phân lập và tuyển chọn vi khuẩn acid acetic ứng dụng trong lên men thủy sâm

Qua quá trình lên men hỗn hợp trà đường của nấm men và vi khuẩn acid acetic tạo ra sản phẩm có vị chua chua ngọt ngọt phù hợp với khẩu vị của nhiều nguời, trong đó vi khuẩn acid acetic l

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN ACID ACETIC

ỨNG DỤNG TRONG LÊN MEN THỦY SÂM

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

CN PHẠM HỒNG QUANG LÊ THỊ MỸ XUYÊN

MSSV: 3104008

LỚP: VI SINH VẬT HỌC K36

Cần Thơ, Tháng 12/2013

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN ACID ACETIC

ỨNG DỤNG TRONG LÊN MEN THỦY SÂM

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

(ký tên) (ký tên)

CN Phạm Hồng Quang Lê Thị Mỹ Xuyên

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

………

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

(ký tên)

Trong thời gian thực hiện luận văn tốt nghiệp tại trường Đại học Cần Thơ, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm và động viên từ gia đình, sự hướng dẫn và chỉ dạy tận tình của quý Thầy, Cô cùng sự giúp đỡ nhiệt tình của các bạn Để hoàn thành được luận văn tốt nghiệp này tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến:

Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ đã tạo điều kiện để tôi hoàn thành luận văn

Thầy Phạm Hồng Quang là cán bộ hướng dẫn đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Thầy Huỳnh Xuân Phong và anh Nguyễn Ngọc Thạnh cán bộ phụ trách phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực phẩm, trường Đại học Cần Thơ đã tạo điều kiện tốt nhất về dụng cụ cũng như trang thiết bị để tôi có thể hoàn thành đề tài này

Cô Nguyễn Thị Pha, cố vấn học tập lớp Vi sinh vật học Khóa 36 đã động viên và kích lệ tinh thần trong suốt thời gian học tập tại trường

Thân gửi đến tập thể lớp Vi sinh vật học khóa 36 lời cảm ơn chân thành, đặc biệt

là các bạn, các anh chị trong phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực phẩm đã luôn sát cánh bên tôi

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc đến cha, mẹ đã luôn ủng hộ tôi về mọi phương diện, là sức mạnh tinh thần giúp tôi vươn lên trong cuộc sống và hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Xin kính chúc quý Thầy, Cô và các bạn sinh viên luôn dồi dào sức khỏe và luôn thành công

Lê Thị Mỹ Xuyên

TÓM LƢỢC

Thủy sâm là sản phẩm lên men với sự kết hợp của nấm men và vi khuẩn acid acetic với nhiều công dụng cho sức khỏe, trong đó vi khuẩn acid acetic có vai trò đặc biệt quan trọng tác động đến chất lượng sản phẩm Đề tài này được thực hiện nhằm phân lập, tuyển chọn các dòng vi khuẩn acid acetic có khả năng sinh acid cao và bước đầu khảo sát các điều kiện lên men thích hợp cho việc sản xuất thủy sâm Nghiên cứu được tiến hành qua hai bước: (i) phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn acid acetic trong 5 mẫu thủy sâm thu thập từ các địa điểm khác nhau; và (ii) khảo sát các điều

mật số giống chủng, nồng độ đường, pH, nhiệt độ và thời gian lên men Kết quả thu được 33 dòng vi khuẩn acid acetic, trong đó dòng HG 3.1 có khả năng sinh acid cao nhất với tỷ lệ đường kính vòng halo/đường kính khuẩn lạc là 1,57 Điều kiện thích hợp cho quá trình lên men acid acetic trong môi trường nước trà được xác định là mật số

Từ khóa: Giấm, lên men, thủy sâm, vi khuẩn acid acetic

MỤC LỤC

Trang

PHẦN KÝ DUYỆT

LỜI CẢM TẠ

TÓM LƯỢC i

DANH SÁCH BẢNG v

DANH SÁCH HÌNH vi

TỪ VIẾT TẮT ix

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

2.1 Giới thiệu chung về acid acetic 2

2.1.1 Khái niệm 2

2.1.2 Tính chất hóa học 3

2.1.3 Ứng dụng 3

2.1.4 Phương pháp sản xuất 4

2.2 Giới thiệu lên men acid acetic 6

2.2.1 Bản chất của quá trình lên men acid acetic 6

2.2.2 Cơ chế phản ứng của quá trình lên men acid acetic 7

2.2.3 Các phương pháp lên men acid acetic 7

2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men acid acetic 12

2.3 Vi khuẩn acid acetic 15

2.3.1 Đặc điểm chung 15

2.3.2 Phân loại 16

2.4 Giới thiệu về trà 20

2.4.1 Giới thiệu chung 20

2.4.2 Thành phần 22

2.5 Giới thiệu thủy sâm 23

2.5.1 Nguồn gốc 23

2.5.2 Giá trị dinh dưỡng 24

2.5.3 Công dụng 27

2.5.4 Quy trình lên men thủy sâm 28

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 29

3.1.1 Địa điểm 29

3.1.1 Thời gian nghiên cứu 29

3.2 Phương tiện nghiên cứu 29

3.2.1 Dụng cụ và thiết bị 29

3.2.2 Nguyên vật liệu 29

3.2.3 Hóa chất 29

3.3 Phương pháp nghiên cứu 30

3.3.1 Các phương pháp phân tích lý hóa 30

3.2.3 Xử lý số liệu, phân tích thống kê 30

3.4 Nội dung và bố trí thí nghiệm 30

3.4.1 Phân lập và định danh sơ bộ các dòng vi khuẩn acid acetic lên men thủy sâm 30

3.4.2 Tuyển chọn các dòng vi khuẩn sinh acid acetic mạnh 31

3.4.3 Khảo sát ảnh hưởng của mật số giống chủng đến quá trình lên men 32

3.4.4 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đường và pH đến quá trình lên men 32

3.4.5 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian lên men 33

3.4.6 Thử nghiệm quy trình sản xuất thủy sâm 33

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ-THẢO LUẬN 35

4.1 Phân lập và định danh sơ bộ các dòng vi khuẩn acid acetic lên men thủy sâm 35

4.2 Tuyển chọn các dòng vi khuẩn sinh acid acetic mạnh 41

4.3 Ảnh hưởng của mật số giống chủng đến quá trình lên men 43

4.4 Ảnh hưởng của nồng độ đường và pH đến quá trình lên men 46

4.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian lên men 49

4.6 Thử nghiệm quy trình sản xuất thủy sâm 51

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN-ĐỀ NGHỊ 53

5.1 Kết luận 53

5.2 Đề nghị 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

PHỤ LỤC

Phụ lục 1 Các phương pháp phân tích

Phụ lục 2: Các hình ảnh

Phụ lục 3: Số liệu thí nghiệm

Phụ lục 4: Kết quả phân tích thống kê

DANH SÁCH BẢNG

Trang

Bảng 1 Các thuộc tính của acid acetic 2

Bảng 2 Phân loại khoa học của trà (chè) 21

Bảng 3 Thành phần chất khô của thủy sâm 25

Bảng 4 Thành phần acid amin của thủy sâm 26

Bảng 5 Thành phần cho 1000mL môi trường YPGD 30

Bảng 6 Nguồn gốc các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường YPGD 35

Bảng 7 Đặc điểm khuẩn lạc các dòng vi khuẩn AAB ủ ở 30ºC sau 72 giờ 38

Bảng 8 Sự chuyển màu môi trường của các dòng vi khuẩn AAB 41

Bảng 9 Kết quả đánh giá cảm quan ở các mật số giống chủng khác nhau 45

Bảng 10 Kết quả đánh giá cảm quan ở các nồng độ đường và pH khác nhau 48

Bảng 11 Kết quả đánh giá cảm quan ở các nhiệt độ và thời gian khác nhau 51

Bảng 12 Kết quả chỉ tiêu theo dõi sản phẩm sau lên men 52 Bảng 13 Chỉ tiêu đánh giá cảm quan

Bảng 14 Kích thước khuẩn lạc, tỉ lệ đường kính vòng halo/đường kính khuẩn lạc ủ ở

30ºC sau 72 giờ

Bảng 15 Sự thay đổi hàm lượng acid theo mật số giống chủng

Bảng 16 Sự thay đổi hàm lượng acid theo độ Brix và pH

Bảng 17 Sự thay đổi hàm lượng acid theo nhiệt độ và thời gian

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 1 Ba cách miêu tả của cấu trúc acid acetic 3

Hình 2 Thiết bị lên men acid aceti theo phương pháp chậm 8

Hình 3 Thiết bị lên men acid acetic bằng phương pháp nhanh 9

Hình 4 Thiết bị lên men acid acetic theo phương pháp chìm 11

Hình 5 Thiết bị lên men acid theo phương pháp hỗn hợp 12

Hình 6 Acetobacter aceti 18

Hình 7 Acetobacter pasteurianum 18

Hình 8 Acetobacter xylinum 19

Hình 9 Acetobacter suboxydans 20

Hình 10 Lá trà Camellia sinensis 21

Hình 11 Sản phẩm thủy sâm trên thị trường 24

Hình 12 Quy trình sản xuất thủy sâm 28

Hình 13 Quy trình sản xuất thủy sâm 34

Hình 14 Vùng sáng do vi khuẩn AAB sinh ra trên môi trường YPGD 36

Hình 15 Hình dạng tế bào vi khuẩn AAB trên kính hiển vi với độ phóng đại X100

37

Hình 16 Tế bào bắt màu đỏ sau khi nhuộm Gram 37

Hình 17 Một số dạng khuẩn lạc của dòng vi khuẩn AAB 39

Hình 18 Sự chuyển màu môi trường của dòng BT 3.1 40

Hình 19 Sự chuyển màu môi trường của dòng TN 1.1 40

Hình 20 Biểu đồ tỉ lệ đường kính vòng halo/đường kính khuẩn lạc 42

Hình 21 Sự biến đổi nồng độ acid ở các mật số giống chủng khác nhau 44

Hình 22 Nồng độ acid sau 7 ngày lên men ở các mật số giống chủng khác nhau 45

Hình 23 Sự biến đổi nồng độ acid ở các nồng độ đường và pH khác nhau 46

Hình 24 Nồng độ acid sau 7 ngày lên men ở các nồng độ đường và pH khác nhau

47

Hình 25 Sự biến đổi nồng độ acid ở các thời gian và nhiệt độ khác nhau 49

Hình 26 Nồng độ acid ở các thời gian và nhiệt độ khác nhau 50 Hình 27 Mẫu thủy sâm khi lên men và thủy sâm thành phẩm 52 Hình 28 Hình dạng khuẩn lạc và tế bào dòng BT 2.1

TỪ VIẾT TẮT

AAB: Acid acetic bacteria

NADH2: Methylenetetrahydrofoate reductase

NADP: Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate

YPGD: Yeast extract-Polypeptone-Glycerol-D glucose

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề

Trà là một loại thức uống phổ biến có từ rất lâu đời Uống trà không đơn giản chỉ

là một thói quen thường ngày trong những giây phút rãnh rỗi hoặc ngồi thư giãn Cứ mỗi tách trà lại mang đến nhiều lợi ích cho cơ thể nhờ vào hàm lượng chất chống oxy hóa cực kỳ dồi dào có trong loại đồ uống này với nhiều tác dụng có lợi cho sức khỏe như thanh lọc cơ thể, giảm cholesterol, chống lại các cơn bệnh về tăng huyết áp, bệnh

về đường tiêu hóa, mất ngủ,…

Ngoài các loại thức uống thì thực phẩm cũng là một phần không thể thiếu trong việc hỗ trợ bảo vệ sức khỏe của con người Đối với Việt Nam cũng như các nước trên thế giới, việc sử dụng các loại thực phẩm từ lên men rất được chú trọng với nhiều sản phẩm đa dạng từ truyền thống đến hiện đại từ trong nước đến du nhập từ nước ngoài như: tương, chao, rau cải muối chua, nem, chả, sữa chua, yoghurt, thủy sâm,…

Thủy sâm là sự kết hợp tuyệt vời giữa thức uống và thực phẩm Qua quá trình lên men hỗn hợp trà đường của nấm men và vi khuẩn acid acetic tạo ra sản phẩm có vị chua chua ngọt ngọt phù hợp với khẩu vị của nhiều nguời, trong đó vi khuẩn acid acetic là một nhân tố quan trọng quyết định chất lượng sản phẩm lên men Tuy nhiên tình hình sản xuất thủy sâm hiện nay còn rất nhiều hạn chế, chủ yếu thực hiện ở quy

mô hộ gia đình, thực hiện thủ công nên không đồng đều về chất lượng ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng

Do đó, việc tìm ra các dòng vi khuẩn acid acetic và nấm men cùng với những điều kiện tốt cho quá trình lên men thủy sâm là vô cùng quan trọng Với mục đích

tuyển chọn các dòng vi khuẩn acid acetic sinh acid cao và bước đầu khảo sát một số

điều kiện thích hợp cho quá trình lên men nhằm tạo ra sản phẩm thủy sâm an toàn cho

người sử dụng mà đề tài: “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn acid acetic ứng dụng

trong lên men thủy sâm” được thực hiện

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn acid acetic sinh acid cao, xác định các điều kiện thích hợp để lên men thủy sâm với dòng vi khuẩn đã tuyển chọn

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung về acid acetic

2.1.1 Khái niệm

Acid acetic có công thức phân tử là CH3COOH hay còn gọi là ethanoic acid, là một acid hữu cơ (acid cacboxylic), mạnh hơn acid carbonic Phân tử gồm có nhóm methyl (-CH3) liên kết với nhóm cacboxyl (-COOH), khối lượng phân tử 60,5 g/mol Acid acetic là một chất lỏng không màu, có mùi sốc, vị chua, có khả năng hút ẩm từ không khí (Nguồn: http://vi.wikipedia.org/wiki/Axit_axetic ngày 27/06/2013).

Trong dung dịch acid acetic tồn tại các dạng (CH3COOH)2, (CH3COOH)3, sự tồn tại các phân tử kép như trên là do các liên kết hydro giữa các phân tử với nhau Acid acetic tan tốt trong nước, ethanol, eter, benzene, acetone và chloroform; không tan trong CS2 Acid acetic rất bền với các chất oxy hóa như acid chromic và permanganate Có khả năng hòa tan cellulose, các hợp chất tương tự cellulose, phân hủy da, gây bỏng da, ăn mòn nhiều kim loại (Nguyễn Đức Lượng, 2002) Ngoài ra nó cũng là dung môi tốt cho nhiều hợp chất hữu cơ (nhựa, tinh dầu, )

Bảng 1 Các thuộc tính của acid acetic

Thuộc tính

2.1.2 Tính chất hóa học

Nguyên tử hydro (H) trong nhóm carboxyl (−COOH) trong các acid cacboxylic như acid acetic có thể cung cấp một ion H+ (proton), làm cho chúng có tính chất acid Acid acetic là một acid yếu, thuộc nhóm acid monoprotic, có Ka bằng 4,75 Nó tạo ra gốc liên kết là acetate (CH3COO−) Dung dịch 1,0 M (tương đương nồng độ giấm gia đình) có pH là 2,4, cho thấy chỉ 0,44% các phân tử acid acetic bị phân ly

Acid acetic lỏng là dung môi protic dính ướt (phân tử phân cực), tương tự như ethanol và nước Với hằng số điện môi trung bình khoảng 6,2 nó có thể hoà tan không chỉ trong các hợp chất phân cực như các muối vô cơ và các loại đường mà nó còn có khả năng hòa tan trong các hợp chất không phân cực như dầu, các nguyên

tố như lưu huỳnh và iod Nó cũng có thể hòa trộn với các dung môi phân cực và không phân cực khác như nước, chloroform và hexan Đối với các ankan cao phân tử (từ octan trở lên) acid acetic không có khả năng trộn lẫn một cách hoàn toàn và khả năng trộn lẫn tiếp tục giảm khi số n-ankan càng lớn Tính chất hòa tan và độ trộn lẫn của acid acetic làm cho nó được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp

2.1.3 Ứng dụng

Acid acetic là một loại acid hữu cơ được ứng dụng rộng rãi trong đời sống và trong sản xuất công nghiệp Những ứng dụng quan trọng của acid acetic bao gồm:

Trong ngành công nghiệp sản xuất mủ cao su, người ta rất sợ hiện tượng đông đặc của mủ trước khi về đến nhà máy chế biến Để chống đông mủ cao su, người ta cho thêm vào mủ nước những chất chống đông Thường người ta dùng dung dịch NH33% Thời điểm cho dung dịch NH3 vào mủ là lúc trút mủ vào xô, thùng,…

Khi đông tụ mủ, người ta pha loãng và khuấy trộn đều, sau đó cho thêm vào

Hình 1 Ba cách miêu tả cấu trúc của acid acetic

(*Nguồn: http://vi.wikipedia.org/wiki/Axit_axetic, ngày 27/06/2013)

Ở Việt Nam hiện nay, mỗi năm sản xuất khoảng 800000 tấn cao su (50% trong

đó được sử dụng trong nước, còn 50% thì xuất khẩu) Như vậy lượng acid acetic sử dụng trong chế biến mủ cao su là rất lớn Mặc dù vậy, nước ta vẫn phải nhập acid acetic từ nước ngoài (chủ yếu là từ Trung Quốc)

Với hàm lượng acid acetic từ 2-5%, người ta gọi dung dịch này là giấm ăn Giấm

ăn được sử dụng trong công nghệ thực phẩm để chế biến đồ hộp, rau, quả, gia vị trong các bữa ăn gia đình Lượng giấm ăn sử dụng trong công nghiệp thực phẩm là rất lớn,

do đó, việc sản xuất giấm ăn không thể mang tính chất thủ công truyền thống mà đã trở thành một ngành sản xuất theo quy mô công nghiệp ở nhiều nước trên thế giới

Acid acetic được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp như: công nghiệp sản xuất chất màu, dung môi hữu cơ (ethyl acetate, butyl acetate, cellulose, acetate, acetone,…) Tổng hợp chất dẻo, tơ sợi, nhựa PVA, trong dược phẩm (điều chế aspirine) Ngày nay, acid acetic và các dẫn xuất của nó đã được nghiên cứu và ứng dụng cho các ngành công nghệ cao như sản xuất phim ảnh không cháy, thủy tinh không vỡ…

Những ngành sản xuất này đòi hỏi lượng acid acetic nhiều và có chất lượng cao hơn dung dịch acid acetic dùng trong công nghệ thực phẩm và trong công nghệ chế biến mủ cao su (Nguyễn Đức Lượng, 2002)

2.1.4 Phương pháp sản xuất

Acid acetic là một loại acid hữu cơ được ứng dụng rộng rãi và từ rất lâu Do đó, loài người đã phát minh ra nhiều phương pháp khác nhau để sản xuất acid acetic, những phương pháp sản xuất acid acetic bao gồm:

- Phương pháp hóa gỗ

- Phương pháp hóa học

- Phương pháp sinh học

- Phương pháp kết hợp

 Phương pháp hóa học

Từ C2H2, C2H5OH hay C2H4 tiến hành tổng hợp có xúc tác sẽ thu được acetaldehyde, oxy hóa acetaldehyde nhờ có xúc tác ở nhiệt độ và áp suất cao sẽ thu được acid acetic

Giai đoạn oxy hóa acetaldehyde thành acid, dùng xúc tác magan, rồi sau đó chưng cất phân đoạn ở nhiệt độ 50-80ºC để thu được acid có hiệu suất cao

Phương pháp này có giá trị thực tế khá cao, nhưng do tạo nhiều sản phẩm phụ nên làm giảm hiệu suất phản ứng

Phương pháp mới nhất hiện nay là tổng hợp từ metanol và CO bằng phản ứng cacbonyl hóa:

- Công nghệ sản xuất acid acetic hoàn toàn không gây ô nhiễm môi trường

- Quá trình chuyển hóa (hay quá trình lên men) được thực hiện ở điều kiện rất ôn hòa, không cần nhiệt độ cao, áp suất cao hay máy móc thiết bị phức tạp

- Nguyên liệu để sản xuất acid acetic bằng phương pháp lên men rất dễ kiếm Có thể sử dụng nguyên liệu chứa đường (nước ép trái cây, nước ép dứa, nước ép mía ),

có thể sử dụng nguyên liệu chứa tinh bột và có thể sử dụng cồn công nghiệp

 Nếu sản xuất từ nguyên liệu chứa tinh bột, phải qua 3 giai đoạn chuyển hóa:

 Giai đoạn chuyển hóa tinh bột thành đường

 Giai đoạn chuyển đường thành cồn

 Giai đoạn chuyển cồn thành acid

 Nếu sản xuất từ nguyên liệu chứa đường thì chỉ cần qua 2 giai đoạn:

 Giai đoạn chuyển hóa đường thành cồn

 Giai đoạn chuyển cồn thành acid

 Nếu sản xuất từ nguyên liệu đã chứa cồn thì ta chỉ cần tạo điều kiện thuận lợi

để vi khuẩn acetic chuyển cồn thành acid acetic

Sản xuất acid acetic theo phương pháp sinh hóa thực chất là quá trình oxy hóa rượu ethylic thành acid acetic nhờ một số vi khuẩn acetic khi có mặt của oxy Từ trước đến nay đã xuất hiện 4 phương pháp:

 Phương pháp chậm

 Phương pháp nhanh

 Phương pháp chìm

 Phương pháp hỗn hợp

2.2 Giới thiệu lên men acid acetic

2.2.1 Bản chất của quá trình lên men acid acetic

Lên men acid acetic là quá trình oxy hóa rượu ethylic thành acid acetic, nhờ vi khuẩn acetic trong điều kiện hiếu khí

Mọi quá trình muốn hoạt động được đòi hỏi phải có năng lượng Để thực hiện được các hoạt động sống như sinh trưởng, sinh sản và phát triển của mình thì vi sinh vật cần phải có năng lượng

Quá trình lên men là quá trình oxy hóa khử sinh học để thu năng lượng và các hợp chất trung gian cho tế bào sinh vật Nhưng tế bào sống chỉ sử dụng năng lượng dưới dạng hóa năng tàng trữ trong mạch carbon và được phóng ra do sự chuyển electron từ mức năng lượng này sang mức năng lượng khác

Các phản ứng sinh hóa xảy ra trong các quá trình lên men là những phản ứng chuyển hydro Nhưng sự chuyển hydro cũng tương đương với sự chuyển electron, vì nguyên tử hydro có thể tách thành proton H+ và electron Các enzyme xúc tác quá trình tách nguyên tử hydro khỏi cơ chất gọi là enzyme dehydrogenase

Trong quá trình lên men giấm, rượu ethylic được oxy hóa thành acid acetic Ở đây sự chuyển hydro được thực hiện nhờ sự xuất hiện của NADP (dạng oxy hóa)

NADP nhận hydro trở thành NADPH2 được chuyển qua chuỗi hô hấp để thu năng lượng Song cơ chất không bị phân giải hoàn toàn nên được gọi là quá trình oxy hóa không hoàn toàn

2.2.2 Cơ chế phản ứng của quá trình lên men acid acetic

Lên men acid acetic là quá trình oxy hoá rượu ethylic thành acid acetic nhờ có enzyme alcohol oxydase xúc tác trong điều kiện hiếu khí:

CH3CH2OH + O2  CH3OOH +H2O + 117 kcal

Để chuyển hoá thành acid acetic, rượu và oxy phải thâm nhập vào tế bào vi khuẩn, ở đây nhờ có enzyme của vi khuẩn xúc tác, rượu được chuyển hoá thành acid acetic để nhận năng lượng dùng cho sự sinh trưởng và phát triển của chúng theo quá trình sau:

CH3CH2OH + 1/2O2  CH3CHO + H2O

CH3CHO + H2O  CH3CH(OH)2

CH3CH(OH)2 + 1/2O2  CH3COOH + H2O

Acid acetic tạo thành sẽ thoát ra khỏi tế bào của vi khuẩn và đi vào môi trường Khi môi trường hết rượu thì vi khuẩn acid acetic sẽ oxy hoá acid acetic thành CO2 và

H2O theo phương trình sau:

CH3COOH + 2O2  2CO2 + 2H2O

Chính vì thế, sau khi lên men luôn duy trì lượng ethanol khoảng 0,3-0,5% để vi khuẩn có thể sử dụng nguồn cơ chất này mà không sử dụng acid acetic như một nguồn năng lượng (Nguyễn Đức Lượng, 2002)

2.2.3 Các phương pháp lên men acid acetic

Yếu tố quan trọng nhất quyết định năng suất và hiệu suất của một phương pháp sản xuất giấm đó chính là bề mặt tiếp xúc giữa oxy của không khí và hợp chất Từ đó con người không ngừng cải tiến, hoàn thiện các phương pháp cũ, tìm ra các phương pháp mới để sản xuất giấm có hiệu quả và kinh tế hơn Đến thời điểm hiện tại, đã có 4 phương pháp sản xuất acid acetic bằng cách lên men:

 Phương pháp chậm

 Phương pháp nhanh

 Phương pháp chìm

 Phương pháp hỗn hợp

 Phương pháp chậm (phương pháp Pháp)

Đây là phương pháp thủ công đã có từ lâu đời, quá trình lên men giấm diễn ra ở

bề mặt tiếp xúc giữa khối dịch lên men và không khí (bề mặt thoáng) trong thùng lên men đặt nằm ngang Rượu vang được acid hóa bằng acid acetic, dịch sản xuất phải đảm bảo 2% acid acetic và 4% rượu hay 3% acid acetic và 3% rượu

Người ta đóng các thùng lên men bằng gỗ có dung tích khoảng 250-300 lít bằng

gỗ sồi hình tang trống (giống các thùng sản xuất bia và rượu vang)

Nguyên liệu dùng để sản xuất acid acetic là nước nho Giống vi khuẩn được sử

dụng cho quá trình sản xuất là Acetobacter orleaneuse (Nguyễn Đức Lượng, 2002)

Để tiến hành sản xuất giấm theo phương pháp này, người ta làm như sau: đổ vào thùng 1/5 thể tích giấm tươi chất lượng cao để acid hóa, sau đó đổ thêm dịch lên men vào cho đến khoảng 1/2 thể tích thùng Tiếp theo cứ mỗi chu kỳ đổ thêm dịch lên men vào cho đến khi đầy Khi nào nhận thấy rượu đã được oxy hóa gần hết (còn lại 0,3-0,5% rượu) thì lấy giấm ra để đem chế biến và bảo quản, đồng thời cho tiếp dịch lên men vào để lên men tiếp

Khi lên men, vi khuẩn giấm phát triển tạo thành màng vi sinh vật trên bề mặt thoáng, khi bị chấn động (do va chạm hay do quá trình đổ dịch lên men vào và tháo sản phẩm ra) nó sẽ bị phá vỡ, chìm xuống tiêu thụ cơ chất mà không tạo thành acid acetic Dần dần trên mặt thoáng lại hình thành màng vi khuẩn mới và lại diễn ra quá trình lên men tiếp tục

Do hạn chế của bề mặt thoáng nên phương pháp này có nhược điểm:

 Thời gian lên men dài

 Nồng độ acid thấp

Hình 2 Thiết bị lên men acid acetic theo phương pháp chậm

(*Nguồn: Mai Thanh Thật, 2005)

 Năng suất thấp

 Thiết bị cồng kềnh

Nhưng bù lại phương pháp này có ưu điểm là giấm có mùi thơm đặc trưng, dễ thực hiện

 Phương pháp nhanh (phương pháp Đức)

Phương pháp này tạo được bề mặt tiếp xúc pha giữa lỏng và khí lớn nhờ bổ sung vật liệu bám trong thiết bị lên men nên năng suất và hiệu suất cao hơn Đã khắc phục được nhược điểm của phương pháp lên men chậm do người Pháp thực hiện

Người ta thiết kế những thùng lên men rất lớn, hình trụ, thường có kích thước như sau:

Chiều cao thùng 2,5-6 m

Có dường kính đáy thùng d = 1,2-3 m

Tỷ lệ đường kính đáy so với chiều cao khoảng 1/2 là thích hợp nhất

Trong thùng được chất đầy phoi bào hay lõi ngô (bắp) Phoi bào hay lõi ngô được xem như chất mang, giữ vi sinh vật trong quá trình lên men Nhờ đó mà vi sinh vật không đi theo vào sản phẩm cuối cùng Ngoài ra, ở đáy thiết bị người ta lắp một hệ thống phân phối không khí đưa từ dưới lên Môi trường lên men được đưa từ trên xuống Toàn bộ thiết bị được thiết kế như Hình 3

Hình 3 Thiết bị lên men acid acetic bằng phương pháp nhanh

(*Nguồn: Mai Thanh Thật, 2005)

Quá trình vận hành thiết bị được thực hiện như sau:

Đầu tiên dùng acid acetic có nồng độ 3-5% chảy qua lớp phoi bào hay lõi ngô để vừa có tác dụng acid hóa vật liệu chất mang để vi sinh vật giống dễ thích nghi trong quá trình lên men Sau đó dùng nước vô trùng rửa qua và cho giống vi khuẩn acid acetic vào Vi khuẩn acid acetic sẽ bám vào phoi bào hay lõi ngô Tiếp đó cho dòng môi trường từ trên xuống qua hệ thống phân phối Môi trường sẽ được phân phối đều khắp vật liệu phoi bào hay lõi ngô, cùng lúc sẽ thổi khí từ dưới lên

Môi trường được đưa từ trên xuống, chảy qua lớp chất mang có chứa vi khuẩn

Vi khuẩn sẽ hấp thụ ethanol, không khí được đưa từ đáy thiết bị lên trên sẽ thẩm thấu vào trong tế bào vi khuẩn Vi khuẩn tiến hành oxy hóa ethanol thành acid sẽ thấm qua màng tế bào đi ra ngoài và theo dung dịch xuống đáy thiết bị lên men thu nhận sản phẩm ở đáy thiết bị lên men

Quá trình lên men được thực hiện ở nhiệt độ 24-37ºC Thời gian lên men kéo dài 8-10 ngày Trong trường hợp dịch lên men cuối cùng chứa hàm lượng acid acetic thấp, tiến hành tái lên men bằng cách bơm chúng ngược lại từ trên xuống

Ưu điểm của phương pháp:

 Thời gian lên men ngắn

 Thiết bị tương đối đơn giản, năng suất cao, ổn định

 Giấm thu được có nồng độ cao (có thể đến 10-11%)

Nhược điểm của phương pháp:

 Hiệu suất không cao do mất mát rượu và acid

 Dùng vật liệu bám phải phù hợp

 Phương pháp chìm (phương pháp sục khí)

Cho không khí sục qua khối dịch lên men mãnh liệt sẽ tạo thành một thể huyền phù có pha rắn là các vi khuẩn giấm, pha lỏng là dịch lên men trong các thiết bị lên men có tên là acetator, dịch rượu được chuyển hóa thành giấm rất nhanh

Phương pháp này có hiệu suất cao, tối thiểu là 91-92%, nếu khống chế tốt ở điều kiện vận hành có thể đạt 98-99% Nó được ra đời từ những kết quả của phương pháp nuôi cấy chìm để sản xuất thuốc kháng sinh, sản xuất men bánh mì

Tuy có được ưu điểm lớn nhưng mãi đến gần đây, phương pháp này mới được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất, nguyên nhân là do nhu cầu phức tạp của thiết bị, tính

ổn định không cao và quan trọng là yêu cầu nghiêm ngặt về việc cấp oxy liên tục

 Phương pháp hỗn hợp (phương pháp lai)

Đây là phương pháp lai giữa hai phương pháp nhanh và chìm Hệ thống lên men

để sản xuất được thiết kế như sau:

Phần trên như generator có đổ đầy đệm, hoạt động theo nguyên tắc lên men nhanh

Ở giữa chỉ là một thùng chứa dung dịch sau khi lên men ở phần trên chảy xuống Phần cuối cùng là hệ thống thổi khí mạnh tạo thành vùng oxy hóa bổ sung như một acetator của phương pháp chìm

Phương pháp kết hợp này có rất nhiều ưu điểm, trong đó ưu điểm nhất là hiệu suất lên men rất cao, nồng độ acid acetic thu được thường nằm trong khoảng 10-12% Phương pháp này phát huy được ưu điểm của cả hai phương pháp nhanh và chìm, nhưng thiết bị yêu cầu quá phức tạp, cồng kềnh, giống vi khuẩn phải phù hợp với cả hai phương pháp

Hình 4 Thiết bị lên men acid acetic theo phương pháp chìm

(*Nguồn: Mai Thanh Thật, 2005)

2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men acid acetic

 Ảnh hưởng của oxy (sự thoáng khí)

Theo cơ chế phản ứng nhận thấy quá trình lên men acid acetic là phản ứng oxy hóa, trong đó oxy đóng vai trò chất nhận hydro, nên sự có mặt của oxy đóng vai trò quan trọng trong quá trình lên men

Trong phương pháp nhanh, do được bổ sung các vật liệu xốp (vỏ bào, than gỗ, cốc…) nên làm tăng bề mặt tiếp xúc giữa môi trường dinh dưỡng và không khí, cải thiện điều kiện không khí do đó thúc đẩy quá trình lên men

Ở phương pháp chìm thì người ta sục khí mạnh liên tục qua dung dịch lên men nhờ đó đã phân tán đều không khí vào môi trường lên men, tạo nên bề mặt tiếp xúc lớn làm tăng quá trình lên men

Hình 5 Thiết bị lên men acid acetic theo phương pháp hỗn hợp

(*Nguồn: Mai Thanh Thật, 2005)

Như vậy, phương pháp nào tạo được bề mặt tiếp xúc giữa không khí và dịch lên men lớn hơn sẽ là phương pháp có hiệu quả và năng suất cao hơn

 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật và hiệu quả lên men Vì vậy, trong thực tế sản xuất, người ta sử dụng yếu tố này để điều chỉnh vận tốc phản ứng Nhiệt độ thích hợp để vi khuẩn acid acetic sinh trưởng và phát triển đối với mỗi loài vi khuẩn khác nhau

Đối với vi khuẩn Acetobacter aceti phát triển tốt trong khoảng 25-30ºC

Đối với vi khuẩn Acetobacter schuitzenbachi phát triển tốt ở nhiệt độ lớn nhất

đó sẽ đình chỉ sự sinh sản của tế bào, làm tăng sự tổn thất của vi khuẩn và hiệu suất của quá trình lên men giảm do bay hơi ethanol và acid acetic

 Nồng độ acid acetic và nồng độ ethanol

- Nồng độ acid acetic

Trong quá trình lên men, nồng độ acid acetic được tạo ra ảnh hưởng đến sự lên men của vi khuẩn Acid acetic tích tụ trong môi trường đến một mức độ nào đó sẽ ức chế hoạt động của chính vi khuẩn Độ acid ban đầu có thể dao động từ 2-6% (Abrini, 1992) Khi dung dịch tích tụ được 8% acid acetic thì hoạt động của các vi khuẩn trở nên ngày càng giảm dần và ngừng họat động khi lượng acid đạt được 12-14%

- Nồng độ ethanol

Tùy từng loài mà chúng có khả năng tồn tại, thường người ta sử dụng nồng độ ethanol từ 6-14%

Nếu trong môi trường không còn rượu thì vi khuẩn tiếp tục oxy hóa acid acetic

để tiếp tục thu năng lượng dùng trong sự sống Vì thế đây là một quá trình có hại Trong sản xuất người ta thường để lại trong môi trường sau lên men độ rượu 0,3-0,5%

Rượu sót trong giấm có tác dụng ức chế sự tổng hợp enzyme oxy hóa acid acetic và muối acetate

 Các chất dinh dưỡng

Trong cơ thể vi sinh vật có khoảng 40 hợp chất khoáng khác nhau có thể ở dạng

tự do hay liên kết hữu cơ cao phân tử, thông thường tổng hàm lượng khoáng trong vi sinh vật chiếm 5-8% trọng lượng chất khô Các chất khoáng chia làm 2 loại:

Khoáng đa lượng: S, P, K, Na, Fe, Mg, Cu,…

Khoáng vi lượng: Cl, Br, I, As, Pb, Zn, Mn,…

Do đó, để cho vi khuẩn giấm phát triển tốt, khi sản xuất giấm ngoài các chất: nước, acid, rượu, cần đưa vào môi trường lên men các muối tan có chứa các nguyên tố khoáng cần thiết tùy theo nhu cầu cụ thể từng loài Ngoài ra trong môi trường dinh dưỡng còn được bổ sung vitamin, chất kích thích sinh trưởng như peptone, cao nấm men,… Trong môi trường dinh dưỡng còn được bổ sung sake, muối đậu nành, acid lactic, glycerine

Ngoài các nguyên tố vi lượng vô cơ, các nguyên tố vi lượng hữu cơ cũng rất cần thiết và quan trọng trong quá trình lên men, tuy sử dụng với nồng độ cực nhỏ cũng có hiệu quả rõ rệt Thông thường các nguyên tố vi lượng đã có mặt trong những nguyên liệu tự nhiên ban đầu khi đưa vào lên men như dịch trái cây, nước chiết malt, nấm men, dịch thủy phân

Phosphate có vai trò quan trọng trong chuyển hóa năng lượng của hệ thống sinh học Vì thế phosphate cần thiết trong thành phần dung dịch lên men, nó được đưa vào môi trường ở dạng muối vô cơ như phosphate kali hay phosphate amon Nồng độ phosphate thường nằm trong khoảng 0,1-0,5%

Nitơ là cấu tạo quan trọng trong thành phần protein và acid nucleic là thành phần rất cần thiết cho sự sống của vi sinh vật Nitơ được đưa vào môi trường dưới dạng muối vô cơ như nitrat, muối amon, urê, …

Glucose đóng vai trò như nguồn cung cấp glucid để cung cấp năng lượng bổ sung cho cơ thể vi sinh vật Ngoài ra, còn là nguồn cung cấp vật liệu xây dựng sinh tổng hợp các cấu tử cần thiết của tế bào

Có 5 kim loại nặng như: Pb, Cu, Fe, Zn, Sn trong dịch lên men sẽ làm giảm hiệu suất lên men

Các chất gây độc hại và ức chế: các chất như tinh dầu lignin, tanin (có trong gỗ)

và một số hợp chất khác có mặt trong môi trường lên men với nồng độ vượt quá ngưỡng giới hạn cho phép đều có tác dụng gây độc hại đến vi sinh vật Vì thế khi chọn vật liệu chế tạo thiết bị cần lưu ý đến những vấn đề này

Mặt khác, chất lượng nước khoáng: chất lượng nước pha loãng cũng có ảnh hưởng đáng kể đến quá trình lên men Yếu tố quan trọng nhất là nước pha loãng có độ sạch sinh học cao (vô trùng) và hàm lượng Clo thấp Nói chung, nước pha loãng tốt là nước có độ sạch sinh học cao, hàm lượng Clo, các kim loại nặng, các chất rắn thấp, có

đủ các nguyên tố vi lượng

 Vật liệu chế tạo thiết bị lên men acid acetic

Do acid acetic là một acid có tính ăn mòn kim loại và hợp kim Tốc độ ăn mòn phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nồng độ, nhiệt độ, vận tốc chuyển động của acid,… cho nên khi chọn vật liệu chế tạo thiết bị sản xuất phải hết sức thận trọng

2.3 Vi khuẩn acid acetic

2.3.1 Đặc điểm chung

Vi khuẩn acid acetic là vi khuẩn lấy năng lượng từ quá trình oxy hóa ethanol để tạo thành acid acetic trong quá trình lên men Những vi khuẩn này dễ tìm thấy trong không khí, đất, nước, các dịch nước quả, bia, rượu có nồng độ thấp, dịch đường… để tiếp xúc với không khí dễ bị vẫn đục nhẹ, trên bề mặt tạo thành một lớp màng mỏng, màng mỏng mịn màu trắng xám hoặc vàng xám Đó là do các vi khuẩn acid acetic phát triển Trước đây Pasteur cho rằng quá trình lên men giấm là do một loại vi khuẩn

thuộc nhóm Acetobacter hoặc Bacterrium Các loài vi sinh vật này không chỉ có khả

năng lên men ethanol để tạo thành acid acetic mà còn có khả năng chuyển hóa propanol thành acid propionic và chuyển hóa butanol thành acid butyric Tuy nhiên chúng không thể chuyển hóa rượu bật cao và methanol Trong môi trường đủ rượu ethylic (5-13%) thì sản phẩm chủ yếu là acid acetic, ở nồng độ rượu thấp hơn các vi khuẩn acid acetic oxy hóa triệt để rượu thành CO2 và H2O (Lương Đức Phẩm, 1998) Trong điều kiện môi trường đầy đủ chất dinh dưỡng và lượng oxy được cung cấp liên tục, chúng có thể tăng sinh khối sau 12 giờ gấp 17 triệu lần so với sinh khối ban đầu

Có khoảng 20 loài đã được nghiên cứu cho thấy khả năng có thể áp dụng vào thực tế (Nguyễn Đức Lượng, 2002) Chúng có những đặc điểm chung sau đây:

- Là những trực khuẩn, không sinh bào tử, có hình que, bầu dục, kích thước 0,8x(1,0-3,0)m, có dạng đơn, sợi chuỗi, một số loài có dạng xoắn, dạng cầu, que phình ra, hình chùy,… Các vi khuẩn này có loài chuyển động được nhờ tiêm mao, có loài không chuyển động được Khi tế bào còn non là vi khuẩn Gram âm khi già chúng

có thể thay đổi Gram Chúng hầu hết là Catalase dương tính, không có Oxydase, thường tạo sắc tố Một số chúng tạo váng màu hồng nhờ porphyrins

- Vi khuẩn acid acetic thuộc nhóm hiếu khí Tốc độ sinh trưởng của chúng rất nhanh Trong quá trình sinh trưởng và phát triển chúng tạo thành acid acetic, ở nồng

độ acid thấp sẽ kích thích sự phát triển của chúng (Lương Đức Phẩm, 1998)

- Vi khuẩn acid acetic có khả năng đồng hóa các nguồn carbon khác nhau như ethanol, glucose, fructose, saccharose, maltose, glycerine, lactose,… không có khả năng sử dụng tinh bột, có khả năng đồng hóa được đạm hữu cơ Còn nguồn khoáng, vitamin thì đòi hỏi phải có acid pantothenic và các chất khoáng (K, Ca, Fe, S, P,…) mới đồng hóa được

- Các loài vi khuẩn acid acetic sinh trưởng ở nhiệt độ tối ưu trong khoảng 30ºC và pH tối ưu là 5,5-6,2 Chúng có khả năng chịu acid cao, một số có thể phát triển ở pH<3,2

23 Những vi khuẩn acid acetic có đặc điểm là dễ thay đổi hình dạng tế bào Trong những điều kiện sinh trưởng không bình thường tế bào có dạng sợi to và dài phình trương lên hoặc có những hình thù kỳ lạ

2.3.2 Phân loại

Vi khuẩn AAB thuộc họ Acetobacteraceae và được phân loại thành 10 giống: Acetobacter, Gluconobacter, Acidomonas, Gluconacetobacter, Asaia, Kozakia, Swaminathania, Saccharibacer, Neoasaia và Granulibacter (Cleenwerck et al., 2002;

Loganathan và Nair, 2004; Jojima et al., 2004; Greeberg et al., 2006) Tuy nhiên trong tài liệu phân loại học Bergey (Holt et al., 1994) chỉ phân loại vi khuẩn AAB thành 3

nhóm chính là Gluconobacter, Acetobacter và Frateuria

Khóa phân loại Acetobacter (Nguyễn Đức Lượng, 2003)

1 Oxy hóa acid acetic thành CO2 và H2O

a Sử dụng NH4 làm nguồn N duy nhất Acetobacter aceti

b Không sử dụng NH4 làm nguồn N duy nhất

- Trên bề mặt môi trường dịch thể tạo thành màng dày nhầy, có chứa

cellulose Acetobacter xylinum

- Trên bề mặt môi trường dịch thể không tạo thành màng dày nhầy, có chứa

cellulose Acetobacter rancens

Acetobacter pasteurianus

Acetobacter kueizingianus

2 Không oxy hóa acid acetic

a Tạo thành sắc tố trên môi trường glucose

- Sắc tố màu nâu tối đến đen nhạt Acetobacter melanogenus

- Sắc tố hồng (pink to rose) Acetobacter roseus

b Không tạo thành sắc tố

- Nhiệt độ thích hợp nhất giữa 30 và 350C Acetobacter suboxydans

- Nhiệt độ thích hợp nhất giữa 18 và 210C Acetobacter oxydans

Vi khuẩn AAB là nhóm vi sinh vật quan trọng thuộc nhóm Acetobacter và Gluconobacter có vai trò rất quan trọng trong đời sống, được sử dụng để sản xuất giấm

ăn cũng như dược phẩm AAB thuộc lớp Acetobacteraceace tồn tại trong môi trường

nhiều đường cũng như ethanol Phần lớn chúng không có khả năng oxy hóa ethanol, đường, rượu đa AAB không chỉ được sử dụng trong sản xuất giấm mà còn sử dụng trong sản xuất thực phẩm, các hợp chất hóa học, thủy sâm, bột ca cao, sorbose, acid gluconic,…

AAB có thể phân lập từ các vật liệu nền cũng như môi trường xung quanh như thực vật, hoa quả, thực phẩm lên men và thức uống

Một số loài vi khuẩn acid acetic điển hình:

 Acetobacter aceti: Acetobacter aceti là trực khuẩn hình que ngắn không sinh

bào tử, không chuyển động và chúng có khả năng liên kết với nhau thành chuỗi dài Chúng bắt màu vàng với iot và có khả năng chịu nồng độ cồn khá cao (11%) và tích tụ được 6% acid acetic Nhiệt độ phát triển tối ưu của chúng là 34ºC, nếu nhiệt độ lên quá 40ºC sẽ xảy ra hiện tượng co tế bào và sẽ tạo ra hình quả lê Thường thấy chúng phát triển trong bia

 Acetobacter pasteurianus: A pasteurianus tăng trưởng ở mức pH khác nhau

(5,5-6,3) và ở nhiệt độ 25-30ºC Nguồn carbon ưa thích là glucose, mannitol, và

ethanol (Konig, 2009)

Trong tự nhiên, A pasteurianus tồn tại trên bề mặt giàu đường như như trái cây,

hoa và rau Chúng cũng được tìm thấy trên các loại trái cây tự nhiên hư hỏng

 Acetobacter orleanense: là trực khuẩn không chuyển động, có kích thước

trung bình Khi tăng nhiệt độ chúng tạo thành tế bào hình dài hoặc hình sợi hoặc không tạo hình Thường thấy chúng phát triển trong dịch nho loãng Có khả năng tồn tại ở nồng độ cồn từ 10-12% và tích luỹ acid acetic đến 9,5%

 Acetobacter xylinum: là trực khuẩn không chuyển động Khi lên men tạo

màng dấm dày như sữa trên bề mặt dung dịch, màng này chứa nhiều hemixenlulose nên khi nhộm với I2 và H2SO4 thì cho màu xanh

Chúng tích tụ được 4-5% acid acetic và có nhược điểm là oxy hóa tiếp tục acid acetic thành CO2 và H2O nên làm giảm hiệu suất thu hồi Chúng được sử dụng trong

ngành sản xuất nước uống lên men có gas Acetobacter xylinum có bao nhầy cấu tạo

bởi cellulose

 Acetobacte kutzinguanum: Khi nhộm I2 cho màu xanh thẫm, tạo thành màng nhầy, không bền dính vào thành bình

 Acetobacter schiitzenbachii: hình que tương đối dài kết hợp thành chuỗi,

không sinh bào tử, không chuyển động Các tế bào già tạo thành màng chặt nhưng không chắc Vì vậy, giống này có thể dùng để sản xuất giấm theo phương pháp chìm

và có thể tạo thành 11,5-12% acid acetic trong dung dịch nuôi cấy Nhiệt độ tối thích

là 29ºC

 Acetobacter curvum: có đặc tính tương tự như Acetobacter schiitzenbachii, tạo

thành acid cao, không tạo màng chắc, không làm bẩn vỏ bào và làm đục giấm Nhiệt

độ tối thích 35-37ºC, nâng nhiệt độ quá giới hạn này giống sẽ phát triển yếu và tạo thành acid kém

 Acetobacter suboxydans: được dùng trong công nghiệp vitamin để sản xuất

ascobic (vitamin C)

Hình 8 Acetobacter xylinum

(*Nguồn:

http://www.doko.vn/luan-van/vi-khuan-acetic-va-len-men-giam-233010, ngày 27/07/2013)

2.4 Giới thiệu về trà

2.4.1 Giới thiệu chung

Cây trà hay cây chè có tên khoa học là Camellia sinensis là loài cây có lá và chồi của chúng được sử dụng để sản xuất trà Các danh pháp khoa học cũ còn có Thea bohea và Thea viridis

Camellia sinensis có nguồn gốc ở khu vực Đông Nam Á, nhưng ngày nay nó

được trồng phổ biến ở nhiều nơi trên thế giới, trong các khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới Nó là loại cây xanh lưu niên mọc thành bụi hoặc các cây nhỏ, thông thường được xén tỉa để thấp hơn 2 mét khi được trồng để lấy lá Nó có rễ cái dài Hoa trà màu trắng ánh vàng, đường kính từ 2,5-4 cm, với 7-8 cánh hoa Hạt của nó có thể ép để lấy dầu

Lá của trà dài từ 4-15 cm và rộng khoảng 2-5 cm Lá tươi chứa khoảng 4% caffeine

Lá non có sắc xanh lục nhạt được thu hoạch để sản xuất trà Ở giai đoạn đó, mặt dưới

lá có lông tơ ngắn màu trắng Lá già thì chuyển sang màu lục sẫm Tùy lứa tuổi mà lá chè có thể dùng làm thành phẩm chè khác nhau vì thành phần hóa học trong lá khác nhau Thông thường, chỉ có lá chồi và 2 đến 3 lá mới mọc gần thời gian đó được thu hoạch để chế biến Việc thu hoạch thủ công bằng tay diễn ra đều đặn mỗi 1 đến 2 tuần (Trịnh Xuân Ngọ, 2007)

Hình 9 Acetobacter suboxydans

http://www.doko.vn/luan-van/vi-khuan-acetic-va-len-men-giam-233010, ngày 27/07/2013)

Bảng 2 Phân loại khoa học của trà (chè)

Phân loại khoa học

Ngành (division) Magnoliopsida

Cây trà phát triển mạnh từ cuối thế kỷ XIX, có khoảng 30 nước trên thế giới trồng trà, 100 nước uống trà Ở Việt Nam, có khoảng 30 tỉnh trồng trà chủ yếu là các tỉnh trung du và vùng núi như: Thái Nguyên, Vĩnh Phúc, Hòa Bình, Hà Giang, Tây Nguyên, Lâm Đồng,… (Vũ Thy Thư và Đoàn Hùng Tiến, 2001) Loại này thân mọc cao, lá lớn và dày, có thể hái về vò nát để nấu uống tươi gọi là trà xanh Loại thứ hai là trà đồn điền du nhập từ phương Tây, cây thấp, lá nhỏ, thường phải ủ rồi mới nấu nước Hạng nhất là trà búp, có khi gọi văn vẻ là "trà bạch mao" hay "trà bạch tuyết" nếu búp

có lông tơ trắng Hạng nhì là hai lá trà kế Lá thứ tư, thứ năm là trà hạng ba Những lá dưới nữa thì dùng làm trà mạn, rẻ hơn cả

(*Nguồn: Trịnh Xuân Ngọ, 2007)

Hình 10 Lá trà Camellia sinensis

(*Nguồn: http://vi.wikipedia.org/wiki/Ch%C3%A8_(th%E1%BB%B1c_v%E1%BA%ADt),

ngày 24/07/2013)

Trên thị trường quốc tế có 3 loại trà khác nhau tùy theo mức độ quá trình lên men hoặc oxy hóa của nó:

 Trà xanh (không bị oxy hóa)

 Trà ô long (một phần bị oxy hóa)

 Trà đen (bị oxy hóa hoàn toàn)

2.4.2 Thành phần

Với sự thâm nhập của trà vào phương Tây, các thành phần hóa học của cây trà bắt đầu được nghiên cứu từ năm 1827 Đến nay, người ta phát hiện được trong thành phần của trà có 13 nhóm gồm 120-130 hoạt chất khác nhau (Đặng Hanh Khôi, 1983):

- Nhóm chất đường: glucose, fructose,… tạo giá trị dinh dưỡng và mùi thơm khi

chế biến ở nhiệt độ cao

- Nhóm tinh dầu: methyl salicylate, citronellol,… tạo nên hương thơm riêng của

mỗi loại trà, chịu ảnh hưởng của khí hậu, loại đất và quy trình chế biến

- Nhóm sắc tố: chất diệp lục, carotene, xantophin, làm cho nước trà thể từ màu

xanh nhạt đến xanh lục sẫm hoặc từ màu vàng đến đỏ nâu và nâu sẫm

- Nhóm acid hữu cơ: gồm 8-9 loại khác nhau, có tác dụng tăng giá trị về mặt

thực phẩm và có chất tạo ra vị

- Nhóm chất vô cơ: kali, phospho, lưu huỳnh, flo,magie, canxi,

- Nhóm vitamin: C, B1, B2, PP,… hầu hết tan trong nước, do đó người ta nói

nước trà có giá trị như thuốc bổ

- Nhóm glucozid: góp phần tạo ra hương trà và có thể làm cho nước trà có vị

đắng, chát và màu hồng đỏ

- Nhóm chất chát (tanin): chiếm 15-30% trong trà, sau khi chế biến thì nó trở

thành vị chát…

- Nhóm chất nhựa: đóng vai trò tạo mùi thơm và giữ cho mùi không thoát đi

nhanh (chất này rất quan trọng trong việc chế biến trà rời thành trà bánh)

- Nhóm chất keo (petin): giúp bảo quản trà được lâu vì có tính năng khó hút ẩm

- Nhóm protein và acid amin: tạo giá trị dinh dưỡng và hương thơm cho trà

- Nhóm enzyme: là những chất xúc tác sinh học quan trọng trong quá trình biến

đổi của cơ thể sống

- Giúp cơ thể tỉnh táo, kích thích lao động, đem lại niềm vui

- Thúc đẩy tiêu hóa và bài tiết

- Giúp cho hô hấp và tim mạch

- Phòng bệnh đau răng

- Hạ cholesterol và chất béo trong máu

- Bảo vệ thần kinh trong bệnh Pakinson…

 Riêng bã trà cũng có nhiều công dụng:

- Phơi khô bỏ túi giấy treo trong nhà vệ sinh khử mùi hôi Để trong tủ lạnh khử mùi khó chịu của nhiều loại thực phẩm

- Cho vào xoong, chảo rang trong khoảng 15 phút để khử mùi tanh của cá

- Lấy bã trà xát lên gương, kính bị ố, rồi lau bằng khăn lạnh thì gương, kính sẽ sáng bóng

- Lấy bã trà khô đốt lên sẽ đuổi được gián, kiến

- Đổ bã trà vào chậu cây cảnh sẽ giữ được độ ẩm

2.5 Giới thiệu thủy sâm

2.5.1 Nguồn gốc

Trà nấm thủy sâm (Tên nước ngoài Kombucha hoặc Kargasok)

Đây là loại thức uống được lên men trong dung dịch trà đường bởi loại nấm người Pháp gọi là Champignon De Longuc Vie (nấm trường sinh) Thời xưa, người vùng Kargasok thuộc Nga dùng trà nấm này có tác dụng giúp sống khỏe và kéo dài tuổi xuân nên nó có tên gọi là trà nấm Kargasok Những người hưởng thọ ở Nga bảo là sống lâu như vậy không những ở môi trường, tập quán sinh hoạt và tâm hồn thư thả

một lượng cao chất đạm mà cơ thể con người có thể hấp thụ vào cơ quan một cách nhanh chóng Nấm trà kích thích những siêu vi khuẩn phân hóa thành các chất dinh dưỡng hữu ích cho con người đào thải những độc tố trong cơ thể ra ngoài bằng đường bài tiết

Khi một nữ du khách quý tộc Nhật đến thăm thắng cảnh ở làng, trông thấy những người già cả ở đây khỏe mạnh lạ thường, gương mặt họ không có nếp nhăn và không

lộ vẻ già nua Bà lấy làm ngạc nhiên và hỏi nguồn gốc thì được biết dân chúng ở đây

có thói quen uống trà Kombucha hàng ngày Bà xin một ít nấm về để làm giống, đem

về Nhật và sau đó chia cho bạn bè để cùng nhau sử dụng Sau nhiều tháng, các bạn của

bà đều vô cùng khen ngợi về sự hữu hiệu của loại nấm này Do đó, trà nấm được đồn đại và truyền đi khắp Nhật Bản và được gọi tên là trà Kombucha (Nguồn: http://namthuysam.com/, ngày 29/07/2013)

2.5.2 Giá trị dinh dưỡng

Thành phần trà Kombucha có chứa enzyme tiêu hóa, vitamin và nhiều hợp chất hữu cơ Vì đây là sản phẩm lên men nên chứa khoảng 0,5-1% ethanol, acid acetic, acid gluconic, acid glycuronic, acid L-lactic, acid carbonic, acid caprilic, acid citric, acid oxalic, acid usnic, acid folic, nhiều vitamin nhóm B như B1, B2, B3, B6, B12, vitamin

C, acid amin, một số hợp chất có tác dụng kháng sinh, sát trùng và giải độc Trà Kombucha còn chứa một lượng nhỏ caffeine vì nó được lên men từ các loại trà như trà xanh, trà đen, trà ô long hoặc trà kukicha (Nguồn: http://namthuysam.com/, ngày 29/07/20113)

Hình 11 Sản phẩm thủy sâm trên thị trường

(*Nguồn:

http://www.thanhnien.com.vn/pages/20110918/thuy-sam-chua-ba-benh.aspx, ngày 9/11/2013)

Bảng 3 Thành phần chất khô của thủy sâm

42,86 ± 0,50 43,85 ± 0,72 0,28 ± 0,01 0,20 ± 0,00 0,02 ± 0,00 0,02 ± 0,00 0,03 ± 0,00 0,37 ± 0,01 0,05 ± 0,00 0,07 ± 0,00 0,68 ± 0,00 0,11 ± 0,01

97,38 ± 0,91 184,10 ± 1,63 124,50 ± 1,22 47,10 ± 0,49 29,20 ± 0,66 61,60 ± 0,58 404,70 ± 1,52 471,20 ± 1,04 66,50 ± 0,85

g/100g chất thô

45,40 ± 0,84 46,40 ± 1,00 0,30 ± 0,01 0,17 ± 0,02 0,02 ± 0,00 0,03 ± 0,00 0,04 ± 0,00 0,40 ± 0,00 0,05 ± 0,00 0,07 ± 0,00 0,09 ± 0,06 0,12 ± 0,04

97,35 ± 0,87 231,10 ± 0,98 147,90 ± 0,65 54,30 ± 0,61 39,70 ± 1,21 52,70 ± 08,4 463,30 ± 1,52 531,30 ± 1,55 68,00 ± 0,74

28,13 ± 0,56 49,49 ± 0,85 0,33 ± 0,01 0,21 ± 0,01 0,02 ± 0,00 0,03 ± 0,00 0,04 ± 0,00 0,45 ± 0,00 0,06 ± 0,00 0,08 ± 0,00 0,09 ± 0,03 0,12 ± 0,02

(*Nguồn: Jayabalan et al., 2010)

Bảng 4 Thành phần acid amin của thủy sâm

Acid amin

mg/g chất khô

Acid amin thiết yếu

30,9 ± 0,55 14,5 ± 0,60 30,3 ± 0,70 10,3 ± 0,70 32,2 ± 0,61 9,5 ± 0,55 6,0 ± 0,30 28,5 ± 0,45 11,2 ± 0,36 9,9 ± 0,45

35,2 ± 0,04 35,9 ± 0,64 48,0 ± 0,36 11,3 ± 0,80 22,3 ± 0,70 13,2 ± 0,58 22,3 ± 0,45 12,3 ± 0,51

41,9 ± 0,40 30,8 ± 0,60 42,0 ± 0,65 15,2 ± 0,35 42,3 ± 0,50 17,2 ± 0,30 10,6 ± 0,55 35,2 ± 0,60 22,2 ± 0,51 18,6 ± 0,40

44,2 ± 0,36 45,1 ± 0,60 53,1 ± 0,40 20,2 ± 0,50 30,2 ± 0,60 20,1 ± 0,65 30,2 ± 0,61 21,1 ± 0,45

53,0 ± 0,50 42,2 ± 0,60 53,2 ± 0,60 24,4 ± 0,47 50,1 ± 0,47 26,6 ± 0,81 18,5 ± 0,60 43,4 ± 0,55 31,7 ± 0,61 27,0 ± 0,55

(*Nguồn: Jayabalan et al., 2010)

2.5.3 Công dụng

Thủy sâm (Kombucha) là dịch trà lên men với nguồn giống là sự kết hợp giữa vi khuẩn acid acetic và nấm men (Aidoo et al., 2006) Nhiều nghiên cứu cho thấy thủy sâm có tác dụng tích cực đối với sức khỏe con người như làm giảm chứng viêm khớp (Dufresne và Farnworth, 2000), táo bón, khó tiêu và cao huyết áp (Erst, 2003)

Theo dược sĩ Lê Kim Phụng, trà Kombucha mang lại các lợi ích sau:

- Tăng sức chịu đựng dẻo dai bền bỉ cho cơ thể, được xem như một loại thuốc bổ, làm giảm đau cơ và triệu chứng mệt mỏi

- Vì là men tiêu hóa, trà Kombucha giúp gia tăng lượng vi khuẩn Bifidium sp có

lợi trong ruột, nhờ sản sinh acid lactic Vi khuẩn này tác động giống như vi khuẩn

Lactobacillus acidophilus thường có trong các loại sữa chua lên men (yoghurt) Trà

Kombucha sản sinh hai loại acid lactic và acid acetic giúp tăng nhanh quá trình lên men trong ruột Trà Kombucha giúp ngừa táo bón, nhiễm trùng đường ruột, kiết lị, rối loạn tiêu hóa, chữa viêm loét ruột và dạ dày

- Cải thiện làn da, trà Kombucha tăng tính đàn hồi cho da, làm màu da tươi sáng hơn Trà Kombucha còn có tác dụng chữa bệnh vảy nến, chàm, mụn nước, mụt cóc, viêm da, sừng da và giúp mọc tóc nhiều hơn

- Giải độc cơ thể, nhờ acid glycuronic kết hợp với các độc tố trong gan và làm chúng dễ tan trong nước, sau đó bài tiết qua đường tiểu

- Chữa đau khớp, sản phẩm chuyển hóa của acid glycuronic là glucosamine rất tốt cho hệ keo giúp bôi trơn các khớp xương và sụn, nhất là ở những người lớn tuổi hay bị đau khớp

- Tác dụng kháng sinh, trà Kombucha còn sản sinh acid usnic, có thể chống lại

các vi khuẩn gây bệnh như Streptococci, Diplococci, và Shigella; giúp cân bằng hệ

acid base cho cơ thể khi chúng ta ăn uống không đúng cách

- Chống trầm cảm và chữa chứng thiếu ngủ

- Giúp gia tăng thị lực, chữa bệnh quáng gà, chảy nước mắt và chứng đục thủy tinh thể ở người cao tuổi Trà Kombucha còn giải cơn ghiền rượu cho những người có thói quen uống rượu (Nguồn: http://tuoitre.vn/chinh-tri-xa-hoi/song-khoe/416138/tra-kombucha-va-suc- khoe.htmL, 31/07/2013).