Góp phần xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho vị thuốc cóc mẳn

Mặt khác, Cóc mẳn còn là một vị thuốc có trong thành phần của phương Nhị trần thang gia giảm Lá hen, một đề tài cấp Bộ đã được nghiệm thu, đánh giá xuất sắc của PGS.TS.. Ở Trung Quốc, n

BỘ Y TẾ

NGUYỄN THỊ HUẾ

CHO VỊ THUỐC CÓC MAN

(C entipeda m inỉm a L A steraceae)

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHÓA 2000-2005

Người hướng dẫn : PGS TS Phạm Xuân Sinh Nơi thực hiện : Bộ môn Dược học cổ truyền

Thời gian thực hiện : 11/2004- 05/2005

£Ờa® cÀM ƠQt

Trong thời gian thực hiện đề tài: “Góp phần xây dựng tiêu chuẩn cơ sở

cho vị thuốc Cóc mẩn” tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của

PGS.TS Phạm Xuân Sinh

Cùng với sự giúp đỡ của các thầy cô bộ môn Dược học cổ truyền, Dược liệu, Thực vật, kĩ thuật viên bộ môn Dược học cổ truyền đã giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quí báu đó

Nhân dịp này cho phép tôi gửi lòi cảm ơn sâu sắc tói Ban giám hiệu nhà trường, Phòng đào tạo, Phòng giáo tài, Phòng quản lí khoa học, cùng toàn thể các thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội đã trang bị kiến thức và tạo điều kiện thuận lọi cho tôi có được kết quả như ngày hôm nay

Hà nội, ngày 20 tháng 5 năm 2005

)

Sinh viên NGUYỄN THỊ HUẾ

MỤC LỤC

Đặt vấn đ ề 1

Phần 1: Tổng q u a n 2

1.1 VỊ trí phân loại 2

1.2 Tên vị thuốc 2

1.3 Đặc điểm thực vật cây Cóc m ẳn 2

1.4 Phân bố 3

1.5 Bộ phận dùng 3

1.6 Thành phần hoá học 3

1.7 Tác dụng dược lí 4

1.7.1 Tác dụng giảm ho trên chuột nhắt trắng 4

1.7.2 Tác dụng long đờm trên chuột nhắt trắng 5

1.7.3 Tác dụng giãn khí quản trên chuột lang cô lập 5

1.7.4 Tác dụng kháng khuẩn 5

1.8 Công nâng chủ trị 6

1.9 Cách dùng, liều dùng ố 1.9.1 Chữa h o 6

1.9.2 Chữa viêm m ũi 6

1.9.3 Chữa mẩn ngứa 6

1.9.4 Chữa chàm, chốc, lở 7

1.9.5 Chữa đau mắt 7

1.9.6 Một số bệnh k h á c 7

Phần 2: Thực nghiệm và kết quả 8

2.1 Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiệm 8

2.1.1 Nguyên vật liệu 8

2.1.2 Phương pháp thực nghiệm 9

2.2 Kết quả thực nghiệm và nhận xét 13

2.2.1 Mô tả thực vật 13

2.2.2 Đặc điểm giải phẫu th ân 14

2.2.3 Đặc điểm bột 14

2.2.4 Nghiên cứu thành phần hoá học 14

2.2.5 Xác định một số chỉ số của dược liệu Cóc m ẳn 24

2.3 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho vị thuốc Cóc m ẳ n 31

2.4 Bàn lu ậ n 37

Phần 3: Kết luận và đề xuất 38

3.1 Kết luận 38

3.2 Đề xuất 39

Tàỉ liệu tham khảo

ĐẶT VẤN ĐỂ

Việt Nam- một nước có khí hậu nhiệt đói, nóng ẩm cộng vói tình trạng ô nhiễm môi trường trầm trọng đã làm gia tăng tỉ lệ mắc bệnh viêm nhiễm: viêm mũi mãn tính, viêm mũi dị ứng, viêm xoang Theo kinh nghiệm dân gian có thể

sử dụng Cóc mẳn để chữa trị

Cóc mẳn là một nguyên liệu sẩn có và có trữ lượng khá nhiều ở Việt Nam với nhu cầu sử dụng ngày càng cao Đã có ghi trong Dược điển Trung Quốc bằng tiếng Anh, tiếng Trung Quốc nhưng chưa có trong danh lục Dược điển Việt Nam

ở các lần xuất bản trước đây Mặt khác, Cóc mẳn còn là một vị thuốc có trong

thành phần của phương Nhị trần thang gia giảm Lá hen, một đề tài cấp Bộ đã được nghiệm thu, đánh giá xuất sắc của PGS.TS Phạm Xuân Sinh Xuất phát từ

thực tế đó, chúng tôi tiến hành khoá luận: “Góp phần xây dựng tiêu chuẩn cơ sở

cho vị thuốc Cóc mẳn” để góp phần xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho phương Nhị

trần thang gia giảm Lá hen, cho Dược điển Việt Nam sau này

Đề tài tiến hành với nội dung sau:

• Về thực v ậ t: Mô tả đặc điểm hình thái thực vật, đặc điểm vi học

• Về hoá học : + Định tính một số thành phần hoá học chính

saponin, coumarin

+ Sắc kí lớp mỏng saponin

+ Định lượng saponin, coumarin trong Cóc mẳn

• Xác định một số chỉ số có ghi trong Dược điển đối vói các vị thuốc thảo mộc

AsteraceaeAsteralesAsteranaeAsteralaeMagnoliopsidaMagnoliophyta1.2 Tên vị thuốc

Cóc mẳn (Centipeda minima L Asteraceae) còn được gọi là Cúc mẳn, cỏ the, Thạch hồ tuy, Nga bất thực thảo, Địa hồ tiêu, cẩu tử thảo [8], Cóc ngồi, Cầy thuốc mộng [7]

1.3 Đặc điểm thực vật cây Cóc mẳn

Cóc mẳn là cây thuộc thảo, mọc hàng năm, cao 5-20cm, có mùi hôi, mọc lan trên mặt đất, phân nhánh nhiều Ngọn có lông mịn, màu trắng nhạt, toàn thân nhẩn

Lá đơn nhỏ, không cuống, mọc so le, đầu tù, phía cuống hẹp lại, mép lá có răng cưa, lá dài từ 10-18mm, rộng 6 -1 0mm, gân chính hoi nổi ở mặt dưới lá, gân

phụ không rõ

Cụm hoa hình đầu màu vàng nhạt, mọc ở ngọn hay ở bên đối diện với một

lá, rất bé Trong đầu có 5 dãy hoa cái ở phía ngoài, ở giữa là hoa lưỡng tính Hoa

cái hình ống, màu trắng, trên có răng cưa Hoa lưỡng tính ít hơn, tràng hình chuông, có 4 răng, hình trứng rộng, màu tím.

Mùa ra hoa vào tháng 2-5

Quả bế có 4 cạnh, có lông mịn

Mùa ra quả vào tháng 4-7 [7], [8]

1.4 Phân bố

Cây mọc hoang ở các vùng đất ẩm (bãi cỏ, ruộng ẩm sau gặt, bờ ao ) trên

nước ta như Hải Dương, Hưng Yên, Thái Bình, Hà Nội, Hà Nam và các nước

có khí hậu nhiệt đới như Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia, Malaysia thường vào tháng 12 năm trước đến tháng 5 năm sau [7]

Ở Trung Quốc, người ta đã xác định trong cây có tinh dầu, acid hữu cơ, acid amin, sterol, flavonoid, saponin triterpenic trong đó stigmasterol và P- sitosterol đã xác định được công thức cấu tạo như sau [25] :

Ấn Độ cũng là nước có Cóc mẳn, khi nghiên cứu về thành phần hoá học người ta đã xác định trong cây có saponin triterpenic [26], trong đó có 4 loại đã xác định được công thức, ngoài ra còn thấy có sitosterol

Ở nước ta, trong các nghiên cứu của các tác giả, sơ bộ thấy trong toàn cây Cóc mẳn có tinh dầu 0,11%; saponin triterpenic 3,1%; coumarin 0,34%

1.7 Tác dụng dược lý

1.7.1 Tác dụng giảm ho trên chuột nhắt trắng

Tác dụng giảm ho thể hiện rõ ờ nhiều dạng chế phẩm khác nhau: dịch ép

cây tươi, dịch sắc trong nước (1:1), dịch chiết trong cồn, dịch saponin toàn phần

(1:1) Kết quả cho thấy Cóc mẳn có tác dụng giảm ho ở các dạng chế phẩm và

liều thử (P<0,01), song dưới dạng nước ép và dịch saponin toàn phần có tác

dụng giảm ho tốt hơn cả so với các dạng chế phẩm còn lại ở liều 0 ,5g/kg thể trọng (chuột) và tác dụng giảm ho của 2 dạng chế phẩm này ở liều 0,25g/kg thể trọng (chuột) và 0,50g/kg thể trọng (chuột) có tác dụng giảm ho tốt hơn cả Codein phosphat ở liều 0,25g/kg thể trọng (chuột) [13]

1.7.2 Tác dụng long đờm trên chuột nhắt trắng

Tác dụng long đờm của Cốc mẳn đã được thử ở nhiều dạng chế phẩm: nước ép cây tươi, nước sắc, dịch chiết cồn, dịch saponin toàn phần (1:1) trong đó

dịch chiết trong cồn và dịch saponin toàn phần ở liều 0,25g/kg thể trọng (chuột)

có tác dụng tốt hơn natribenzoat ở liều l,25g/kg thể trọng [15].

1.7.3 Tác dụng giãn k h í quản trên chuột lang cô lập

Ở điều kiện bình thường, Cóc mẳn có tác dụng giãn khí quản nhẹ và yêu trên khí quản chuột lang cô lập

Trên khí quản bị co thắt bởi acetylcholin thì cao lỏng Cóc mẳn (1:1) có tác dụng giãn khí quản rõ rệt với tỷ lệ giãn bằng 74,5%

Khi khí quản bị giãn bởi adrenalin thì Cóc mẳn vẫn tiếp tục gây giãn nhưng yếu

1.7.4 Tác dụng kháng khuẩn

Cây Cóc mẳn đã được thử tác dụng kháng khuẩn ở nhiều dạng chế phẩm khác nhau: dạng nước ép (1:1), dịch saponin toàn phần, dịch chiết coumarin toàn phần ở các nồng độ khác nhau, trên các chủng khác nhau [15]

Gr{+): Bacillus subtilis 958, Bacillus pulminis ATCC10241, Bacillus ceveus ATCC 9946, Sarcina lutca ATCC 9341, Staphylocccus aureus ATCC 12228

Gr(-): Echrichia coli 1026B6, Proteus mirabilis, Shigella ílexneri 11, Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa 27853 [15]

Kết quả cho thấy dịch chiết coumarin toàn phần có tác dụng trên hầu hết các chủng vi khuẩn, đặc biệt là ức chế sự phát triển của trực khuẩn mủ xanh

Bên cạnh những tác dụng dược lý như đã kể trên, Cóc mẳn còn là cây ít

độc tính, không độc ở liều 125g/kg thể trọng.

1.8 Công năng, chủ trị

Cóc mẳn có vị đắng, tính ấm [7]

Theo kinh nghiệm y học cổ truyền phương Đông, Cóc mẳn có tác dụng nhuận phế, chỉ ho, bình suyễn, điều trung, ích khí, khử phong, trừ thấp, lương huyết, hạ huyết dùng để điều trị viêm khí quản mạn tính, ho suyễn, phong thấp, đau nhức, cao huyết áp [7], [8 ]

1.9 Cách dùng, liều dùng

1.9.1 Chữa ho

Ở nước ta, nhân dân hay sử dụng Cóc mẳn với mục đích chữa ho đặc biệt

là ho ở trẻ em Khi bị ho có thể dùng Cóc mẳn 20g khô hoặc 30g tưoi sắc vói 500ml nước rồi uống Đối vói trẻ ho gà dùng Cóc mẳn phối hợp với Chua me đất mỗi vị 12g đem giã nhỏ rồi chế vói nước chín, vắt lấy nước cho uống [14]

Khi bị cảm sốt, ho khan: dùng Cóc mẳn phối hợp với lá xương sông và râu ngô mỗi vị 40g sắc với 300ml nước đến khi còn 200ml thì chia thành 2 phần uống trong ngày [14]

1.9.2 Chữa viêm mũi

Dùng Cóc mẳn để chữa viêm mũi dị ứng, hay viêm mũi mạn tính bằng cách vò nát Cóc mẳn tưoi và nút vào lỗ mũi Hoặc dùng chữa bị thương bong gân hay bị rắn cắn, giã cây Cóc mẳn rồi xoa đắp [21]

1.9.3 Chữa mẩn ngứa (eczema)

Dùng Cóc mẳn 2 phần, đậu xanh 1 phần, muối vài hạt, giã nhỏ cả 3 thứ rồi đắp lên chỗ bị eczema đã rửa sạch [8]

1.9.6 Một số bệnh khác

Ngoài ra, Cóc mẳn còn có tác dụng lợi tiểu tiện, chữa bệnh giun đũa, bệnh

lị amip, bệnh sốt rét, gãy xương [8]

- Cây tươi dùng để mô tả thực vật, làm tiêu bản.

- Sau khi thu hái, làm sạch, phơi khô tự nhiên rồi sấy để xác định tỉ lệ tạp chất, tỉ lệ vụn nát Sau đó nghiền nhỏ để soi bột, chiết xuất, phân tích hoá học và xác định một số chỉ số như: độ ẩm, độ trương nở, tỉ lệ các chất chiết được trong nước và trong cồn, độ tro toàn phần

b Dung môi và hoá chất.

a.Thu mẫu và bảo quản.

Dược liệu một phần để cây tươi và ngâm trong cồn, một phần được sấy khô bảo quản trong túi polymer, để nơi khô ráo

b Quan sát đặc điểm hình thái.

Dược liệu được quan sát bằng mắt thường về hình dạng, kích thước, màu sắc, thể chất

c Nghiên cứu cấu tạo giải phẫu

Bằng phương pháp soi dưới kính hiển vi với vật kính 10,40,100

• Vi phẫu

- Chọn phần dược liệu đặc trưng

- Tiến hành cắt bằng máy vi phẫu cầm tay

- Xử lý lát cắt theo trình tự

Tẩy sáns

Ngâm các lát cắt trong dung dịch Qoramin 10% khoảng 30 phút Rửa bằng nước cất nhiều lần cho đến khi hết Cloramin

Ngâm trong dung dịch acid acetic 10% trong 5 phút

Rửa lại bằng nước cất

Nhuôm kép

Nhuộm bằng đỏ son phèn và xanh metylen

Tiếp tục ngâm trong đỏ son phèn Rửa bằng nước cất nhiều lần cho đến khi nước rửa không còn màu hồng

Nhuộm màu xanh bằng xanh metylen Rửa lại bằng nước cất cho đến khi nước rửa không còn màu xanh Thòi gian nhuộm tuỳ thuộc vào khả năng bắt màu của từng loại vi phẫu

Loai nước

Vi phẫu phải được loại sạch nước trước khi cố định Các lát cắt được khử nước từ từ với độ cồn tăng dần 10°, 20°, 30°, 80°, 90°, cồn tuyệt, đối Rửa bằng xylen nguyên chất 3 lần

Lên kính

Nhỏ lên phiến kính một giọt bôm/xylen

Đặt vi phẫu vào giữa giọt bôm và đậy lamen

Để tiêu bản ở nơi thoáng mát độ 1-2 tuần.

Tiêu bản khô, được đưa lên kính hiển vi, quan sát đặc điểm giải phẫu

- Lên tiêu bản bằng nước hoặc glycerin.

- Quan sát đặc điểm bột bằng kính hiển vi

- Mô tả các đặc điểm bột như vói vi phẫu

d Nghiên cứu thành phần hoá học

• Định tính saponin, coumarin

- Chiết xuất saponin, coumarin

- Làm các phản ứng thường quy ống nghiệm đối với saponin, coumarin

+ Hệ 3 n-butanol: ethylacetate: nước (4:1:5)

+ Hệ 4 cyclohexan: ethyl acetate (4:6)

+ Hệ 5 cloroform: methanol: nước (65:35:10)

- Thuốc thử phun hiện màu

+ Dung dịch H2S04 20% trong MeOH

+ Dung dịch vanilin 1%/ cồn/ H2S04 đặc

+ SbCl3 20% trong CHCI3

+ SoiUV

• Định lượng saponin, coumarin theo phương pháp cân

e Xác định một số chỉ số theo Dược điển Việt Nam III

• Xác định độ ẩm theo phương pháp sấy.

• Xác định tro toàn phần theo phương pháp cân

• Xác định chỉ số trương nở

• Xác định tỉ lệ tạp chất trong dược liệu bằng mắt thường

• Xác định tỉ lệ vụn nát trong dược liệu bằng rây

• Xác định các chất chiết được bằng nước và ethanol theo phương pháp chiết lạnh

/ Xử lý số liệu theo phương pháp thống kê [1], [13'].

• Loại bỏ giá trị nghi ngờ:

Tiến hành N phép thử song song, giá trị của các phép thử thu được là

Xj (i=l,2, N) Sắp xếp các giá tri này theo thứ tự tăng dần Xị, x 2, XN.

X, là giá tậ nghi ngờ Để xét xem có phải loại bỏ giá tậ này hay không, dùng tiêu chuẩn Q

o - X , - X 2

V m V - V

y v i A n

So sánh giá trị Qtn với Q tới hạn cho trong bảng (phụ lục 1, trang 37, phân

tích I) nếu Qtn>Q thì loại bỏ kết quả nghi n g ờ

• Giá trị trung bình:

Độ lệch chuẩn tương đối:

Khoảng tin cậy:

2.2 Kết quả thực nghiệm và nhận xét

2.2.1 Mô tả thực vật

• Cây tươi (xem hình 2.1)

Đã tiến hành lấy mẫu cây Cóc mẳn ở Hưng Yên và Thái Bình

Cóc mẳn là loại cây thảo, nhỏ mềm, cành phân nhánh nhiều, mọc sát mặt đất Rễ nhiều rễ con, màu vàng nâu Thân mảnh, dễ gãy, màu xanh nhạt, lá nhỏ không có cuống, mọc so le, mép lá có răng cưa (3-5), gân chính nổi rõ ở mặt

dưói lá, gân phụ không rõ, khi vò có mùi hắc khó chịu Cụm hoa hình đầu, màu

vàng nhạt, mọc ở ngọn hay ở bên đối diện với một lá.

• Cây khô (xem hình 2.2)

Toàn cây màu nâu, nhăn nheo, lá giòn dễ gãy Hoa màu vàng nhạt, dễ bị vụn nát

2.2.2 Đặc điểm giải phẫu thân (xem hình 2.3)

Ngoài cùng là lớp biểu bì gồm các tế bào hình chữ nhật xếp đều đặn Tiếp theo là mô mềm vỏ gồm các tế bào hình cầu có màng tế bào mỏng, to nhỏ khác nhau, rải rác trong mô mềm vỏ là các túi tiết tinh dầu Sát với libe là mô cứng, bó libe-gỗ, trong cùng là mô mềm ruột

2.2.3 Đặc điểm bột (xem hình 2.4)

Bột có màu xanh nhạt, có mùi hắc, quan sát dưới kính hiển vi thấy: mảnh biểu bì có chứa lỗ khí (2), mảnh mô mềm có chứa tế bào lớn (1), bó sọi (4), mảnh mạch xoắn & mảnh mạch điểm (6 ), mảnh mô mang ống tiết (3), các dạng hạt phấn (5)

2.2.4 Nghiên cứu thành phần hoá học

a Saponin

• Định tính

Cân khoảng 20g bột thô dược liệu cho vào cốc có mỏ 250mỊ Thêm 100ml cồn 80° Đun cách thuỷ đến sôi được chừng 10 phút Lọc, lấy dịch lọc, rồi tiến hành định tính

- Quan sát hiện tượng tạo bọt

Hình 2.1: Cây Cóc mẳn tươi

Hình 2.2: Cây Cóc mẳn khô

Hình 2.3: Yỉ phẫu thân Cóc mẳn

Hình 2.4: Đặc điểm vi học bột cây Cóc mẳn

Cho vào hai ống nghiệm có kích thước bằng nhau mỗi ống 0,5ml dịch chiết cồn; ống thứ nhất cho thêm 5ml HC1 0,1N; ống thứ hai cho thêm 5ml NaOH 0,1N Lắc cả hai ống nghiệm trong 5 phút, để yên trong 15 phút, thấy bọt

bền vững và chiều cao cột bọt ở hai ống bằng nhau Hiện tượng dương tính vói

saponin triterpenic

- Quan sát hiện tượng phá huyết

Xử lí máu: Lấy máu thỏ cho vào ống nghiệm đã có sẵn Heparin Rồi pha với NaCl 0,9% để có nồng độ 2%

Xử lí dịch chiết: Cô cạn 20ml dịch chiết cồn rồi hoà tan vào lml NaCl 0,9% (dịch A)

Lấy hai ống nghiệm mỗi ống cho lml dung dịch máu đã pha loãng:

ống 1: cho thêm 1 ml dịch A

ống 2: cho thêm 1 mi NaQ 0,9%

Lắc nhẹ trong 1 p hút Sau đó để yên 3 tiếng Quan sát thấy:

ống 1: không có tế bào máu lắng đọng dưới đáy ống nghiệm,

ống 2 : có tế bào máu lắng đọng dưói đáy ống nghiệm

Hiện tượng dương tính với saponin

- Phản ứng màu

Cô cạn phần còn lại dịch chiết cồn đến hết mùi cồn, thêm vào 10ml nước cất, cho vào bình gạn, lắc với ether dầu hoả để loại chlorophyl (làm 3 lần, mỗi lần 5ml ether dầu hoả), gạn lấy lớp nước Gộp dịch chiết nước Đun cách thuỷ đến khi đuổi hết ether dầu hoả Dịch chiết nước đem tiến hành làm phản ứng màu

+ Phản ứng Rosenthaler: Lấy lml dịch chiết nước cho tác dụng với lmlvalinin 1%/cồn, cho thêm một vài giọt H2S04 đặc Xuất hiện màu tím hoa cà.Phản ứng dương tính vói saponin

+ Phản ứng Lỉbermann-Buchardt: Lấy ỉượng dịch chiết nước còn lại thêm lOml H2S04 10%, đun cách thuỷ sôi 30 phút Lấy sapogenin bằng cách lắc với

CHCI3 3 lần (mỗi lần 5ml) Chia đồi ỉượng dịch chiết CHCI3 vào hai ống nghiệm, cô đến cạn 1 ống, hoà tan trong 2ml anhydric acetỉc, thêm 2-3 giọt

H2SO4 đặc xuất hiện màu đỏ tía Phản ứng dương tính vói saponỉn.

+ Phản ứng Saỉkowskỉ: Lượng dịch chiết CHC13 trong ống 2, thêm vài giọt H2S04đặc thấy xuất hiện màu đỏ tía Phản ứng dương tính vóỉ saponin.

- Sắc kí lóp mỏng

Dịch chấm sắc kí: Hoà tan cắn được chiết theo hình 2.6 trong cồn cao độ.

Pha tĩnh: Bản mỏng sỉỉỉcagen G254

Pha động: Hệ n-Butanol: ethyỉacetate : HzO (4:1:5)

Thu được bốn vết (xem hình 2.5)