Xác định chỉ thị phân tử đa hình giữa giống cho (KC25) và giống nhận khang dân (KD) QTL gen quy định tính trạng tăng số hạt trên bông

Tiềm năng của việc sử dụng chỉ thị phân tử đã rút ngắn được thời gian chọn tạo giống, đánh giá được đa dạng di truyền, nâng cao hiệu quả chọn lọc các tính trạng khó, có thể loại được ản

QTL/GEN QUY ĐỊNH TÍNH TRẠNG TĂNG SỐ HẠT TRÊN BÔNG

Người thực hiện : Trần Bích Đào Hướng dẫn đề tài : TS Trần Đăng Khánh

Cơ quan chủ trì đề tài : Viện Di truyền Nông nghiệp

Thời gian thực hiện : 08/2014 - 05/2015

Hà Nội , tháng 05/2015

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy hướng dẫn: TS.Trần Đăng Khánh, trong nhiều tháng thầy đã tận tình giúp đỡ cùng tôi đi những bước đầu tiên của khóa luận tốt nghiệp

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa, các thầy cô trong

tổ di truyền, tập thể các thầy cô giáo khoa Sinh – KTNN, phòng quản lí khoa học và Ban giám hiệu trường Đại học sư phạm Hà Nội 2 Đã tạo mọi điều kiện cho tôi học tập và nghiên cứu hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Tôi cũng xin đồng cảm ơn Bộ môn Kĩ thuật Di truyền,Viện Di truyền Nông nghiệp Đã tạo điều kiện cho tôi tiến hành thực nghiệm thành công Cảm ơn tất cả bạn bè đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện khóa luận

Hà Nội, tháng 05 năm 2015

Sinh viên thực hiện

Trần Bích Đào

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là khóa luận tốt nghiệp của riêng tôi Các số liệu trong khóa luận tốt nghiệp là khách quan, trung thực và chƣa có ai công bố trong bất cứ công trình nào khác

Hà Nội, tháng 05 năm 2015

Sinh viên thực hiện

Trần Bích Đào

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN………

LỜI CAM ĐOAN………

DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT TRONG ĐỀ TÀI…………

MỤC LỤC………

MỞ ĐẦU……… 1

1 Đặt vấn đề……… 1

2 Mục đích nghiên cứu……… 2

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU……… 4

1.1 Giới thiệu sơ lược về nguồn gốc cây lúa……… 4

1.2 Giới thiệu về QTL……… 7

1.3 Chỉ thị phân tử và ứng dụng chỉ thị phân tử trong công tác chọn giống……… 8

1.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước……… 12

1.4.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước……… 12

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 20 CHƯƠNG II VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……… 23

2.1 Vật liệu……… 23

2.1.1 Giống lúa thí nghiệm ……… 23

2.1.1.1 Khang dân (KD) ……… 23

2.1.1.2 Dòng (KC25) ……… 23

2.1.2 Mồi ADN……… 23

2.2 Nội dung nghiên cứu của đề tài……… 25

2.3 Phương pháp nghiên cứu……… 25

2.3.1 Phương pháp tách chiết ADN tổng số……… 25

2.3.2 Phương pháp PCR với mồi thí nghiệm……… 27

2.3.3 Phương pháp điện di trên gel agarose 0,8%……… 28

2.4 Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu……… 31

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ……… 32

3.1 Tách chiết và tinh sạch AND……… 32

3.2 Khảo sát tính đa hình tại vị trí QTL/gen quy đinh tính trạng tăng số hạt trên bông.……… 40

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……… 42

4.1 Kết luận……… 42

4.2 Kiến nghị……… 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO……… 43

nhận gen với chỉ thị RM6; RM3; RM345 36 Hình 3.5 Kết quả khảo sát đa hình với ADN các giống cho và

DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT TRONG ĐỀ TÀI

RFLP : Restriction Fragment Lenght Polymorphilism

AFLP : Amplified Fragment Length Polymorphism

SNP : Single Nucleotide Polymorphism

IRRI : Viện di truyền lúa Quốc tế

QTL : Quantitative Trait Loci

MAS : Marker Assisted Selection

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Lúa (Oryza sativaL.) là cây lương thực quan trọng cung cấp cho khoảng

50% dân số trên thế giới Bên cạnh đó, lúa cũng đảm bảo an ninh lương thực cho nhiều quốc gia, đặc biệt là các nước Châu Á, trong đó Việt Nam là quốc gia sản xuất lúa gạo lâu đời

Trong tình hình tiêu thụ lúa gạo trên thế giới hiện nay, Việt Nam có tổng sản lượng lúa đứng thứ năm và là nước xuất khẩu gạo thứ hai sau Thái Lan, chiếm khoảng 50% tổng sản lượng gạo thương mại trên thế giới hiện nay [1] Lúa gạo là nguồn thu ngoại tệ lớn nhất của nền nông nghiệp xuất khẩu và cũng là cây trồng chủ yếu ở Việt Nam

Trên thực tế, biến đổi khí hậu đang là mối đe dọa lớn mà nhân loại sẽ phải đương đầu trong thế kỉ 21 Biến đổi khí hậu dẫn đến sự thay đổi thất thường của các yếu tố thời tiết cực đoan (hạn hán, lũ lụt, mưa đá,…) ảnh hưởng rất lớn đến môi trường sinh thái, đặc biệt là sinh thái nông nghiệp Bên cạnh đó, dân số ngày một tăng nhanh, quá trình đô thị hóa phát triển mạnh mẽ dẫn đến diện tích đất trồng giảm mạnh Chính vì vậy, sản lượng lúa gạo của Việt Nam có thể giảm một cách kịch tính.Đối với chọn tạo giống lúa, mục đính cuối cùng mà các nhà chọn giống là tạo ra được các giống lúa phẩm chất tốt, chất lượng cao và năng suất lớn

Trong nhiều thập kỉ qua, ứng dụng các phương pháp chọn giống truyền thống như: lai tạo, đột biến trong chọn tạo giống lúa cho năng suất cao ở nước

ta đã đạt được nhiều kết quả khả quan Tuy nhiên, ứng dụng các phương pháp truyền thống trong chọn tạo giống lúa vẫn gặp phải một số trở ngại dẫn đến kết quả chọn lọc không như mong muốn như: khi lai tạo hoặc gây đột biến để

khai thí nghiệm trên đồng ruộng nên phụ thuộc rất nhiều vào các yếu tố môi trường và ý muốn chủ quan của người chọn tạo.v.v Trong khi đó, nhờ sự phát triển của công nghệ sinh học mà trong chọn tạo giống cây trồng nói chung và cây lúa nói riêng đã hình thành hướng chọn tạo mới được gọi là MAS

(Marker Assisted Selection) Tiềm năng của việc sử dụng chỉ thị phân tử đã

rút ngắn được thời gian chọn tạo giống, đánh giá được đa dạng di truyền, nâng cao hiệu quả chọn lọc các tính trạng khó, có thể loại được ảnh hưởng của nhân tố môi trường trong quá trình chọn lọc.(Thomson và ctv, 2009: Septiningsih và ctv; Singh và ctv, 2009)

Nhằm góp phần vào công tác chọn tạo giống lúa cao sản, tôi xin chọn

tiến hành đề tài: "Xác định chỉ thị phân tử đa hình giữa giống cho (KC25)

và giống nhận Khang dân (KD) QTL/ gen quy định tính trạng tăng số hạt trên bông" với mục đích xác định các chỉ thị phân tử đa hình giữa giống cho

và nhận QLT/ gen quy định tính trạng tăng số hạt trên bông, nhằm phục vụ cho các bước tiếp theo của nghiên cứu chọn tạo giống lúa cho sản lượng cao ở nước ta

2 Mục đích nghiên cứu

+ Tách chiết được ADN của hai giống lúa Khang dân và (KC25)

+ Xác định được các chỉ thị đa hình giữa hai giống cho Khang dân và giống nhận (KC25)

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

3.1 Ý nghĩa khoa học

- Đề tài đánh giá được các chỉ tiêu hình thái sinh trưởng phát triển, chỉ tiêu

năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất các giống lúa thu thập dùng làm dòng nhận gen và cho gen

- Xác định chỉ thị phân tử đa hình tại vị trí QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt trên bông giữa dòng/giống cho gen và dòng/giống nhận gen

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Sau khi nghiên cứu sẽ xác định đƣợc các chỉ thị cho đa hình giữa giống cho QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt trên bông (KC25) và dòng nhận gen (KD) sẽ đƣợc sử dụng để đánh giá xác định kiểu gen ở thế hệ con lai, tìm

ra cá thể mang QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt trên bông triển vọng

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu sơ lược về nguồn gốc cây lúa

1.1.1 Nguồn gốc

Lúa thuộc chi Oryza là một trong những loại cây trồng có lịch sử trồng

trọt lâu đời nhất, gắn liền với sự phát triển lịch sử loài người, nhất là vùng châu Á Nguồn gốc của cây lúa đã được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu [1]

Vavilov (1926), trong nghiên cứu nổi tiếng của ông về sự phân bố đa dạng

di truyền của cây trồng, cho rằng lúa trồng được xem như phát triển từ Ấn Độ

Roschevicz (1931) phân các loài Oryzathành 4 nhóm: Sativa, Granulata,

Coarctata và Rhynchoryza, đồng thời khẳng định nguồn gốc của Oryza sativalà một trường hợp của nhóm Sativa, có lẽ là Oryza sativa.spontanea, ở

Ấn Độ, Đông Dương hoặc Trung Quốc [1]

Có ý kiến cho rằng, cây lúa xuất phát từ Đông Nam Á, từ đó lan dần lên phía Bắc Gutchtchin, Ghose, Erughin và nhiều tác giả khác thì cho rằng Đông Dương là cái nôi của lúa trồng De Candolle, Rojevich lại quan niệm rằng Ấn Độmới là nơi xuất phát chính của lúa trồng Dựa vào lịch sửphát triển lúa hoang ở trong nước cho rằng lúa trồng có xuất xứ ở Trung Quốc Một sốnhà nghiên cứu Việt Nam lại cho rằng nguồn gốc cây lúa là ở Miền Nam nước ta và Campuchia [1]

Sampath và Rao (1951) cho rằng sự hiện diện của nhiều loại lúa hoang ở

Ấn Độvà Đông Nam Á chứng tỏ rằng Ấn Độ, Miến Điện hay Đông Dương là nơi xuất xứcủa lúa trồng Sato (Nhật Bản) cũng cho rằng lúa có nguồn gốc ở

Ấn Độ, Việt Nam và Miến Điện

Tuy có nhiều ý kiến nhưng chưa thống nhất, nhưng căn cứ vào các tài liệu

diện rộng rãi của các loài lúa hoang dại trong khu vực, nhiều người đồng ý rằng nguồn gốc cây lúa là ởvùng đầm lầy Đông Nam Á, rồi từ đó lan dần đi các nơi Thêm vào đó, sự kiện thực tế là cây lúa và nghề trồng lúa đã có từ rất lâu ở vùng này, lịch sử và đời sống của các dân tộc Đông Nam Á lại gắn liền với lúa gạo đã minh chứng nguồn gốc của lúa trồng

Chang (1976), nhà di truyền học cây lúa của Viện Nghiên Cứu lúa Quốc Tế(IRRI), đã tổng kết nhiều tài liệu khác nhau và cho rằng việc thuần hóa lúa trồng có thể đã được tiến hành một cách độc lập cùng một lúc ở nhiều nơi, dọc theo vành đai trải dài từ đồng bằng sông Ganges dưới chân phía đông của dãy núi Hy-Mã-Lạp-Sơn (Himalayas - Ấn Độ), ngang qua Bắc Miến Điện, Bắc Thái Lan, Lào và Việt Nam, đến Tây Nam và Nam Trung Quốc [1]

Ở nước ta theo nhiều tài liệu khảo cổ học trên các trống đồng Đông Sơn, cho thấy cây lúa đã xuất hiện từ 4000-3000 năm trước công nguyên Cây lúa được coi là cây trồng “bản địa”, nó không phải là loại cây trồng từ nơi khác đưa vào (Bùi Huy Đáp, 1985) Lúa trồng hiện nay có nguồn gốc từ lúa dại

Một số tác giả như Đinh Dĩnh, Bùi Huy Đáp, Đinh Văn Lư… cho rằng: Oryza

Fatua là loài lúa dại gần nhất và được coi là tổ tiên của lúa trồng hiện nay[1]

1.1.2 Tổ tiên lúa trồng

Theo Chang (1965) [1], cả 2 loài lúa trồng đều có chung một thủy tổ, do quá trình tiến hóa và chọn lọc tự nhiên lâu đời, đã phân hóa thành 2 nhóm thích nghi với điều kiện ở 2 vùng địa lý xa rời nhau là Nam - Đông Nam Châu

Á và Châu Phi nhiệt đới Oryza sativa L tiêu biểu nhóm lúa trồng Châu Á có

tổ tiên trực tiếp là Oryza nivara, một loài lúa hoang hằng niên Oryza

glaberrima Steud cũng tiến hoá từ một loài lúa hoang hằng niên khác, thường

gọi là Oryza breviligulata Chev et Poehr hoặc là Oryza barthii A Chev Hai loài cỏ hằng niên O spontanea và O stapfii cũng có thể lai tạp với các loài

lúa hoang tổ tiên để cho ra các loài lúa trồng tương ứng Hiện nay, nhiều

người tỏ ra đồng ý với quan điểm và giả thuyết này Oka (1964) [1], cũng cho

1 sơ đồ tương tự, nhưng cho rằng loài trung gian là O perennis thay vì O

rufipogon và O longistaminata

Hình 1.1 Lịch sử tiến hóa của các loài lúa trồng (Chang, 1975)

(AA, AbAb, AgAg): Ký hiệu loại nhiễm sắc thể

1.2 Giới thiệu về QTL

- Trong di truyền học, một QTL (viết tắt của định lượng đặc điểm locut“locut tính trạng số lượng”) là một vị trí mà biến thể alen có liên quan đến sự thay đổi trong một tính trạng số lượng, tức là những nhân vật có thể đo lường mà thay đổi liên tục Sự hiện diện của một QTL để lập bản đồ gen sau, nơi mà tổng số biến thể cho một nhân vật nhất định được chia thành các thành phần liên quan đến khu vực một hoặc nhiều nhiễm sắc thể

Dựa vào công thức sau:

P= µ + G + e = µ + a +d + i + e

QT: Tính trạng số lượng (tính trạng thể hiện sự phân bố chuẩn, liên tục trong quần thể lớn và chưa qua chọn lọc nào)

P: Đánh giá kiểu hình (sự đo lường hiệu quả của các cá thể)

G: Ảnh hưởng kiểu gen (ảnh hưởng của yếu tố di truyền, kiểm soát kiểu hình, được đo lường thông qua độ lệch với giá trị trung bình quần thể)

a: Ảnh hưởng tính cộng (một phần của ảnh hưởng môi trường)

d: Độ lệch tính trội (ảnh hưởng kiểu gen không có sự tham gia của [a], ảnh hưởng tương tác giữa hai alen trong cùng locut)

i: Epistasis (ảnh hưởng tương tác giữa 2, 3 hay nhiều locut)

e: Sai lệch trong liên kết [Linkage disequilibrum] (các locut không thể kết hợp ngẫu nhiên để tạo ra sự tăng, giảm kiểu gen nào đó, do sự liên kết quá chặt hoặc yếu tố khác, so với trường hợp nó không liên kết Mức độ sai lệch trong liên kết được xác định bằng mức độ liên kết, sự chọn lọc,v.v…) [5]

- Xác định QTL ảnh hưởng đến một tính trạng số lượng được đưa ra trong một cơ thể dựa trên lý thuyết về mối liên kết và tái tổ hợp phát triển trong những năm đầu thế kỷ XX Tính sẵn có của bản đồ gen dày đặc của thực vật và động vật đã làm sống lại quan tâm đến lý thuyết này kể từ thập niên cuối cùng của thế kỉ [13]

1.3 Chỉ thị phân tử và ứng dụng chỉ thị phân tử trong công tác chọn giống

-Chỉ thị phân tử ADN

Các chỉ thị phân tử ADN là những chỉ thị dựa trên bản chất đa hình ADN Nó cho phép xác định được các chỉ tiêu trực tiếp của kiểu gen thông qua việc xác định các trình tự nhất định của gen, hay các trình tự đặc hiệu liên kết chặt với các gen mang các tính trạng mong muốn Từ đó, khắc phục ảnh hưởng của các yếu tố môi trường, theo dõi và phát hiện được các gen mong muốn, sự biến đổi của chúng qua các thế hệ khi chưa có sự biểu hiện ra kiểu hình [6]

Chỉ thị phân tử ADN có thể là một gen hoặc những đoạn ADN đặc hiệu Chỉ thị di truyền phân tử có tính ổn định cao và có thể xác định trong tất

cả các loại mô với độ chính xác cao mà không bị ảnh hưởng bởi điều kiện của môi trường Theo lý thuyết một chỉ thị phân tử ADN phải đáp ứng yêu cầu: cho đa hình cao, di truyền đồng trội, xuất hiện nhiều trong genom, tập tính chọn lọc trung tính, dễ tiếp cận, phân tích nhanh dễ dàng Xong gần như không thể tìm được một chỉ thị nào thỏa mãn được tất cả yêu cẩu trên Tùy thuộc vào từng nghiên cứu mà người ta sử dụng hệ thống các chỉ thị phù hợp mục đích [2]

-Ứng dụng chỉ thị ADN

Trong nghiên cứu sử dụng chỉ thị ADN được ứng dụng để: phân tích đa dạng di truyền giúp rút ngắn thời gian chọn lọc đối với các tính trạng không hoặc khó đánh giá thông qua kiểu hình Giúp xác định mối quan hệ di truyền các cá thể trong cùng loài hoặc giữa các loài là cơ sở cho việc phân loại dưới loài, phát hiện loài mới và mối quan hệ giữa các loài Hơn nữa nghiên cứu đa dạng di truyền có thể giúp tiên đoán khả năng cho ưu thế lai giữa các cặp bố

mẹ

Tìm chỉ thị phân tử liên kết gen và lập bản đồ gen, chỉ thị ADN cũng cho phép các nhà chọn giống thực vật đặt chính xác các QTL vào bản đồ phân tử Bản đồ với tính trạng số lượng (QTL) thường có ít thông tin về sự kiểm soát gen

Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử kết hợp với lai trở lại để quy tụ gen khắc phục nhược điểm trong chọn giống truyền thống: gặp nhiều khó khăn, tốn thời gian và công sức, đôi khi còn không thực hiện được Bước đầu đã đạt được những kết quả rất tốt

Chỉ thị phân tử ADN được chia làm ba loại chính:

• Chỉ thị dựa trên cơ sở nguyên lý lai ADN: chỉ thị RFLP

• Chỉ thị dựa trên cơ sở nhân bản ADN bằng kỹ thuật PCR: RAPD, AFLP, STS, RGA, SNP

• Chỉ thị dựa trên cơ sở những chuỗi có trình tự lặp lại (Chỉ thị tiểu vệ tinh, chỉ thị vi vệ tinh) [2]

- Chỉ thị phân tử SSR (Simple sequence repeat) và ứng dụng trong

nghiên cứu, xác định tăng năng suất số hạt trên bông

Chỉ thị phân tử SSR

Chỉ thị SSR hay còn gọi là vi vệ tinh, là những đoạn trình tự ADN đơn giản lặp lại nối tiếp và chỉ gồm 1- 6bp Hiện tượng các SSR trong cơ thể sinh vật nhân chuẩn là khá phổ biến ở động vật và thực vật Tuy nhiên, tùy từng loài mà số lượng các nucleotit trong mỗi đơn vị lặp lại có thể thay đổi từ một đến hàng chục và số lượng đơn vị lặp lại có thể biến động từ hai đến hàng chục lần hoặc nhiều hơn Thông thường có các kiểu lặp lại:

- Lặp lại hoàn toàn: các đơn vị lặp lại sắp xếp nối tiếp nhau

- Lặp lại không hoàn toàn: xen kẽ vào các đơn vị lặp lại là một hoặc một

số nucleotit khác

- Lặp lại phức tạp: xen kẽ giữa các đơn vị lặp lại khác nhau

Thông thường, các SSR có mặt chủ yếu ở các vùng dị nhiễm sắc của nhiễm sắc thể như vùng tâm động hoặc các đầu mút, chúng giữ vai trò quan trọng trong việc điều hoà phiên mã đối với các gen hoạt động ở vùng nguyên nhiễm sắc, góp phần làm tăng tính ổn định cơ học của nhiễm sắc thể trong các quá trình phân bào và có thể chứa đựng những thông tin di truyền liên quan đến sự xác định giới tính ở cả động vật và thực vật

Bản chất đa hình của SSR có thể được sinh ra do sự nhân bội từ ADN tổng số của hệ gen nhờ sử dụng hai đoạn mồi bổ trợ với trình tự gần kề hai đầu của vùng lặp lại Sự khác nhau về độ dài ở locut SSR được phát hiện bởi

sự nhân đoạn ADN nhờ phản ứng PCR Kích thước của sản phẩm PCR được xác định một cách chính xác bằng điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamit với sự khác nhau về độ dài có thể rất nhỏ (2bp) Chỉ thị SSR dùng để đánh giá đa dạng di truyền, xác lập quan hệ di truyền của cây trồng, chọn lọc tính kháng bệnh, một số tính trạng có quan hệ chặt chẽ với năng suất

ở cây lúa, lập bản đồ, nghiên cứu locus tính trạng số lượng (QTL)

Ứng dụng của chỉ thị SSR trong xác định gen tăng năng suất số hạt trên bông

Nhờ chỉ thị phân tử mà công việc xác định gen tăng năng suất trở lên dễ dàng, chủ động và chính xác hơn

Xác định gen kháng bằng chỉ thị phân tử nghĩa là sử dụng các chỉ thị phân tử liên kết chặt với các gen kháng và các QTL để chọn được các cá thể mang gen kháng trong quần thể phân li Độ chính xác của phương pháp này

có thể lớn hơn 99,75% khi gen kháng kẹp giữa hai chỉ thị liên kết với gen kháng đó và khoảng cách di truyền từ chỉ thị phân tử đến gen kháng nhỏ hơn 5cM Bằng cách chọn lọc này, các tổ hợp gen kháng khác nhau được chọn lọc

là dựa trên kiểu gen thay vì dựa trên kiểu hình [3]

Về cơ bản các loại chỉ thị trên đều có thể được ứng dụng để lập bản đồ di truyền hoặc nghiên cứu sự đa dạng di truyền hoặc phân lập gen, hoặc xác định gen,… Tuy nhiên, mỗi loại chỉ thị có ưu - nhược điểm riêng vì thế tuỳ vào mục đích, yêu cầu và điều kiện cụ thể của mỗi nghiên cứu mà lựa chọn sử dụng chỉ thị nào cho thích hợp

Thuận lợi to lớn của phân tích SSR là phương pháp này biểu hiện số lượng lớn sự đa hình Hơn nữa, khả năng phân biệt các cá thể khi có sự kết hợp các locut được kiểm tra làm cho phương pháp này rất hữu dụng trong các thí nghiệm dòng chảy gen, xác định cây trồng và phân tích mối quan hệ di truyền [5] SSR là chỉ thị đồng trội, do đó dị hợp tử có thể dễ dàng được xác định trong quá trình thực nghiệm Tính đồng trội của SSR sẽ gia tăng sự hiệu quả và độ chính xác của những phép tính toán di truyền quần thể dựa trên những chỉ thị này so với những chỉ thị khác, như AFLP và RAPD Hơn nữa, việc xác định dị hợp tử ở thế hệ F1 sẽ làm cho những phân tích phả hệ, sự lai giống, dòng chảy gen trở nên dễ dàng hơn Chỉ thị SSR là một công cụ hữu hiệu để chọn lọc giống, đa dạng hoá về các vật liệu di truyền và dùng trong thiết lập bản đồ di truyền

Khi các mồi SSR đã được xác định, việc sàng lọc các vật liệu sử dụng

kỹ thuật này hoàn toàn không đắt tiền Hơn nữa, sự khuếch đại SSR giữa các loài nghĩa là sự xác định những mồi SSR thích hợp không cần thiết trong những loài có quan hệ gần [4], [5] Hạn chế của chỉ thị này là quá trình thiết

kế mồi chi phí cao liên quan đến trình tự mồi chính xác cho loài quan tâm có thể không có sẵn, và vì thế khó để ứng dụng cho các nhóm không có hoạt động nghiên cứu, mỗi loại mồi chỉ đặc trưng cho một loài và không thể áp dụng phân tích trên một hệ thống lớn bao gồm nhiều loài có quan hệ di truyền

xa nhau

Về cơ bản các loại chỉ thị trên đều có thể được ứng dụng để lập bản đồ

di truyền hoặc nghiên cứu sự đa dạng di truyền hoặc phân lập gen, hoặc xác định gen,… Tuy nhiên, mỗi loại chỉ thị có ưu - nhược điểm riêng vì thế tuỳ vào mục đích, yêu cầu và điều kiện cụ thể của mỗi nghiên cứu mà lựa chọn sử dụng chỉ thị nào cho thích hợp Trong số các chỉ thị phân tử, SSR có nhiều ưu điểm: đơn giản, dễ thực hiện, nhanh, chính xác, độ đa hình cao và kinh tế Hiện nay, đã có khoảng 2740 chỉ thị SSR cho toàn bộ Bộ gen lúa và như vậy

trung bình cứ 157kp của phân tử ADN có một chỉ thị SSR

1.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

1.4.1.Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Sự ra đời của các kĩ thuật chỉ thị phân tử cho phép xác định hàng loạt các QTL liên kết tính trạng số lượng, yếu tố cấu thành năng suất Những năm gần đây, nhiều QTL/gen quy định tính trạng cấu thành năng suất đã được xác định trên rất nhiều các quần thể từ các tổ hợp lai giữa giống hay các loài phụ QTL/gen năng suất và yếu tố cấu thành năng suất được xác định trên tất cả các nhiễm sắc thể của lúa Một số công trình nghiên cứu về QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt trên bông như:

Các nhà nghiên cứu của khoa di truyền chọn giống cây trồng, Đại học Cornell, Bang New York, Hoa Kỳ đã đưa ra giải pháp nghiên cứu tính trạng năng suất (số hạt/bông) là xác định vị trí các locut của gen quy định tính trạng dựa trên sự liên kết với chỉ thị phân tử (QTL mapping) từ một giống

thuộc dòng lúa ôn đới Japonica có năng suất không cao nhưng chất lượng tốt,

tạo ra loại gạo Koshihikari (gạo được dùng trong sushi) và một giống lúa

nhiệt đới Indica có năng suất cao hơn nhưng chất lượng không cao bằng, tạo

ra loại gạo Habataki để có nhiều đa hình về trình tự ADN giữa hai bố mẹ, tạo thuận lợi cho thiết kế chỉ thị phân tử cho phân tích sau này Kết quả là các tác

Gn1 có giá trị LOD =9 cũng có giá trị R2 cao nhất: 44% Cả hai giá trị LOD

và R2 cho QTL này là rất lớn, có thể dễ dàng phân biệt được các nhóm kiểu hình khác nhau (QTL này làm tăng số lượng hạt tới 92 hạt) Do đó, xác suất

có gen trong vùng QTL này ảnh hưởng đến tính trạng là rất cao (LOD = 9, khả năng có QTL cao hơn 109 lần so với khả năng không có QTL) Ngoài ra các nhà nghiên cứu còn chỉ ra rằng gen quy định năng suất lúa (số hạt/bông) còn có mối tương tác với gen quy định chiều cao cây [14]

Ở Ấn Độ, các nhà khoa học đã tiến hành thực hiện lập bản đồ gen quy định tính trạng số hạt trên bông Bản đồ liên kết di truyền với 166 chỉ thị SSR trên 12 nhiễm sắc thể đã được xây dựng từ quần thể tái tổ hợp (RILs) giữa

giống Pusa 1266 (giống cho số hạt nhiều) và giống Pusa Basmati 1 (số hạt ít)

đã xác định 1 QTL (qGN4-1) trên vai dài của nhiễm sắc thể số 4 và được thu

hẹp đến 0,78Mbp Vùng này được so sánh để xác định vùng tương đồng với QTL2/Nre3 về số hạt trên trái của ngô trên nhiễm sắc thể số 2 Kết quả mở ra triển vọng về việc cải thiện tiềm năng năng suất của lúa trồng với việc chọn lọc giống có số hạt/bông nhiều bằng ứng dụng chỉ thị phân tử [15]

Ngày 13/12 Viện nghiên cứu lúa Quốc Tế IRRI đã thông báo phát hiện

ra loại gen mới (gen SPIKE) trên lúa cho năng suất cao Gen SPIKE có nguồn gốc Indonesia đã góp phần tăng năng suất lúa đáng kể Các thử nghiệm của của IRRI cho thấy năng suất tăng 13-36% so với IR64 và IRRI146 Gene SPIKE của giống IR64 được thử nghiệm ở nhiều nước châu Á bao gồm Lào, Indonesia (đảo Java), Ấn Độ (bang Tamil Nadu) và Nhật Bản Việc phát hiện

ra loại gen này sẽ tiếp tục còn có nhiều triển vọng trong thời gian sắp tới [16] Như vậy, một trong những ứng dụng quan trọng của chỉ thị phân tử là xác định chỉ thị phân tử liên kết QTL/gen và lập bản đồ QTL/gen Với sự ra đời của hàng loạt các kỹ thuật chỉ thị phân tử đã cho phép xác định những QTL liên kết đến các tính trạng nông sinh học, yếu tố cấu thành năng suất

Trong nghiên cứu xác định chỉ thị phân tử và lập bản đồ QTL/gen điều khiển một tính trạng năng suất hay yếu tố cấu thành năng suất Đây là một việc làm khó vì năng suất hay yếu tố cấu thành năng suất là tính trạng di truyền số lƣợng, nó là tổ hợp tính trạng nhƣ: số hạt chắc trên bông, số bống trên khóm, khối lƣợng nghìn hạt Những nằm gần đây, nhiều QTL/gen quy định tính trạng cấu thành năng suất đã đƣợc xác định trên rất nhiều các quần thể từ các tổ hợp lai giữa giống hay các loài phụ QTL/gen năng suất và yếu tố cấu thành năng suất đƣợc xác định trên tất cả các nhiễm sắc thể của lúa.Ở đây chúng tôi tập hợp lại những kết quả xác định QTL/gen liên kết năng suất và yếu tố cấu thành năng suất trên cây lúa

Nhiễm sắc thể số 1: Các nhà khoa học trên thế giới đã xác định đƣợc

nhiều tính trạng liên quan đến năng suất trên nhiễm sắc thể số 1 nhƣ: ba QTL quy định tính trạng khối lƣợng nghìn hạt tại vị trí gần chỉ thị phân tử RM283 -RM259 [8], theo Cui và cs (2003)RG690 - RM212, và RG810 - RG331 (Hittalmani và cs 2003) Một QTL liên kết tính trạng số hoa trên bông tại vị trí chỉ thị phân tử RM1- RM490 [8] và một QTL liên kết tính trạng số hạt chắc trên bông đã đƣợc xác định từ các tác giả [8] tại vị trí giống QTLs liên kết tính trạng khối lƣợng nghìn hạt RM283 - RM259 Một QTL liên kết tính trạng tỷ lệ đậu hạt tại vị trí RM265 - RM315 [8] Vị trí chi thị phân tử RZ730 -RZ810, một QTL cho tính trạng số bông trên khóm cũng đã đƣợc xác định [9] Locut quy định trực tiếp với tính trạng năng suất đƣợc xác định tại vị trí gần RM230 - RM532 [9]

Nhiễm sắc thể số 2: QTL quy định khối lƣợng nghìn hạt đƣợc xác định

từ năm tác giả khác nhau với cùng vị trí chỉ thị phân tử RM240 - RM266 [8]

Ba QTL liên kết tính trạng tổng số hạt trên khóm, tại các vị trí gần tâm động [8] vị trí chỉ thị RM263 [10] và vị trí chỉ thị RZ123 - RZ446 [11] Một QTL quy định tính trạng tỷ lệ đậu hạt đƣợc xác định từ bốn tác giả tại vị trí chỉ thị

phân tử RZ123 - RZ446 trên vai dài của nhiễm sắc thể số 2 [11] Hai QTL quy định tính trạng số bông trên khóm đƣợc xác định tại vị trí gần tâm động [9] Hai QTL liên kết tính trạng năng suất đƣợc xác định gần tâm động [8] và theo Xiao và cs (1998) nằm trên vai dài của nhiễm sắc thể 2

Nhiễm sắc thể số 3: Một số tác giả đã xác định QTL liên kết tính trạng

khối lƣợng nghìn hạt trên nhiễm sắc thể số 3 Một trong số đó là QTL đƣợc xác định tại vị trí tâm động [8] Tác giả Li và cs (2004) đã lập bản đồ QTL liên kết tính trạng khối lƣợng nghìn hạt với khoảng cách 98kb QTL thứ hai đƣợc xác định trên nhiễm sắc thể số 3 tại vị trí chỉ thị phân tử RM16-RM168 [10] QTL thứ ba đƣợc xác định trên vai ngắn [8] Hai QTL liên kết tổng số hạt trên bông trên vai dài của nhiễm sắc thể 3 [8] Theo Xing và cs(2001) gần chỉ thị phân tử RM282, một QTL cho số hạt chắc trên bông cũng đƣợc xác định Một QTL tỷ lệ đậu hạt đƣợc xác định [8] và Xing và cs (2001) xác định QTL cho tỷ lệ đậu hạt khác tại vị trí G144 - C1087 Bốn QTL liên kết số bông trên khóm đƣợc xác định tại vai dài [11].Theo Xu và cs(2001) CDO337 -OSR31, RZ598 - RM16[8] và theo Hittalmani và cs(2003) CDO87 - RG910 QTL quy định năng suất cũng đƣợc xác định trên vai dài [8], RG393 - G144,

và theo Venuprasad và cs (2002) RZ329 - RZ892

Nhiễm sắc thể số 4: Ba QTL/gen liên kết với tính trạng khối lƣợng

nghìn hạt đƣợc các nhà khoa học xác định hai QTL tại vị trí gần chỉ thị phân

tử CDO244 - RG864 [10] và theo Lin và cs (1996)một tại vị trí RG143 (Hai QTL quy định tổng số hạt trên cây đƣợc xác định tại vi trí RM303 - RM317 [11] và RG214 - RG620 [9] Hai QTL quy định tính trạng số hạt trên bông đƣợc xác định tại vi trí RZ656 - C513 [7], và theo Hua và cs (2003)một cái khác tại RG214 - RG620 Hai QTL quy định tính trạng tỷ lệ đậu hạt đƣợc xác định tại vị trí gần tâm động trên vai dài và một cái khác tại RG214 - RG260 [8] Ba QTL quy định tính trạng số bông trên khóm đƣợc xác định bởi các tác

giả [11] Hai QTL quy định tính trạng năng suất tại vị trí gần tâm động [11], một tại vị trí RG214 - RG620 theo Brondani và cs(2002)

Nhiễm sắc thể số 5: Ba QTL quy định tính trạng năng suất đƣợc xác

định trên nhiễm sắc thể số 5 tại vị trí R1674 - RG360, và gần tâm động liên kết chỉ thị RZ296 [9], [11], và RM26 - C147 Hai QTL quy định tính trạng khối lƣợng nghìn hạt liên kết chỉ thị phân tử RG360 - R3166 trên vai ngắn theo Yu và cs(1997) và tại RG13 - RG470 [8] Hai QTL quy định tính trạng

số hạt trên cây tại vị trí chỉ thị phân tử RZ556 - RG360 [11] và gần RG13 [10] Hai QTL liên kết tính trạng số hạt chắc trên bông tại vị trí RG360 -RG182 trên vai ngắn [9]và tại vị trí RM164 - C624 trên vai dài [10]

Bốn QTL quy định tính trạng tỷ lệ đậu hạt đƣợc xác định liên kết chỉ thị phân tử RZ390 - RM153 [8] RZ296 [11] và G366 - C624 tại vị trí chỉ thị phân

tử RG435 trên vai dài [11] Ba QTLs quy định số bông trên khóm liên kết chỉ thị phân tử RG360-RG9, và C734B nằm trên vai dài tại vị trí CDO1083 [11]

Nhiễm sắc thể số 6: Ba QTL quy định tính trạng khối lƣợng nghìn hạt

đƣợc xác định một tại vị trí R2869 - C226A [11], một tại C751A - RZ667 [10]

và một tại R2549-C962 Ba QTL quy định tính trạng số hạt trên bông đƣợc xác định tại vị trí trên vai ngắn của nhiễm sắc thể số 6, liên kết với chỉ thị phân tử R2869 [11], và RG138 - RM253 [10] và G122 - R2549 Tác giả Brondani và cs (2002) đã xác định QTL quy định tính trạng tỷ lệ đậu hạt đƣợc xác định liên kết chỉ thị phân tử OG32 Trong khi đó, Thomson và cs (2003) xác định QTL quy định tính trạng tỷ lệ đậu hạt tại vị trí RM276 Ba QTL số bông trên khóm đƣợc xác định tại vi trí Wx - RG213 [10], RM3 -CDO78, RG653[11] Hai QTL quy định tính trạng năng suất đƣợc xác định bởi một số tác giả tại vi trí chỉ thị phân tử RZ398 - RM204 [10], [11] và RG653 - G342 [11]

Nhiễm sắc thể số 7: Ba QTL quy định tính trạng khối lượng 1000 hạt

liên kết chỉ thị phân tử RG128 - C1023 trên vai ngắn, RM125 gần tâm động,

và RM11 - RZ626 [11] Bốn QTL quy định tính trạng tổng số hạt trên cây được xác định liên kết chỉ thị phân tử RG128 - RG528, C1023 - R1440 gần tâm độn, RM336 - R1245 [10], và theo Xing và cs (2001) RM234 - R1789

Ba QTL quy định tính trạng số hạt chắc trên bông được xác định liên kết chỉ thị RG128 -C1023 trên vai ngắn, C1023B-R1440 gần tâm động, RZ471 - RZ624 [10] Ba QTLs quy định tỷ lệ đậu hạt được xác định tại vị trí gần tâm động trên vai ngắn, theo Lu và cs (1997) RG650 - C285, và gần chỉ thị STSG3 trên vai dài

Hai QTL quy định tỷ lệ đậu hạt liên kết chỉ thị phân tử R2401 tại vị trí gần tâm động, RZ471 - RM234 [8], [11] Bốn QTL quy định tính trạng năng suất được xác định tại vị trí chỉ thị phân tử RG128 - C1023 trên vai ngắn, RZ471 - RZ753 và RZ753 - RZ263 [8]

Ghd7 là gen quy định tính trạng tăng số hạt trên bông đã được phát hiện

từ giống lúa Minghui 63 Ghd7 nằm gần tâm động, trên nhiễm sắc thể số 7

Ghd7 làm tăng (65.8%) số hoa trên bông trên giống Zhenshan97 Gpa7 được

phát hiện từ giống lúa hoang O Rufipogon Gpa7 làm tăng số hạt trên bông trên giống lúa Indica Guichao 2 Gw9.1 là QTL liên kết tính trạng tăng khối lượng 1000 hạt, đã được phát hiện từ lúa hoang Oryza Rufipogon Gw9.1 được phát hiện nằm trên nhiễm sắc thể số 9 Gw11 liên kết tính trạng khối

lượng hạt, đã được các nhà chọn giống ở trường đại học tổng hợp quốc gia

Chungnam Hàn Quốc phát hiện từ giống lúa hoang O grandiglumis Ashikari

và cs (2005) đã xác định được gen Gn1a, gen tăng số hạt trên bông trên nhiễm sắc thể 1 Linh và cs (2008) đã lập bản đồ QTL yd7 liên kết tính trạng tăng năng suất từ lúa hoang O minuta trên nhiễm sắc thể số 7 Sự có mặt của

yd7 trên giống lúa trồng đại trà Hwaseongbyeo làm tăng 15 đến 20% năng

suất

Nhiễm sắc thể số 8: Ba QTL quy định tính trạng khối lƣợng nghìn hạt

liên kết chỉ thị phân tử C1121 - RZ562 gần tâm động, RM223 - RZ28 và RM284 - RM210 Bốn QTL quy định số hạt chắc trên bông đƣợc xác định liên kết chỉ thị phân tử RG333 - C1121, RM25 - RG978, RM210 - RZ66 [8]

và CDO99 [11] Hai QTL quy định tính trạng tỷ lệ đậu hạt liên kết chỉ thị phân tử RM25, RZ28 [11] Một QTL quy định tính trạng số bông trên khóm liên kết chỉ thị phân tử RM210 [11] Hai QTL quy định tính trạng năng suất đƣợc xác định tại vị trí gần tâm động [11] và một tại vị trí liên kết chỉ thị phân

Nhiễm sắc thể số 10: Bốn QTL quy định tính trạng khối lƣợng nghìn hạt

liên kết chỉ thị phân tử C153A - RM222 trên vai ngắn nhiễm sắc thể 10, RG257 - RM311 [8], [11], RG241 - RZ500 và RM561 - C371 Hai QTL quy định tính trạng tổng số hạt trên cây liên kết chỉ thị phân tử RM239-RZ561 [11], C405 - C371 trên vai dài [11] Một QTL quy định tính trạng tỷ lệ đậu hạt liên kết chỉ thị phân tử RM147 [8], [11].Hai QTL quy định tính trạng số hạt chắc trên bông liên kết chỉ thị phân tử RZ892 - RZ561 [11] C677 -