Xây dựng phương pháp định lượng selen trong thực phẩm bằng quang phổ hấp thụ nguyên tử (a AS)

Xuất phát từ nhu cầu thực tế và trang thiết bị sẵn có của phòng thí nghiệm, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Xây dựng phương pháp định lượng Selen trong thực phẩm bằng quang phổ hấp thụ

BỘ Y T Ế TRƯỜNG ĐẠI HỌC D ư ợ c HÀ NỘI

Viện dinh dưỡng

Bộ môn Hoá phân tích Thời gian thực hiện:

Tháng 12/2006 - 5/2007

I * THIr V ! F \ !

-HÀ NỘI, THÁNG 512007

M Ở Ỉ e i u n d i t

quá trình thjïe hiên khơá luân nàụ,ý tòi đă nhăn đuổe ảự Ituêitạ flan, quan tám giúft itđ eủa ừúe tlĩ li ụ eề ạiáa, eáe eáềi t ó nhản iùên phồng, *30041 đèn thiĩừ

phfitn Çîrunjg, tâm DCỈem nghiêm (JJê linh cur tứàn thue phẩm, (J)lỀết dinh dưõtiíị

(JJỞi Lồng, kính ti^enự ữà lùêi ổn &âu ẳắe, tài æltt ạửl Lời eánt đn ehân thành tối:

DCiểnt nụhìêwi (ỉ)è linh eut tũàn thiĩe phẩm , <Viẽn (lình dưẻếiụ

ÇJhS ÇJrÂn QíLạuiẬỈn 3K ả- (B& mèềi ^3f)éa fthản tíừh-ÇJrùènti <TE)ại họe nữượe

'JÔÎL Qlội

này,

ÇJ&i æiit eJian thành eủm ổềi :

Çî& ÇJrun ÇJü cfav-ÇJỆtưềnụ, Œ)al hite <T)u’ jtf4L 'Jôà Qíỗi ¿tã đổng, ụẻft

nhữễíạ // tô « qxtự Ỉ%ÓJU ụỉĩtp tồi heàn thành khỡá luận nùụ^.

Çîèi eũn t£ æln lừkụ tầ lồềtự biếl ổn ehăềt thành tối:

X í Mế ÇJhi ^phỉúỉnụ, ÇJhtifr

(ễíìt (Dũăit (ĩ)àn 3Cỉẻn

(Và eáa eáit lìA nhản úiên phềnụ^ 'JÔ04L đ&e thu’e phẩm ÇJrunx} tăm 3(Ẩent nụhiỀm (Ỉ)Ề

ắỈnh ait túùn thựa fìỉtẩmý (JJiên í/ỉễth díiỉUiụ đă ụiủp đẵ aà tạ& iềiởi điều kiên thiiản

Lơi ừhũ tồi irơtig, ếuốt quá trình thu’j£ hiên đê tài

Qlhản ílift tí ¿i ụf là i ừìinự æiit ụửỉ lồ i eảnt đềt ehãtt thành lởi eáử thầy, ừê íịiáũ trưỉỉnụ <Đại họe <T)ưjổ4ì, /Jôà Qlội ¿tã truụỉtr đại eh& lồi nhữnụ, Ui en thứe €Ịuặ lúm t*4Mjí¿ 5 năm họa qu a Ể ả n t ổn ụia đình , lwn l%ề OỈL n hun ty nụuồi thân ụ ỉu đã luân luân ừê úiíf độềtụ mền tồ i twnty quá trình ihụ’ jfL hỉên tm h&àềt thành kltởá luận lút

TrangLời cảm ơn

MỤC LỤC

1.5.1 Phương pháp vô cơ hóa khô 18

3.3 BÀN LUẬN

KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT

Tài liệu tham khảo

BẢNG CH Ử V IẾ T TẮ T

Atomic Absorption Spectrometry

Association O f Analytical Chemistry

Electrodeless Discharge Lamp

Electro- Thermal Atomic Absorption Spectrometry

Hollow Cathod Lamp

Hydrid Vapor Generation

Iductively Coupled Plasma- Mass Spectrometry

Limit O f Detection

Limit O f Quantification

Neutron Activation Analysis

Recommended Daily Allowancges

Relative Standard Deviation

22

22

22

26 26 29 31 32 32 33 33 33 33 34 34 35

35

35

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 : Lượng Selen ăn vào hàng ngày theo khuyến cáo của Viện

Y học M ỹ

Bảng 2.2 : Chương trình vô cơ hoá mẫu gạo bằng lò vi sóng

Bảng 2.3: Chương trình vô cơ hóa mẫu đỗ và lạc nhân bằng lò vi sóng

Bảng 2.4: Chương trình vô cơ hóa tỏi bằng lò vi sóng

Bảng 3.5: Khảo sát nồng độ HC1

Bảng 3.6: Khảo sát nồng độ NaBH4

Bảng 3.7: Sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào nồng độ seien

Bảng 3.8: Xác định LOD và LOQ

Bảng 3.9: Kết quả khảo sát quy trình vô cơ hóa

Bảng 3.10: Kết quả khảo sát độ lặp lại trên mẫu đỗ xanh

Bảng 3.11: Kết quả khảo sát độ lặp lại trên mẫu đỗ đen

Bảng 3.12: Kết quả khảo sát độ lặp lại trên mẫu đậu Hà Lan

Bảng 3.13: Kết quả khảo sát độ lặp lại trên mẫu gạo nếp

Bảng 3.14: Kết quả khảo sát độ lặp lại trên mẫu lạc nhân

Bảng 3.15: Kết quả khảo sát độ lặp lại trên mẫu tỏi

Bảng 3.16: Kết quả khảo sát độ lặp lại trên mẫu gạo Tạp Giao

Bảng 3.17 Kết quả khảo sát độ đúng trên mẫu tỏi

Bảng 3.18 Kết quả khảo sát độ đúng trên mẫu đỗ xanh (thêm chuẩn 150 ng seien)

Bảng 3.19 Kết quả khảo sát độ đúng trên mẫu đỗ xanh (thêm chuẩn 50 ng seien)

20 Bảng 3.20 Kết quả khảo sát độ đúng trên mẫu đỗ xanh

(thêm chuẩn 200 ng selen)

(thêm chuẩn 10 ng selen) 26

(thêm chuẩn 100 ng selen) 26

23 Bảng 3.23 Kết quả khảo sát độ đúng trên mẫu gạo nếp

(thêm chuẩn 200 ng selen) 3 7

24 Bảng 3.24 Ảnh hưởng của nồng độ acid nitric 37

25 Bảng 3.25 Ảnh hưởng của nồng độ asen 38

26 Bảng 3.26 Kết quả định lượng selen trong một số mẫu thực phẩm 41

DANH MỤC CÁC HÌNH

1 Hình 1.1: Mối quan hệ giữa độ hấp thụ và nồng độ dung d ịc h 1 5

2 Hình 3.2: Đường cong biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào nồng

độ seien 29

3 Hình 3.3: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính của độ hấp thụ vàonồng độ seien 3 Q

ĐẶT VẤN ĐỂ

Trong cuộc sống hàng ngày, ngoài các chất dinh dưỡng và vitamin, cơ thể cần được bổ sung một lượng khoáng chất thích hợp để duy trì các chức năng sống Selen là một trong 10 nguyên tố vi lượng thiết yếu của cơ thể Nó đóng vai trò quan trọng trong tế bào vì liên quan đến sinh tổng hợp Co- enzym Q (ubiqinon), là thành phần cấu tạo nên Glutathion peroxydase (GSH Px), một enzym chống lại quá trình oxy hóa lipid, bảo vệ tế bào Ngoài ra selen còn giúp ngăn ngừa và phòng tránh một số bệnh như tim mạch, ung thư, và tham gia giải độc các kim loại nặng Thiếu selen là nguyên nhân gây ra nhiều bệnh nghiêm trọng nhưng quá thừa selen cũng rất nguy hiểm, có thể gây ngộ độc [2], [4], [8], [10], [12], [13], [18], [33]

Selen tham gia vào khẩu phần ăn của con người chủ yếu thông qua thức ăn

và nước uống Vì vậy, để kiểm soát lượng selen đưa vào cơ thể đòi hỏi phải có phương pháp chính xác và tin cậy để xác định hàm lượng selen trong thực phẩm Trên thế giới, người ta đã tiến hành phân tích selen trong thực phẩm bằng nhiều phương pháp khác nhau như đo huỳnh quang, kích hoạt nơtron, HVG- AAS, ET- AAS hay phương pháp ICP- MS [11], [14], [15], [20], [23]

Kỹ thuật HVG- AAS đang được sử dụng khá rộng rãi vì nó đáp ứng được các yêu cầu đối với việc xác định chính xác các nguyên tố vi lượng trong các đối tượng sinh học, dược phẩm, thực phẩm

Ở Việt Nam hiện tại chưa ban hành chính thức các phương pháp phân tích Selen trong mẫu thực phẩm Xuất phát từ nhu cầu thực tế và trang thiết bị sẵn có

của phòng thí nghiệm, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Xây dựng phương pháp

định lượng Selen trong thực phẩm bằng quang phổ hấp thụ nguyên tử

(AAS)” với 2 mục tiêu sau:

1 'Xây dựng được một phương pháp phân tích selen trong thực phẩm có độ chính xác, độ tin cậy cao góp phần giúp người tiêu dùng lựa chọn khẩu phẩn ăn hợp ly cũng như việc kiểm soát vệ sinh an toàn thực phẩm.

2 Áp dụng phương pháp đã xây dựng đ ể định lượng selen trong một số thực phẩm.

Chương I: TổNG QUAN

1.1 NGUYÊN TỐ SELEN

1.1.1 Đặc điểm [2], [5], [8], [9], [12], [33]

Tên quốc tế: Selenium

Kí hiệu hóa học: Se

Nguyên tử lượng: 78,96

Số thứ tự : 34

Thuộc nhóm V IA trong bảng hệ thống tuần hoàn các nguyên tố

Các nguyên tố cùng nhóm với seien: oxy, lưu huỳnh, telu và poloni

Selen được Berzelius (1779-1848) - nhà hóa học người Thụy Điển tìm ra năm 1817

Tính chất hóa học của seien rất giống lưu huỳnh Chúng đều thể hiện mức oxy hóa -2, +4, +6 tương ứng với các hợp chất: Sulfid- selenid, Sulfit- selenit, sulfat-selenat

Selen có thể thay thế vị trí của lưu huỳnh trong nhiều hợp chất hữu cơ tạo

ra những hợp chất tương tự của seien như: thioure và selenoure, cystein và selenocystein, methionin và selenomethionin, các enzyme chứa nhóm -SeH tương

tự các enzyme chứa nhóm -SH

Ở mức oxy hóa -2, seien tồn tại dưới dạng selenid (Se2')

Ở mức oxy hóa +4, seien tồn tại dưới dạng seien dioxyd (Se02), acid selenơ (H2Se03), muối selenit (Se032') và seien tetraclorid (SeCl4)

Ở mức oxy hóa +6, seien tồn tại dưới dạng acid selenic (H2Se04) hoặc muối selenat (Se042')

Các hợp chất seien đáng chú ý trong dinh dưỡng và sức khỏe là các dạng methyl hóa của seien như: (CH3)2Se, (CH3)2Se+; các selenoacid amin như: selenocystein, selenocystin, selenomethionin

1.1.2 Phân bố của Selen trong tự nhiên [2], [8], [12], [18], [33]

1.1.2.1 Selen trong đất

Selen phân bố khắp nơi ở trên vỏ trái đất với những lượng nhỏ Hầu hết các loại đất đều có chứa selen với hàm lượng từ 0,1 đến 2 ppm Thực vật có thể hấp thu selen nhưng còn phụ thuộc nhiều yếu tố, trong đó chủ yếu là dạng tồn tại của selen trong đất Se+6 là dạng hòa tan chính trong đất mà thực vật có thể đồng hóa được.

Ngoài ra, selen trong đất còn tồn tại ở dạng selenid kim ỉoại nặng (có độ hòa tan thấp), selen nguyên íố (tồn tại với iượng rất nhỏ) và dạng hợp chất hữu cơ (được giải phóng từ xác thối rửa của các thực vật)

1.1.2.2 Selen trong thực vật

Hàm lượng selen trong thực vật phụ thuộc từng loại cây Thông thường, người ta chia thực vật làm 3 nhóm:

-Nhóm 1 gồm các loại cây ít tập trung selen, đa số thực vật thuộc loại này

-Nhóm 2 gồm các loài cây tập trung selen ở mức vừa phải, đặc biệt trong

nhóm này lúa mỳ là loại ngũ cốc giàu selen nhất

-Nhóm 3 gồm các cây có hệ số tập trung selen cao, rất hiếm có thực vật thuộc nhóm này

Những cây tập trung selen thường thuộc họ Đậu, họ Cà phê Đặc biệt trên

thế giới có những cây có hệ số tập trung selen lớn như Morinda reticulata Benth (họ Cà phê), cây Neptunia ampỉexicauỉis Benth (họ Đậu) và cao nhất là những

cây thuộc loài Astragalus

Trong các loài cây trồng, lúa mỳ có khả năng tập trung nhiều selen hơn cả.Các loại đậu có hàm lượng selen thấp hơn các loại ngũ cốc

Các loại rau thường có hàm lượng selen thấp

Hàm lượng selen trong thực vật cũng phụ thuộc vào độ ẩm của đất Những vùng đất ẩm thì hàm lượng selen trong cây thường thấp hơn

Ngoài ra, selen còn phân bố trong nước với lượng rất ít Trong thịt và cá,

hàm lượng selen ở vào khoảng từ 0,4 đến 1,5 ụg/g Selen tập trung nhiều nhất ở

da và gan các loài cá, đặc biệt ở cá ngừ Vì thế mỡ cá và dầu gan cá có hàm lượng selen lớn Các loài động vật khác có lượng selen ít và không ổn định

1.1.3 Vai trò của selen trong cơ thể [2], [4], [8], [10], [12], [13], [18], [33]

Trước đây, selen được coi là nguyên tố có độc tính cao vì trên những vùng đất giàu selen thường gặp một số bệnh ở súc vật và người như rụng lông, yếu cơ

Thế nhưng, đến năm 1949, Claton và Bauman đã nhận thấy rằng hàm

lượng selen trong khẩu phần ăn có tác dụng ngăn chặn sự phát triển ung thư ở

chuột Năm 1971, người ta đã chứng minh được vai trò quan trọng của selen trong thành phần cấu tạo của glutathion peroxydase

Ngày nay, selen được coi là nguyên tố vi lượng rất quan trọng giúp cơ thể phòng chống bệnh tật

❖ Vai trò của selen trong chống oxy hóa

Selen có vai trò rất quan trọng trong sự hình thành và phân hủy gốc tự do Selen là nguyên tố cấu thành của hệ enzym glutathion peroxyđase (GSH Px) có vai trò cực kỳ quan trọng trong hệ thống chống gốc tự do, chống oxy hóa của cơ thể Nó có mặt trong mọi tế bào, cùng các enzym superoxyd dimutase (SOD), catalase loại bỏ gốc tự do, phá hủy hydroperoxyd và các peroxyd lipid khác của acid béo (LO O , LOOH ) bảo vệ màng tế bào và ADN

Peroxyd được loại bỏ theo cơ chế sau:

(glutathion reductase)Ngoài ra, selen còn tham gia vào thành phần của nhiều chất hoạt động sinh học chứa nhóm -SH, -SeH như selenomethionin Tính chất chống oxy hóa của selen còn do selen xúc tác cho tổng hợp co-enzym Q, một chất chống oxy hóa chủ yếu của cơ thể

GSSG + 2H20

glutathion (dạng oxy hóa)

❖ Selen và bệnh ung thư

Tiến sĩ Gerald F Combs, giám đốc trung tâm dinh dưỡng Grand Forks của USDA cho rằng “Không có chất dinh dưỡng nào có thể ngăn chặn ung thư hiệu quả hơn selen” Selen có tác dụng chống oxy hóa, trung hòa gốc tự do, do đó làm tăng chức năng hoạt động miễn dịch của tế bào Ngoài ra, selen còn ngăn chặn sự tưới máu cho khối u làm cho tế bào ung thư tự hủy hoại Theo nhiều nghiên cứa

đã được đưa ra, selen giúp phòng ngừa ung thư tuyến tiền liệt, ung thư vú, phổi, buồng trứng trực tràng, kết tràng, thực quản, tụy tạng

❖ Selen và bệnh tim mạch

Selen là chất antioxidant, có thể hạn chế sự oxy hóa các LDL cholesterol nên ngăn chặn quá trình tạo các mảng xơ vữa động mạch- nguyên nhân gây cao

huyết áp, thiếu máu cục bộ ở các cơ quan, thiểu năng tuần hoàn não Vào đầu

những năm 30, ở Trung Quốc, người ta phát hiện ra bệnh Keshan xảy ra ở những đứa trẻ có khẩu phần ăn thiếu hụt selen trầm trọng (ít hơn 19 |ig/ngày đối với nam và 13 Ịig/ngày đối với nữ) Nét đặc trưng của bệnh Keshan là hoại tử nhiều ở

cơ tim

Ngoài ra, selen còn có tác dụng hạ huyết áp và góp phần bảo vệ sự toàn vẹn của collagen là điều kiện cần thiết để phòng tránh các bệnh tim mạch

❖ Selen và quá trình viêm

Có nhiều nghiên cứu cho thấy rằng selen làm giảm viêm một cách rõ rệt, đặc biệt là Na2Se Selen có tác dụng chống viêm do nó có thể làm ổn định lysosom Màng lysosom không nguyên vẹn là nguyên nhân của quá trình viêm Tác dụng chống viêm của selen tăng lên khi phối hợp cùng với vitamin E

❖ Selen và hệ thống miễn dịch

Selen có vai trò quan trọng đối với cơ thể trong việc phòng chống các bệnh nhiễm khuẩn, nhiễm virut kể cả HIV/AIDS Sự thiếu hụt selen làm giảm khả năng thực bào, giảm lượng và hoạt tính của tế bào lympho T do đó làm giảm sự nhạy cảm của cơ thể đối với các tác nhân này Theo nghiên cứu của các nhà khoa

học trường Đại học Miami (Mỹ) cho biết những bệnh nhân HIV dùng 200 |ig seien mỗi ngày có thể giảm được trung bình 12% lượng virut này trong máu Sự thiếu hụt seien làm cho nhiều loại virut lành tính trở nên có độc lực (ví dụ virut Coxsackie B3).

❖ Selen và sự lão hóa

Gốc íự do làm sai lệch cấu trúc và rối loạn thông tin trên nhữĩig phân tử sinh học, vật chất di truyền và tế bào Gốc tự do chính là nguyên nhân của sự lão hóa

Các hợp chất của seien và co- enzym Q có khả năng chống oxy hóa các lipid ở màng tế bào, phân hủy các peroxyđ đã tạo thành trong tế bào, đảm bảo sự toàn vẹn của tế bào, làm chậm quá trình lão hóa của cơ thể, kéo dài tuổi thọ của con người Thực phẩm giàu seien giúp bảo vệ da chống lại tia cực tím Vì thế chất này cần được cung cấp đầy đủ trong mùa nắng nóng (khoảng 200 g rau quả mỗi ngày)

❖ Selen và các bệnh về mắt

Selen có liên quan đến độ nhanh nhạy của thị lực con người Nếu mỗi ngày đưa vào cơ thể một lượng seien nhất định từ ăn uống sẽ làm giảm phát sinh cận thị và các bệnh về mắt khác Nhiều nghiên cứu cho rằng seien tham gia vào phản ứng quang hóa xảy ra ở võng mạc Tác dụng làm sáng mắt của seien là do

sự điều hòa quá trình sinh các gốc tự do trong võng mạc Mặt khác, seien còn đảm bảo sự toàn vẹn của thủy tinh thể

Ngoài ra, seien còn có tác dụng giải độc nhiều kim loại nặng như asen, thủy ngân, cadimi, chì, đồng Nó có khả năng liên kết với các kim loại nặng và đào thải ra nước tiểu Selen cũng có tác dụng làm tăng hoạt động của tuyến giáp

do thúc đẩy sự chuyển hóa levothyronin (T4) thành levothyroxin (T3) có hoạt tính sinh học mạnh hơn

1.1.4 Độc tính của seien [2], [4], [9], [12], [18]

I.I.4.I Đối với động vật

Độc tính của selen trên động vật phụ thuộc vào liều lượng, thời gian dùng

và loại súc vật Có 3 loại ngộ độc: ngộ độc cấp tính, trường diễn và bán trường diễn Giới hạn giữa liều dùng tối thiểu và liều gây độc rất hẹp Trên chuột, liều tối thiểu hàng ngày là 0,1 |ig/g trong khi hơn 2 |ig/g đã gây ngộ độc mạn tính Trong các hợp chất của selen, selen vô cơ và dạng aminoacid ít độc nhất còn seỉen hydrid là dạng độc nhất

I.I.4.2 Đối với con người

Ở người, nếu lượng selen ăn vào ở mức vừa phải (<800|ig/ngày) thì không gây độc Tuy nhiên, cũng có vài báo cáo về tác hại nghiêm trọng của selen như ngộ độc cấp tính nặng và tử vong Khi bệnh nhân hấp thụ một lượng lớn selen mà không được dùng thuốc giải độc ngay sẽ xuất hiện một số triệu chứng như viêm

dạ dày ruột, rối loạn thần kinh, suy hô hấp và suy thận Ngộ độc mạn tính selen

được mô tả ở hầu hết bệnh nhân là thay đổi cấu trúc móng, rụng lông tóc Nếu

tiếp tục ăn vào với liều cao sẽ gây tổn thương da, hệ thần kinh, ỉa chảy, hỏngrăng Những triệu chứng này xuất hiện khi dùng 3200 đến 6700 |ig selen/ngày Ở

Mỹ, người ta coi liều 500 Ịig/ngày dùng trong thời gian dài là có nguy cơ ngộ độc cho người

1.1.5 Nhu cầu Selen của con người [4], [8], [12], [21]

Selen tham gia vào khẩu phần ăn của con người thông qua thức ăn và nước uống Ở hàm lượng hợp lý selen có tác dụng rất tốt trong phòng ngừa bệnh tật nhưng nếu thừa sẽ gây ra độc tính Vì vậy, việc quy định về hàm lượng selen ăn vào hàng ngày cũng được nhiều quốc gia quan tâm Năm 1980, các nhà khoa học

Mỹ đã xác định hàm lượng selen trong chế độ dinh dưỡng hàng ngày của người lớn là 50- 200 |ig Ở Australia liều khuyên dùng đối với người trưởng thành là 85

|ig/ngày đối với nam và 70 ịig/ngày đối với nữ

Theo khuyến cáo của Viện Y học Mỹ, lượng selen ăn vào hàng ngày (RDA) đối với trẻ em và người lớn như sau :

Bảng 1.1 : Lượng Selen ăn vào hàng ngày theo khuyến cáo của Viện Y học

M ỹ

(ng/ngày)

Phụ nữ mang thai(ng/ngày)

Phụ nữ đang cho con bú (ng/ngày)

Mức tối đa

ăn vào (jig/ngày)

Năm 1999, Marijana Matex, Maja Blausa và Jerica Grgic nghiên cứu xác định seien trong một số thực phẩm như thịt, cá, trứng, sữa bằng phép đo phổ hấp thụ nguyên tử

Năm 2002, Han Wen Sun, Jing Ha, De Qiang Zhang, Li Li Yang và Jian Min Sun đã xây dựng phương pháp để định lượng vết seien trong nước tiểu bằng phổ hấp thụ dẫn xuất hydrid

1.2.2 Trong nước

ở Việt Nam, vấn đề về seien bắt đầu được quan tâm, nghiên cứu nhiều từ đầu những năm 90 của thế kỷ trước

Năm 1991, Bùi Mai Hương đã nghiên cứu định lượng vết selen và telu bằng một số phương pháp cực phổ hiện đại.

Năm 1997, Lê Thị Hương Giang (Trường Đại học Tổng hợp) nghiên cứu xác định selen bằng phương pháp cực phổ xung vi phân và Volt- ampe hòa tan

Năm 2001, Ngô Văn Tuyên nghiên cứu định lượng selen trong nấm men bằng hệ máy phân lích MS-750

Năm 2002, Tiến sĩ Nguyễn Quang Thường công bố công trình nghiên cứu sản xuất nấm men giàu selen ở quy mô phòng thí nghiệm và xây dựng phương pháp định lượng selen trong nấm men bằng phương pháp quang phổ hấp thụ UV-

1.3 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG SELEN

1.3.1 Phương pháp phân tích khối lượng [2], [8], [14], [33]

Nguyên tắc: Chuyển hợp chất selenat (Se042'), selenid (Se032') trong các

mẫu thử về selen nguyên tố kết tủa đỏ bằng các chất khử như: S 02, Fe++, Cu+, thioure ; thu lấy tủa, rửa tủa, sấy khô rồi cân khối lượng và tính kết quả Có thể cho selen tác dụng với thuốc thử o- diamino thơm tạo phức piazoselenol kết tủa, thu lấy tủa, rửa tủa, sấy khô, cân và tính kết quả

Phương pháp này không được dùng để phân tích selen trong thực vật vì hàm lượng selen trong thực vật thường nhỏ

1.3.2 Phương pháp quang phổ hấp thụ UV- VIS [2], [8], [14], [32], [33]

Nguyên tắc: Selen (IV) phản ứng nhạy và chọn lọc với o- diamino thơm,

tạo phức piazoselenol tan trong các dung môi hữu cơ Phức này có cực đại hấp thụ rất đặc trưng, có thể đo quang để xác định hàm lượng selen Thuốc thử 3,3- diaminobenzidin và 2,3- diaminonaphtalen là phổ biến nhất

Phương pháp này dựa trên phản ứng tạo phức nhạy, chọn lọc, áp dụng được với các mẫu có hàm lượng selen thấp, nhưng có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến kết quả định lượng Do đó nếu dùng phương pháp này để định lượng selen trong thực phẩm sẽ gặp nhiều khó khăn do nền mẫu phức tạp.

1.3.3 Phương pháp huỳnh quang [2], [8], [12], [14], [33]

Nguyên tắc: Phức piazoselenol tạo thành giữa selen (IV) và các o-

diamino thơm phát huỳnh quang ở bước sóng nhất định Do đó có thể đo huỳnh quang để định lượng selen

Phương pháp này nhạy nhưng nếu mẫu phân tích chứa nhiều nguyên tố vi lượng thì kết quả có thể bị ảnh hưởng

1.3.4 Phương pháp cực phổ [8], [11], [12], [15]

Nguyên tắc: Đưa selen trong mẫu về Se(IV) rồi thực hiện cực phổ giọt

thủy ngân với dung dịch điện ly nền acid Dưới thế 0-100mV, selen bị khử ở catod cho 2 thế bán sóng Đo cường độ dòng khuếch tán giới hạn tại thế bán sóng thứ hai sẽ xác định được nồng độ selen trong dung dịch đo

Trong ngành phân tích thực phẩm, phương pháp AAS cũng được ứng dụng khá nhiều để xác định hàm lượng các nguyên tố trong các mẫu rau quả, thịt, cá

Phương pháp AAS có độ nhạy, độ chính xác cao nên chúng tôi sẽ ứng dụng phương pháp này để xác định hàm lượng selen trong thực phẩm- một nguyên liệu mà hàm lượng selen rất ít và có nhiều tạp chất.

1.4.1 Lý thuyết về phương pháp AAS

Như chúng ta đã biết, vật chất được cấu tạo bởi các nguyên tử Trong điều kiện bình thường nguyên tử không thu cũng không phát ra năng lượng dưới dạng các 'bức xạ Lúc này nguyên tử tồn tại ở trạng thái cơ bản, bền vững và nghèo năng lượng nhất Khi nguyên tử ở trạng thái hơi tự do, nếu chiếu một chùm tia sáng có những bước sóng xác định vào đám hơi nguyên tử đó thì chúng sẽ hấp thụ các bức xạ có bước sóng nhất định ứng đúng với những tia bức xạ mà nó có thể tạo ra trong quá trình phát xạ của nó Lúc này nguyên tử nhận năng lượng và chuyển lên trạng thái kích thích có năng lượng cao hơn trạng thái cơ bản Đó là tính chất đặc trưng của nguyên tử ở trạng thái hơi Quá trình này gọi là quá trình hấp thụ năng lượng của nguyên tử tự do ở trạng thái hơi và tạo ra phổ hấp thụ nguyên tử của nguyên tố đó

❖ Nguyên tắc phép đo AAS

Phương pháp phân tích dựa trên cơ sở đo phổ hấp thụ nguyên tử của một nguyên tố được gọi là phép đo phổ hấp thụ nguyên tử (AAS)

Cơ sở lí thuyết của phép đo này là sự hấp thụ năng lượng (bức xạ đơn sắc) của nguyên tử tự do ở trong trạng thái hơi (khí) khi chiếu chùm tia bức xạ qua đám hơi của nguyên tố ấy trong môi trường hấp thụ Vì thế muốn thực hiện được phép đo phổ hấp thụ nguyên tử của một nguyên tố cần phải thực hiện các quá trình sau:

- Chọn các điều kiện và một loại trang bị phù hợp để chuyển mẫu phân tích từ trạng thái ban đầu (rắn hay dung dịch) thành trạng thái hơi của các nguyên tử tự do Đó là quá trình hóa hơi và nguyên tử hoá mẫu

- Chiếu chùm tia sáng bức xạ đặc trưng của nguyên tố cần phân tích qua đám hơi nguyên tử vừa điều chế được ở trên Các nguyên tử của nguyên tố cầũ[xác định trong đám hơi sẽ hấp thụ những tia bức xạ nhất định và tạo ra phổhấp thụ của nó ở đây phần cường độ của chùm tia sáng đã bị hấp thụ phụ thuộc vào nồng độ của nguyên tử trong môi trường hấp thụ

- Tiếp đó, nhờ một hệ thống máy quang phổ người ta thu toàn bộ chùm sáng, phân ly và chọn một vạch phổ hấp thụ của nguyên tố cần nghiên cứu để đo cường độ của nó Cường độ đó chính là tín hiệu hấp thụ của vạch phổ hấp thụ nguyên tử Trong một giới hạn nhất định của nồng độ c , giá trị cường độ này là phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ c của nguyên tố trong mẫu phân tích

Ba quá trình trên chính là nguyên tắc của phép đo phổ hấp thụ nguyên t ử

❖ Trang bị của phép đo ÁAS

Hệ thống máy đo phổ hấp thụ nguy en tử bao gồm 4 phần cơ bản sau:

- Phần 1: Nguồn phát tia phát xạ cộng hưởng của nguyên tố phân tích : đèn catod rỗng (HCL- Hollow Cathode Lamp), đèn phóng điện không điện cực (EDL- Electrodeless Discharge Lamp) hoặc nguồn phát bức xạ liên tục đã được biến điệu

- Phần 2: Hệ thống nguyên tử hóa mẫu phân tích: được thực hiện theo hai

kỹ thuật nguyên tử hóa mẫu

+ Nguyên tử hóa bằng ngọn lửa: bao gồm bộ phận dẫn mẫu vào buồng aerosol hóa và đèn để nguyên tử hóa mẫu (burner head)

+ Kỹ thuật nguyên tử hóa không ngọn lửa: gồm một lò nung nhỏ bằng graphit (cuvet graphit) hay thuyền tangtan (Ta) để nguyên tử hóa mẫu nhờ nguồn năng lượng điện có thế thấp (nhỏ hơn 12V) nhưng có dòng rất cao (50-800 A)

- Phần 3: Hệ thống máy quang phổ hấp thụ, bộ đom sắc có nhiệm vụ thu, tán sắc và chọn tia sáng (vạch phổ) cần đo hướng vào nhân quang điện để phát tín hiệu hấp thụ AAS của vạch phổ

- Phần 4: Là hệ thống chỉ thị tín hiệu hấp thụ của vạch phổ, thường chỉ thị hấp thụ năng lượng bằng:

+ Thang đo mật độ quang

+ Phương pháp hiệu số chỉ độ hấp thụ của vạch phổ

+ Ghi cường độ vạch phổ ở dạng pic

+ Phương pháp in trực tiếp giá trị đo

❖ Cường độ của vạch phổ hấp thụ nguyên tử

Cường độ của vạch phổ hấp thụ nguyên tử và nồng độ của nguyên tố đó trong đám hơi tuân theo định luật Lambert -Beer Chiếu chùm tia sáng đơn sắc cường độ I0 đi qua môi trường chứa nguyên tử tự do có nồng độ N và bề dày L Gọi D là cường độ vạch phổ hấp thụ nguyên tử ta có:

D = log Io/I = 2,303 KV.N.L (1.1)Trong đó:

I0: Cường độ chùm sáng tới

I: Cường độ chùm sáng sau khi đi qua môi trường hấp thụ

D: Cường độ hấp thụ của một vạch phổ

Kv: Hệ số hấp thụ của mỗi vạch phổ

L: Bề dày của môi trường hấp thụ chứa nguyên tố cần phân tích ở trạng thái hơi

N: Số nguyên tử tự do của nguyên tố phân tích ở trạng thái hoi

Mối quan hệ giữa N và c rất phức tạp, phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhưng

có thể biểu thị theo công thức:

C1 C2 C3 C4 C5 C6 Nồngđộ(ppm)

Hình 1.1 Mối quan hệ giữa độ hấp thụ và nồng độ dung dịch

Với Cx < Co thì b = 1, D và c tuyến tính theo phương trình có dạng y=a.x

Với Cx > c 0 thì b < 1, D và c không tuyến tính

C0 được gọi là giới hạn trên của quan hệ tuyến tính

Trong phân tích, người ta thường sử dụng đoạn tuyến tính AB vì việc tính toán sẽ cho kết quả chính xác

1.4.2 Kỹ thuật hydrid hóa [6]

Nguyên tử hóa mẫu phân tích là quá trình quan trọng của phép đo phổ

AAS vì chỉ có nguyên tử tự do ở trạng thái hơi mới cho phổ hấp thụ nguyên tử

Số nguyên tử tự do trong trạng thái hơi là yếu tố quyết định cường độ vạch phổ hấp thụ nguyên tử nên quá trình nguyên tử hóa mẫu sẽ ảnh hưởng rất lớn đến kết quả phân tích

ở đây, chúng tôi dùng kỹ thuật hydrid hóa để chuyển nguyên tố cần phân tích về dạng hydrid rồi mới nguyên tử hóa

Nguyên tắc: Trong những điều kiện nhất định, một số nguyên tố có khả

năng phản ứng với hydro mới sinh hoặc chất khử sinh ra hợp chất hydrid ở trạng

thái khí Các hợp chất này dễ bị nguyên tử hóa thành các nguyên tử tự do có khả năng hấp thụ quang sinh ra phổ hấp thụ nguyên tử.

Các hợp chất này có nhiệt độ phân hủy rất thấp: HgH2 ở 20°C; AsH3,TeH4 SeH4 ở 700°C; AsH5, TeH6, SeH6 ở 850°c

Sau khi các hợp chất hydrid đã được hình thành trong bình phản ứng, dùng khí trơ argon dẫn vào cuvet thạch anh để nguyên tử hóa và đo phổ

Các phản ứng tạo hợp chấí hydrid:

Hg(II) + SnCl2 + H+ ^ Hg(k)

• Vói As (III): As(III) + NaBH4 + H+ -ỳ AsH3 -> As(k).

Ở đây phản ứng của ion hóa trị cao với hydro mới sinh thường rất chậm nên phải khử trước As (V) về As (ni), Se (VI) về Se (IV) và Te(VI) về Te(IV) rồi mới tiến hành phản ứng như vậy kết quả sẽ ổn định hơn

Trang bị của kỹ thuật hydrìd' gồm có các bộ phận sau

- Bình phản ứng

- Bộ bơm mẫu và thuốc th ử

- Bộ lọc và làm khô khí hydrid

- Cuvet thạch anh

- Nguồn nhiệt để nguyên tử hóa hợp chất hydrid có thể dùng:

• Nguồn nhiệt điện (kiểu lò nung)

- Thuốc thử khử: dùng hai loại chính là

Te,

Đặc điểm của kỹ thuật hydrid hóa:

- Có độ nhạy rất cao, giới hạn phát hiện cỡ ng/mL

- Do tách được chất phân tích ra khỏi nền mẫu nên đã loại trừ được nhiều yếu tố ảnh hưởng đồng thời cũng làm giàu được chất phân tích

- Độ chọn lọc cao

- Áp dụng được cho hầu hết các đối tượng mẫu

Vì vậy, hiện nay kỹ thuật này đang được ứng dụng để xác định một số nguyên tố như Hg, As, Se, T e

1.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng

Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả phân tích trong phép đo AAS rất đa dạng và phức tạp tùy thuộc vào thành phần của mẫu và nền mẫu Nhìn chung, có thể chia thành 6 nhóm sau:

Nhóm 1 : Các thông số của hệ máy đo phổ

Nhóm 2: Các điều kiện nguyên tử hóa mẫu

Nhóm 3: Các ảnh hưởng về phổ như sự hấp thụ nền, sự chen lấn của vạch phổ và sự hấp thụ của các hạt rắn

Nhóm 4: Kỹ thuật và phương pháp được chọn để xử mẫu

Nhóm 5: Các yếu tố vật lý như độ nhót, sức căng bề mặt của dung dịch mẫu có ảnh hưởng nhiều đến phép đo nhất là khi mẫu phân tích có nồng độ lớn

Nhóm 6: Các yếu tố hóa học như nồng độ acid và loại acid trong dung dịch mẫu, các cation và anion trong dung dịch, thành phần nền và dung môi hữu cơ

Vì vậy, để kết quả chính xác và tin cậy đòi hỏi người phân tích phải biết làm giảm hoặc loại bỏ các yếu tố ảnh hưởng về mặt hóa học cũng như về phổ hấp thụ trong mỗi trường hợp

1.5 PHƯƠNG PHÁP VÔ C ơ HÓA MAU [8], [14], [22], [24]

Các nguyên tố trong mẫu phân tích thường ở dạng hợp chất hữu cơ hoặc

thành dạng vô cơ Thông thường có thể xử lý mẫu bằng một trong các phương pháp sau: vô cơ hóa khô, vô cơ hóa ướt, vô cơ hóa trong lò vi sóng và lên men.

1.5.1 Phương pháp vô cơ hóa khô

Nguyên tắc: Đốt cháy các chất hữu cơ trong mẫu phân tích để giải phóng

kim loại dưới dạng oxyd hoặc muối của chúng bằng nhiệt Sau đó hòa tan cắn trong acid để tạo dung dịch

Phương pháp này thực hiện đơn giảri, vô cơ hóa triệt để nhưng có nhược điểm chính là nhiệt độ tro hóa cao (khoảng 500- 600°C) nên làm mất các nguyên

tố dễ bay hơi như: Pb, Zn, Ag, Se, As , thời gian xử lý mẫu kéo dài Có thể khắc phục bằng cách cho thêm chất bảo vệ như M g(N 03)2 hoặc K N 03 và chọn nhiệt

độ thích hợp

1.5.2 Phương pháp vô cơ hóa ướt

Nguyên tắc: Oxy hóa hợp chất hữu cơ bằng một acid hoặc một hỗn hợp

acid có tính oxy hóa mạnh thích hợp

Phương pháp này có ưu điểm là thời gian phân tích ngắn, nhiệt độ YÔ cơ hóa không cao nên bảo toàn được chất phân tích nhưng lại phải dùng một lượng acid lớn (thường gấp 3 đến 5 lần mẫu) Vì vậy, phương pháp này đòi hỏi phải sử dụng acid có độ tinh khiết cao và chỉ thích hợp với những mẫu có khối lượng nhỏ

1.5.3 Phương pháp vô cơ hóa trong lò vi sóng

Nguyên tắc: Dùng năng lượng vi sóng đốt nóng thuốc thử và mẫu đựng

trong bình kín Trong bình kín, áp suất cao có thể dễ dàng đạt được nhiệt độ cao làm tăng tốc độ vô cơ hóa

Đây là phương pháp xử lý mẫu hiện đại nhất hiện nay, rút ngắn thời gian

xử mẫu, không mất mẫu (do hệ kín), vô cơ hóa triệt để và có thể vô cơ hóa nhiều mẫu cùng một đối tượng Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi thiết bị đắt tiền, không phải cơ sở nào cũng có

1.5.4 Phương pháp lên men

Nguyên tắc: Hòa tan mẫu thành dung dịch huyền phù, thêm enzym xúc

tác và ủ ở nhiệt độ 37- 40°c trong thời gian 7-1 0 ngày Trong thời gian lến men, các chất hữu cơ bị phân hủy thành khí C 0 2, acid, nước và giải phóng kim loại trong hợp chất hữu cơ dưới dạng cation trong dung dịch nước

Phương pháp này có đặc điểm là vô cơ hóa mẫu êm dịu, không cần hóa chất, không iàm mất nguyên tố cần phân tích, rất thích hợp cho việc phân hủy các mẫu đường, nước ngọt, nước giải khát, tinh bột nhưng thòi gian xử lý mẫu lâu

và phải chọn được loại emzym thích hợp

Chương II: ĐÒI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN c ứ u

Đối tượng nghiên cứu của chúng tôi là các loại gạo và ngũ cốc được lấy từ các chợ ở Hà Nội như chợ Mơ, chợ Hôm Mẫu sau khi thu về được bảo quản trong túi kín và ghi mã số

Mẫu 1 : Gạo nếp

Mẫu 2: Gạo Tạp Giao

Mẫu 3: Tỏi

Mẫu 4: Đậu Hà Lan

Mẫu 5: Đỗ đen xanh một

Mẫu 6: Đỗ xanh

Mẫu 7: Lạc nhân

2.2 THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT

2.2.1 Hóa chất và thuốc thử

- Dung dịch chuẩn gốc Se 1000 |ig/mL :

+ Dung dịch mua sẵn Natri selenit pentahydrat, Na2Se03.5H20 (Merck,

No 10667)

+ Pha từ bột Se: Hòa tan 1,000g bột Se với lượng tối thiểu H N 03 trong cốc 200mL và bay hoi đến khô (lặp lại vài lần) Hòa tan bằng HC1 (1+9) và định mức đến vạch trong bình 1 lít

- Natri borohydrat 0,4% (w/v): Dung dịch này phải được pha mới ngay trước khi dùng theo cách như sau: Hòa tan 2,5 g NaOH trong 200 mL nước cất sau đó cho vào 2,0 g NaBH4, pha loãng đến 500 mL bằng nước cất Đem rung siêu âm trong bể rung siêu âm 1 giờ

- Dung dịch HC1 5M: Lấy 212,5 mL HC1 đậm đặc 37% hòa tan trong 200

mL nước cất rồi định mức đến 500 mL Sau đó đem rung siêu âm trong bể rung siêu âm 1 giờ

- Acid nitric đậm đặc HNO3 65% (Merck)

- Hydrogen peroxyd H20 2 30% (Merck).

- Nước cất 2 lần

2.2.2 Dụng cụ, thiết bị

- Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AA- 6800 của hãng Shimadzu

- Bộ hóa hơi hydrid HVG-1

- Đèn catod rỗng Se

- Ống thạch anh chữ T (cuvet nguyên tử hóa) chịu nhiệt điện ~ 790°c

- Khí acetylen

- Khí argon

- Lò vô cơ hóa mẫu START D của hãng Milestone (Italia)

- Máy rung siêu âm

- Các dụng cụ thông thường của phòng thí nghiệm

Tất cả các máy móc dụng cụ đã được kiểm định và hiệu chuẩn theo đúng tiêu chuẩn ISO/ IEC 17025, GLP

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

2.3.1 Phương pháp xử lý mẫu: Phương pháp vô cơ hóa trong lò vi sóng

Mẫu thu được phải xay nhỏ, trộn đều để đảm bảo đồng nhất Cân chính xác khoảng lg mẫu bằng cân phân tích có độ chính xác 0,001 g rồi cho vào các ống vô cơ hóa làm bằng Teflon Thêm tác nhân vô cơ hóa mẫu, đậy kín, vặn thật chặt và đặt các ống Teflon vào lò vi sóng, đặt chương trình nhiệt độ

Các đối tượng mẫu khác nhau có chương trình vô cơ hoá khác nhau

- Mẫu gạo:

• Tác nhân vô cơ hoá: 5 mL H N 03 65% + 5 mL H20 + 1 mL H20 2 30%.

• Chương trình nhiệt độ:

Bảng 2.2: Chương trình vô cơ hóa mẫu gạo bằng lồ vỉ sóng

Bảng 2.3: Chương trình vô cơ hóa mẫu đỗ và lạc nhân bằng lò vi sóng

Bảng 2.4: Chương trình vô cơ hóa mẫu tỏi bằng lờ vỉ sóng

Lưu ý: Khi cho hoá chất vào các ống Teflon đựng mẫu phải theo đúng thứ

tự và phun vào thành ống để mẫu tập trung ở phần dưới đáy ống

Mẫu sau khi vô cơ được chuyển sang cốc có mỏ 100 mL, tráng rửa nhiều lần bằng nước cất, sau đó cô đến muối ẩm trên bếp cách thủy ở nhiệt độ 85°c (trên 85°c Selen sẽ bay hơi và làm mất mẫu) Mẫu sau khi xử lý được hòa tan bằng 5 mL dung dịch HC1 (1+ 1) cho vào bình định mức 25mL, thêm nước cất đến vạch.

2.3.3 Phương pháp đánh giá và xử lý kết quả

Mẫu đã xử lý ở trên được đo bằng hệ thống HVG- A AS rồi tính toán kết quả dựa trên đường chuẩn đã lập

Hàm lượng seien trong mẫu được tính như sau:

Cx x V

(-^tổng- Xmẫu) X ^ câ n

Độ thu hồi: H (%) = -X 100% (1.5)

^chuẩnTrong đó

X: hàm lượng Se trong mẫu (ng/g)

Cx: Nồng độ Se có trong dung dịch thử (ng/mL)

V: Thể tích định mức sau vô cơ (mL)

m: khối lượng mẫu đem vô cơ (g)

Xmẫu: Hàm lượng selen trong mẫu thử (ng/g)

x tổng: Hàm lượng selen trong mẫu thêm chuẩn (ng/g)

mcân: Khối lượng cân của mẫu thêm chuẩn

mchuấn: Khối lượng chuẩn thêm vào (ng)

Sử dụng toán thống kê để khảo sát các thông số của phép đo: