phân lập và tuyển chọn vi khuẩn phân giải keratin từ chất thải lõ giết mổ heo tại huyện vũng liêm tỉnh vĩnh long

Đề tài “ Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn phân giải keratin từ chất thải lò giết mổ heo tại huyện Vũng Liêm, tỉnh Vĩnh Long” được tiến hành với mục tiêu phân lập được một số dòng vi khuẩn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN

PHÂN GIẢI KERATIN TỪ CHẤT THẢI

LÕ GIẾT MỔ HEO TẠI HUYỆN VŨNG LIÊM

TỈNH VĨNH LONG

MSSV: 3102826 LỚP: CNSH K36

Cần Thơ, Tháng 11/2013

PHẦN KÝ DUYỆT

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SNH VIÊN THỰC HIỆN

(ký tên) (ký tên)

Bùi Thị Minh Diệu Nguyễn Thùy Linh

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

………

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

(ký tên)

LỜI CẢM TẠ

Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:

− Ban Giám Hiệu trường Đại Học Cần Thơ, Ban Giám Đốc Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và rèn luyện trong bốn năm qua

− Ban Giám Đốc Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện đề tài

− Cô Bùi Thị Minh Diệu và tập thể lớp Công nghệ sinh học khóa 36 đã đồng hành cùng tôi trong suốt quảng đường đại học Cảm ơn cô đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài tốt nghiệp

Cảm ơn tất cả các anh chị, các bạn trong phòng thí nghiệm Sinh học phân tử thực vật đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong thời gian thực hiện luận văn

Nguyễn Thùy Linh

TÓM TẮT

Keratin là một protein khó phân hủy trong tự nhiên nhưng lại chứa những acid amin quan trọng có thể sử dụng làm nguyên liệu cho sản xuất thức ăn gia súc, phân hữu cơ, gas sinh học Phân hủy keratin bằng phương pháp vật lý hay hóa học dễ làm phá hủy những acid amin này, cần tốn nhiều năng lượng và tạo ra những chất gây ô nhiễm môi trường Trong những năm gần đây, phân giải keratin bằng biện pháp sinh

học rất được các nhà nghiên cứu quan tâm và chú trọng Đề tài “ Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn phân giải keratin từ chất thải lò giết mổ heo tại huyện Vũng Liêm, tỉnh Vĩnh Long” được tiến hành với mục tiêu phân lập được một số dòng vi khuẩn có

khả năng phân giải keratin và tuyển chọn các dòng vi khuẩn có khả năng phân giải keratin mạnh Kết quả đã phân lập được 20 dòng vi khuẩn trong đó có 7 dòng được phân lập từ mẫu đất, 9 dòng từ mẫu lông và 4 dòng từ mẫu nước Qua khảo sát ghi nhận hai dòng K13 và K5 có hoạt độ enzyme keratinase cao nhất Tiến hành khảo sát khả năng phân giải keratin trên cơ chất bột lông heo và bột lông gia cầm của 20 dòng

vi khuẩn, sau 7 ngày ủ lắc đã chọn được hai dòng có tỉ lệ phân giải bột lông heo cao tương đương nhau là K13 và K18, 4 dòng có tỉ lệ phân giải bột lông gia cầm cao nhất

và không khác biệt ý nghĩa là dòng K11, K13, K18 và K20 Từ kết quả các thí nghiệm cũng cho thấy rằng vi khuẩn phân giải keratin từ lông gia cầm tốt hơn nguồn keratin lông heo và khả năng phân giải keratin của vi khuẩn không hoàn toàn phụ thuộc vào hoạt tính enzyme keratinase của chúng

Từ khóa: keratin, phân lập, bột lông heo, hoạt độ keratinase

MỤC LỤC

PHẦN KÝ DUYỆT

LỜI CẢM TẠ

TÓM TẮT i

MỤC LỤC ii

DANH SÁCH BẢNG iv

DANH SÁCH HÌNH v

TỪ VIẾT TẮT vi

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 2

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Sơ lược về keratin và chất thải chứa keratin 3

2.2 Sơ lược về vi khuẩn phân giải keratin 5

2.3 Sơ lược về enzyme keratinase 6

2.4 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về vi khuẩn phân giải keratin 7

2.4.1 Một số nghiên cứu trong nước 7

2.4.2 Một số nghiên cứu ngoài nước 7

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 9

3.1 Phương tiện nghiên cứu 9

3.1.1 Địa điểm nghiên cứu: 9

3.1.2 Thời gian nghiên cứu: 9

3.1.3 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 9

3.1.4 Vật liệu thí nghiệm 9

3.1.5 Hóa chất 10

3.2 Phương pháp nghiên cứu 11

3.2.1 Phương pháp thu mẫu 11

3.2.3 Thí nghiệm 2: Khảo sát và tuyển chọn vi khuẩn phân giải keratin mạnh 12

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17

4.1 Phân lập các dòng vi khuẩn phân giải keratin 17

4.1.1 Nguồn mẫu phân lập vi khuẩn 17

4.1.2 Hình thái khuẩn lạc 17

4.2 Đánh giá hoạt độ enzyme keratinase các dòng vi khuẩn phân lập được 19

4.3 Khảo sát và tuyển chọn vi khuẩn phân giải keratin mạnh 20

4.3.1 Khả năng phân giải cơ chất chứa keratin của các dòng vi khuẩn phân lập được 20

4.3.2 Hình dạng tế bào và đặc tính Gram những dòng vi khuẩn tuyển chọn 25

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 27

5.1 Kết luận 27

5.2 Kiến nghị 27

TÀI LIỆU THAM KHẢO 28

PHỤ LỤC

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1 Đặc điểm hình thái các dòng vi khuẩn phân lập được 18

Bảng 2 Hoạt tính keratinase của các dòng vi khuẩn 19

Bảng 3 Tỷ lệ phân giải bột lông heo của các dòng vi khuẩn 21

Bảng 4 Tỷ lệ phân giải bột lông gia cầm của các dòng vi khuẩn 23

Bảng 5 Đặc điểm khuẩn lạc, hình dạng tế bào và đặc tính Gram những dòng vi khuẩn tuyển chọn 26

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1 α – keratin và β – keratin 3

Hình 2 Lông heo sau khi cắt nhuyễn 8

Hình 3 Quy trình xác định mật số vi khuẩn bằng phương pháp đếm sống 13

Hình 4 Ảnh khuẩn lạc một số dòng vi khuẩn phân lập được 17

Hình 5 Tỷ lệ phân giải keratin từ hai nguồn cơ chất khác nhau và hoạt độ keratinase của các dòng vi khuẩn 24

Hình 6 Ảnh các khuẩn lạc tuyển chọn 26

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Ngành chăn nuôi trên thế giới đang trên đà phát triển, đáp ứng nhu cầu tăng cao

về thực phẩm đồng thời mang lại lợi nhuận cho nhiều quốc gia đặc biệt là những nước

có nền nông nghiệp lâu đời như Việt Nam Theo Bộ Nông nghiệp & Phát triển nông thôn, tổng sản lượng thịt cung cấp ra thị trường của nước ta 6 tháng đầu năm 2013 đạt 2,62 triệu tấn(*)

Cùng với sự gia tăng đàn vật nuôi thì tình trạng ô nhiễm môi trường

do chất thải chăn nuôi cũng đang ở chiều hướng báo động, đáng chú ý là lông gia súc, gia cầm với thành phần keratin khó phân hủy đang góp phần gây nên ô nhiễm đất, ô nhiễm nguồn nước,… khi chúng được thải trực tiếp ra môi trường mà không qua xử lý Vĩnh Long là một trong những tỉnh thành ở Đồng bằng sông Cửu Long có nhiều cơ sở giết mổ gia súc gia cầm nhất, trong đó huyện Vũng Liêm là huyện có đàn gia súc lớn nhất Những cơ sở giết mổ gia súc gia cầm tại đây hầu hết không có biện pháp xử lý các chất thải giết mổ nên thải trực tiếp xuống sông, gây ô nhiểm nghiêm trọng

Sự phân giải các chất thải có chứa keratin có ý nghĩa thiết thực trong ngành công

- nông nghiệp như chế biến thức ăn thủy sản, gia súc gia cầm và sản xuất phân bón (Nguyễn Huy Hoàng et al., 2010) Việc xử lý chất thải keratin bằng các phương pháp chôn và đốt gây ô nhiễm nước, đất và không khí Trong keratin lại chứa những acid amin quan trọng có thể sử dụng làm thức ăn cho gia súc Bên cạnh đó, keratin còn được dùng như một nguyên liệu cho sản xuất phân hữu cơ, gas sinh học Do đó, tìm ra một phương pháp hiệu quả để xử lý chất thải keratin là một vấn đề có ý nghĩa quan trọng trong ngành chăn nuôi, vừa có thể xử lý hiệu quả chất thải lông gia súc, gia cầm

và vừa có thể tạo ra những sản phẩm có giá trị kinh tế Phân hủy keratin bằng phương pháp vật lý hay hóa học dễ làm phá hủy những acid amin, cần sử dụng rất nhiều năng lượng và tạo ra những chất gây ô nhiễm cho môi trường (Matikevičienė et al., 2009) Trong những năm gần đây, biện pháp xử lý lông gia súc, gia cầm bằng phương pháp sinh học rất được quan tâm và chú trọng

Việc ứng dụng biện pháp sinh học sử dụng các vi khuẩn có khả năng phân giải keratin đạt được được hai ưu thế quan trọng là không gây hại với môi trường và nâng cao giá trị dinh dưỡng của sản phẩm protein Chính vì vậy, việc phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn có khả năng phân giải keratin từ chất thải tại các cơ sở giết mổ

heo không những bổ sung được các dòng vi khuẩn có hoạt tính keratinase cao để đưa vào ứng dụng mà còn giải quyết được bài toán về việc xử lý nguồn chất thải lông gia súc, gia cầm theo chiều hướng vừa không gây ô nhiễm môi trường vừa đạt hiệu quả cao

(*) Thông tin số liệu từ

http://www.agroviet.gov.vn/Lists/appsp01_statistic/Attachments/69/Baocao_6_2013.pdf

1.2 Mục tiêu đề tài

Phân lập và tuyển chọn được ít nhất hai dòng vi khuẩn có khả năng phân giải keratin mạnh từ chất thải tại một số cơ sở giết mổ heo ở huyện Vũng Liêm, tỉnh Vĩnh Long

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về keratin và chất thải chứa keratin

Keratin thuộc họ protein cấu trúc dạng sợi, là thành phần chủ yếu cấu tạo nên biểu bì, tóc, móng, lông, sừng,… Cấu trúc cơ bản bậc hai của keratin phân thành hai

2004) Dựa vào hàm lượng lưu huỳnh, keratin được phân loại thành keratin cứng và mềm Keratin cứng ở lông, tóc, móng guốc và móng với hàm lượng cầu nối disulfide cao, bền và không thể kéo dài Keratin mềm ở da hay mô sẹo có hàm lượng cầu nối disulfide thấp và mềm dẻo hơn (Voet and Voet, 1995) Sự liên kết chéo chặt chẽ nhờ các cầu nối disulfide, các liên kết hidro và tương tác kỵ nước tạo nên cấu trúc keratin bền vững, kháng lại sự phân giải bởi các enzyme thủy phân protein thông thường như trysin, pepsin, papain… Tuy nhiên, một số loại vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm vẫn có thể phân giải keratin hiệu quả nhờ hoạt tính enzyme keratinase (Onifade et al., 1998)

Hình 1 α – keratin và β – keratin

(Nguồn: http://thuviensinhhoc.com/chuyen-de-sinh-hoc/sinh-hoc-te-bao/1653-phan-loai protein,

ngày 15/07/2013)

Lông chứa khoảng 90% protein, trong đó thành phần chính là keratin Keratin là thành phần cấu tạo chủ yếu trong lông, tóc, móng tay, móng vuốt, da,… (Onifade et al., 1998) Đối với gia súc như heo thì lông chiếm từ 0,5-0,8% trọng lượng cơ thể Đối với gà trưởng thành thì lông chiếm 5-7% trọng lượng (Lê Thị Thu Huyền, 2012) Tuy nhiên, lông rất khó bị phân giải nên không được xem là nguồn cung cấp protein chủ yếu

Lông gia súc có cấu tạo chủ yếu từ protein keratin dạng α – helix, cấu trúc này bền vững, tương tự cấu trúc β – sheets của keratin có trong lông gia cầm cũng hết sức chặt chẽ và khó phân giải Trong tự nhiên, thời gian thật sự để keratin (từ lông gà) tự phân là 5 – 7 năm (Lê Thị Thu Huyền, 2012)

Các chất thải giàu keratin khó phân hủy và ngày càng gia tăng tích lũy trong tự nhiên chủ yếu ở dạng lông gia súc, gia cầm, tóc, móng, sừng góp phần gây ra vấn đề

ô nhiễm môi trường (Gupta and Ramnani, 2006) Tuy nhiên, sự phân giải các chất thải chứa keratin vẫn mang lại những lợi ích thiết thực trong ngành công - nông nghiệp như chế biến thức ăn thủy sản, gia súc, gia cầm và sản xuất phân bón Ở Việt Nam, chỉ một phần rất nhỏ trong số các vật liệu chứa keratin như lông, tóc, móng, được sử dụng chủ yếu trong sản xuất một số sản phẩm thủ công, may mặc, phần lớn còn lại chỉ được loại bỏ và xử lý đơn giản như đốt, chôn hoặc chỉ là chất thành các đống rác lớn chưa

có biện pháp xử lý gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng

Ước tính hàng năm, trên thế giới thải ra hàng triệu tấn chất thải chứa keratin từ ngành chăn nuôi gia cầm, thuộc da, công nghiệp chế biến thịt và tỷ lệ này tăng khoảng 4,5% mỗi năm (C.A.S.T., 1995 và Freeman et al., 2009) Các phế phẩm của gia súc và gia cầm sau khi bị giết mổ đều thải ra môi trường gây ô nhiễm nghiêm trọng như lông heo, lông bò, sừng bò, móng trâu, móng bò, lông gà, lông vịt,… Việc xử lý các chất này thành thức ăn gia súc bằng các phương pháp hóa, lý tốn khá nhiều năng lượng (nhiệt độ và áp suất cao); đồng thời, làm mất đi các acid amin thiết yếu (Onifade et al., 1998), quá trình phân giải sinh học các chất thải chứa keratin đã được đề xuất như một giải pháp hiệu quả, ít tốn kém (Ignatova et al., 1999 và Xie et al., 2010)

2.2 Sơ lƣợc về vi khuẩn phân giải keratin

Các dòng vi khuẩn có khả năng phân giải keratin chủ yếu thuộc chi Bacillus và

Streptomyces Trong số các chủng Bacillus sp., B licheniformis và B subtilis được mô

tả là có khả năng thủy phân keratin tốt (Balaji et al., 2008; Cai et al., 2008; Manczinger et al., 2003; Suh and Lee, 2001; Zhang et al., 2009), gen kerA của

Bacillus licheniformis đã được nhân dòng và giải mã trình tự (Lin et al.,1995) Các

chủng B pumilus và B cereus cũng có khả năng tổng hợp keratinase (Ghosh et al.,

2008; Kim et al., 2001; Kumar et al., 2008; Werlang và Brandelli, 2005)

Những dòng vi khuẩn chịu nhiệt hứa hẹn khả năng thủy phân các protein không tan trong nước như keratin, vì những protein này dễ phân hủy hơn ở nhiệt độ cao

(Suzuki et al., 2006) Một số dòng Streptomyces chịu nhiệt phân lập từ đất có thể phát

triển và phân giải keratin ở nhiệt độ trên 50oC (Chitte et al., 1999; Mohamedin, 1999),

ngoài ra còn có các vi khuẩn chịu nhiệt có hoạt tính keratinase như Fervidobacterium

pennavorans (Friedrich and Antranikian, 1996), Thermoanaerobacter keratinophilus

(Riessen and Antranikian, 2001), Fervidobacterium islandicum (Nam et al., 2002) Một số dòng vi khuẩn ưa ấm như Streptomyces pactum DSM 40530 (Böckle et al., 1995) và Streptomyces albidoflavus K1-02 (Bressolier et al., 1999) cũng được mô tả

cho thấy khả năng phân giải keratin Khả năng thủy phân keratin ở các vi khuẩn

Streptomyces có thể liên quan đến việc các dòng vi khuẩn này tổng hợp được các

protease phổ rộng như pronase, đã được sản xuất thương mại từ vi khuẩn Streptomyces

griseus (Jurasek et al., 1974) Bên cạnh đó, Streptomyces pactum có thể làm giảm

lượng cầu nối disulfide khi phát triển trên cơ chất lông vũ (Böckle and Müller, 1997) cho thấy loài vi khuẩn này có thể tạo ra enzyme disulfide reductase để phục vụ sự phân giải keratin

Hoạt tính keratinase còn được biểu hiện ở các dòng vi khuẩn ưa kiềm như

Nesternkonia sp AL-20 (Gessesse et al., 2003) và Nocardiopsis sp TOA-1 (Mitsuiki

et al., 2004) Hai dòng xạ khuẩn Streptomyces flavis 2BG và Microbispora aerata

IMBAS-11A được phân lập từ các mẫu đất ở Nam cực cũng cho thấy khả năng tạo keratinase trong quá trình phát triển trên chất thải lông cừu (Gushterova et al., 2005)

Các dòng vi khuẩn Gram dương như Arthrobacter sp (Lucas et al., 2003),

Microbacterium sp (Thys et al., 2004) và Kocuria rosea (Bernal et al., 2006) cũng có

khả năng phân giải keratin Các vi khuẩn Gram âm cũng được báo cáo cho thấy có khả năng phân giải protein nhưng tài liệu còn khá hạn chế và hoạt động phân hủy lông vũ

chỉ được mô tả gần đây ở các loài Vibrio sp (Sangali et al., 2000), Chryseobacterium

sp (Riffel et al., 2003) và Xanthomonas sp (De Toni et al., 2002)

2.3 Sơ lƣợc về enzyme keratinase

Keratinase là một loại enzyme ngoại bào, thuộc họ protease có khả năng phân giải cơ chất keratin không tan Keratinase chỉ được tạo ra khi có sự hiện diện của cơ chất keratin Một số loài vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn phân lập từ đất chôn chất thải giàu keratin cho thấy có khả năng tổng hợp keratinase (Riffel and Brandelli, 2006) Keratinase phân hủy keratin bằng cách tấn công vào các cầu nối disulfide (Prasad et al., 2010) Cho đến nay, hầu hết các keratinase được mô tả đều thuộc loại serineprotease Chỉ có một vài metalloprotease cho thấy có hoạt tính phân giải keratin, các metalloprotease này thường được thấy ở các vi khuẩn Gram âm (Brandelli, 2007)

Keratinases sản xuất bởi Microsporum, Trychophyton, và Microsporum Doratomyces

đã được mô tả (Kushwaha, 1983; Grzywnowicz et al., 1989; Gradisar et al., 2000)

Việc sản xuất keratinase từ chủng Aspergillus fumigatus và Aspergillus flavus đã được

Santos et al (1996) nghiên cứu

Các enzyme phân giải protein là một trong những nhóm enzyme thương mại quan trọng được ứng dụng nhiều trong các quy trình công nghiệp, chế biến thực phẩm hay công nghệ thuộc da (Gupta et al., 2002) Keratinase từ vi khuẩn có ứng dụng quan trọng trong các quy trình sinh học liên quan đến chất thải có chứa keratin từ các ngành công nghiệp gia súc gia cầm Keratin lông không hòa tan có thể được chuyển đổi sau khi thủy phân bằng keratinase tạo thức ăn gia súc, phân bón, chất keo hay được sử dụng cho sản xuất các acid amin hiếm như serine, cysteine và proline (Papadopoulos

et al., 1986; Onifade et al., 1998; Gupta and Ramnani, 2006)

Từ những năm 90 của thế kỷ XX, các kiến thức về keratin và enzyme keratinase dần được khám phá.Tuy nhiên, đến nay cơ chế phân giải sinh học keratin vẫn chưa hoàn toàn được hiểu rõ Noval và Nickerson (1959) đã mô tả sự phân giải keratin bởi enzyme của vi khuẩn Sự phá hủy các cầu nối disulfide có thể là yếu tố quan trọng trong sự phân giải keratin (Kunert and Stransky, 1988; Kunert, 1992; Böckle and Müller, 1997)

2.4 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về vi khuẩn phân giải keratin

2.4.1 Một số nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, một số loài vi khuẩn có khả năng phân giải keratin đã được phân lập từ đất và lông vũ tại nơi giết mổ gia cầm trên môi trường có bổ sung bột lông vũ Nguyễn Đình Quyến và Trần Thị Lan Phương (2001) đã tiến hành phân lập được từ

đất 7 chủng xạ khuẩn và 15 chủng Bacillus có khả năng phân giải casein rõ rệt Trong

đó có 5 chủng xạ khuẩn và 2 chủng Bacillus có khả năng phân giải lông gà mạnh mẽ

Nguyễn Huy Hoàng et al (2010) đã tiến hành phân lập các chủng vi khuẩn

Bacillus, Chryseobacterium,… từ một số vùng đất khác nhau ở phía Bắc Việt Nam

Điều kiện thích hợp cho các chủng vi khuẩn này phát triển là ở 30 - 40o

C trên môi trường có bổ sung bột lông vũ Khả năng thủy phân lông vũ của các chủng vi khuẩn này đạt từ 75 - 90% sau 3 ngày nuôi cấy Các chủng vi khuẩn đã được phân loại định danh bằng các nghiên cứu đặc điểm hình thái, hóa sinh kit API 50CHB, API 20NE và trình tự gen mã hóa 16S rRNA

Nguyễn Thị Hồng Thẩm (2011) phân lập được 21 dòng vi khuẩn phân giải lông

vũ từ lông và đất Trong đó, hai dòng vi khuẩn K14 và K15 cho thấy khả năng phân giải lông gà hiệu quả nhất Kết quả định danh cho thấy dòng vi khuẩn K14 tương đồng

với dòng Chryseobacterium indologenes McR-1 với độ tương đồng 98% và dòng K15 tương đồng với dòng Bacillus subtilis BE-91với độ tương đồng 99%

2.4.2 Một số nghiên cứu ngoài nước

Geun-Tae Park et al (2006) đã tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng của điều kiện

môi trường đến sự phân giải lông gà và hoạt tính keratinase của vi khuẩn Bacillus

megaterium F7-1 Vi khuẩn này phân hủy hoàn toàn lông gà trong vòng 7 ngày Nhiệt

độ 25 - 40oC và pH 7-11 là tối ưu cho sự phát triển cũng như hoạt tính keratinase của chúng Hoạt tính keratinase tạo ra trong môi trường chứa 0,6% sữa không béo là 468 U/ml, cao gấp 9,4 lần trong môi trường không bổ sung sữa Lượng keratinase tạo ra phụ thuộc vào hàm lượng lông vũ

Riffel et al (2002) đã nghiên cứu và cho thấy vi khuẩn Chryseobacterium sp

dòng kr6 có khả năng phân hủy hoàn toàn lông vũ trong quá trình nuôi cấy Dòng vi khuẩn này có nhiệt độ và pH tối ưu cho sự phát triển là 30oC và pH 8 Dưới điều kiện

này, hoạt động phân giải lông vũ cũng biểu hiện tối đa Nghiên cứu cũng cho thấy hoạt tính của keratinase bị ức chế bởi EDTA, Hg2+, Cu2+ và được kích hoạt bởi Ca2+

Sangali et al (1999) phân lập được các vi khuẩn có khả năng phân giải keratin

thuộc họ Vibrionaceae từ một cơ sở sản xuất gia cầm ở Brazil Nghiên cứu cho thấy

nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của vi khuẩn này là 30oC và cũng tại nhiệt độ này, lượng enzyme và các protein hòa tan được tạo ra cực đại

Riffel và Brandelli (2006) tiến hành phân lập vi khuẩn phân giải keratin từ chất thải lông gia cầm Bốn dòng vi khuẩn sau khi nuôi cấy trên môi trường bột lông vũ và kiểm tra khả năng phân giải protein trên môi trường sữa Trong đó có ba dòng Gram

âm (thuộc chi Burkholderia, Chryseobacterium và Pseudomonas) và một dòng Gram dương (Microbacterium sp.) Những vi khuẩn này có thể phát triển trên đa dạng các

chất thải chứa keratin như bột lông vũ, lông vũ thô, móng gà, tóc và len Hoạt tính phân giải protein của dịch trích enzyme thô từ các dòng vi khuẩn này được kiểm tra với hai cơ chất azokeratin và azocasein Kết quả cho thấy enzyme keratinase hoạt động trên cả hai cơ chất và có khả năng phân giải keratin tương đương với các enzyme phân gải protein có nguồn gốc từ vi khuẩn trên thị trường

Daroit et al (2009) phân lập được dòng vi khuẩn Bacillus sp P45 biểu hiện khả

năng phân giải protein trên môi trường sữa không béo và môi trường bột lông vũ

Dòng Bacillus sp P45 có khả năng phân hủy 90% lông gà sau 72 giờ nuôi cấy trong

môi trường lỏng có bổ sung lông gà Sự hình thành nhóm thiol cũng được ghi nhận trong quá trình sinh trưởng của vi khuẩn, cho thấy sự đóng góp của quá trình phá hủy cầu nối disulfide trong sự phân giải keratin lông vũ

Theo kết quả nghiên cứu của Agrahari et al (2010), ba dòng vi khuẩn B

megaterium SN1, B thuringenesis SN2, B Pumilis SN3 phân lập từ bãi đất chôn lông

gia cầm có khả năng phân giải lông gà và lông bồ câu sau 120 giờ nuôi cấy

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Địa điểm nghiên cứu:

Thí nghiệm thực hiện tại phòng thí nghiệm Sinh học phân tử Thực vật, thuộc Viện Nghiên cứu & Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ

3.1.2 Thời gian nghiên cứu:

Đề tài thực hiện từ tháng 08/2013 đến 11/2013

3.1.3 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm

- Tủ cấy vi sinh vật TELSTAR (Spain), tủ ủ vi sinh vật BINDER (USA) Nồi khử trùng nhiệt ướt PBINTERNATIONAL (Italy), tủ lạnh trữ mẫu SANYO (Japan), máy lắc mẫu NEW BRUNSWICH SCIENTIFIC (USA), pH kế EUTECH (Malaysia), cân điện tử SARTORIUS TEG101 (Germany), bộ micropipette NICHIPET EX (Japan),

- Đĩa petri, bình tam giác, ống nghiệm, eppendorf, đèn cồn, que cấy, đầu cône,

- Giấy lọc được đánh dấu và sấy khô ở 60oC đến khi khối lượng không đổi Sau khi sấy, xác định khối lượng từng miếng giấy lọc

3.1.4 Vật liệu thí nghiệm

Mẫu được thu tại năm cơ sở giết mổ heo huyện Vũng Liêm, tỉnh Vĩnh Long Lông heo dùng làm cơ chất thu tại một

số cơ sở giết mổ gia súc trên địa bàn tỉnh

Vĩnh Long, rửa sạch bằng nước máy, phơi

dưới ánh nắng mặt trời cho khô nước, sấy

khô đến khối lượng không đổi Sau đó cắt

nhuyễn (như hình 2), trữ lại dùng pha môi

trường bột lông Hình 2 lông heo sau khi cắt nhuyễn

Lông gia cầm (tỉ lệ lông gà và lông vịt là 1:1) thu tại một số cơ sở giết mổ gia cầm trên địa bàn tỉnh Vĩnh Long, rửa sạch bằng nước máy, phơi dưới ánh nắng mặt trời cho khô nước, sấy khô đến khối lượng không đổi Sau đó nghiền thật mịn, bảo quản nơi khô ráo đến khi sử dụng

3.1.5 Hóa chất

a) Hóa chất pha môi trường:

Môi trường sử dụng gồm môi trường tăng sinh khối và môi trường thạch agar Các môi trường đều có thành phần bột lông heo, đây là nguồn cung cấp carbon, nitơ duy nhất cho vi khuẩn sinh trưởng và phát triển

 Môi trường tăng sinh khối

Thành phần môi trường tăng sinh khối (dựa theo môi trường tăng sinh bột lông gia cầm của Matikevičienė et al., 2009) 1 lít gồm:

Nước cất thêm vào đủ 1 lít

 Môi trường thạch agar (môi trường bột lông heo)

Thành phần môi trường bột lông heo (dựa theo môi trường bột lông gia cầm FMA của Daniel et al., 2009) 1 lít gồm:

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Phương pháp thu mẫu

 Mẫu đất: lấy khoảng 10gram mẫu ở ngay cơ sở giết mổ và chuồng nuôi gia súc (đào sâu khoảng 20cm)

 Mẫu nước: lấy khoảng 10ml nước tại nơi nguồn nước thải của cơ sở giết mổ đổ

ra trực tiếp (nơi nước tĩnh, đọng)

 Mẫu lông: lấy khoảng 10gram lông heo đang phân hủy trong đất ngay tại cơ sở giết mổ

Mỗi mẫu đất, nước và lông cho vào một túi nilon sạch loại dùng một lần, ghi nhãn, đem về phòng thí nghiệm và trữ ở nơi mát đến khi tiến hành thí nghiệm

3.2.2 Thí nghiệm 1: phân lập các dòng vi khuẩn phân giải keratin

a) Phương pháp phân lập

Cân 1gram mẫu đối với mẫu đất, lông hoặc hút 10ml nước đối với mẫu nước cho vào bình tam giác 250ml chứa 99ml môi trường lỏng có bổ sung bột lông heo (90ml đối với mẫu nước), ủ ở 30oC trên máy lắc (120rpm) trong vòng 24 giờ nhằm tăng sinh khối các vi khuẩn trong mẫu

Pha loãng dịch môi trường từ nồng độ 100 đến nồng độ 10-10, trải lên môi trường bột lông heo, ủ ở 300C trong 2 ngày Những dòng có khả năng phát triển trên môi trường bột lông heo tiếp tục được cấy chuyển trên môi trường này đến khi ròng Các mẫu ròng trữ trong ống môi trường thạch nghiêng có cùng thành phần ở 4oC

b) Kiểm tra hoạt độ enzyme keratinase bằng cơ chất azokeratin

Phương pháp này thực hiện đầu tiên bởi Lin et al (1992) sử dụng azokeratin kiểm tra hoạt độ của enzyme keratinase sinh ra từ vi sinh vật

 Chuẩn bị cơ chất azokeratin: Azokeratin tổng hợp từ lông gà theo phương pháp tổng hợp của Joshi et al (2007)

 Chuẩn bị enzyme keratinase thô: enzyme keratinase thô dùng để xác định hoạt độ enzyme của các nghiệm thức Các bước chuẩn bị như sau:

- Nuôi vi khuẩn trong môi trường bột lông heo

- Lọc dung dịch nuôi vi khuẩn bằng giấy lọc, loại bỏ phần bột lông chưa bị phân giải

- Cho 1ml dịch lọc vào eppendorf 1,5ml, ly tâm ở 12000rpm trong 5 phút (Park

và Son, 2009), loại bỏ vi khuẩn (phần rắn phía dưới) trong dung dịch

- Phần dung dịch lỏng phía trên eppendorf sử dụng như enzyme keratinase thô

để đo hoạt độ của enzyme trong các thí nghiệm

 Xác định hoạt độ enzyme keratinase thô với cơ chất azokeratin (Areeb el al., 2012)

Mục đích: Xác định hoạt độ enzyme keratinase do các dòng vi khuẩn tạo ra bằng

cơ chất azokeratin

Phương pháp thực hiện:

- Lấy 5mg azokeratin cho vào eppendorf 1,5ml, thêm 0,8ml dung dịch đệm potassium phosphate 50mM, pH 7,5 Lắc đều hỗn hợp bằng máy vortex đến khi azokeratin hòa vào dung dịch hoàn toàn

- Cho 0,2ml dịch enzyme thô vào eppendorf, trộn đều hỗn hợp và ủ lắc 50oC trong 15 phút

- Thêm 0,2ml trichloroacetic acid (TCA) 10% (mẫu đối chứng thêm TCA trước khi cho dung dịch enzyme keratinase thô vào)

- Lọc hỗn hợp, dung dịch lọc đo ở bước sóng 450nm để xác định hoạt tính keratinase của vi khuẩn

Một đơn vị hoạt độ của enzyme xác định bằng sự gia tăng 0,01 đơn vị hấp thụ quang phổ ở 450nm so với mẫu đối chứng sau 15 phút phản ứng Những dòng có hoạt tính keratinase được chọn để tiến hành thí nghiệm tiếp theo

3.2.3 Thí nghiệm 2: Khảo sát và tuyển chọn vi khuẩn phân giải keratin mạnh

a) Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 1 nhân tố, 3 lần lặp

lại đối với mỗi loại dịch nuôi cấy vi khuẩn

b) Tiến hành thí nghiệm:

 Phương pháp đếm sống (Hoben and Somasegaran, 1982):

 Tăng sinh khối các dòng vi khuẩn phân lập được: lấy từ 1-2 khuẩn lạc vi khuẩn cho vào môi trường tăng sinh khối ủ lắc 120rpm ở 300C trong 48 giờ

 Đếm mật số vi khuẩn: dùng phương pháp đếm sống:

− Mục đích: đếm mật số vi khuẩn đảm bảo cân bằng mật độ vi khuẩn chủng vào môi trường Kết quả so sánh khả năng phân giải keratin giữa các dòng

vi khuẩn sẽ chính xác và đáng tin cậy

− Phương pháp đếm sống: Quy trình xác định mật số vi sinh vật bằng phương pháp đếm sống:

+ Pha loãng mẫu ở độ pha loãng 10-6,10-7, 10-8, 10-9 lần

+ Mỗi đĩa môi trường phân làm 4 phần cho 4 mức độ pha loãng khác nhau

+ Mỗi độ pha loãng hút 3 giọt (mỗi giọt là 5µl) nhỏ lên môi trường thạch ở 3 điểm riêng biệt trên 1 phần đĩa như hình 3

+ Ủ ở nhiệt độ 300C, sau 24 giờ tiến hành đếm khuẩn lạc Chọn mức pha loãng có khuẩn lạc rời tốt để đếm số khuẩn lạc Mỗi khuẩn lạc được hình thành từ một tế bào vi khuẩn, thông qua đếm số khuẩn lạc xác định mật

số vi khuẩn tương ứng với độ pha loãng, từ đó tính mật số vi khuẩn trong mẫu ban đầu

Hình 3 Quy trình xác định mật số vi khuẩn bằng phương pháp đếm sống

Công thức tính mật số vi khuẩn:

Số tế bào/ml = A x 200 x B Trong đó:

A: số khuẩn lạc trung bình của 3 giọt (số khuẩn lạc/5µl) B: mức độ pha loãng

200: hệ số chuyển từ 5µl đến 1ml

 Khảo sát khả năng phân giải bột lông heo của các dòng vi khuẩn:

Đối với mỗi dòng vi khuẩn, chuẩn bị một bình yaourt 75ml chứa 30ml môi trường gồm NaCl 0,5g/l, K2HPO4 0,3g/l và KH2PO4 0,4g/l và 0,5g bột lông heo, môi trường khử trùng ở 121o

C trong 20 phút Lần lượt chủng vào mỗi bình yaourt 1,5ml dịch nuôi vi khuẩn (đã đồng nhất mật số ở 108 CFU/ml) của các dòng vi khuẩn phân lập được, ủ ở 30oC trên máy lắc (120rpm) Một bình yaourt với cùng thể tích môi trường nhưng không chủng vi khuẩn sử dụng làm mẫu đối chứng Sau 7 ngày nuôi lắc, tiến hành lọc và rửa môi trường qua giấy lọc Whatman No.1 đã được cân khối lượng trước đó Cân lượng bột lông heo còn lại sau khi đã lọc và sấy khô ở 60oC đến khối lượng không đổi, tính khối lượng bột lông heo bị phân giải trong quá trình nuôi cấy Khả năng phân giải bột lông heo của vi khuẩn tính theo công thức sau (Nguyễn Huy Hoàng et al., 2010):

A (%) = (mBĐ - mC) x 100 / mBĐ

Trong đó: A (%): tỷ lệ bột lông heo bị phân giải bởi vi khuẩn

mBĐ: khối lượng bột lông heo ban đầu

mC : khối lượng bột lông heo còn lại sau khi bị phân giải

Chỉ tiêu theo dõi: khả năng phân giải bột lông heo của các dòng vi khuẩn

 Khảo sát khả năng phân giải bột lông gia cầm của các dòng vi khuẩn:

Thí nghiệm khảo sát khả năng phân giải bột lông gia cầm của các dòng vi khuẩn tiến hành tương tự như khảo sát khả năng phân giải bột lông heo, nhưng với cơ chất là bột lông gia cầm

 Quan sát hình dạng, khả năng chuyển động và nhuộm Gram những dòng vi khuẩn phân giải keratin mạnh

 Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động

Sau khi chọn hai dòng vi khuẩn có khả năng phân giải keratin mạnh, tiến hành quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của tế bào vi khuẩn trong môi trường nước cất vô trùng Cách chuẩn bị mẫu vi khuẩn như sau:

- Dùng kim cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ khuẩn lạc, trải đều lên giọt nước

vô trùng đã nhỏ sẳn trên kính mang vật

- Dùng kính đậy vật đậy lên giọt nước bằng cách để một cạnh của kính đậy vật tiếp xúc với kính mang vật một góc 45º, hạ kính đậy vật xuống từ từ và nhẹ nhàng sao cho trong mẫu vật không có bọt khí

Tiến hành quan sát mẫu vật dưới kính hiển vi quang học ở vật kính dầu x100, ghi nhận hình dạng và khả năng chuyển động của tế bào vi khuẩn

 Xác định đặc tính Gram vi khuẩn bằng phương pháp nhuộm Gram

Sau khi quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn, tiến hành nhuộm Gram vi khuẩn theo các bước:

- Dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn, trải đều lên giọt nước cất vô trùng trên kính mang vật

- Hơ mẫu vật trên ngọn lửa đèn cồn để cố định vi khuẩn trên kính mang vật

- Nhỏ từ một đến hai giọt Crystal Violet, để hai phút

- Rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô

- Nhỏ từ một đến hai giọt dung dịch Iod, để một phút

- Rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô

- Rửa lại bằng cồn 70% thật nhanh để tẩy màu từ đầu đến cuối kính mang vật

- Rửa lại bằng nước cất vô trùng trong vài giây, chậm nhẹ cho khô

- Nhỏ từ một đến hai giọt Fushin, để một phút

- Rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô

Quan sát mẫu trên kính hiển vi quang học ở vật kính dầu x100 và ghi nhận Gram của vi khuẩn Nếu mẫu vi khuẩn có màu tím xanh của Crystal violet là mẫu Gram dương; có màu hồng đỏ của Fushin là mẫu Gram âm

 Xử lý số liệu: kết quả khả năng phân giải keratin của các dòng vi khuẩn xử lý

thống kê bằng phần mềm Excel và Minitab để tuyển chọn ít nhất hai dòng vi khuẩn phân giải keratin mạnh