm gần đây Mỗi phương pháp, mỗi kỹ thuật đều có ưu nhược điểm nhất định và có phạm vi ứng dụng riêng cho phân tích từng đối tượng cụ thể Riêng đối với Mo là nguyên tố vi lượng có hàm lượng nhỏ, chỉ tồn tại chủ yếu dưói dạng vết nên vấn đề xác định hàm lượng Mo gặp phải nhiều khó khăn Hiện nay, có một số phương pháp xác định hàm lượng Mo đã được ứng dụng và cho kết quả tốt Có thể nêu ra một số phương pháp sau đây:

1.3.1 Phương pháp đo quang [13].

Phương pháp này thường được áp dụng để xác định hàm lượng Mo trong nước uống và quy định so màu của phức Mo với thioxianid để xác định

Nguyên tắc: Phương pháp dựa trên việc tạo phức màu vàng hồng của Mo(V) với thioxianid Dùng thiếc diclorid để chuyển Mo6+ thành Mo5+ Đo cường độ màu của dung dịch thu được trên máy so màu Xây dựng đồ thị chuẩn, tính giá trị mật độ quang của mẫu kiểm tra từ mật độ quang đo được của mẫu nước đem thử

Hàm lượng Mo (X) tính bằng mg/1 theo công thức:

Y_ C.1000

~ F.1000trong đó:

c là hàm lượng Mo tìm được theo thang tiêu chuẩn hoặc theo đồ

thị chuẩn, tính bằng |j,g

V là thể tích nước lấy để thử, tính bằng ml

Nguyên tắc: Việc xác định Mo(VI) dựa trên khả năng xúc tác cho phản ứng chỉ thị: 27" + H20 2 + 2H+ -» /2 + H20

Khi có mặt hồ tinh bột, I2 sẽ tạo thành phức màu xanh có cực đại hấp thụ À,=585 nm Trên hệ FIA, nếu cố định chiều dài vòng phản ứng, chiều dài đường ống dẫn, thì sau một khoảng thời gian nhất định sẽ xuất hiện pic tương ứng Việc thay đổi nồng độ các tác nhân phản ứng sẽ làm thay đổi tốc

độ cả phản ứng xúc tác và không xúc tác Tuy nhiên bằng cách điều chỉnh mật

độ quang khi không có mặt Mo(VI) (phản ứng không xúc tác) về giá trị A = 0 ( đường nền) sẽ thu được giá trị AA Trên máy sẽ ghi được chiều cao pic tương ứng

1.3.3 Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử [24],[25].

Phương pháp này có ưu điểm là giới hạn nồng độ phát hiện được tới 10'6 g/ml ( kỹ thuật F-AAS); 10'9 g/ml (kỹ thuật ETA-AAS) Tuy nhiên thiết bị của phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử rất tinh vi, hiện đại, đòi hỏi phải có

kỹ thuật và trình độ xử lý máy móc

1.4 Phương pháp quang p h ổ hấp thụ nguyên tử (AAS).

1.4.1 Đối tượng và phạm vi ứng dụng của AAS [4],[5],[9],[23].

Đối tượng chính của phương pháp phân tích theo phổ hấp thụ nguyên tử

là phân tích lượng nhỏ (lượng vết) các kim loại trong các mẫu khác nhau của các chất vô cơ và hữu cơ Với các trang bị và kỹ thuật hiện nay, bằng phương pháp phân tích này người ta có thể định lượng được hầu hết các kim loại (khoảng 65 nguyên tố) và một số á kim đến giới hạn nồng độ cỡ ppm (microgram) bằng kỹ thuật F-AAS, và đến nồng độ ppb (nanogam) bằng kỹ thuật ETA-AAS với sai số không lớn hơn 15%

Phương pháp phân tích phổ hấp thụ nguyên tử được sử dụng để xác định các kim loại trong các mẫu quặng đất, đá, nước khoáng, các mẫu của y học, sinh học, các sản phẩm nông nghiệp, rau quả, thực phẩm, nước uống, các nguyên tố vi lượng trong phân bón, trong thức ăn gia súc, Ở nhiều nước trên thế giới, nhất là các nước phát triển, phương pháp phân tích phổ hấp thụ nguyên tử đã trở thành một phương pháp tiêu chuẩn để định lượng nhiều kim loại Riêng ở nước ta, đến nay trong toàn quốc cũng đã có gần ba chục phòng thí nghiệm và hệ thống máy đo phổ hấp thụ nguyên tử

1.4.2 Cơ sở lý thuyết và trang bị của phương pháp AAS.

I.4.2.I Cơ sở lý thuyết [2],[4],[9].

Vật chất được cấu tạo bởi các nguyên tử, và nguyên tử là phần tử cơ bản nhỏ nhất còn giữ được tính chất của nguyên tố hoá học Trong điều kiện bình thường, nguyên tử tồn tại ở trạng thái cơ bản, không thu và cũng không phát ra năng lượng Đó là trạng thái bền vững và nghèo năng lượng nhất của nguyên

tử Nhưng khi nguyên tử ở trạng thái hơi tự do, nếu ta chiếu một chùm tia sáng

có những bước sóng (tần số) xác định vào đám hơi nguyên tử, thì các nguyên

tử tự do đó sẽ hấp thụ các bức xạ có bước sóng nhất định ứng đúng với những

tia bức xạ mà nó có thể phát ra được trong quá trình phát xạ của nó Lúc này nguyên tử đã nhận năng lượng của các tia bức xạ chiếu vào nó và nó chuyển lên trạng thái kích thích có năng lượng cao hơn trạng thái cơ bản Đó là tính chất đặc trưng của nguyên tử ở trạng thái hơi Quá trình đó được gọi là quá trình hấp thụ năng lượng của nguyên tử tự do ở trạng thái hoi và tạo ra phổ nguyên tử của nguyên tố đó Phổ sinh ra trong quá trình này được gọi là phổ hấp thụ nguyên tử Quá trình hấp thụ chỉ xảy ra với các vạch phổ nhạy, các vạch phổ đặc trưng và các vạch phổ cuối cùng của các nguyên tố Muốn có phổ hấp thụ nguyên tử, trước hết phải tạo ra được đám hơi nguyên tử tự do, và sau đó chiếu vào nó một chùm tia sáng có những bước sóng nhất định ứng đúng với các tia phát xạ nhạy của yếu tố cần nghiên cứu.

1.4.2.2.Phương trình cơ bản của phép đo AAS [2],[4],[7].

Theo định luật Lambe Bear, nếu chiếu một chùm sáng cường độ ban đầu là I0 qua đám hơi nguyên tử tự do của nguyên tố phân tích nồng độ là N và

bề dày L cm, thì cường độ chùm sáng I sau khi đi qua môi trường hấp thụ được tính theo:

I = I0 e - ^ N-L) (1)Trong đó:

trường hấp thụ và phụ thuộc cả vào bề dày L của lớp hấp thụ (bề dày chùm sáng đi qua) Nhưng trong máy đo phổ hấp thụ nguyên tử thì chiều dài của đèn nguyên tử hoá hay cuvet graphit là không đổi, nghĩa là L không đổi, nên giá trị A chỉ còn phụ thuộc vào số nguyên tử N có trong môi trường hấp thụ Như vậy cường độ của vạch phổ hấp thụ sẽ là:

AẲ = k.N (3)Với k = 2,303 Kv L

Trong đó: k là hệ số thực nghiêm, nó phụ thuộc vào các yếu tố:

-H ệ số hấp thụ nguyên tử Ky của vạch phổ hấp thụ

- Nhiệt độ của môi trường hấp thụ

- Bề dày của môi trường hấp thụ Song công thức (3) chưa cho ta biết mối quan hệ giữa cường độ vạch phổ vànồng độ c của nguyên tố phân tích trong mẫu Tức là quan hệ giữa N và c.Đây chính là quá trình hoá hơi và nguyên tử hoá mẫu phân tích Nghiên cứuquá trình này, lý thuyết và thực nghiệm chỉ ra rằng, mối quan hệ giữa nồng độ

N và nồng độ c trong mẫu phân tích được tính theo biểu thức sau:

F là tốc độ dẫn mẫu vào hệ thống nguyên tử hoá (mL/phút)

w là hiệu suất aerosol hoá mẫu

s là hiệu suất nguyên tử hoá

nR là SỐ phân tử khí ở nhiệt độ ban đầu T0 (°K)

Q là tốc độ của dòng khí mang mẫu vào buồng aerosol hóa (lít/phút),

c là nồng độ của nguyên tố phân tích có trong dung dịch mẫu

Phương trình (4) cho ta biết mối quan hệ giữa N và c Mối quan hệ này rất phức tạp, nó phụ thuộc vào tất cả các điều kiện nguyên tử hoá mẫu, phụ

thuộc vào thành phần vật lý, hoá học, trạng thái tồn tại của nguyên tố ở trong

mẫu Nhưng nhiều kết quả thực nghiệm chỉ ra rằng, trong một giới hạn nhất định của nồng độ c, thì mối quan hệ giữa N và c có thể được biểu thị theo công thức:

Trong đó:

Ka là hằng số thực nghiệm, phụ thuộc vào tất cả các điều kiện hóa hơi

và nguyên tử hoá mẫu

b là hằng số bản chất, phụ thuộc vào từng vạch phổ của từng nguyên tố

b có giá trị bằng 1 và nhỏ hơn 1, tức là 0 < b <= 1, nghĩa là ứng với mỗi vạch phổ của mỗi nguyên tố phân tích, ta luôn tìm được một giá trị c = C0 để b bắt đầu nhỏ hơn 1 Nghĩa là ứng với:

Vùng nồng độ Cx < C0 thì luôn luôn có b = 1, nghĩa là mối quan hệ giữa

Trong đó a = K.Ka và được gọi là hằng số thực nghiệm, phụ thuộc vào

tất cả các điều kiện thực nghiệm để hoá hơi và nguyên tử hoá mẫu

Phương trình (6) được gọi là phương trình cơ sở của phép đo định lượng các nguyên tố theo phổ hấp thụ nguyên tử của nó

1.4.2.3.Trang bị của phép đo AAS [2],[4].

Muốn thực hiện phép đo AAS, hệ thống máy đo phổ hấp thụ nguyên tử phải bao gồm các phần cơ bản sau:

Phần 1: Nguồn phát tia bức xạ cộng hưởng của nguyên tố phân tích (vạch phổ phát xạ đặc trưng của nguyên tố cần phân tích), để chiếu vào môi trường hấp thụ chứa các nguyên tử tự do của nguyên tố Đó là các đèn catot rỗng(HCL), các đèn phóng điện không điện cực (EDL), hay nguồn phát bức

xạ liên tục đã được biến điệu

Phần 2: Hệ thống nguyên tử hoá mẫu phân tích Hệ thống này được chế tạo theo hai loại kỹ thuật nguyên tử hoá mẫu Đó là kỹ thuật nguyên tử hoá bằng ngọn lửa đèn khí (lúc này ta có phép đo F-AAS) và kỹ thuật nguyên tử hoá không ngọn lửa (lúc này ta có phép đo ETA-AAS) Căn cứ vào tính chất của nguyên tử cần định lượng mà có phép đo thích hợp

Phần 3: Hệ thống máy quang phổ hấp thụ, nó là bộ phận đơn sắc, có nhiệm vụ thu, phân ly và chọn tia sáng (vạch phổ) cần đo hướng vào nhân quang điện để phát hiện tín hiệu hấp thụ AAS của vạch phổ

Phần 4: Hệ thống chỉ thị tín hiệu hấp thụ của vạch phổ (tức là cường độ của vạch phổ hấp thụ hay nồng độ nguyên tố phân tích) Hệ thống này có thể

là các trang bị:

+ Đơn giản nhất là một điện thế chỉ năng lượng hấp thụ (E) của vạchphổ

+ Một máy tự ghi píc của vạch phổ

+ Hoặc bộ hiện số digital

+ Hay bộ máy tính và máy in (printer)

+ Hoặc máy phân tích (Intergrator)

Với các máy hiện đại còn có thêm một microcomputer hay microprocessor, và

hệ thống phần mềm Loại trang bị này có nhiệm vụ điều khiển quá trình đo và

xử lý các kết quả đo đạc, vẽ đồ thị, tính nồng độ mẫu phân tích

1.4.3 Kỹ thuật nguyên tử hoá [2],[4].

Để thực hiện quá trình nguyên tử hoá mẫu, người ta dùng hai phương pháp khác nhau, đó là kỹ thuật nguyên tử hoá trong ngọn lửa của đèn khí và

kỹ thuật không ngọn lửa trong cuvet graphit Tương ứng ta có phép đo F-AAS

và ETA-AAS

- Nguyên tử hoá bằng ngọn lửa đèn khí

Dùng năng lượng nhiệt của ngọn lửa đèn khí khi đốt cháy một hỗn hợp khí để hoá hơi mẫu, nguyên tử hoá mẫu phân tích tạo ra nguyên tử tự do của nguyên tố cần phân tích cho phép đo phổ AAS

Trong phép đo F-AAS nhiệt độ của ngọn lửa phụ thuộc vào bản chất, thành phần của chất khí đốt và tốc độ dẫn khí Vói mỗi hỗn hợp khí đốt sẽ cho ngọn lửa có nhiệt độ khác nhau, thường sử dụng hỗn hợp không khí nén và acetylene hoặc N20 và acetylene

- Nguyên tử hoá không ngọn lửa

Mẫu phân tích được đặt trong cuvet graphit hay trong thuyền Ta và được nung nóng nhờ nguồn năng lượng nhiệt điện để sấy khô mẫu, tro hoá luyện mẫu và sau đó nguyên tử hoá mẫu để đo tín hiệu hấp thụ của vạch phổ

Phương pháp này cung cấp cho phép đo AAS có độ nhạy khá cao cỡ ng/ml, nguyên tử hoá được nhiều nguyên tố hơn kỹ thuật đo ngọn lửa, tốn ít mẫu Quá trình thực hiện trong môi trường khí trơ Argon Quá trình nguyên tử hóa xảy ra theo 3 giai đoạn chính: sấy mẫu, tro hoá luyện mẫu, nguyên tử hoá mẫu để đo tín hiệu hấp thụ AAS Hai giai đoạn phụ là: làm sạch cuvet và làm nguội cuvet

Trong luận văn này, do Mo có hàm lượng nhỏ nên chúng tôi sử dụng kỹ thuật hấp thụ không ngọn lửa

1.4.4 Phương pháp xử lý mẫu trước khi phân tích [4],[9],[11].

Tuỳ thuộc vào bản chất của chất phân tích, đối tượng mẫu, điều kiện trang bị kỹ thuật mà ta có các phương pháp xử lý mẫu thích hợp Với mẫu thực vật để định lượng vi lượng kim loại, hiện nay thường sử dụng các phương pháp vô cơ hoá mẫu sau:

1.4.4.1 Phương pháp vô cơ hoá khô

Nguyên tắc: Đốt cháy các hợp chất hữu cơ có trong mẫu phân tích để

giải phóng kim loại ra dưói dạng oxit hoặc muối của chúng bằng nhiệt, sau đó hoà tan bằng các acid thích hợp

Phương pháp này có ưu điểm là đơn giản, triệt để nhưng lại có nhược điểm chính là làm mất các nguyên tố dễ bay hơi như: Hg, Pb, As, và không

áp dụng được cho các nguyên tố có áp suất hoi cao như As, Hg, Cd, , thời gian xử lý mẫu kéo dài

Để khắc phục người ta thường cho thêm chất bảo vệ như Mg(N03)2, KN03 và chọn nhiệt độ thích hợp

1.4.4.2.Phương pháp vô cơ hoá ướt.

Nguyên tắc: Oxi hoá các chất hữu cơ bằng acid hoặc hỗn hợp acid có

tính oxi hoá mạnh (ví dụ H2S04, HN03, HCIO4)

Phương pháp này đơn giản về mặt thực hiện, ưu việt hơn phương pháp khô về mặt tốc độ, bảo toàn được chất phân tích nhưng phải dùng một lượng acid khá nhiều, thường từ 3 đến 5 lần mẫu, vì vậy yêu cầu các acid phải có độ tinh khiết cao

1.4.4.3 Phương pháp xử lý mẫu trong lò vi sóng.

Nguyên tắc: Dùng năng lượng của lò vi sóng để đun nóng dung môi và

mẫu trong bình kín Trong điều kiện nhiệt độ và áp suất cao có thể dễ dàng hoà tan được mẫu

Do được thực hiện trong bình kín nên quá trình vô cơ ho '

sóng vừa không làm mất mẫu vừa vô cơ hoá mẫu một cách triệt để

1 7

-I.4.4.4 Phương pháp lên men.

Nguyên tắc: Hoà tan mẫu thành dung dịch hay huyền phù, thêm men

xúc tác và lên men ở nhiệt độ 37- 40°c trong thời gian 7 - 1 0 ngày Trong thời

gian lên men, các chất hữu cơ bị phân huỷ thành khí C 02, acid, nước và giải phóng các kim loại trong hợp chất hữu cơ ra dưới dạng cation trong dung dịch nước

Đây là phương pháp vô cơ hoá mẫu êm dịu nhất, không cần hoá chất, không làm mất nguyên tố cần phân tích, nhưng có nhược điểm là thời gian xử

lý mẫu khá lâu và phải chọn được loại men thích hợp

PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

2.1 Nguyên vật liệu và phương pháp.

2.1.1 Dược liệu nghiên cứu.

Để có các mẫu phục vụ cho mục đích nghiên cứu, chúng tôi chọn ngẫu nhiên các vị dược liệu trong nhà thuốc y học dân tộc Dược liệu được xử lý sơ

bộ như sau: thái mỏng bằng dao cầu, dùng thuyền tán để tán nhỏ thành bột mịn, rây lấy bột mịn để được bột có kích cỡ đồng nhất, đóng dược liệu vào túi polyethylene và để nơi khô mát Trước khi phân tích các mẫu đều được đo độ

ẩm Sau đó cho vào bình hút ẩm để tiện cho lần phân tích sau nếu cần

Máy quang phổ hấp thụ Hitachi Z-5000 (Hitachi, Nhật)

Máy lọc nước trao đổi ion Easypure UV/UF (Bamstead, Mỹ)

Máy ly tâm Hettich- Universal 32 (Hettich, Đức)

Tủ sấy Memmert (Memmert, Đức)

xác bằng phép đo AAS trước khi dùng Trong đề tài này chúng tôi có sử dụng các loại hoá chất sau:

« + Acid HNO3 65% (Merck, loại dùng cho AAS)

+ Acid HCIO4 70% (Merck, loại dùng cho AAS)

+ Nước cất hai lần được cất từ máy lọc nước trao đổi ion Easypure UV/UF

2.1.4 Nội dung nghiên cứu.

Nghiên cứu phương pháp phân tích hàm lượng Mo trong dược liệu với các nội dung sau:

- Khảo sát các điều kiện để định lượng Mo trong các mẫu dược liệu:

+ Khảo sát các thông số máy,điều kiện đo phổ

+ Xây dựng quy trình xử lý mẫu

+ Khảo sát phương pháp định lượng mẫu

+ Khảo sát độ lặp lại, độ đúng, sai số của phương pháp

- Áp dụng quy trình đã xây dựng được để định lượng Mo trong 20 mẫu dược liệu nghiên cứu

2 0

-2.1.5 Phương pháp nghiên cứu.

- Phương pháp xử lý mẫu: phương pháp vô cơ hoá ướt

- Kỹ thuật nguyên tử hoá: Nguyên tử hoá không ngọn lửa, sử dụng cuvet graphit

- Phương pháp phân tích định lượng: đo phổ hấp thụ AAS bằng phương pháp đường chuẩn

- Xử lý số liệu: Phương pháp thống kê

2.1.6 Phương pháp xử lý số liệu.

- Công thức tính hàm lượng Mo trong dược liệu:

Trong đó:

X là hàm lượng Mo trong mẫu dược liệu (|Lig/g)

c là nồng độ Mo xác định bằng phương pháp đường chuẩn (|ig/l)

M là khối lượng mẫu phân tích (g)

V là thể tích định mức (1)

Tính, đứng

Tính đúng được biểu diễn dưói dạng sai số, nó nói lên sự phù hợp giữa kết quả thực nghiệm với giá tri thực( hoặc được coi là giả thực)

+ Sai số tuyệt đối E = x - x t (7)

+ sai số tương đối Ej = — 100% (8)

X

- So sánh độ chính xác của hai loại thí nghiệm:

Giả sử có hai loại thí nghiệm được tiến hành với số lần thí nghiệm là Nj

và N2, độ lệch chuẩn Sj và s 2, quy ước Sj > S2

- So sánh hai giá trị trung bình:

Định lượng một mẫu thử bằng hai phương pháp với số lần xác định song

sánh x l và x2 xem hai kết quả có phù hợp nhau hay không ta tiến hành như sau:

Trước hết so sánh độ chính xác của hai phương pháp:

a Nếu F ’ < F: Hai phương pháp có độ chính xác khác nhau không có ý

nghĩa thống kê Tính e = t.sd

Dùng trị số t ứng với mức tin cậy 95% và số bậc tự so là Nj + N2 -2

sd được tính theo công thức:

Nếu X ị - x 2 < £ thì coi như Xị và x2 phù hợp với nhau, nghĩa là cùng đạidiện cho một giá trị thực.

2.2.1 Xác định độ ẩm của dược liệu.

Dược liệu đem nghiên cứu thường có độ ẩm nhất định Các mẫu dược liệu trước khi phân tích thường được đo độ ẩm để đảm bảo đã được chế biến

và bảo quản tốt Mặt khác, qua đó ta có thể xác định được hàm lượng chất nghiên cứu (Mo) trong dược liệu khô thông qua hàm lượng của nó trong dược liệu ẩm và độ ẩm của dược liệu

Để xác định độ ẩm của dược liệu chúng tôi tiến hành như sau:

Trên máy xác định hàm ẩm SARTORIUS, cân một lượng dược liệu nhất định, khoảng 2,5 g bột Sau đó chọn nhiệt độ và thời gian sấy (110° trong 10 phút)

2 3