Nghiên cứu ảnh hưởng một số dẫn xuất artemisinin gắn fluor lên một số chỉ số huyết học và hóa sinh ở động vật thực nghiệm

Do vậy, việc nghiên cứu tìm ra một loại dẫn xuất mới của artemisinin để hạn chế được nhược điểm của thuốc là hết sức cần thiết, các nhà khoa học Pháp đã tổng hợp được một số dẫn xuất art

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược s ĩ KHOÁ 1999 - 2004)

NíỊLtời hướng dấn : TS Nguyễn Xuân Trường

TS Trương Văn Như

N ơi thực hiện : VIỆN SR - KST - CT TRUNG ƯƠNG

Thời gian thực hiện : 8/2003 - 12/2004

LỜI CẢM ƠN

Em xin bày tỏ lòng b iết ơn sâu sắc tói Tổ: Nguvễn Ầuân Trưòng, Tổ: Trương Văn Như những ngưòi thầy đã tận' tình hưóng đẫn, giúp đ õ em thức hiện và hoàn thành đ ể tài này

Dồng thòi em xin chân thành cảm ơn các thầv, cô trong Bộ môn Dược Lực, cản b ộ của các phòng ban trong trường Dại học Dược Hà Nội các cán b ộ của khoa Nghiên cứu lâm sàng điểu trị ố ố t R é t Viộn ỗ ố t D ét -

Kỷ ổinh Trùng - Côn Trùng Trung ương

Cũng thông qua đây em xin bày tỏ lòng b iế t ơn tói các tất cả các thầy cô, gia đỉnh và bạn b è đã giúp đ õ động viên em trong suốt thòi gian học tập rèn luyện đ ể em có được như ngàỵ hôm nay

Hà Nội, ngày ,J>0 tháng 5 năm 2 0 0 4

ôinh viên

Nguyễn Văn Kún

Ki

M Ụ C L Ụ C

Trang

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

1.1 Lịch sử phát triển của các thuốc chống sốt rét 2 1.2 Hiện tượng kháng thuốc của ký sinh trùng sốt rét 4 1.3 Tình hình nghiên cứu Artemisnin và dẫn xuất của nó 7

1.4 Tình hình nghiên cứu artemisinin gắn fluor 12

2.1 Đối tượng nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiệm 16

2.2.1 Kết quả nghiên cứu độc tính bán cấp ở trên khỉ tiêm

21

thuốc BB101, BB103 và khỉ chứng.

2.2.2 Kết quả nghiên cứu độc tính bán cấp ở thỏ uống Gôm

Arabic 1% và thỏ uống BB103 liều 50mg/kg X 28 ngày 29

D A N H M Ụ C C Á C C H Ữ V I Ế T T Ắ T

BB101: Trifluouromethyl-đihvdroartemisininBB103: Pentafluoroethyl- dihydroartemisinin

SLHC: Sô lượng hổns cầu

S G OT : Serum glutamat oxalate transaminaseSGPT: Serum glutamat pyruvate transaminase

KST-CT: Ký sinh trùng — Côn trùng

Đ ẶT VẤN Đ ỂNhững năm gần đây, artemisinin chất được chiết lừ cây thanh hao hoa vàng (Artemisia annua L Asteraceae) được nhiều nhà nghiên cứu trên thế và Việt Nam quan tâm bởi lính ưu việt của nó Thuốc này vừa ít độc lại có hoạt tính và hiệu quả điều trị cao, chống lại các thể kháng của p íaclciparum và chống lại sốt rét ác tính thể não Tuy nhiên, do khả năng hoà tan ít cả trong dầu lẫn trong nước cũng như liều dùng và tỷ lệ tái phát còn cao nên khả năng ứng dụng artemisinin bị hạn chế Mặt khác, tình trạng KSTSR kháng thuốc

SR ngày càng trở nên phức tạp [1] Vì vậy, việc nghiên cứu tìm ra loại thuốc mới chống sốt rét có hiệu lực với p íalciparum là m ột vấn đề mang tính chất thời sự Trong những năm gần đây artemisịnin và m ột số dẫn xuất của nó đã được sử dụng để điều trị sốt rét trong chương trình phòng chống sốt rét quốc gia Nhờ vậy đã làm giảm số vụ dịch sốt rét, giảm tỷ lệ sốt rét ác tính và giảm

tỷ lệ tử vong Tuy nhiên, dùng artemisinin vẫn còn nhược điểm lớn nhất là tỷ

lệ tái phát bệnh sốt rét còn cao (14%- 15%) Do vậy, việc nghiên cứu tìm ra một loại dẫn xuất mới của artemisinin để hạn chế được nhược điểm của thuốc

là hết sức cần thiết, các nhà khoa học Pháp đã tổng hợp được một số dẫn xuất artemisinin gắn fluor Trong số các dẫn xuất đó thì 10a-trifluorom ethy]- dihydroartem isim in (BB101) và 10ot - pentaíluoroethyl - dihydroartemisinin (BB103) được thử nghiệm ban đầu tại Viện SR- KST - CT trung ương cho thấy thuốc tác dụng tốt trên KSTSR p falciparum và p.berghei Viện đã phối hợp với công hoà Pháp nghiên cứu tiền lâm sàng các dẫn chất trên trong đề tài cấp Nhà nước giai đoạn 2002 - 2005 Thực hiện m ột phần của đề tài trong khoá luận này, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của một sô dẫn xuất Artemisinin gắn íluor lên một số chỉ số huyết học và hoá sinh ở động vật thực nghiệm ”

Đề tài có 2 mục tiêu sau:

1 Đánh giá ảnh hưởng của BB101, BB103 lên một số chỉ sô' huyết học,

ho á sinh và khả năng phục hồi sau ngừng thuốc ỏ khỉ thực nghiệm.

2 Đánh giá ảnh hưởng của BBI03 lẻn một sỏ chỉ sô huyết học, hoá sinh

và khả năng phục hồi sau ngừng thuốc ở thỏ thực nghiệm.

I

P H Ầ N 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN CỦA CÁC THUỐC CHỐNG SỐT RÉT

Hai ngàn năm trước đây, sách cổ của Trung Quốc đã nói tới cây thường sơn (Dichroa febrifuga séx) và qinghao (Artemisia annua L.) Nhưng mãi tới thế kỷ 17, khi người châu Âu khai thác và sử dụng cây Cinchona (cây sốt, fever trees, mọc ở sườn núi Pêru) thì việc nghiên cứu về mặt hoá học mới thực

sự bắt đầu Năm 1810, A Gomez (Bồ Đào Nha) và I Gize (Nga) thu được tinh thể quinin Bốn năm sau, p Pelletier và J Caventou phân lập được alcaloid của vỏ cây cinchona tạo thuận lợi cho việc chiết xuất quinin ở nhiều nước trên thế giới [7] Mặc dù vậy, quinin không đủ đáp ứng nhu cầu, nhất là trong chiến tranh thế giới thứ nhất Điều đó đã thúc đẩy việc nghiên cứu tổng hợp ra các thuốc sốt rét mới Kết quả là hàng nghìn hợp chất mới đã được đỉều chế Qua sàng lọc nhiều thuốc kháng sinh mới được đưa vào sử dụng

Từ công thức của quinin cùng với sự phát hiện tác dụng ức chế ký sinh trùng sốt rét của xanh methylen, năm 1926 Schuleman, Shoenhoíer và

W ingler (Đức) đã tổng hợp được primaquin thuộc nhóm 8-aminoquinolein, sau đó M agnidsson và Stroukov (Nga) tìm ra plasmocid

Năm 1932, M auss và Mietzh tổng hợp được atebrin, mepacrin thuộc nhóm 9 - am inoacriđin bằng cách thay thế nhân quinolein trong công thức primaquin bởi nhân acridin Cũng như Primaquin, mặc dù rất độc, chất nàyđược Pairly (ú c ) chứng minh có tác dụng khả quan trên 2000 trường hợp người tình nguyện [7]

Năm 1934, A nderstag (Đức) phát hiện santochin và resorchin bằng cách thay vị trí gắn chuỗi thẳng trong công thức pamaquin, lừ 8 sang 4 Theo cách này, Hoa Kỳ dã tổng hợp 17000 hợp chất cùng nhóm 4 - aminoquinolcin Rối sau dó, nhờ thay đổi thành phần chuỗi hên (aminoalkyl amino), năm 1944

chloroquin và amodiaquin ra đời Đó là íhuôc chống sốt rét lý iưởng Irong nhiều năm qua, thuốc vừa có tác dụng điều trị p falciparum lẫn p vivax, vừa

có khả năng dự phòng, lại ít độc hơn các thuốc chống sốt rét khác trong Ihời kì đó

Năm 1945, Curd Davey và Rose tổng hợp được proguanil (chất 4880) dựa vào nhận xét của Diaz de Leon về tác dụng chống kí sinh trùng sốt rét của sulíam id và về cơ chế tác dụng của mepacrin (cạnh tranh với ribofIavin của hệ enzym ký sinh trùng), proguanil có một nhân chlorophonin và một nhóm alkyl Tác dụng của proguanil cao hơn quin, nhưng lại ít độc hơn Cơ chế tác dụng của proguanil là ức chế sự phân chia nhân của ký sinh trùng sốt rét thê

vô tính do ức chế hệ enzym dehydroíolatereductase (DHFR), 2 nãm sau Bekhli (Nga) cũng tìm được một chất cùng nhóm với proguanil là bigumal [7]

Năm 1951, Falco và Hitchings (trong công trình phối hợp giữa anh và Hoa Kỳ) tìm được pyrimethamin có cơ chế tác động giống proguanil, nhưng ít độc hơn

Năm 1960 xảy ra sự kiện p íalciparum kháng lại cloroquin ở Colombia (do Young và Moore, Hoa Kỳ phát hiện), tình trạng p falciparum kháng lại các thuốc sốt rét nhóm 4 - aminoquinolein lan nhanh sang các nước Nam Mỹ

và Đông Nam Á (Thái Lan, Nam Việt Nam, M alaixia ) Tổ chức Y tế Thế giới thấy cần phải đưa việc nghiên cứu thuốc chống sốt rét mới vào chương trình chống kháng thuốc Có nhiều nước tham gia nghiên cứu sản xuất thuốc chống sốt rét mới bằng cách thay thế các nhóm chức trong công thức hoá học của các thuốc chống sốt rét đã bị kháng Trong vòng 15 năm từ 1963, các nước Tây Âu và Hoa Kỳ đã lổng hợp nhiều loại chất chống sốt rét, nhưng chỉ

có một số ít chất có tác dụng trên thử nghiệm bước đầu đối với KSTSR động vật và cuối cùng chỉ có khoảng 10 hợp chất có tác dụng điều trị lâm sàng Bên cạnh dó, sulfamiđ, sulíon và một số kháng sinh cũng tỏ ra có giá trị Ị2 1 1 Sự phối hợp giữa sulfamid chậm và bán chậm với các thuốc ức chế en/ym DMHR

3

cho kết quá tốt Những phác đồ điều trị chống ký sinh trù nu kháng thuốc gổin sulíbnamiđ phối hợp với pyrimclhamin và quinin đem lại kết quả đicu trị ỏ' nhiều vùng có ký sinh trùng kháng thuốc như Thái Lan, Việt Nam và nhò' đó, giám được tỷ lệ tử vong do sốt rét ác tính và sốt rét nặng một cách đáng kể ị 7 Ị.

Từ năm 1967 các nhà khoa học Trung Quốc đã bắt tay vào kiểm tra một cách có hệ thống các cây thuốc cổ truyền để tìm nguồn thuốc mới Một trong những cây thuốc ấy, một loại cây thảo đã được sử dụng từ lâu đời có lên Qinghao (A rtem isia annua L ) đã được tập trung nghiên cứu Năm 1972, đã tách chiết được artemisinin (Qinghaosu) từ cây Q inghao (Thanh hao)

Artemisinin là một sesquiterpen lacton mang một nhóm peroxid nội, khác hẳn với cấu trúc của các thuốc chống sốt rét khác, trong hệ thống dị vòng của nó không có nitơ

Sau khi được tách và xác định đặc tính, artem isinin và một số dẫn xuất của nó đã được các nhà khoa học Trung Quốc nghiên cứu một cách khá toàn diện về hiệu lực của chúng trên các mô hình sốt rét trong phòng thí nghiệm dược học, dược động học, độc tính và thử nghiệm lâm sàng Các dẫn xuất của artemisinin như dihydroartem isinin, artemether, natri artesunat thể hiện hiệu lực chống sốt rét cao hơn bản thân artemisinin (Trigg - 1989) [24] Hiện nay, artemisinin và các dẫn xuất của nó là loại thuốc chống SR mới được quan tâm không chỉ riêng ỏ' Trung Quốc, ở Việt Nam, m à ở nhiều nơi trên thế giới Nó

có tác dụng đối với các trường hợp SR nặng, SR ác tính và SR thể não

1.2 Hiện tượng kháng thuốc của ký sinh trùng sốt rét.

Theo định nghĩa của tổ chức y tế thế giới: Kháng thuốc là “khả năng của một chủng KST có thể sống sót và phát triển mặc dù bệnh nhân đã được điều trị và hấp thụ một lượng thuốc hoặc chính xác hơn là trong máu bệnh nhân có nồng độ Ihuốc mà trước đây vẫn ngăn cản và diệt được loại KST sôì rct dó” Định nghĩa này dược xem như là kháng tương đối và trong thực lố là

tiếp tục tăng liều lượng lên dến giới hạn mà bệnh nhân có thể chịu dựng dược nhưng không khỏi bệnh, đó là khánu hoàn toàn Hiện nay, “kháng thuốc” mang ý nghĩa kháng hoàn toàn [6|.

Các nghiên cứu lâm sàng về kháng thuốc được đánh giá theo tiêu chuán của tổ chức y tế thế giới (1973): đáp ứng của p ĩalciparum theo test in vivo 7 ngày và 28 ngày

* Test in vivo 28 ngày

- Nhạy (S): trong 7 ngày đầu bệnh nhân hết sốt, sạch KSTSR, không tái phát KST SR cho đến ngày thứ 28

- Kháng độ 1 (RI): hết sốt và sạch KSTSR trong tuần đầu nhưng lại tái phát KST từ ngày thứ 8 đến 28

- Kháng độ 2 (RII): số lượng KSTSR giảm dần nhưng không hếl hẳn, tới ngày thứ 7 vẫn còn nhưng < 25% so với ngày NO

- Kháng độ 3 (RIII): số lượng KSTSR giảm dần nhứng không hết hẳn, cho tới ngày thứ 7 vẫn còn nhưng > 25% so với NO hoặc lượng KST không giảm, thậm chí còn tăng cao hơn so với NO

Việt Nam là nước có p íalciparum kháng thuốc mạnh Trường hợp đầu tiên p íalciparum kháng chloroquin được phát hiện tại Nha Trang (1961), An Khê (1964), Tây Ninh, Bình Định (1968) Sau đó lan rộng ra cả khu vực Tây Nguyên, miền Trung và Nam Bộ

Năm 1966, Đặng Văn Ngữ và Nguyễn Duy Sỹ đã phát hiện kháng chloroquin tại VTnh Linh Sau đó Bùi Đại, Vũ Thị Phan (1967) cũng thông báo nhiều trường hợp kháns thuốc của p íalciparum

Năm 1968, lần đầu tiên xuất hiện một vụ dịch khá lớn do p falciparum kháng chloroquin xảy ra ở Quỳnh Thắng, Nghệ An [16] Sau giải phóng miền Nam, có sự giao lưu giữa hai miền, biển động dân cư lớn, tình hình SR ở miền Bắc quay n ở lại và p falciparum kháng thuốc lan rộng trong cá nước 117 ị

5

Tỷ lệ kháng choloroquin tại thực dịa là 40% - 50%, tại bệnh viện là 50- 80% cả in vivo và in vilro, đặc biệt là trẻ CITI, ly lệ kháng thuốc lên lới 90c/(

(1990) Ị16J

ỏ' nước ta, tỷ lệ kháng fancidar tương đối cao mặc dù thuốc này dược đưa vào sử dụng chưa lâu Năm 1998, trong một nghiên cứu tại nhiều điểm trong cả nước của Nguyễn Duy Sỹ đã xác định tỷ lệ kháng RI = 31,7%, RII = 25,8%, RIII = 14% (n= 243)

Đôi khi những chủng p íalciparum kháng mạnh với chloroquin thì cũng

kháng chéo với quinin Nghiên cứu ở khu vực Tây Nguyên, với liều ],25g quinin sulíat 10 ngày thấy tỷ lệ kháng quinin RI + RII là 53,3% năm 1990 Đến năm 1972, tỷ lệ này đã là 80% với liều 25mg/kg thể trọng 7 ngày 110,11]

M eíloquin được đưa vào sử dụng ở nước ta từ năm 1989 đến nay Thuốc được sử dụng chủ yếu để điều trị-P íalciparum đa kháng Nãm 1990 Viện SR

- KST - CT Trung đã nghiên cứu trên 274 bệnh nhân SR thuộc các vùng lưu hành SR ở miền Bắc với liều duy nhất 15mg/kg thể trọng thấy kháng RI là 3,2%, không có kháng RII và RIII Lê Đình Công (1990) cho thấy tỷ lệ kháng

RI là 1% [4]

Như vậy, p falciparum kháng thuốc ngày càng tăng và lan rộng nhiều nơi trên cả nước, do đó việc nghiên cứu để tìm ra một loại thuốc mới thay thê các thuốc đã bị kháng là vấn đề hết sức cần thiết trong tình trạng sốt rét diễn biến ngày càng phức tạp hiện nay [7] Trong lúc chờ đợi vaccin và các thuốc điều trị đặc hiệu, vấn đề phòng bệnh vẫn là biện pháp hàng đầu Cần khuyến khích các bệnh nhân nằm màn, làm sạch môi trường, phun thuốc diệt muỗi

1.3 Tình hình nghiên cứu artcm isnin và dẫn xuất của nỏ.

1.3.1 Vài nét vê cáy Thanh hao hoa vàng.

Cây Thanh hao hoa vàng thuộc chi Artemisia v ề thực vật học, theo J.D ’.Hooker 1882), theo M H.Lecomte (1922) và một số tài liệu khác thì với chi Artemisia, trên thế giới đã biết khoảng 250 loài [ ] 8]

Cây Thanh hao hoa vàng có tên khoa học là A rtem isia annua L., họ Cúc (Asteraceae)

Artem isia annua L là cây thảo, sống hàng năm, mọc hoang thành từng đám ở vùng đồi, ven suối, ven sông, cao từ 1,2 - 1,5 mét, lá xẻ lông chim hai lần, thành phiến dẹt, phủ lông mềm, có mùi thơm Cụm hoa hình cầu thành một chuỳ kép, lá bắc tổng bao hình trứng hoặc bầu dục, hoa mầu vàng nhạt Trong một cụm hoa có sáu hoa, xung quanh là hoa cái, ở giữa là hoa lưỡng tính Hoa nhỏ chỉ dài bằng một màng lọc, mặt vỏ có tuyến dầu [11]

Thanh hao hoa vàng mọc hoang ở Trung Quốc Cây còn mọc hoang lạiChâu Âu, Iran, M ông c ổ , Triều Tiên, Nhật, Ấn Độ, Bắc Mỹ và một số nước Đông Nam á

Năm 1924, Gagnepain [8] đã nói về cây Thanh hao mọc ở Lạng Sơn và Hưng Yên Ó Việt Nam, vùng phân bố của cây Thanh hao chủ yếu ở vùng Đông Bắc Cây mọc tập trung nhiều ở Lạng Sơn, Cao Bằng, còn ở Quảng Ninh, Hà Bắc, Bắc Thái, Hải Hưng, cây Thanh hao mọc thưa thớt, không có khả năng khai thác [18]

7

lượng artcmisinin trong lá cây Thanh hao trồng tại Văn Đicn (rrhanh 'Trì, llà Nội) Ircn các loại vật liệu Irồng, mậl độ trồng và thời điểm thu hái khác nhau

là 0,17% đến 0,99%

+ Công dụng:

Thanh hao hoa vàng được sử dụng từ nhiều thê kỷ ở Trung Quốc làm thuốc thanh nhiệt, bổ vị (dạ dày, cầm máu, chữa trĩ, chữa sốt, đặc biệt được dùng riêng lẻ hoặc phối hợp với tẩy tê tê để chữa sốt rét ) Thế kỷ 14, Tuệ Tĩnh, thế kỷ 18 , Hải Thượng Lãn ông Lê Hữu Trác xác nhận cây Thanh hao

có vị mát, tính lành, chữa được các chứng lao tổn, nóng âm ỉ, đồ mồ hôi trộm, bệnh lỵ, bệnh sốt rét Đồng bào các dân tộc vùng Lạng Sơn dùng lá, cuống hoa làm thuốc chữa sốt cao, giải độc, cảm mạo, rối loạn tiêu hoá Lá lộc của cây non có thể dùng để nấu canh ăn thay rau [10]

1.3.2 Artem isỉnỉn.

+ Tách chiết

Artem isinin được các tác giả Trung Quốc tách chiết lần đầu vào năm

1972 bằng ethyl ether Tuy nhiên, các chi tiết của phương pháp tách chiết này không được công bố

Năm 1984, Daniel L Klayman và cộng sự đã mô tả phương pháp chiết xuất artemisinin từ dược liệu sấy khô

Năm 1994, Guo-Qiang Zheng và cộng sự đã đưa ra phương pháp chiết xuất artemisinin từ cây Thanh hao hoa vàng mọc ở Việt Nam nhằm phục vụ chương trình sản xuất thuốc sốt rét cho quán đội [8,10] Việc chiết xuất artemisinin đã phát triển rất nhanh chóng Trong những năm gần đây (1991 - 1997) chiết xuất artemisinin ở Việt Nam đã tăng từ một vài kilôgam lên vài tấn

+ Xác định cấu trúc /2 6 /

Artemisinin cổ tên khoa học như sau: O ctahydro-3,6,9 - trimelhyl-3, 12

- cpoxy-124 pyrano |4 ,3 ,j| - 1 ,2 - bcn/odioxcpin-10 (3ỈI)-ON

Công thức của artemisinin là C l5II22O v Cônc thức không gian của arlcmisinin đã được nghiên cứu tỉ mỉ bằng phương pháp nhiễu xạ tia X.

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của atem itnin.

Trong công thức bên, vòng A có dạng cyclohexan, vòng D là 5 lacton, vòng B và c đều là dị vòng oxy bão hoà, trong đó vòng c là một vòng trioxan,

có liên quan nhất đến hoạt tính chống sốt rét của artem isinin [25]

+ Tính chất

Artem isinin có dạng tinh thể hình kim không màu, không mùi, điểm nóng chảy 156° - 157° Artemisinin rất ít tan trong nước và trong đầu, tan trong hầu hết các dung môi hữu cơ

A rtem isinin bền trong dung môi trung tính ở nhiệt độ 150°c, hoặc tới

50°c trên điểm chảy (khoảng 200°C) trong gần 2,5 phút [10] Artemisinin không bền trong acid và kiềm, thậm chí ngay cả ở nhiệt độ phòng

Năm 1976, với mục đích làm tăng liệu lực chữa sốt rét của artemisinin, các nhà khoa học Trung Quốc khử artemisinin bằng natri borohydriđ cho dihydroartem isinin, hợp chất này tác dụng mạnh gấp hai lần chất gốc Từ đó đến nay đã có hơn 100 dẫn xuất dược tổng hợp Trong dó atermether, arteether, acid arlenilic và artesunat, là các dẫn xuất ether, ester của dihydroartem isinin đã thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học [26] (hình 1.2)

«>

: Artemether : Arteenther

R = CH

R = CH,CH

R = CH2CH2COO'Na+ : Natri artesunat

Dẫn xuất của artemisinin hứa hẹn nhất là dihydroatem isinin bán ester của acid succinic dạng muối natri hoà tan trong nước, có thể dùng để tiêm tĩnh mạch, có tên là natri artesunat

Ở Việt Nam, từ 1992 - 1996, Phan Đình Châu, Đỗ Hữu Nghị, Phan Lệ Thuỷ đã bán tổng hợp được artesunat [3], artem ether, arteether [13] và acid artenilic [4]

+ Dược động học của artemisinin và dẫn xuất của nó.

Atemisinin và các dẫn xuất của Ĩ1Ó được hấp thu, chuyển hoá thải trừ một cách nhanh chóng sau khi uống, thuốc được hấp thu ở ruột, nồng độ tối đa đạt được trong máu, sau một giờ, thòi gian bán thải là bốn giờ [2] Thuốc gắn với protein huyết tương trên 50%, tiêm bắp nồng độ thuốc trong huyết tương cao và kéo dài, thuốc được phân bố khắp cơ thể nhưng phần lớn được tập trung

ở gan, thận, túi mật Sau khi uống khoảng 80% lượng thuốc được bài tiết qua thận và nước tiểu trong vòng 24 giờ, sodium artesunate được chuyển hoá nhanh thành dihydroartem isinin in vitro Ở chuột cống trắng, sau khi uống thuốc 1 giờ nồng độ thuốc ỏ' trong các mô giảm theo thứ tự: gan > não > huyết tương > phổi > thận > cơ > tim > lách [20] Sau khi tiêm tĩnh mạch [3H] arlemether vào chuột nhắt thuốc được phân bố khắp cơ thể, phần lớn tập trung

ở gan, thận, túi mậl, tổng lượng hoạt độ phóng xạ được bài tiết theo nước tiểu

và phân bố trong 24 giò' là 68%, trong 72 giờ là 95% Điều này chứng lỏ có ihc gan là Mơi ehuycn hoá thuốc mạnh nhất, (hận là nơi chuyển hoá íl hơn

+ Độc tính của artcm isinin và dẫn xuất của nó.

Artem isinin và dẫn xuất của nó là những thuốc ít độc Ị2 0 Ị Các nghicn cứu về độc tính cấp và bán cấp của artemisinin và các dẫn xuất của nó đối với động vật thực nghiệm là tương đối thấp

Độc tính cấp của artemisinin và dẫn xuất của nó (bảng 1.1)

Bảng 1.1 Liều chết 50% (LD50) của artem isinin và dẫn xuất của nó so

với chloroquin Tên thuốc Loài súc vật LDS0 đường uống LDS0 đường tiêm

Độc tính bán cấp Artemether và artem ther liều 12,5mg/kg đến 50mg/kg thể trọng ảnh hưởng rõ đến chức nâng não bộ của chó [23] Mesnick và cs đã nhận thấy khi dùng artemether liều cao trên chuột cống đã gây hoại tử neuron ở các vùng đặc biệt (nhân đỏ và nhân tiền đình) của não 122]

Các nghiên cứu trên chuột cống trắng cho thấy với liều uống 250 - 500mg/kg dùng 14 ngày liên tục, artemisinin và dẫn xuất của nó không ảnh hưởng đến trọng lượng, công thức Iĩiáu, hình ảnh vi thê gan, tim, phối, thận của chuột thí nghiệm Các kếl quả nghiên cứu trên thỏ cho thấy với liổu AS

II

gấp 14 lần liêu dùng ư lâm sàng không làm ihay đổi số lượng hồng cầu, hạch cầu, công thức bạch cáu của thỏ, không ảnh hưởng đến chức năng uan nếu chi dùng từng đọt ngắt quãng Artesunat với liều lOOmg/kg X 28 ngày liên tục trcn thỏ không ảnh hưởng đến tim mạch và thể trọng của thỏ, giảm nhẹ số lượng hồng cầu, tỷ ]ệ hemoglobin, tăng nhẹ bạch cầu ở thỏ, làm thay đổi cấu trúc vi thể gan thận thỏ Nhưng những biến đổi này được phục hồi sau 7-15 ngày ngừng thuốc [5].

Atemisinin và dẫn xuất của nó có thể qua được hàng rào nhau thai và máu não nên ảnh hưởng của artemisinin và dẫn xuât của nó khi dùng cho phụ

nữ mang thai còn có nhiều ý kiến khác nhau Các nghiên cứu về sử dụng artemisinin và dẫn xuất của nó trên phụ nữ có thai còn rất hạn chế, năm 1999 tại Gambia đã tiến hành nghiên cứu điều trị hàng loạt đối với phụ nữ ở lứa tuổi sinh đẻ bằng liều duy nhất AS phối hợp với pirim ethamin - sulíadoxin (PSD), kết quả cho thấy trong 265 trẻ sinh ra ở nhóm bà mẹ uống thuốc trong thời gian mang thai, không có biểu hiện gì bất thường đối với thai hoặc các biểu hiện có hại cho sức khoẻ Nghiên cứu các tác giả trong nước và nước ngoài đều cho thấy artem isinin và dẫn xuất của nó không phải là chất gây đột biến, tuy nhiên một số tác giả Trung Quốc cho rằng artemisinin độc với bào thai chuột nhắt và chuột cống trắng chủng wistar, đặc biệt trong thời kỳ đầu và giữa của bào thai, uống liều 1/400 liều LD50 có một nửa các bào thai bị hấp thu, uống liều 1/25 LDS0 100% bào thai bị hấp thu gây ra một số dị hình như thoát vị rốn

1.4 Tình hình nghiên cứu artem isinin gắn fluor.

Mặc dù tác dụng chống SR của artemisinin có nhiều ưu việt so với các thuốc chống SR kinh điển, nhưng việc sử dụng còn nhiều hạn chế do khả nâng hoà lan kém của nó cả Irong nước lẫn trong dầu và dễ bị kháng thuốc Do đó, các nhà khoa học trên thế giới đã nghiên cứu hán tổng hợp từ nó các dẫn xuất mới dc sàng lọc ra các hợp châì có hoạt lính chống SR mạnh hơn, dễ hoà lan

hơn và ít bị kháng hơn Chủ yếu là lạo ra các nhổm háo nước, háo dầu trong phân tử Dẫn chất bán tống hợp dầu tiên có hiệu lực hon arlcmisinin là dihydroarmisinin (DHA), nó cũng là tiền chất để tạo ra nhiều dãn chấl khác của artemisinin

Các dẫn xuất ether của DHA đều tồn tại dưới 2 dạng đồng phần a và Ị3 với các ancol có mạch carbon thẳng và ngắn thì đồng phần ị3 chiếm ưu thế, các đồng phần này thường tồn tại dưới dạng tinh thể Các đồng phân a thường

là dạng dầu, người ta có thể điều chế chọn lọc ra đồng phân a của các dẫn xuất ether hoá bằng cách sử dụng dẫn xuất halogen thay cho ancol để tác dụng với DHA

Trương Đình Thạc và cộng sự (Viện hoá công nghiệp) và Jean-Pierren Bécgué (Pháp) đã tìm cách gắn fluor vào phân tử artem isinin, để ổn định được dạng hemiacetal của DIIA Các dẫn xuất ether gắn fluor của DMA sẽ chuyến hoá chậm hơn, làm chậm quá trình oxy hoá bởi enzym cytochrome P450 Hơn nữa, việc thay thế các nguyên tử hydrogen bằng những nguyên tử fluor có thểlàm thay đổi khả năng hoà tan của phân tử

Các dẫn xuất ether của artemisinin có chứa fluor được điều chế theo 3 phương pháp sau:

- Cho DHA tác dụng với ancol có chứa fluor, chất xúc tác đặc hiệu BF3Et20

- Cho DHA tác dụng với ancol có chứa íluor, chất xúc tác là CLSi (CH^V

- Áp dụng phản ứng Mitsunobu

Trên nguyên tắc của các phương pháp trên, nhóm BIOCIS - Chatenay đã tổng hợp được 2 dẫn xuất gắn fluor của DHA là:

* 10a - triíluorom ethyl - DMA (ký hiệu BB101)

* l()a - pentaíluoroethyl - DMA (ký hiệu BB103)

Các chất này đã được phân tích cấu trúc và cho công ihức cấu tạo như sau

13

Dihydroartem isinin 10a - trifluorom ethyl-DH A (BB101)

D ihydroartem isinin 10a-pentafluoroethyl-D H A (BB103)

+ Các kết quả nghiên cứu ban đầu

Một trong các dẫn xuất gắn ílour của artemisinin có tác dụng tốt với KSTSR là 10a-trifluorrom ethyl-dihydroartem isinin (BB101) Thuốc đã được thử nghiệm ban đầu tại Viện SR- KST - CT trung ương năm 1999, thấy có tác dụng trên p íalciparum nuôi cấy và p berghei gây nhiễm ở chuột nhắt trắng [2] Nghiên cứu cho thấy thuốc có tác dụng diệt KST nhanh và mạnh hưn artem isinin Nồng độ ức chế 50% KST (IC50) là 4,4 mol/1 với chủng nhạy Cloroqunin và 4,6 mol/1 với chủng kháng Cloroquin, nồng độ này thấp hưn artem isinin 3 lần Thử nghiệm trên chuột nhắt trắng nhiễm p.berghei cho thấy ART-F với liều 50 mg/kg, 100% chuột sạch KST sau 24 giờ, tỷ lệ khỏi bệnh là 100%, chưa thấy tái phát trong vòng 60 ngày đối với cả chủng nhạy và chúng kháng Chloroquin

Một sỏ kết quả nghiên cứu của các tác giả Pháp Ị19].

15

PH Â N 2 THỤC NGHIỆM VẢ KẾT QUẢ 2.1 Đối tượng nguyên vật liệu và phương pháp thục nghiệm.

2.1.1 Địa điểm nghiên cứu.

Phòng thí nghiệm nghiên cứu độc tính, nghiên cứu sinh học thực nghiệm của viện SR-KST-CT trung ương

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu.

Đối tượng nghiên cứu là các động vật thực nghiệm gồm:

- Khỉ (M acaca sp Copithecidea) khoẻ mạnh, số lượng 05 con, có trọng lượng trung bình 3,5 - 5kg/con do Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương cung cấp (có nguồn gốc từ Đảo Rều Quảng Ninh) Được nuôi trong cùng một điều kiện

và chế độ ăn như nhau, ổn định trong 01 tháng trước khi tiến hành thí nghiệm

-ITiỏ trưởng thành (oryctolảgus curiculus L), số lượng 20 con do Trung tâm đê thỏ Ba Vì cung cấp có trọng lượng trung bình 2 ± 0,3kg/con được nuôi trong cùng điều kiện, chế độ ăn uống như nhau

2.1.3 Nguyên liệu, phương tiện kỹ thuật.

- Bột BB101, BB103 dạng tinh khiết do Jean Pierre Begue và Viện khoa học Việt Nam cung cấp

- Tween 80 và DMSO được dùng làm dung môi để hoà tan BB101 và BB103 và dùng cho khỉ chứng

- Cân đồng hồ để xác định trọng lượng thỏ và khỉ

- Cân Sartoriuss có độ chính xác d = 0 ,0 lm g dùng để cân thuốc

- Chất chống đông máu heparin

- Xét nghiệm sinh hoá được đo trên máy photom eter 5010 của hãng Mannhein Boringger (Đức)

2.1.4 Phương pháp nghiên cứu.

* Thiết kế nghiên cứu.

- Thực nghiệm 1: Nghiên cứu độc tính bán cấp trên khí Gồm 5 con chia thành số như sau:

+ Khi số 1: Khỉ chứng tiêm dung môi (DMSO + TWEEN 80 + Nước Cất).+ Khỉ số 2 và Khỉ số 3 tiêm BB101

+ Khỉ số 4 và Khỉ số 5 tiêm BB103

Khỉ ở các lô này dùng để xét nghiệm các chỉ sô huyết học và sinh hoá, vào các ngày trước khi tiêm thuốc (NO), sau tiêm thuốc 15 ngày (N I5), sau tiêm thuốc 30 ngày (N30) Sau 15 ngày ngừng tiêm thuốc (N45)

- Thực nghiệm 2: Nghiên cứu độc tính bán cấp trên thỏ Gồm 20 con được chia ngẫu nhiên thành 2 lô, mỗi lô 10 con

+ Lô uống BB103 liều 50mg/kg X 28 ngày

+ Lô chứng uống gôm arabic 1%

Số thỏ này dùng để xét nghiệm các chỉ số huyết học và sinh hoá, vào ngày trước uống thuốc (NO), sau 14 ngày uống thuốc (N14), sau 28 ngày uống thuốc (N28) và sau 7 ngày ngừng uống thuốc (N35)

+ Các chỉ số về sinh hoá bao gồm: Hàm lượng SGOT (U/l), Hàm lượng SGPT (U/l), Hàm lượng Creatinin (ịimol/1), Hàm lượng protein (g/1), Hàm lượng Bilirubin (ịiunol/1) -" - " x

* Phương pháp tiến hành.

• Phương pháp nghiên cứu độc tính bán cấp trên khỉ.

- Khí 5 con được chia như sau:

+ Khí số 1 tiêm dung môi (DMSO + Tween 80 + nước cất)

+ Khỉ số 2 tiêm BB101 liều 4mg/kg X 30 ngày

+ Khỉ số 3 tiêm BB 101 liều 8mg/kg X 30 ngày

+ Khỉ số 4 tiêm BB103 liều 3,5mg/kg X 30 ngày

+ Khỉ số 5 tiêm BB103 liều 7 mg/kg X 30 ngày

- Tiêm bắp cho khi vào lúc 9 giờ sáng hàng ngày khi khỉ chưa được ănuống gì, tiêm liên tục trong 30 ngày, theo dõi các biểu hiện ăn uống, đại tiểutiện, hình dáng bên ngoài hàng ngày

- Các chỉ số nghiên cứu được đánh giá vào các thời điểm: ngay trước tiêm thuốc (N0), ngày thứ 14 (N14) ngày thứ 30 (N30) và sau 15 ngày ngừng tiêm thuốc (N45)

- Phương pháp xác định các chỉ số về huyết học Sô lượng hồng cầu,

hàm lượng Hb, số lượng bạch cầu, công thức bạch cầu được xác định bằng kỹ thuật thường qui

- Phương pháp xác định các chỉ sô về hoá sinh.

+ H o ạt tín h enzym S G O T (serum glutamat oxaloacetat transam inase)được xác định theo phương pháp của Bermeryer H.Ư theo nguyên lýsau:

GOTa-cetoglutamat + L - aspartat " L- glutamat + oxaloacetat

MDH

MDH: malad dehydrogenase

Đo NADH ở bước sóng 340nm trên máy quang kế 4010 của Đức

+ H o ạt tín h enzym S G P T (serum glulamat pyruvat transam inase) đượcxác định theo phương pháp Bermaryer H.Ư theo nguyên lý sau:

(.IMu-cetoulutamut -+- L - alaniii " l.-ululumut + pyvuvat.

MHI I

p y v u v a t + N A D H + H + I l a c t a t + N A I ) '

Đo NADH ứ bước sóng 340mn tròn máy quarm kế 4010 cúa Đức

- Phưong pháp xác định protein toàn phần trong huyết thanh.

Nsuyên lý: - protein huyết thanh tạo phức màu với muôi đồng trongmôi trường kiềm Đậm độ màu tỷ lệ với nồns độ protein có tronc duníi dịch.Tiến hành do màu ở bước sórm 550 nm trên máy tư đônu LISA của hãn°< _ J <_ CT

Viphaco (Pháp) ở nhiệt độ 37°

r r ' - A t h ử

K ết q u a : P ro te in (g/1) = — - X 60.

Amẫu

- Phương pháp định lượng creatinin trong huyết thanh

Nguyên lv: Xác định hoạt độ của enzym thuỷ phân creatinin theo phản ứng sau:

Creatinase Creatinin + H20 - ► CreatinCreatin + H-,0 Sarc.oim.Qxy d a ^ Sarcorin + UrêSarcorin + 0 2 + H20 Crcatiiia.sc Glyxin + HCHO + iI:0 211,02+ E I I S P T + 4 aminoantipyrin - ► Đỏ quinon

Đậm độ đỏ quinon tỷ lệ với nồníi độ creatinin có trong dung dịch Tiên hành do màu ớ bước sóng 500 nm trên máy tự dộng U S A của hãng Viphaco

(Pháp) ư nhiệt độ 37°c

Athử

K ết q u a : c r e a t i n i n (|Limol/l) = — —- X 176,8

Amẫu

- Phương pháp xác định hàm lưựng b iliru b in huvèt thanh.

Nuuyêiì 1V: Dìm lì duníi dich cafein ben/.oat dể hoà tan bilirubin tự do Bilirubin tạo với thuốc thử cỉia/.o (acid dia/o phcnylsimfonic) thành

azobilirubin màu hồng, có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 530 nm, Đậm độ màu tỷ lệ thuận với nồng độ bilirubin.

A thửKết quả: Nồng đô bilirubin (|imol/l) = — —— x85,5

Amẫu

• Phương pháp nghiên cứu độc tính bán cấp trên thỏ.

- Thỏ được chia ngẫu nhiên thành 2 lô, mỗi lô 10 con:

+ Lô thỏ uống BB103 liều 50mg/kg/ngày X 28 ngày liên tục

+ Lô thỏ chứng uống gôm arabic với liều trên

Các thỏ được uống thuốc hàng ngày vào lúc 9 giờ sáng Theo dõi các biểu hiện ăn uống, đại tiểu tiện, hình dáng bên ngoài hàng ngày

- Các chỉ số huyết học, hoá sinh được tiến hành vào các thời diểm trước uống thuốc ngày NO, ngày thứ 14 (N14), ngày 28 (N28) và sau 7 ngày ngừng thuốc (N35)

Các chỉ số nghiên cứu độc tính bán cấp ở các lô thỏ uống BB103 Cácchỉ số về huyết học, hoá sinh, đánh giá giống như ở khỉ

2.1.5 x ủ lý số liệu.

- Trên khỉ: do số lượng khỉ ở mỗi lô chỉ có một con không dùng được phương pháp thống kê y - sinh học mà dùng phương pháp thống kê miêu tá để nhận xét số liệu trước trong và sau thực nghiệm

- Trên thỏ: các kết quả nghiên cứu được xử lý theo phương pháp thống

kê y- sinh học, dùnơ các mẫu nhỏ (n < 30) trên máy tính theo chương trình Epiĩnfo 6.0 để đánh giá trung bình (X)và dộ lệch chuẩn (SD) theo các nội dung:

+ So sánh ngang sự thay đổi các chỉ số nghiên cứu ở các thời điểm N I4,N28, N45 trong từng lô theo phương pháp tự chứng

+ So sánh dọc giữa các lô ở từng thời điểm nghiên cứu theo phương pháp so sánh giữa các nhóm độc lập

Nếu p > 0,05 là khác biệt không có ý nghĩa thống kê