Điều chế và tiêu chuẩn hóa hai tạp chất liên quan 5 methylthiazol 2 ylamin và n (2z) 3 ethyl 5 methyl 1,3 thiazol 2(3h) yliden 4 hydroxy 2 methyl 2h 1,2 benzothiazin 3 carboxamid 1,1 dioxyd của meloxicam

Điều chế và tiêu chuẩn hóa hai tạp chất liên quan 5 methylthiazol 2 ylamin và n (2z) 3 ethyl 5 methyl 1,3 thiazol 2(3h) yliden 4 hydroxy 2 methyl 2h 1,2 benzothiazin 3 carboxamid 1,1 dioxyd của meloxicam

MỞ ĐẦU

Trong nghiên cứu, sản xuất thuốc thành phẩm, ngoài vấn đề nghiên cứu tác dụng dược lý của các hoạt chất chính, các nhà nghiên cứu còn phải khảo sát các tác dụng dược lý của các tạp chất có thể phát sinh trong nguyên liệu hoặc thành phẩm do nguyên liệu đầu vào còn lẫn tạp hoặc tạp chất phân hủy phát sinh trong quá trình sản xuất và lưu hành Đối với các thuốc ung thư, tim mạch, kháng sinh, đái tháo đường, kháng viêm non-steroid, … hoặc các thuốc có ngưỡng trị tiệu thấp thì với một sự thay đổi nhỏ hàm lượng hoạt chất chính hoặc có tạp chất phát sinh có thể sẽ thay đổi hiệu quả lâm sàng và đặc tính an toàn của thuốc hoặc gây các tác dụng khác nhau với hậu quả không lường trước được Hơn nữa, việc sử dụng thuốc generic (thuốc hết hạn bảo hộ quyền sở hữu) cho bệnh nhân để giảm chi phí điều trị đòi hỏi các cơ quan kiểm nghiệm phải kiểm soát chặt chẽ chất lượng và hiệu quả của thuốc so với thuốc gốc, đặc biệt là hàm lượng hoạt chất và tạp chất phân hủy

Ví dụ: tạp chất trong thuốc trung hòa acid dạ dạy Rolaid gây nôn mửa, tổn thương răng, lợi…được bệnh nhân phản ánh

Hiện nay, vấn đề khảo sát và tổng hợp các tạp chất liên quan trong nguyên liệu và thành phẩm tương ứng chưa được quan tâm nhiều tại Việt Nam Mặt khác, một số tạp chất chuẩn vẫn chưa có hoặc nếu có thường rất đắt tiền và phải mua từ nước ngoài Trong khi đó, một số chuyên luận trong Dược điển Việt Nam IV có qui định kiểm tra tạp chất liên quan trong cả nguyên liệu và thành phẩm tương ứng như meloxicam, metformin, … Do đó, việc nghiên cứu tổng hợp và tiêu chuẩn hóa các tạp chất sẽ góp phần tăng cường công tác kiểm tra chất lượng thuốc, giúp giảm bớt

chi phí mua tạp chuẩn từ nước ngoài Vì vậy, đề tài “Điều chế và tiêu chuẩn hóa hai tạp chất liên quan 5-methylthiazol-2-ylamin và N-[(2Z)-3-ethyl-5-methyl-1,3- thiazol-2(3H)-yliden]-4-hydroxy-2-methyl-2H-1,2-benzothiazin-3-carboxamid-1,1- dioxyd của meloxicam” được thực hiện với mong muốn điều chế và tiêu chuẩn hóa

hai tạp chất liên quan của meloxicam để ứng dụng vào việc kiểm tra nguyên liệu và thành phẩm chứa hoạt chất này

CHƯƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tạp chất liên quan của meloxicam

1.1.1 Qui định tạp chất liên quan theo một số đi

1.1.1.1 Dược điển Việt Nam IV [3]

Quy định 3 tạp chính có thể có trong meloxicam:

1.1.1.2 Dược điển Anh 2010 [8]

Quy định 5 tạp chính có thể có trong meloxicam, đó là các tạp A, B, C, D, E, trong

đó hai tạp A và B giống với quy định của Dược điển Việt Nam IV

- Tạp C: 2H-1,2-benzothiazin-3-carboxamid-1,1-dioxyd

N-[(2Z)-3,5-dimethyl-1,3-thiazol-2(3H)-yliden]-4-hydroxy-2-methyl Tạp D: methyl-2H-1,2-benzothiazin-3-carboxamid-1,1-dioxyd

1.1.2.1 Các nguyên nhân có thể phát sinh tạp

Tạp chất có thể xuất hiện trong quá trình sản xuất, tinh chế, đóng gói sản phẩm hoặc khi sản phẩm đã được lưu hành trên thị trường Tạp chất xuất hiện ở giai đoạn tổng hợp là các nguyên liệu ban đầu còn tồn dư khi cho vào phản ứng Đây là các tạp chất điển hình được lưu ý nhiều nhất khi kiểm tra độ tinh khiết của một hoạt chất, cần phải dựa vào đặc tính lý hóa của các chất và các thiết bị dụng cụ để tách sản phẩm tổng hợp Ngoài ra, các tạp chất có thể có nguồn gốc từ nguyên liệu ban đầu

do nguyên liệu ban đầu chưa được tinh khiết

Trong quá trình tinh chế sản phẩm sau khi tổng hợp cũng không tránh khỏi hiện tượng các hóa chất dùng để tinh chế bị lẫn vào trong sản phẩm, do đó việc chọn lựa phương pháp tinh chế thích hợp để làm sạch sản phẩm cũng là một quá trình phức tạp đòi hỏi nhiều kiến thức và kỹ năng

Sau khi sản phẩm được lưu hành trên thị trường, do tác động của môi trường bên ngoài như sự va đập, nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm… thì các hoạt chất chính của sản

Kiềm

phẩm cũng có thể bị phân hủy dẫn đến phát sinh một số tạp chất, các tạp chất này được gọi là tạp chất phân hủy Hiện nay, với phương pháp lão hóa cấp tốc có thể dự đoán được một số tạp chất phân hủy để từ đó có phương pháp bảo quản thích hợp

1.1.2.2 Quy trình tổng hợp meloxicam

Theo Tibor Mezei và cộng sự [21], sơ đồ tổng hợp meloxicam như sau:

Hình 1.1 Sơ đồ tổng hợp meloxicam của Tibor Mezei và cộng sự

Ngoài ra còn có qui trình tổng hợp của meloxicam theo Gunter Trummlitz và cộng

sự với bằng sáng chế US Patent 4,233,299 [22] và theo Joseph G Lombardino và cộng sự với bằng sáng chế US Patent 3591584 7/17 [19]

1.1.2.3 Nguyên nhân phát sinh tạp chất của meloxicam

Từ hình 1.1 cho thấy tạp chất A và tạp chất B (theo quy định của Dược điển các nước) là thành phần chính trong quá trình tổng hợp meloxicam, vì vậy trong quá trình kết tinh và tinh chế có thể còn lẫn một lượng nhỏ hai thành phần này Đặc biệt, tạp chất B còn có thể xuất hiện do sự thủy phân meloxicam ở nối amid khi điều kiện môi trường thích hợp

Ttạp chất C, D (theo quy định của Dược điển Anh 2010) có thể xuất hiện trong quá trình tổng hợp meloxicam theo cả hai đường (hình 1.1) Các tạp chất này có thể được giải thích là do tác nhân alcol mới sinh phản ứng tạo thành tạp chất khi điều kiện xúc tác thích hợp [24]

1.1.2.4 Độc tính [11][12]

Các tạp chất meloxicam gây độc tính nếu nuốt phải, gây dị ứng khi tiếp xúc, có thể gây chóng mặt, ngủ gà ngủ gật, hôn mê, suy thận cấp, bất thường chức năng gan, suy giảm chức năng hô hấp Các tạp này có hại với các loài sống dưới nước, có thể

là nguyên nhân gây tác hại lâu dài cho môi trường nước và có thể nguy hiểm cho trẻ trong bụng mẹ

1.1.3 Tạ ấ B (5-Methylthiazol-2-ylamin )

1.1.3.1 Công thức, tên khoa học

Công thức phân tử: C4H6N2S

hối lượng phân tử: 114,17 g/mol

Danh pháp I AC: 5-methyl-2-thiazolamin

Danh pháp thông thường: 5-methylthiazol-2-ylamin hay 2-amino-5-methylthiazol

1.1.3.2 nh chất l – hóa

Dạng bột màu kem đến màu nâu, bền ở điều kiện thường, có mùi hôi đặc trưng của nhóm amin Tan trong methanol, cloroform Nhiệt độ nóng chảy: 92-96 °C

1.1.3.3 Giới hạn cho phép

a Trong nguyên liệu meloxicam

Theo chuyên luận meloxicam của Dược điển Việt Nam IV [3], giới hạn cho phép của tổng phần trăm tất cả các tạp (phân tích bằng H LC) không được quá 0,3%, trong đó tạp chất B không được quá 0,1%

Dược điển Anh 2010 [8] và Dược điển Mỹ 2009 [23] cũng quy định tổng phần trăm tất cả các tạp không được quá 0,3%, trong đó tạp chất B không được quá 0,1%, qui định giới hạn cho phép của tạp chất B tương tự như Dược điển Việt Nam IV

b Trong chế phẩm chứa meloxicam

Theo chuyên luận viên n n meloxicam của Dược điển Việt Nam IV [3], giới hạn cho phép của tổng phần trăm tất cả các tạp (phân tích bằng H LC) không được quá , trong đó tạp B không được quá 0,15%

1.1.3.4 Phương pháp tổng hợp tạp chất B

Theo Arthur I.Vogel [6] -amino- -methylthia ol được tổng hợp từ phản ứng đóng vòng của thioure và monocloroaceton ] Trong đó, cloroaceton được tổng hợp bằng phản ứng clor hóa aceton ở nhiệt độ thấp Cloroaceton công nghiệp được cất lại trước khi sử dụng cho phản ứng tổng hợp, nhiệt độ sôi 118-120 °C

Quy trình tổng hợp như sau: phân tán g thioure trong ml nước cất bằng máy khuấy từ, đun hồi lưu và thêm từ từ , g ( ml) monocloroaceton trong khoảng hơn phút Trong quá trình phản ứng thioure tan và sinh nhiệt Đun hồi lưu dung dịch màu vàng trong giờ, sau đó làm lạnh trong nước đá, khuấy đều, thêm g bột natri hydroxyd Chuyển vào bình lắng gạn, thêm một ít nước đá, thu lớp dầu phía trên và chiết lớp nước với ml ether x lần Làm khan lớp dầu và dịch chiết ether bằng magnesi sulphat khan Làm bay hơi ether bằng bếp cách thủy và cất dầu tồn dư dưới áp suất giảm 2-amino-5-methylthia ol thu được ở 130- °C dưới áp suất mmHg, sau đó được làm lạnh trong nước đá để kết tinh thành dạng rắn

Theo bằng sáng chế số PCT/JP99/05895 [25], -amino- -methylthia ol được tổng

hợp từ phản ứng đóng vòng của thioure và -cloropropionaldehyd Trong đó -cloropropionaldehyd được điều chế từ phản ứng clor hóa propionaldehyd bằng

khí clor trong điều kiện thích hợp

Trong một nghiên cứu cải tiến phương pháp tổng hợp -amino- -methylthia ol từ

n-propanol bằng phản ứng oxy hóa và clor hóa với acid hypoclorơ (mới sinh khi

cho khí clor phản ứng với nước), sau đó phản ứng đóng vòng với thioure cho hiệu

suất toàn phần 55% [27]

1.1.3.5 Phương pháp xác định giới hạn tạp chất B theo DĐVN IV [3]

Phương pháp: Sắc ký lỏng

Pha động A: Dung dịch kali dihydro phosphat , , đã được điều chỉnh đến pH

6,0 bằng dung dịch natri hydroxyd 8,5%

Pha động B: Methanol

Dung dịch thử: Pha dung dịch chế phẩm có nồng độ 0,4% trong một hỗn hợp

methanol 40% - dung dịch natri hydroxyd 0,4 M (50 : 3) Pha loãng 2 lần dung dịch

này bằng methanol 40%

Dung dịch đối chiếu (1): Pha loãng 1 thể tích dung dịch thử thành 100 thể tích bằng

methanol 40% Pha loãng 1 thể tích dung dịch này thành 10 thể tích bằng methanol

40%

Dung dịch đối chiếu (2): Pha dung dịch tạp chất chuẩn của meloxicam có nồng độ

0,4% trong một hỗn hợp methanol 40% - dung dịch natri hydroxyd 0,4 M (50 : 3)

Pha loãng 2 lần dung dịch này bằng methanol 40%

Điều kiện sắc ký: Cột pha đảo C18 (150 x 4,6 mm; 5 µm), cột Inertsil ODS-2 là phù hợp Đầu dò quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 260 nm và 350 nm Thể tích tiêm:

10 µl

Tiến hành sắc ký theo chương trình ở bảng 1.1

Bảng 1.1 Chương trình dung môi kiểm tạp chất B của meloxicam theo Dược điển

Việt Nam IV

Thời gian (phút)

đồ giống với sắc ký đồ đối chiếu được cung cấp cùng với tạp chất B của meloxicam chuẩn

Giới hạn tạp B: Trên sắc ký đồ của dung dịch thử ở bước sóng 260 nm, diện tích pic

của pic tương ứng với pic của tạp chất B không được lớn hơn diện tích của pic thu được trên sắc đồ của dung dịch đối chiếu (1) ở bước sóng 350 nm (0,1%)

1.1.3.6 Phương pháp xác định giới hạn tạp chất B theo Dược điển Anh 2010 Phương pháp: Sắc ký lỏng

Pha động A: Dung dịch kali dihydrophosphat g/l đã được điều chỉnh đến pH 6,0

bằng dung dịch natri hydroxyd 1 M

Pha động B: Methanol

Dung dịch thử: hòa tan 40 mg chất cần kiểm tra vào hỗn hợp 5 ml methanol và 0,3

ml natri hydroxyd 1 M, pha loãng thành 20 ml với methanol

Dung dịch đối chiếu (a): Pha loãng 2 ml dung dịch thử thành 100 ml với methanol

Pha loãng 5 ml dung dịch này thành 100 ml với methanol

Dung dịch đối chiếu (b): Hòa tan 2 mg chất cần kiểm tra và 2 mg tạp B vào hỗn hợp

5 ml methanol và 0,3 ml natri hydroxyd 1 M, pha loãng thành 25 ml với methanol

Điều kiện sắc ký: Cột pha đảo C18 (150 x 4,6 mm; 5 µm) Nhiệt độ cột 45 °C Tốc

độ dòng 1,0 ml/phút Đầu dò quang phổ đặt ở bước sóng 260 nm và 350 nm Thể tích tiêm mẫu: 10 µl

Tiến hành sắc ký các dung dịch theo chương trình ở bảng 1.2

Bảng 1.2 Chương trình dung môi kiểm tạp chất B của meloxicam theo Dược điển

Anh 2010

Trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (b), thời gian lưu tương đối của pic tạp B so với pic meloxicam (thời gian lưu khoảng 7 phút) là khoảng 0,5 Ở bước sóng

260 nm, hệ số phân giải giữa pic meloxicam và pic tạp B không được nhỏ hơn ,

Giới hạn tạp B: Trên sắc ký đồ của dung dịch thử ở bước sóng 260 nm, diện tích pic

của tạp chất B không được lớn hơn diện tích của pic thu được trên sắc đồ của dung dịch đối chiếu (a) ở bước sóng 350 nm (0,1%)

1.1.3.7 Phương pháp xác định giới hạn tạp chất B theo Dược điển Mỹ [23]

Phương pháp: Sắc ký lỏng

Pha động : Dung dịch kali dihydrophosphat , , đã được điều chỉnh đến

pH 6,0 bằng dung dịch natri hydroxyd 1 N

Pha động : Methanol

Dung dịch phù hợp hệ thống: Cân 4 mg meloxicam chuẩn và 4 mg tạp B chuẩn, cho

vào bình định mức 50 ml, hòa tan bằng 5 ml methanol và 0,3 ml dung dịch natri hydroxyd 1 N, thêm methanol đến vạch, lắc đều

Dung dịch chuẩn: Cân chính xác mg meloxicam, cho vào bình định mức 20 ml,

hòa tan bằng 5 ml methanol và 0,3 ml dung dịch natri hydroxyd 1 N, thêm methanol đến vạch, lắc đều Pha loãng 2 ml dung dịch này thành 100 ml với methanol

Dung dịch thử: Cân chính xác mg meloxicam, cho vào bình định mức 20 ml,

hòa tan bằng 5 ml methanol và 0,3 ml dung dịch natri hydroxyd 1 N, thêm methanol đến vạch, lắc đều

Thời gian (phút)

ha động A (%)

ha động B (%)

Điều kiện sắc ký: Cột pha đảo C18 (150 x 4,6 mm; m) Nhiệt độ cột °C, tốc độ dòng ml/phút Đầu dò quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 260 nm và 350 nm Thể tích tiêm: 5 µl

Tiến hành sắc ký theo chương trình ở bảng 1.3

Bảng 1.3 Chương trình dung môi kiểm tạp chất B của meloxicam theo Dược điển

Mỹ 2009

Thời gian

(phút)

ha động A (%)

ha động B (%)

Tiến hành sắc ký các dung dịch chuẩn và dung dịch thử

Phần trăm tạp chất B được tính theo công thức:

C% = 100(CS/CT)(1/F)(rU/rS)

Trong đó: CS: nồng độ meloxicam (mg/ml) trong dung dịch chuẩn; CT: nồng độ meloxicam (mg/ml) trong dung dịch thử; F: hệ số đáp ứng tương đối (Đối với tạp B, F=1); rU: diện tích pic tạp chất B trong dung dịch thử ở bước sóng thích hợp (Đối với tạp B: 260 nm); rS: diện tích pic của meloxicam trong dung dịch thử ở bước sóng 350 nm

Giới hạn cho phép (%, kl/kl) của tạp B là 0,1%

1.1.3.8 Phương pháp xác định giới hạn tạp chất B bằng phương pháp quang phổ

Tạp chất B còn được định lượng bằng cách tạo phức màu với oxa-1,3-diazol (NBD-Cl) và đo ở bước sóng nm hương pháp tiến hành như sau: [10]

7-cloro-4-nitrobenz-2 Pha dung dịch đệm borat pH 8: hòa tan 0,620 g acid boric và 0,750 g kali clorid vào ml nước, pH được điều chỉnh đến pH 8 bằng natri hydroxid 0,1 M và thêm nước vừa đủ 200 ml

- Cân chính xác 10 mg meloxicam, cho vào bình định mức 100 ml, thêm 20 ml natri hydroxid M và thêm nước vừa đủ ml, đun sôi trong phút Để nguội, điều chỉnh đến pH 9 bằng acid hydrocloric 2 M Lấy một lượng dung dịch tương đương g meloxicam, thêm ml đệm borat pH , sau đó thêm , ml dung dịch NBD-Cl (0,4% kl/tt), lắc đều, đun nóng đến 100 0C trong 30 phút Để nguội, cho vào bình định mức 10 ml, acid hóa bằng 0,1 ml acid hydroclorid 0,1 M và thêm methanol vừa đủ, lắc đều Tiến hành đo phổ hấp thụ của mẫu trắng và mẫu thử trong khoảng 350 – 700 nm

1.1.4 Tạp chất D

1.1.4.1 Công thức, tên khoa học

Công thức phân tử: C16H17N3O4S2

hối lượng phân tử: 379,45 g/mol

Danh pháp I AC:

1.1.4.3 Giới hạn cho phép

a Trong nguyên liệu chứa meloxicam

Theo chuyên luận meloxicam của Dược điển Anh 2010 [8], giới hạn cho phép của tổng phần trăm tất cả các tạp (phân tích bằng H LC) không được quá , trong đó tạp chất D không được quá 0,1%

b Trong chế phẩm chứa meloxicam

Theo chuyên luận viên n n meloxicam của Dược điển Anh [8], giới hạn cho phép của tổng phần trăm tất cả các tạp (phân tích bằng HPLC) không được quá 0,5% trong đó tạp chất D không được quá 0,2%

1.1.4.4 Phương pháp tổng hợp tạp chất D

Cho đến nay chưa tìm thấy bài báo hay công trình nghiên cứu cụ thể nào được công

bố về tổng hợp tạp chất D theo Dược điển Anh 2010

1.1.4.5 Phương pháp định lượng/xác định giới hạn tạp chất D

Dược điển Anh [8] ghi rõ phương pháp định lượng tạp chất D trong chuyên luận meloxicam bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Điều kiện sắc ký tương tự như phương pháp định lượng tạp chất B ở mục 1.1.3.6

1.2 Các phương pháp xác định độ tinh khiết

1.2.1 Nhiệ độ nóng chảy

Muốn đánh giá độ tinh khiết của một chất, tiến hành xác định các hằng số vật lý của chất đó rồi so sánh với tài liệu Đối với chất rắn thường tiến hành xác định nhiệt độ nóng chảy

Để xác định khoảng chảy và điểm chảy, tùy theo tính chất lý học của từng chất , có thể áp dụng một trong các phương pháp 1, 2 hay 3 theo phụ lục , Dược điển Việt Nam IV [3]

Các chất tinh khiết bao giờ cũng có một nhiệt độ nóng chảy xác định hoảng nhiệt

độ từ khi trạng thái rắn bắt đầu tan chảy đến khi tan chảy hoàn toàn thường chênh lệch khoảng °C Nếu có lẫn tạp chất nhiệt độ nóng chảy sẽ thấp hơn và khoảng cách nhiệt độ nóng chảy sẽ rộng hơn so với một chất tinh khiết [18]

1.2.2

Đây là một phương pháp đơn giản, nhanh và rẻ tiền

Một dung dịch mẫu thử được chấm trên một lớp mỏng chất hấp phụ (thường là silicagel, nhôm oxyd) tráng trên nền phẳng (kính, kim loại, chất dẻo) đóng vai trò là một pha t nh

Một dung môi khai triển (pha động) di chuyển dọc theo bản mỏng sẽ làm di chuyển các cấu tử của mẫu thử theo một vận tốc khác nhau tạo thành một sắc đồ gồm nhiều vết có f khác nhau

Có loại bản mỏng: bản mỏng phân tích và bản mỏng chế hóa Bản mỏng phân tích

có thể ứng dụng để kiểm tra độ tinh khiết của một hợp chất bằng cách: Chấm tương đối đậm mẫu thử trên ít nhất bản mỏng khác nhau, khai triển với ít nhất hệ dung môi khác nhau Nếu cả sắc đồ đều cho một vết gọn trong vùng f , - , thì

có thể sơ bộ kết luận rằng mẫu thử là một chất tinh khiết Việc khẳng định sự tinh khiết của mẫu thử sẽ được kiểm tra tiếp bằng phương pháp H LC [7]

1.2.3 iệu

hi tiến hành phân tích mẫu bằng phương pháp H LC, trong các điều kiện sắc ký khác nhau, nếu một chất chỉ cho một pic đối xứng riêng biệt, không bị chồng phủ bởi các pic kế cận thì khả năng đó là một chất tinh khiết Nhờ độ phân giải và độ tin cậy cao cùng với các bộ phận phát hiện cung cấp các thông tin cấu trúc, H LC là một công cụ rất hữu ích trong việc xác định độ tinh khiết của các hợp chất khác nhau [4]

1.2.4 iệ i uả

hương pháp điện di mao quản dùng để tách các tiểu phân đã ion hóa, hòa tan hay phân tán trong dung dịch điện giải dưới tác dụng của điện trường Độ nhạy không bằng so với HPLC nhưng độ phân giải cao do số đ a lý thuyết lớn nên diện tích pic hẹp, vì vậy các chất tách được hoàn toàn và tinh khiết Tuy nhiên, kết quả không ổn định, độ lặp lại không cao do phụ thuộc vào sự thay đổi pH và dòng điện thẩm

1.2.5 ộ ạ

Cộng hưởng từ hạt nhân là phương pháp khá phổ biến và sự biện giải toàn bộ phổ được nhiều chuyên gia mong đợi Đây là phương pháp không làm phá vỡ cấu trúc, nếu kết hợp với các thiết bị hiện đại có thể thu được dữ liệu tốt từ mẫu có khối

lượng nhỏ hơn một miligam hương pháp này có thể cho biết được các nhóm chức,

sự liên kết nguyên tử, sự tương tác nội và ngoại phân tử cũng như cấu hình và cấu dạng tương đối Khi có sự hiện diện tạp chất sẽ thay đổi số lượng proton và độ dịch

chuyển hóa học khi so sánh với phổ chuẩn

1.3 Chất đối chiếu

1.3.1 ị ĩ

Chất đối chiếu là chất đồng nhất đã được xác định là đúng để dùng trong các phép thử đã được quy định về hoá học, vật lý và sinh học Trong các phép thử đó các tính chất của chất đối chiếu được so sánh với các tính chất của chất cần thử Chất đối chiếu phải có độ tinh khiết phù hợp với mục đích sử dụng [3]

1.3.2 Phân loại chất đối chiếu [9]

Chuẩn sơ cấp hay chuẩn gốc là chuẩn được thừa nhận không cần phải so sánh với chất khác

Chuẩn thứ cấp được thiết lập dựa trên chuẩn sơ cấp, gồm có chuẩn chính thức vùng hay quốc gia

Chuẩn làm việc, được thiết lập dựa trên chuẩn chính thức

1.3.3 Thiết lập chấ đối chiếu

- Chọn hóa chất làm đối tượng, có thể áp dụng kỹ thuật tinh chế để đạt độ tinh khiết cần thiết theo bảng 1.4

Bảng 1.4 Yêu cầu về độ tinh khiết chất đối chiếu theo quy trình phân tích [26]

Định lượng

Thử tinh khiết

Định lượng hoạt chất chính > 99,5%

Thử giới hạn tạp chất > 98%

hi định lượng Định tính và thử tính phù hợp hệ thống Tùy trường hợp

- Định danh bằng các phương pháp phổ học ( V-Vis, I , MS, MN ) hay sắc

ký (sắc ký lớp mỏng, HPLC, GC)

- ác định độ tinh khiết của chất cần làm chất đối chiếu:

Các phương pháp trực tiếp: sắc ký, quang phổ, phân tích nhiệt, xác định tạp chất vô

cơ, các chất d bay hơi (nước, dung môi tồn dư)

Các phương pháp gián tiếp: năng suất quay cực, phân tích nguyên tố, chuẩn độ các nhóm chức

- Đánh giá tạp chất liên quan bằng nhiều phương pháp khác nhau

- Định lượng bằng một phương pháp đã được thẩm định, thực hiện ở các phòng thí nghiệm khác nhau

- Đánh giá kết quả, ấn định hàm lượng dựa trên kết quả liên phòng

1.3.4 ó ói, bảo quản và sử dụng

Để đáp ứng mục đích sử dụng, chất đối chiếu phải được bảo quản, theo d i và sử dụng đúng Theo quy định thông thường, chất đối chiếu phải được đựng trong bao

bì gốc, kín, có nhãn r ràng Điều kiện bảo quản tốt nhất là chất đối chiếu được đóng trong lọ thủy tinh nâu để tránh tác động ánh sáng, quá trình đóng được thực hiện trong buồng nitơ hoặc chân không và bảo quản ở 5 0C, nếu cần có điều kiện bảo quản đặc biệt khác thì có hướng dẫn trên nhãn

1.3.5 ộ ổ định và chu kỳ đ i ại

Điều quan trọng của chất đối chiếu là độ ổn định, do đó phải theo dõi bằng cách kiểm tra đánh giá lại thường kỳ các chất đối chiếu và thay thế chúng khi có những thay đổi quan trọng Chọn lựa phương pháp phân tích thích hợp để theo d i độ ổn định của chất đối chiếu tùy thuộc vào bản chất của chúng Quy trình chung để kiểm tra sản phẩm phân hủy, độ ẩm …

- Sắc ký lớp mỏng để tìm tạp chất liên quan

- ác định nước bằng chuẩn độ Karl-Fisher hay giảm khối lượng do sấy khô

- Sắc ký lỏng hiệu năng cao để định lượng và xác định giới hạn tạp chất

Tần suất đánh giá lại tùy thuộc vào các thông số như hàm lượng nước, mẫu thử dùng thử nghiệm, điều kiện bảo quản Nói chung sự chuẩn hóa lại các chất đối chiếu được đề nghị là hai năm, riêng đối với chất đối chiếu có độ nhạy cảm cao có thể là 6 tháng hoặc 12 tháng

1.3.6 Hạn dùng của chấ đối chiếu

Chất đối chiếu không chỉ định hạn dùng, phần lớn được thay thế bằng lô sản xuất mới khi có những biến đổi thuộc tính riêng quan trọng được ghi nhận sau khi được

đánh giá lại theo chu kỳ quy định

CHƯƠNG 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu – Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 ối i u

Tạp chất B: 5-methylthiazol-2-ylamin

Tạp chất D (theo Dược điển Anh 2010) 2(3H)-yliden]-4-hydroxy-2-methyl-2H-1,2-benzothiazin-3-carboxamid-1,1-dioxyd

N-[(2Z)-3-ethyl-5-methyl-1,3-thiazol-2.1.2 Chất chuẩn - ó ấ - Dung môi

Meloxicam chuẩn do Viện kiểm nghiệm thuốc TP.HCM cung cấp:

- Số kiểm soát: QT 089060911

- Hàm lượng: 99,35% tính trên chế phẩm nguyên trạng

- Điều kiện bảo quản: 5 °C trong tủ lạnh

Nguyên liệu meloxicam dùng để tổng hợp tạp đạt chuẩn EP 6.3

- Hãng sản xuất: Công ty dược phẩm Zhejiang Excel (Domesco phân phối)

Dung môi dùng cho sắc ký lỏng (Merck): methanol, isopropanol

Dung môi dùng cho phân tích: methanol, dicloromethan, n-hexan, aceton, cloroform, dimethylformamid

2.1.3 iế bị

Bản mỏng silica gel 60 F254, Merck (Đức)

Bể siêu âm Elma T DH (Đức)

Cân phân tích điện tử KERN ABS 220- (Đức)

Tủ sấy ULM-500 Memmert (Đức)

Cột sắc ký Gemini C18 (250 x 4,6 mm ; 5 µm), Phenomenex (Mỹ)

Cột sắc ký Gemini - NX C18 (150 x 4,6 mm ; 5 µm), Phenomenex (Mỹ)

Máy cô quay RE300DB, Stuart (Thụy S )

Máy chuẩn độ điện thế inoLab pH (Đức)

Máy đo điểm chảy Stuart SMP10 (Anh)

Máy đo phổ hồng ngoại Shimadzu FTIR-8201PC (Nhật)

Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Waters , đầu dò PDA 2996 (Mỹ), được nối với máy tính xử lý kết quả bằng phần mềm Empower-2

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 iều chế tạp chất liên quan của meloxicam

2.2.1.1 Tinh chế tạp chất B của meloxicam

hương pháp tinh chế dự định tiến hành: phương pháp kết tinh lại trong dung môi thích hợp

Sơ bộ kiểm tra độ tinh khiết bằng nhiệt độ nóng chảy và sắc ký lớp mỏng

Pha dung dịch tạp chất B trong methanol, chấm trên bản mỏng và khai triển với các

hệ dung môi khác nhau

Tạp chất B được coi là tinh khiết về sắc ký khi trên các bản mỏng khai triển với các

hệ dung môi khác nhau thu được sắc ký đồ không có vết lạ nào

Tiến hành

Hòa tan meloxicam vào lượng vừa đủ DMF khan trong bình cầu, thêm từng giọt hỗn dịch natri hydrid (60% trong dầu khoáng) trong DMF khan vào dung dịch meloxicam đã được làm lạnh đến 5 0C, khuấy khoảng 5 phút Thêm ethyl bromid vào hỗn hợp trên và khuấy ở nhiệt độ phòng Theo dõi phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng cho đến khi xuất hiện vết mới Để yên cho đến khi xuất hiện tủa Lọc lấy tủa, rửa tủa vài lần bằng DMF, sau đó rửa lại với nước và methanol, sấy khô

b Tinh chế

Dựa vào độ tan của meloxicam và sản phẩm tổng hợp trong DMF, cho một lượng lớn DMF vào sản phẩm tổng hợp, siêu âm 5 phút, lọc lấy tủa, rửa tủa vài lần bằng

DMF, sau đó rửa lại với nước và methanol, sấy khô Loại meloxicam thừa bằng phương pháp sắc ký cột Lượng silicagel nạp vào cột gấp 25 – 50 lần so với lượng mẫu cần tinh chế; mẫu được thêm một lượng tối thiểu dung môi pha động và trộn đều với silica gel theo tỉ lệ 1/10 Cô bay hơi dung môi, sấy khô, sau đó nạp lên cột

đã được ổn định với pha động Rửa giải hứng lấy phân đoạn sản phẩm, cô thu hồi dung môi, rửa lại với DMF, nước và methanol lần nữa, sấy khô

Chuẩn bị mẫu thử: Cân chính xác 10 mg tạp chất B (hoặc D), thêm 4 ml dung dịch

natri hydroxyd M và ml methanol, siêu âm phút, để nguội, thêm methanol

vừa đủ 100 ml, lắc đều Lọc qua màng lọc 0,45 µm

Mẫu trắng: Chuẩn bị giống như mẫu thử nhưng không có tạp chất B (hoặc D)

Chọn điều kiện sắc ký thích hợp dựa vào:

- Pic tạp chất B (hoặc D): hệ số đối xứng AS nằm trong khoảng 0,8 – 1,5, tách hoàn toàn các pic khác trên sắc ký đồ (kể cả meloxiccam), đạt độ tinh khiết pic ≥ 99%, thời gian lưu không quá dài để giảm thời gian phân tích, tiết kiệm dung môi

Bảng 2.1 Các điều kiện sắc ký khảo sát tạp chất B và D

Bước sóng phát hiện Dựa vào phổ UV tại thời gian lưu của tạp B hoặc D

ha động

- Dung môi pha động MeOH – nước MeOH – nước

MeOH – isopropanol MeOH – nước thêm triethylamin

- Tỉ lệ dung môi pha

Thể tích tiêm mẫu 10 μl và 20 μl với nồng độ mẫu 100 µg/ml

Thêm base hữu cơ

vào pha động Triethylamin 1 mM; 0,8 mM

Cột pha đảo Gemini C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm)

Theo quy định của DĐVN IV 3], yêu cầu về tính phù hợp của hệ thống cho các chuyên luận không có trong Dược điển Việt Nam là: độ lệch chuẩn tối đa được phép cho các lần tiêm lặp lại là 2% Ngoài ra, hệ thống phải đạt các yêu cầu sau:

- Hệ số đối xứng của pic chính phải trong khoảng 0,8- , ( , ≤ AS ≤ , )

- Độ phân giải giữa pic chính và pic phụ phải lớn hơn , ( S > 1,5)

 Tính đặc hiệu

Phải phân biệt được chất phân tích với các chất khác

Tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện 3 mẫu: mẫu trắng, mẫu pha động và mẫu thử Yêu cầu:

- Sắc ký đồ mẫu pha động, mẫu trắng: nếu xuất hiện pic thì các pic đó phải không được xuất hiện tại vị trí tương ứng của pic tạp chất B (hoặc D) trong sắc ký

đồ mẫu thử, và các pic này phải có phổ hấp thụ UV giống với các pic có thời gian lưu tương ứng trong sắc ký đồ mẫu thử

- Sắc ký đồ mẫu thử phải không xuất hiện pic tạp trùng với pic tạp chất B (hoặc D), pic tạp chất B (hoặc D) phải tinh khiết

Vẽ đường biểu di n của diện tích pic trung bình theo nồng độ phân tích

ác định các hệ số B0 (độ dốc), B (tung độ gốc), R2 (bình phương của hệ số tương quan) của phương trình hồi quy (ŷ B0x + B) Thường chấp nhận sự tuyến tính khi , ≤ 2 ≤

Sử dụng “phân tích hồi quy” để kiểm tra tính thích hợp của phương trình hồi quy và

ý ngh a của các hệ số trong phương trình hồi quy

 Độ chính xác

Độ chính xác của phương pháp thể hiện ở độ lặp lại và độ chính xác trung gian

- Độ lặp lại

Thực hiện bằng cách chuẩn bị 6 mẫu thử của chất cần xác định độ tinh khiết ở nồng

độ thích hợp trong miền giá trị đã khảo sát Mỗi mẫu tiến hành sắc ký 2 lần

- Độ chính xác liên ngày

Tiến hành như độ lặp lại và làm trong 3 ngày khác nhau với cùng điều kiện làm việc

và người thực hiện

2.2.2.3 Kết quả kiểm tra độ tinh khiết các tạp chất

a Tại phòng thí nghiệm Hóa phân tích – iểm Nghiệm (Khoa Dược - Đại học

Y Dược T HCM)

Tiến hành sắc ký 3 mẫu thử tại nồng độ đã khảo sát, mỗi mẫu tiêm 2 lần, tính độ tinh khiết trung bình của mẫu thử

b Tại Viện kiểm nghiệm thuốc TP.HCM

Tiến hành theo quy trình kiểm tra độ tinh khiết các tạp chất đã xây dựng

2.2.3 i u uẩ ó ạ ấ

2.2.3.1 Tính chất

Dựa vào cảm quan xác định hình dạng, màu, mùi của chất

ác định độ tan: bằng cách cho lượng dung môi vào 1 g chất thử để ở nhiệt độ 25 ±

2 ºC trong 30 phút, cứ cách 5 phút lại lắc giây, đánh giá theo Dược điển Việt Nam IV [3]

2.2.3.2 Định tính

 Nhiệt độ nóng chảy [3]

Tiến hành giống mục 2.2.1.1

 Phổ hồng ngoại:

Tiến hành đo phổ hồng ngoại bằng kỹ thuật dập viên KBr

- Chuẩn bị mẫu: nghiền 1-2 mg chất thử với 300-400 mg bột mịn kali bromid

đã sấy khô Luợng này đủ để tạo một viên n n có đường kính 13 mm và cho phổ có cường độ phù hợp Nghiền hỗn hợp cẩn thận và rải đều lên một khuôn thích hợp Nén khuôn có hỗn hợp chất thử tới áp suất khoảng 800 M a trong điều kiện chân không

- Tiến hành đo, xác định số sóng của các nhóm chức đặc trưng trong công thức cấu tạo của chất thử

 Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Tiến hành sắc ký 3 mẫu thử theo điều kiện đã chọn Trên sắc ký đồ, dựa vào thời gian lưu để xác định pic tạp chất B (hoặc D)

2.2.3.2 Độ tinh khiết

ác định độ tinh khiết của mẫu thử bằng quy trình đã xây dựng ở mục 2.2.2

2.2.4 i đồng nhất lọ u đó ói

Tiến hành đánh giá dựa trên hướng dẫn của ISO Guide 35 [17]

Phòng thí nghiệm đánh giá: chọn phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn GLP hoặc ISO

để tiến hành đánh giá đồng nhất lô

Thực hiện tại khoa Thiết lập chất chuẩn – chất đối chiếu và khoa Vật lý đo lường, Viện kiểm nghiệm thuốc thành phố Hồ Chí Minh

Lấy mẫu: sử dụng cách lấy ngẫu nhiên theo phần mềm Excel, số lọ (g) được lấy để

kiểm tra: g N 1 lọ, trong đó N là số lọ đóng được

Xác định hàm lượng: áp dụng quy trình xác định độ tinh khiết để tiến hành xác định

hàm lượng, mỗi lọ được kiểm tra 2 lần, thống kê kết quả thu được

Loại giá trị bất thường bằng trắc nghiệm Dixon [20]: xếp các giá trị định lượng trong đánh giá đồng nhất lọ theo thứ tự từ nhỏ đến lớn Tính Gmin và Gmax của hai giá trị nhỏ nhất và lớn nhất Các giá trị được coi là bình thường khi Gmin và Gmax đều nhỏ hơn G0,05

Đánh giá đồng nhất giữa các lọ: đánh giá theo ISO Guide [17] Các lọ được coi

là đồng nhất khi r bb

u n

S



Sr: độ lệch chuẩn lăp lại

n: số lần lặp lại của kết quả đo

ubb: độ không đảm bảo đo từ độ đồng nhất giữa các lọ

Thực tế khó đạt được yêu cầu trên nên có thể áp dụng công thức chuyển đổi sau để tính ubb

u 

MSwithin: trung bình bình phương trong từng nhóm

vMSwithin: bậc tự do của trung bình bình phương trong từng nhóm

Các lọ được xem là đồng nhất khi thỏa mãn bất đẳng thức:

n

S S u n

MS

bb bb within among

2 2





Sbb: độ lệch chuẩn của độ đồng nhất giữa các lọ

MSamong: trung bình bình phương giữa các nhóm

2.2.5 Ấ định giá trị công bố chất chuẩn

Tiến hành dựa theo hướng dẫn của ISO 13528 [16]

Thành phẩm sau khi đóng gói và đánh giá đồng nhất lô đạt yêu cầu được lấy mẫu ngẫu nhiên và tiến hành định lượng tại hai phòng thí nghiệm độc lập

Lựa chọn phòng thí nghiệm: thực hiện tại ít nhất 2 phòng thí nghiệm, các phòng thí

nghiệm đạt tiêu chuẩn GLP hoặc ISO , trong đó có ít nhất một phòng thí nghiệm có đủ thẩm quyền và có ý ngh a pháp lý đối với Việt Nam Mỗi phòng thí nghiệm sẽ nhận được 6 lọ mẫu ngẫu nhiên kèm theo quy trình phân tích và các tài liệu liên quan khác

Trước khi phân tích, mỗi phòng thí nghiệm sẽ đánh giá lại tính phù hợp của hệ thống Nếu đạt yêu cầu, tiến hành định lượng trên 6 mẫu đã nhận, mỗi mẫu nên được kiểm tra 2 lần để tránh sai số

Hai phòng thí nghiệm tham gia đánh giá các tạp chất liên quan của meloxicam thuộc khoa:

- Thiết lập chất chuẩn và chất đối chiếu, Viện kiểm nghiệm thuốc thành phố

Hồ Chí Minh

- Vật lý đo lường, Viện kiểm nghiệm thuốc thành phố Hồ Chí Minh

Xác định giá trị công bố trên phiếu kiểm nghiệm (CoA) [16]

Tiến hành xác định giá trị công bố trên phiếu kiểm nghiệm

*) (

p

x

x

i i

với p : tổng các giá trị có kết quả z-score < 2,0

Giá trị ấn định x* (n) được chọn khi giá trị s* không thay đổi sau n lần tính (lấy 3 số

lẻ phía sau dấu phẩy), sử dụng giá trị ấn định x*(n) để đánh giá từng kết quả phân tích theo test-z, loại bỏ các kết quả phân tích có |z| > 2,0 Chọn các giá trị | | ≤ , ; tính giá trị trung bình

Xác định độ không đảm bảo đo: U x 1,25s*/ p

Lập hồ sơ chất chuẩn, dán nhãn lọ chuẩn và kèm theo phiếu kiểm nghiệm (theo ISO Guide 31) Bảo quản ở nhiệt độ 2 - 8 0C, tránh ánh sáng

Chuẩn bị mẫu chuẩn: giới hạn cho phép của tạp B và D trong nguyên liệu

meloxicam theo Dược điển Anh 2010 đều là 0,1% Do tạp chất C và tạp chất D theo Dược điển Anh 2010 [8] có công thức tương tự nhau, được quy định giới hạn cho phép trong nguyên liệu lần lượt là , và , Do đó, mẫu chuẩn được chuẩn bị với tỉ lệ nồng độ meloxicam : tạp chất B : tạp chất D là 1000 : 1 : 0,5

Chuẩn bị mẫu thử: thủy phân nguyên liệu meloxicam trong dung dịch natri

hydroxyd 1 M và sau đó điều chỉnh bằng cách thêm chuẩn meloxicam và tạp chất D

để được dung dịch thử có tỉ lệ nồng độ của meloxicam : tạp chất B : tạp chất D tương ứng như trong dung dịch chuẩn

2.2.6.2 Xây dựng qui tr nh định lượng các tạp chất liên quan trong ngu ên liệu

và chế phẩm meloxicam ằng P C

Từ điều kiện sắc ký xác định độ tinh khiết của tạp chất B và D (mục 2.2.2), tiếp tục khảo sát điều kiện sắc ký để tách đồng thời meloxicam, tạp chất B, tạp chất D và các tạp khác (nếu có) Tiến hành sắc ký mẫu chuẩn và mẫu thử với điều kiện sắc ký gradient dự kiến ở bảng 2.2 sau:

Bảng 2.2 Chương trình dung môi định lượng tạp chất B và D

Pha động A: Dung dịch triethylamin 0,8 mM

ha động A (%)

ha động B (%)

Tiến hành sắc ký mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu trắng (chuẩn bị giống như mẫu chuẩn

nhưng không có các tạp chất B, D), mẫu pha động, mẫu thử thêm chuẩn

Yêu cầu:

- Sắc ký đồ mẫu pha động, mẫu trắng: phải không có pic nào xuất hiện tại thời gian lưu tương ứng của pic tạp chất B và D trong mẫu chuẩn

- Sắc ký đồ mẫu thử, mẫu thử thêm chuẩn: không xuất hiện pic lạ trùng với pic

tạp chất B và D; pic tạp chất B, D phải tinh khiết và tách hoàn toàn với pic

meloxicam và các pic tạp khác (nếu có), diện tích pic của tạp chất B và D phải tăng

lên trong mẫu thử thêm chuẩn

- Phổ UV tại thời gian lưu của pic tạp chất B, D trong sắc ký đồ mẫu chuẩn,

mẫu thử, mẫu thử thêm chuẩn phải giống nhau

 Tính tuyến tính

Khảo sát khoảng tuyến tính từ 80-120% của nồng độ đo Tiến hành pha 5 dung dịch

(ứng với 5 nồng độ 80%, 90%, 100%, 110%, 120%), thực hiện tiêm 3 lần cho mỗi

mẫu ác định diện tích pic trung bình của mỗi mẫu Vẽ đồ thị biểu di n và thiết lập

phương trình hồi quy của diện tích pic theo nồng độ

Đánh giá t nh tu ến tính: sử dụng “phân tích hồi quy” để kiểm tra tính thích hợp

của phương trình hồi quy và ý ngh a của các hệ số trong phương trình hồi quy

 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

- Giới hạn phát hiện:

hương pháp tiến hành: pha loãng nồng độ chất phân tích đến mức tín hiệu nhỏ nhất

còn phát hiện được

Đo tín hiệu thu được từ mẫu trắng và mẫu chuẩn có nồng độ đã biết (được xác định

trong phần khảo sát điều kiện sắc ký) Tín hiệu thu được từ mẫu trắng là N, từ mẫu

chuẩn là S Thiết lập tỉ số S/N Pha loãng dần mẫu chuẩn tới một nồng độ tối thiểu

nào đó còn phát hiện được bằng quy trình phân tích đề xuất Với S/N = 3/1 là chấp

nhận được Nồng độ mẫu chuẩn tại điểm đó chính là LOD

- Giới hạn định lượng:

hương pháp tiến hành: pha loãng nồng độ chất phân tích đến mức tín hiệu vẫn đáp ứng độ đúng và độ chính xác

Phân tích mẫu trắng và mẫu chuẩn có nồng độ đã biết Tín hiệu thu được từ mẫu trắng là N, từ mẫu chuẩn là S Thiết lập tỉ số S/N Với S/N = 10/1 là chấp nhận được Nồng độ mẫu chuẩn tại điểm đó chính là LOQ

 Độ chính xác

- Độ lặp lại: tiến hành sắc ký 6 mẫu thử, mỗi mẫu tiêm 1 lần

- Độ chính xác liên ngày: tiến hành như độ lặp lại và làm trong 3 ngày khác nhau với cùng điều kiện làm việc và người thực hiện

Độ chính xác thể hiện bởi giá trị độ lệch chuẩn tương đối của hàm lượng tạp chất B

và D trong mẫu thử, RSD tối đa cho ph p đối với nồng độ phân tích ≤ g/ml là 7,3% [14]

Tính tỷ lệ phục hồi lượng chất chuẩn thêm vào

Yêu cầu: hương pháp định lượng đạt độ đúng khi tỷ lệ phục hồi nằm trong giới hạn cho phép Với nồng độ chất phân tích ≤ g/ml, tỷ lệ phục hồi được chấp nhận trong khoảng 80 – 110% [14]

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 iều chế tạp chất liên quan của meloxicam

3.1.1 Tinh chế tạp chất B

 hương pháp: kết tinh lại trong methanol

Tiến hành: Hòa tan 4,0 gam 5-methylthiazol-2-ylamin trong một lượng tối thiểu methanol nóng Lọc nóng qua giấy lọc Để nguội cho kết tinh Lọc dưới áp suất giảm thu tủa Sấy trong tủ sấy 50 °C trong 6 giờ, thu được 3 gam sản phẩm tinh chế

 Sơ bộ kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm tinh chế bằng nhiệt độ nóng chảy

và sắc ký lớp mỏng:

- Nhiệt độ nóng chảy:

Bảng 3.1: Kết quả xác định nhiệt độ nóng chảy của tạp chất B

Lần đo Nhiệt độ bắt đầu tan chảy

- Sắc ký lớp mỏng:

Dung dịch thử: dung dịch tạp B 0,01 g/ml methanol

Bản mỏng silica gel 60 F254, Merck, kích thước 10 x 1,5 cm

Thể tích chấm mẫu: 10 µl

Dung môi khai triển:

(1) Dicloromethan – methanol (20:1)

(2) n-hexan – aceton (2:1)

Phát hiện: soi dưới đèn V nm

Theo kết quả trong hình 3.1, khi tiến hành sắc ký với 2 hệ dung môi khai triển khác nhau đều chỉ cho một vết duy nhất, không có vết lạ, sơ bộ cho thấy mẫu tạp chất B tinh khiết

Quy trình tổng hợp tạp chất D được tiến hành như sau:

Hòa tan 10 g meloxicam vào 50 ml DMF khan trong bình cầu 250 ml, thêm từ từ từng giọt hỗn dịch natri hydrid (1,5 g) trong DMF khan (10ml) vào dung dịch meloxicam đã được làm lạnh đến 5 0C, khuấy 30 phút Thêm 40 ml ethyl bromid vào hỗn hợp trên và khuấy ở nhiệt độ phòng khoảng 4 giờ Để yên cho tủa màu vàng lắng xuống, lọc lấy tủa, rửa tủa 3 lần bằng DMF, sau đó tiếp tục rửa tủa với nước 3 lần, methanol 3 lần (mỗi lần khoảng 50 ml), sấy khô thu được 7 g sản phẩm

3.1.2.2 Tinh chế

Tiến hành: cho sản phẩm tổng hợp vào 100 ml DFM, siêu âm 5 phút, đun nóng ở nhiệt độ 60 0C, lọc nóng lấy tủa, rửa tủa 3 lần bằng DMF, sau đó rửa lại với nước và methanol, sấy khô thu được 5 g sản phẩm Tiếp tục tinh chế sản phẩm sau khi sấy khô bằng sắc ký cột [5]

Chuẩn bị cột sắc ký: cột thủy tinh, đường kính 3 cm, dài 1 m

ha động: dicloromethan : H2O (20 : 1)

ha t nh: silica gel kích thước 230 - 400 µm

Chuẩn bị mẫu: 2 g mẫu được hòa tan vào ml pha động, thêm 20 g silica gel và trộn đều với mẫu, sau đó cô bay hơi dung môi, sấy khô

Mẫu được nạp lên cột đã được ổn định với pha động, thấm ướt mẫu bằng một lượng dung môi tối thiểu Rửa giải và hứng lấy từng phân đoạn sản phẩm, mỗi phân đoạn

15 ml và được kiểm tra bằng phương pháp H LC với hệ dung môi methanol : H2O (60 : 40) Cô thu hồi dung môi, rửa lại với DMF, nước và methanol, sấy khô, thu được 800 mg sản phẩm

3.1.2.3 Thử tinh khiết

- ác định nhiệt độ nóng chảy

Bảng 3.2 Kết quả xác định nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm tổng hợp

Lần đo Nhiệt độ bắt đầu tan chảy

Phát hiện: soi dưới đèn V nm

Theo kết quả trong hình 3.2, khi tiến hành sắc ký với 3 hệ dung môi khai triển khác nhau đều chỉ cho một vết duy nhất, không có vết lạ, sơ bộ cho thấy sản phẩm tổng hợp tinh khiết

Hình 3.2 Kết quả sắc ký lớp mỏng của sản phẩm tổng hợp

Hệ dung môi khai triển: (1) tricloromethan – methanol (40:1)

(2) dicloromethan – methanol (30:1) (3) n-hexan – aceton (4:5)

1000.0 1250.0

1500.0 1750.0

2000.0 2500.0

3000.0 3500.0

1/cm 4000.0

Bảng 3.3 Kết quả biện giải phổ IR của sản phẩm tổng hợp

có sự xuất hiện hai số sóng của nhóm chức -SO2-

 Phổ MS

Phổ MS [M+Na]+ và [M+H]+ của sản phẩm tổng hợp cho các mảnh có số khối (m/z) 402,13 và 380,12 phù hợp với số khối của tạp chất C (DĐVN IV) hoặc tạp chất D (BP 2010) ứng với công thức C16H17N3O4S2 (M= 379,45)

Hình 3.4 Phổ MS của sản phẩm tổng hợp

13,549 -CH3 (ethyl-Nthiazol)

Hình 3.5b Phổ 13C NMR của sản phẩm tổng hợp

Nhận xét: hình 3.5a, 3.5b và bảng 3.4a, 3.4b của phổ NMR cho thấy số lượng và vị

trí của proton, carbon phù hợp với công thức tạp chất C (DĐVN IV) hoặc tạp chất

D (Dược điển Anh 2010) ứng với công thức C16H17N3O4S2

 Phổ NOESY

Hình 3.5c Phổ NOESY của sản phẩm tổng hợp

Phổ NOE (7,48 ppm): 4,2; 2,32 ppm (hình 3.5c) cho thấy proton H- ’ có tương tác với proton H (CH3-C- ’) và H (-CH2-N-thiazol) chứng tỏ nhóm -CH2- của ethyl gắn trên N-thiazol

Như vậy, dựa trên phổ IR, MS và NMR có thể khẳng định sản phẩm tổng hợp chính

là tạp chất D (Dược điển Anh 2010)

9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5

3.1.2.5 Hiệu suất phản ứng

Hiệu suất thô (chưa qua cột sắc ký): 50%, thu được 5 g sản phẩm tổng hợp

Hiệu suất tinh chế tinh khiết: 40%, thu được 800 mg sản phẩm tinh khiết

Hiệu suất quy trình: 20%, thu được 2 g sản phảm tinh khiết

3.2 y ng quy t nh xác định độ tinh khiết các tạp chất ằng HPLC