phân lập và khảo sát đặc tính vi khuẩn nội sinh cây lúa trồng trên đất của huyện phú hòa, tỉnh phú yên

LỜI CẢM TẠ Để hoàn thành luận văn “Phân lập và khảo sát đặc tính vi khuẩn nội sinh cây lúa trồng ở huyện Phú Hòa, tỉnh Phú Yên”, bên cạnh sự nổ lực của bản thân, em luôn nhận được sự g

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MSSV: 3092441

LỚP: CNSH TT K35

PHẦN KÝ DUYỆT

(ký tên) (ký tên)

GS.TS Cao Ngọc Điệp Nguyễn Thị Ngọc Thiên

XÉT DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

………

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (ký tên)

LỜI CẢM TẠ

Để hoàn thành luận văn “Phân lập và khảo sát đặc tính vi khuẩn nội sinh cây lúa

trồng ở huyện Phú Hòa, tỉnh Phú Yên”, bên cạnh sự nổ lực của bản thân, em luôn nhận

được sự giúp đỡ tận tình của quý thầy cô cùng sự chia sẻ từ phía gia đình và bạn bè Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn:

Quý thầy cô thuộc viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học đã truyền đạt cho em những kiến thức quý báu trong thời gian học tập;

Thầy Giáo sư-Tiến sĩ Cao Ngọc Điệp đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi trong thời gian em thực hiện luận văn;

Cán bộ phòng thí nghiệm Vi sinh vật, thuộc viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học đã hỗ trợ em hoàn thành đề tài;

Gia đình và bạn bè đã động viên em trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Tuy em đã cố gắng hoàn thiện luận văn, với thời gian và khả năng còn hạn chế, luận văn không thể tránh khỏi thiếu sót Em mong nhận được sự góp ý chân thành từ quý thầy

cô và các bạn

Sau cùng, em xin gửi lời chúc sức khỏe và thành công đến gia đình, quý thầy cô và tất cả các bạn

TÓM LƯỢC

Lúa (Oryza sativa) giữ một vị trí không thể thay thế trong các loại cây trồng được thuần hóa vì nó là cây lương thực quan trọng và là cây trồng đầu tiên được giải trình tự đầy đủ Từ mẫu rễ và thân cây lúa trồng ở huyện Phú Hòa, tỉnh Phú Yên, hai mươi lăm dòng vi khuẩn nội sinh đã được phân lập Tất cả các dòng vi khuẩn này đều thuộc nhóm Gram âm, tế bào có hình que và có khả năng chuyển động Chín mươi hai phần trăm khuẩn lạc do hai mươi lăm dòng vi khuẩn này tạo thành có dạng tròn, mô và bìa nguyên Các dòng vi khuẩn này đều có khả năng cố định đạm, hòa tan lân khó tan và sinh tổng hợp Indole-3-acetic acid (IAA); dòng PH4 là dòng vi khuẩn tốt nhất với khả năng tổng hợp lượng NH 4 + cao nhất (7,70 μg/ml ở ngày thứ tư sau chủng), lượng lân hòa tan cao nhất (181,54 μg/ml sau mười ngày chủng) và dòng PH13 sinh tổng hợp lượng IAA cao nhất (31,64 μg/ml) sau sáu ngày chủng

Từ khóa: cố định đạm, cây lúa, hòa tan lân, huyện Phú Hòa, sinh tổng hợp IAA, vi khuẩn nội sinh

MỤC LỤC

Trang

TÓM LƯỢC i

MỤC LỤC ii

DANH SÁCH BẢNG iv

DANH SÁCH HÌNH v

TỪ VIẾT TẮT vi

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Giới thiệu 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 2

1.3 Nội dung nghiên cứu 2

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Huyện Phú Hòa, tỉnh Phú Yên 3

2.2 Sơ lược về cây lúa (Oryza sativa) 4

2.2.1 Nguồn gốc 4

2.2.2 Đặc điểm hình thái và sinh thái 5

2.2.3 Nhu cầu dinh dưỡng 6

2.2.4 Giá trị dinh dưỡng và vị trí kinh tế 7

2.3 Vi khuẩn nội sinh 9

2.3.1 Các nhóm vi khuẩn nội sinh 9

2.3.2 Một số đặc tính của vi khuẩn nội sinh 11

2.3.2.1 Khả năng cố định đạm 11

2.3.2.2 Khả năng hòa tan lân khó tan 12

2.3.2.3 Khả năng tổng hợp Indole-3-acetic aicd (IAA) 13

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện 15

3.2 Phương tiện nghiên cứu 15

3.2.1 Vật liệu thí nghiệm 15

3.2.3 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 17

3.3 Phương pháp nghiên cứu 17

3.3.1 Thu thập và xử lý mẫu 17

3.3.2 Phân lập 18

3.3.3 Quan sát hình thái, đo kích thước khuẩn lạc 18

3.3.4 Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn 19

3.3.5 Khảo sát khả năng tổng hợp NH4+ bằng phương pháp Indolephenol Blue 21

3.3.6 Khảo sát khả năng hòa tan lân khó tan 22

3.3.7 Định lượng IAA bằng phương pháp Salkowski 23

3.3.8 Xử lý số liệu 24

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn 25

4.1.1 Phân lập vi khuẩn 25

4.1.2 Đặc điểm khuẩn lạc và đặc tính sinh học của các dòng vi khuẩn phân lập 26

4.2 Khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn 28

4.3 Khả năng hòa tan lân 31

4.4 Khả năng tổng hợp IAA 33

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 35

5.1 Kết luận 35

5.2 Đề nghị 35 PHỤ LỤC

Phụ lục: Phân tích ANOVA

DANH SÁCH BẢNG

Trang

Bảng 1: Thành phần dinh dưỡng trong 100 g gạo 8

Bảng 2: Thành phần môi trường NFb (Kireg và Dobereiner, 1984) 15

Bảng 3: Công thức môi trường Burk (Park et al, 2005) 16

Bảng 4: Công thức môi trường NBRIP lỏng (Nautiyal, 1999) 16

Bảng 5: Đường chuẩn NH4+ 22

Bảng 6: Đường chuẩn P2O5 23

Bảng 7: Đường chuẩn IAA 24

Bảng 8: Nguồn gốc các dòng vi khuẩn được phân lập trên môi trường NFb 25

Bảng 9: Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập được 28

Bảng 10: Khả năng tổng hợp NH4+ của các dòng vi khuẩn nội sinh 30

Bảng 11: Khả năng hòa tan lân của các dòng vi khuẩn nội sinh phân lập được 32

Bảng 12: Khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn phân lập được 34

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 1 Lúa (Oryza sativa) 4

Hình 2 Vi khuẩn Gluconacetobacter diazotrophicus và Burkholderia ambifaria 10

Hình 3 Sơ đồ lộ trình tổng hợp IAA ở Enterobacter cloacae 14

Hình 4 Cấu trúc màng tế bào của vi khuẩn Gram âm và Gram dương 19

Hình 5 Vòng pellicle xuất hiện sau 2-3 ngày chủng 26

Hình 6 Khuẩn lạc tròn, mô, bìa nguyên màu trắng đục (trái) và màu vàng nhạt (phải) 27

TỪ VIẾT TẮT

NADP Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate

EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

1.1 Giới thiệu

Lúa là cây lương thực quan trọng, giữ một vị trí không thể thay thế trong các loại cây trồng được thuần hóa Hiện nay, diện tích trồng lúa bao phủ hơn 110 vùng lãnh thổ, thích nghi rất rộng với nhiều điều kiện sinh thái khác nhau từ vĩ độ 350 Nam – 530 Bắc Theo thống kê năm 2004: Trong các loại cây lương thực lấy hạt ở Việt Nam thì lúa và ngô

là hai loại cây lương thực chính, song so với tổng sản lượng của hai loại cây này thì sản lượng ngô chỉ vào khoảng trên dưới 10%, vì vậy, lúa là cây lương thực chính trong mục tiêu phát triển nông nghiệp của Việt Nam để đảm bảo vững chắc an ninh lương thực quốc gia và xuất khẩu Hiện nay diện tích trồng lúa cả nước từ 7,3 dến 7,5 triệu ha, năng suất trung bình 46 ha, sản lượng dao động trong khoảng 34,5 triệu tấn/năm, xuất khẩu từ 2,5 triệu đến 4 triệu tấn/năm Việt Nam có bờ biển dài trên 3000 km, sông núi nhiều, địa hình phức tạp nên đã hình thành nhiều vùng trồng lúa khác nhau, trong đó có vùng đồng bằng ven biển miền Trung Tại đây, những cánh đồng lúa thuộc huyện Phú Hòa, tỉnh Phú Yên được xem là có diện tích lớn

Cây lúa thích hợp với đất thịt hay đất thịt pha sét, ít chua hoặc trung tính (pH 7,5) Trong thực tế, lúa cũng có thể thích nghi được trong những điều kiện đất đai khắc nghiệt như phèn, mặn, khô hạn, ngập úng Tuy nhiên, năng suất và sản lượng lúa tùy thuộc vào phân bón hóa học mà nông dân sử dụng Để tạo được 1 tạ thóc, cây lúa cần 2

5,5-kg N, 0,7- 0,9 5,5-kg P, 3,2 5,5-kg K và 2 5,5-kg Si Vì vậy, để đạt năng suất hạt 6-7 tấn/ha vụ, cây lúa cần 8-10 tấn phân chuồng, 100-120 kg N, 100-120 kg P và 30-60 kg K Tuy nhiên, trong những năm gần đây, nhiều người lo ngại về ảnh hưởng của phân bón đến môi trường và sức khỏe con người Đối tượng độc hại đầu tiên là nguồn nước và đất, mà tác nhân chính là dư lượng nitrat, dẫn đến ngộ độc nitrat, ảnh hưởng xấu đến hệ sinh thái Bên cạnh đó, dư lượng phân bón trong lương thực gây hại cho sức khỏe người tiêu dùng

và gia súc, ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng

Có một lợi thế không thể phủ nhận hiện nay là những tiến bộ vượt bậc của khoa học, đặc biệt là lĩnh vực công nghệ sinh học vi sinh vật, tạo điều kiện thuận lợi cho việc nghiên

cứu hệ vi sinh vật sống nội sinh trong cây lúa, từ đó tìm ra giải pháp hợp lý để cải thiện tình trạng phụ thuộc phân hóa học với nhiều rủi ro nêu trên Vi khuẩn nội sinh là vi khuẩn sống nội bào hoặc liên bào bên trong các mô khỏe mạnh của cây chủ toàn bộ hoặc một phần vòng đời của nó, thường không gây triệu chứng bệnh (Wilson, 1995) Vi khuẩn nội sinh có thể có lợi cho thực vật bằng cách sản xuất một loạt các sản phẩm tự nhiên có tiềm năng trong y học, nông nghiệp hay công nghiệp Ngoài ra, các nhà khoa học đã chứng minh rằng vi khuẩn nội sinh có tiềm năng để loại bỏ chất gây ô nhiễm đất bằng cách tăng cường phytoremediation (các hợp chất phân hủy thực vật) (Rayan, 2008) Bên cạnh đó, cùng với khả năng hòa tan lân, vi khuẩn nội sinh cũng có thể cố định đạm sinh học, góp

phần đáng kể vào sự tăng trưởng thực vật (Hurek et al., 2002) cũng như tăng độ phì nhiêu

cho đất Cùng với những đặc tính khác, vi khuẩn nội sinh góp phần tạo nên một nền nông nghiệp bền vững Chính vì vậy, sự hiểu biết về những đặc điểm và cơ chế tương tác với thực vật cũng như những đặc tính của vi khuẩn nội sinh rất cần thiết để đạt được hiệu quả tối ưu trong sự áp dụng tương tác giữa thực vật và vi khuẩn vào việc giải quyết trình trạng

phụ thuộc phân bón hóa học của nền nông nghiệp

1.2 Mục tiêu của đề tài

Phân lập và tuyển chọn những dòng vi khuẩn nội sinh có đặc tính tốt trong cây lúa ở huyện Phú Hòa, tỉnh Phú Yên

1.3 Nội dung nghiên cứu

- Phân lập một số dòng vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng ở huyện Phú Hòa, tỉnh

Phú Yên;

- Khảo sát khả năng cố định đạm, hòa tan lân và tổng hợp Indole-3-acetic acid (IAA) của những dòng vi khuẩn này

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Huyện Phú Hòa, tỉnh Phú Yên

Căn cứ vào điều kiện tự nhiên, tập quán canh tác, sự hình thành mùa vụ và phương thức gieo trồng, nghề trồng lúa được hình thành và phân chia thành 3 vùng trồng lúa lớn: Đồng bằng sông Hồng, đồng bằng ven biển miền Trung và đồng bằng Nam Bộ Đồng bằng ven biển miền Trung kéo dài từ Thanh Hóa tới Bình Thuận, cực Nam Trung Bộ, được chia thành 2 vùng chính: Vùng đồng bằng ven biển Bắc bộ và Vùng đồng bằng ven biển Trung bộ và nam Trung Bộ Trong đó, vùng đồng bằng ven biển Trung và Nam Trung bộ kéo dài từ Quảng Bình tới Bình Thuận, có diện tích là 8250 km2

(http://www.vaas.org.vn/images/caylua/01/13_venbienmientrung.htm, 05/07/2013), trong

đó Phú Yên là một trong những đồng bằng có diện tích trồng lúa lớn

Huyện Phú Hòa thuộc tỉnh Phú Yên nằm về phía tả ngạn sông Đà Rằng, phía Bắc giáp huyện Tuy An, Nam giáp huyện Tây Hòa và Đông Hòa, phía Đông giáp thành phố Tuy Hòa, Tây giáp huyện Sơn Hòa Với tổng diện tích đất là 26390,96 ha, huyện Phú Hòa

có 8654,30 ha đất nông nghiệp và 10976,40 ha đất lâm nghiệp (http://www.phuyen.gov.vn, 04/09/2013)

Về đặc điểm khí hậu, huyện Phú Hòa mang những đặc điểm chung của khí hậu thuỷ văn nhiệt đới gió mùa khu vực Nam Trung bộ, hàng năm có hai mùa rõ rệt, mùa mưa kéo dài từ tháng 9, 10 đến tháng 12, mùa khô mát từ tháng 12 đến tháng 5, mùa nóng ẩm từ tháng 5 đến tháng 9

Tiềm năng kinh tế - xã hội: Phú Hòa là một huyện nằm trên vùng châu thổ đồng bằng sông Đà Rằng, nên người dân nơi đây đã sớm phát triển kinh tế nông nghiệp, khai thác những lợi thế về đất đai để biến khu vực nay thành một trong những vựa lúa của tỉnh

có năng xuất cao Lúa được nhân dân canh tác 2 vụ/năm, được sử dụng hệ thống đập Đồng Cam Các xã như Hoà Thắng, Hòa An, Hòa Trị là những vùng trồng lúa có năng xuất cao của tỉnh (trên 70 tạ/ha) Được thiên nhiên ưu đãi ngoài đồng bằng màu mỡ thuận lợi cho cây lúa phát triển còn có tiềm năng khá lớn về trữ lượng vật liệu dùng trong ngành xây dựng cơ bản (cát, đất, đá)

Bên cạnh nghề nông với hai ngành trồng trọt và chăn nuôi đóng vai trò chủ đạo, cư dân Phú Hòa trong quá trình sinh sống đã tạo ra những ngành nghề truyền thống phù hợp với điều kiện thiên nhiên và nhu cầu cần thiết hàng ngày, như các ngành nghề: gốm, dệt vải, lụa, đan đát, tráng bánh, làm bún cũng khá phát triển, đã làm đa dạng hoá nền kinh tế

ở vùng đất Phú Hòa

2.2 Sơ lược về cây lúa (Oryza sativa)

2.2.1 Nguồn gốc

nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi, 26/07/2013), có khoảng 22 loài, trong đó, 20

loài hoang dại và 2 loài được thuần chủng là O sativa và O glaberrima (Vaughan, 1994),

và O sativa được trồng phổ biến hơn cả O sativa được trồng khắp nơi trên thế giới, bao

gồm châu Á, Bắc và Nam Mỹ, châu Âu, Trung Đông và những nước châu Phi

Hình 1 Lúa (Oryza sativa)

(*Nguồn: http://www.vaas.org.vn/images/caylua/10/001_caylua.htm, 29/07/2013, http://www.vaas.org.vn/images/caylua/ 10/002_gdptcaylua.htm, 29/07/2013)

Loại lúa hoang phổ biến (Oryza rufipogon) được xem là tổ tiên của lúa châu Á O sativa có nguồn gốc tại khu vực xung quanh vùng Đông Nam Á hơn 10.000 năm trước

Nơi đây có đủ mọi điều kiện để phát triển giống lúa này, và đó cũng là nơi đã xuất hiện nền văn minh lúa nước, vì vậy Đông Nam Á còn có thể xem là 1 trong những trung tâm nông nghiệp đầu tiên trên thế giới

O sativa có bộ gen lưỡng bội (2n = 24) nhỏ (430.106 bp) Đây là bộ gen nhỏ nhất trong các loại cây trồng (Chang, 2002)

2.2.2 Đặc điểm hình thái và sinh thái

Lúa là cây thân cỏ hàng năm Đặc điểm chung của lúa là cây mọc thành cụm, thân thẳng đứng, phiến là dài và phẳng Các hoa nhỏ tự thụ phấn mọc thành các cụm hoa, phân nhánh cong hay rủ xuống, hạt lúa được bao bọc trong một vỏ trấu dài 5–12 mm

Rễ lúa có cấu tạo sơ cấp, gồm: biểu bì, nhu mô vỏ rễ và phần trung trụ; giữ nhiệm

vụ giúp cây đứng vững, hút nước và muối khoáng Rễ phát triển nông hay sâu tùy thuộc vào tính chất đất Đất tơi xốp, thoáng khí, nhiều mùn thuận lợi cho bộ rễ phát triển

Thân lúa gồm nhiều mắt và lóng, được bao bọc bởi bẹ lá trước thời kỳ lúa trổ Chiều cao thân phụ thuộc vào đặc tính từng giống Nhiệm vụ của thân lúa là giữ cho cây đứng vững và vận chuyển chất dinh dưỡng; ở thời kỳ sinh trưởng dinh dưỡng thân còn tích lũy đường bột cung cấp cho bông và hạt

Lúa là cây đơn tử diệp (1 lá mầm) Lá lúa mọc đối ở 2 bên thân lúa, lá ra sau nằm về phía đối diện với lá trước đó Lá trên cùng được gọi lá lá cờ hay lá đòng Lá lúa gồm phiến lá (bộ phận quang hợp), cổ lá và bẹ lá

Bông lúa gồm các phần chính: cổ bông, trục bông, gié chính, gié phụ và trên gié đính nhiều hoa Hạt lúa thuộc loại quả dĩnh, màu sắc hạt thay đổi tùy theo giống Đa số các hạt lúa đều có màu vàng Bên trong hạt lúa là hạt gạo do bầu nhụy phát triển thành Hạt gạo gồm có vỏ cám, nội nhũ và phôi, trong đó nội nhũ chứa tinh bột Hàm lượng amylosepectin trong thành phần tinh bột hạt gạo càng cao tức hàm lượng amylose càng thấp thì gạo càng dẻo

Theo Nguyễn Ngọc Đệ (2008), đời sống cây lúa bắt đầu từ lúc hạt nẩy mầm cho đến khi lúa chín, có thể chia làm 3 giai đoạn chính: giai đoạn tăng trưởng (sinh trưởng dinh dưỡng), giai đoạn sinh sản (sinh dục) và giai đoạn chín

Cây lúa thích nghi rất rộng với điều kiện sinh thái khác nhau từ vĩ độ 35o Nam – 53o

Bắc Điều kiện sinh thái có ảnh hưởng trực tiếp đến đời sống cây lúa, nó quyết định loại hình cây lúa, cơ cấu giống lúa, thời vụ gieo cấy, biện pháp canh tác và hình thành các

vùng trồng lúa khác nhau Đất trồng lúa cần giàu dinh dưỡng, nhiều hữu cơ, tơi xốp, thoáng khí, khả năng giữ nước, giữ phân tốt, tầng canh tác dày để bộ rễ ăn sâu, bám chặt vào đất và huy động nhiều dinh dưỡng nuôi cây Loại đất thịt hay đất thịt pha sét, ít chua hoặc trung tính (pH = 5,5-7,5) là thích hợp đối với cây lúa Tuy nhiên, muốn trồng lúa đạt năng suất cao, đất ruộng cần bằng phẳng và chủ động nước Trong thực tế, có những giống lúa có thể thích nghi được trong những điều kiện đất đai khắc nghiệt (như: phèn, mặn, khô hạn, ngập úng) rất tốt Lúa phát triển ở độ cao 3000 m so với mực nước biển trong khí hậu nhiệt đới

Bên cạnh đó, các điều kiện nhiệt độ, thủy văn, lượng mưa, gió và ánh áng cũng có ảnh hưởng quyết định đến sự sinh trưởng và phát triển của cây lúa

2.2.3 Nhu cầu dinh dưỡng

Về phương diện dinh dưỡng, trong đất ngập nước ammonium là dạng đạm chính cung cấp cho cây lúa; đồng thời cây lúa chịu đựng và sử dụng được có hiệu quả nồng độ đạm ammonium tương đối cao (Nguyễn Ngọc Đệ, 2008) Cây lúa cần nhiều loại dưỡng chất để phát triển, bao gồm chất đa lượng như N, P, K, Si, Ca, Mg,… và vi lượng như Fe,

Zn, Cu, lưu huỳnh,… Có nhiều chất dinh dưỡng khoáng mà cây lúa cần, nhưng 3 yếu tố dinh dưỡng mà cây lúa cần với lượng lớn là: đạm, lân và kali là những chất cần thiết cho những quá trình sống diễn ra trong cây lúa Các nguyên tố khoáng còn lại, cây lúa cần với lượng rất ít và hầu như đã có sẵn ở trong đất (http://www.vaas.org.vn/images/caylua/ 10/039_vaitrophanbon.htm, 26/07/2013)

Đạm (nitrogen) là chất tạo hình cây lúa, là thành phần chủ yếu của protein và chất diệp lục làm cho lá xanh tốt, gia tăng chiều cao cây, số chồi và kích thước lá thân (http://nhanong.com.vn/3-11-127-363-Nhu-cau-dinh-duong-cua-cay-lua.html, 26/07/13) Khác với các cây trồng cạn, cây lúa nước chỉ hấp thu và sử dụng chủ yếu là đạm ammonium, nhất là trong giai đoạn sinh trưởng ban đầu (Nguyễn Ngọc Đệ, 2008) Dù cây lúa hút đạm ammonium nhanh hơn nitrat nhưng lại không tích lũy ammonium trong

tế bào lá, lượng ammonium dư thừa sẽ được kết hợp thành asparagin ở trong lá Nhưng cây lúa sẽ tích lũy nhiều nitrat trong tế bào khi nồng độ nitrat trong môi trường cao Về

thành ammonium, nên việc đồng hóa đạm nitrat cần nhiều năng lượng hơn đạm ammonium

Lân (phosphate) là chất tạo năng lượng, là thành phần của những hợp chất quan trọng cần trong quá trình chuyển hóa của cây lúa như ATP, NADP, Bên cạnh đó, lân cũng góp phần thúc đẩy việc sử dụng và tổng hợp chất đạm trong cây, kích thích cây ra

rễ mạnh, hình thành nhiều nốt sần, hạt chắc cau-dinh-duong-cua-cay-lua.html, 26/07/2013) Lân còn là thành phần cấu tạo acid nhân (acid nucleic), thường tập trung nhiều trong hạt Độ pH là yếu tố quyết định hàm lượng lân di động trong dung dịch đất Ở pH = 4-8, các ion chủ yếu có mặt trong dung dịch đất

(http://nhanong.com.vn/3-11-127-363-Nhu-là H2PO4- và HPO42- Nhu cầu tổng số về lân của cây lúa ít hơn đạm

Kali (potassium) có tác dụng làm cứng cây, quang hợp tốt, bông to, chắc hạt, chống rét, hạn chế sâu bệnh Kali dễ hoà tan, phân huỷ nhanh Kali tập trung chủ yếu trong rơm rạ, chỉ khoảng 6-20% ở trên bông Nếu thiếu kali, cây lúa có chiều cao và số chồi gần như bình thường, lá vẫn xanh nhưng mềm rủ, yếu ớt, dễ đổ ngã, dễ nhiễm bệnh

nhất là bệnh đốm nâu (Helminthosporium oryzae), lá già rụi sớm

2.2.4 Giá trị dinh dưỡng và vị trí kinh tế

Gạo là thức ăn giàu dinh dưỡng So với lúa mì, gạo có thành phần tinh bột và protein hơi thấp hơn, nhưng năng lượng tạo ra cao hơn do chứa nhiều chất béo hơn Trong hạt gạo, hàm lượng dinh dưỡng tập trung ở các lớp ngoài và giảm dần vào trung tâm Phần bên trong nội nhũ chỉ chứa chủ yếu là chất đường bột Cám hay lớp vỏ ngoài của hạt gạo chiếm khoảng 10% trọng lượng khô là thành phần rất bổ dưỡng của lúa, chứa nhiều protein, chất béo, khoáng chất và vitamin đặt biệt là các vitamin nhóm B

Cũng theo FAO, gạo cung cấp 27% năng lượng và 20% protein cho dân số toàn cầu (http://www.fao.org/rice2004/en/kids.htm, 25/07/2013)

Bảng 1: Thành phần dinh dưỡng trong 100 g gạo

Nhiều báo cáo chỉ ra rằng một số thành phần được phân lập và có nguồn gốc từ gạo

có hoạt tính dược lý và sinh học khác nhau (Liao et al., 2006)

Chính vì vậy, Oryza sativa L giữ một vị trí không thể thay thế trong các loại cây

trồng được thuần hóa vì nó là cây lương thực quan trọng và là cây trồng đầu tiên được

giải trình tự đầy đủ (Garris et al., 2005) Hiện nay, diện tích trồng O sativa bao phủ hơn

110 vùng lãnh thổ, thích nghi rất rộng với nhiều điều kiện sinh thái khác nhau từ vĩ độ

350 Nam – 530 Bắc Chín mươi phần trăm tổng số gạo được trồng và tiêu thụ tại châu Á Cho đến 2002, tổng diện tích trồng lúa được ước tính là 1,5 triệu km2, đến 2003, tổng sản lượng lúa gạo được sản xuất trên toàn thế giới là 589 triệu tấn, trong đó, châu Á chiếm đa

số (http://www.fao.org/rice2004/en/kids.htm, 25/07/2013) Theo tổ chức lúa gạo châu Á (The Asia Rice Foundation), từ nay đến năm 2020, sẽ có thêm 1,2 tỉ người tiêu thụ lúa gạo ở châu Á, đòi hỏi sản lượng lúa gạo phải tăng một phần ba từ 320 triệu tấn lên 420 triệu tấn (http://www.asiarice.org/sections/learnrice/riceislife.html, 25/07/2013)

Các quốc gia dẫn đầu về sản lượng lúa theo thứ tự là Trung Quốc, Ấn Độ, Indoniesia, Bangladesh, Việt Nam, Thái Lan và Myanmar, tất cả đều nằm ở Châu Á Như

vậy, có thể nói Châu Á là vựa lúa quan trọng nhất thế giới

2.3 Vi khuẩn nội sinh

Vi khuẩn nội sinh được định nghĩa là vi khuẩn được phát hiện bên trong thực vật mà

bề mặt đã được khử trùng hoặc dịch trích thực vật và không có những tác động gây hại trên thực vật (Mano và Morisaki, 2008) Vi khuẩn nội sinh được biết đến từ hơn một trăm năm về trước, sự hiện diện của những vi khuẩn này trong mô của thực vật khỏe mạnh lần đầu tiên được báo cáo vào năm 1926 Thuật ngữ vi sinh vật nội sinh được dùng để chỉ sự phát triển của vi khuẩn hoặc vi nấm bên trong cây Vi khuẩn nội sinh được định nghĩa theo nhiều cách và những định nghĩa này được sửa đổi ngày một hoàn thiện hơn

Vi khuẩn nội sinh có thể sống bắt buộc trong mô thực vật suốt dòng đời của nó hoặc không Những vi khuẩn sống bắt buộc trong thực vật phải phụ thuộc vào cây chủ để sinh trưởng và phát triển; và chúng có thể truyền qua cây chủ khác theo chiều dọc hoặc thông qua vector Ngược lại, những vi khuẩn không sống bắt buộc trong mô thực vật có giai đoạn trong chu kỳ sống trải qua bên ngoài cây chủ, mà chủ yếu là môi trường đất

Sự thích nghi của vi khuẩn bên trong thực vật được cho là kết quả của của quá trình chọn lọc tự nhiên Vi khuẩn nội sinh có thể thúc đẩy tăng trưởng và năng suất cho cây chủ

và được xem như tác nhân kiểm soát sinh học (Ryan, 2008) vì chúng có khả năng chống lại mầm bệnh như nấm, vi khuẩn, tuyến trùng,… gây bênh cho cây trồng (Cao Ngọc Điệp, 2010)

2.3.1 Các nhóm vi khuẩn nội sinh

Vi khuẩn nội sinh tồn tại trong cây chủ không bị giới hạn bởi một loài duy nhất mà bao gồm nhiều chi và loài (Ryan et al., 2008) Mundt và Hinkle (1976) báo cáo rằng có khoảng 46 loài vi khuẩn nội sinh khác nhau từ 27 loài thực vật

Hình 2 Vi khuẩn Gluconacetobacter diazotrophicus (trái) và Burkholderia

ambifaria (phải)

(*Nguồn: http://genome.jgi-psf.org/gludi/gludi.home.html, 29/07/2013, http://genome.jgi-psf.org/bura6/bura6.home.html, 29/07/2013)

Azospirilum đại diện cho nhóm vi khuẩn rễ có khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực

vật tốt nhất (Steenhoudt và Vanderleyden, 2000) Chúng có khả năng cố định đạm, tương tác với cây và sản xuất phytohorrmone (Michiels, 1989)

Vi khuẩn thuộc chi Bacillus được báo cáo là vi khuẩn nội sinh trong hạt bắp ngô

(Rijavec et al., 2007) và không chỉ được phân lập từ cây bắp ngô (Chelius et al., 2001) mà còn từ nhiều cây khác như đậu, khoai tây, cây tùng bách,… (Elvira-Recuenco và Van Vuurde, 2000; Garbeva et al., 2001; Izumi et al., 2008) Mavingui et al (1992) thấy rằng

có những quần thể khác nhau của Bacillus polymyxa trong đất, rễ và vùng đất rễ Vi khuẩn thuộc chi Bacillus và Pseudomonas dễ dàng được nuôi cấy (Seghers et al., 2004)

Vi khuẩn Gluconacetobacter diazotrophicus có khả năng cố định đạm được mô tả

bởi Cavalcante và Do¨bereiner khi kết hợp với cây mía (1988) Vi khuẩn này cũng được tìm thấy trong tự nhiên ở những cây chủ khác Các nhà khoa học đã chứng minh rằng chúng có khả năng cố định đạm và tổng hợp IAA (Muthukumarasamy et al., 2002; Lee et al., 2004)

Rhizobium etli được tìm thấy như là vi khuẩn nội sinh tự nhiên của cây bắp ngô

trong lĩnh vực nông nghiệp truyền thống (Gutierrez-Zamora và Martınez-Romero, 2001)

Vi khuẩn nội sinh ở cây lúa thuộc các nhóm sau: Azospirilum sp (Kaneko, 2010), Azoarcus sp (Hurek et al., 1999) Rhizobium leguminosarum (Yanni et al., 1997), Herbaspirillium seropedicae (Olivares et al., 1996), Burkholderia sp và Rhizobium sp

Sự chuyển N2 thành ammonia được xúc tác bởi nitrogenase Enzyme này là một phức hệ metalloenzyme, chứa 2 thành phần protein: protein-Fe và protein Fe-Mo (Jacobson et al., 1989) Các thành phần cũng hoạt động của nitrogenase được mã hóa và

điều khiển bởi gen nif – được tìm thấy trên bộ nhiễm sắc thể của của vi khuẩn cố định

đạm và vi khuẩn lam, tuy nhiên, chúng thường được tìm thấy trên plasmid của vi khhuẩn cùng với những gen khác liên quan đến sự cố định đạm (wikipedia.org, 2013)

Theo Cao Ngọc Điệp (2011), phản ứng khử N2 dưới sự xúc tác của enzyme nitrogenase được tóm tắt như sau:

N2 + 6e- + 12ATP +12H2O => 3NH4+ + 12ADP + 12Pi + 4H+

Quá trình khử này bao gồm nhiều phản ứng khử kế tiếp nhau:

N2 + 2H+ => [NH=NH] + 2H+ => [NH2-NH2] + 2H+ => 2NH3

2.3.2.2 Khả năng hòa tan lân khó tan

Lân hiện diện trong đất được phân loại thành lân tan, lân vô cơ không tan và lân hữu

cơ không tan (Kucey et al., 1989) Cây trồng chỉ có thể sử dụng được lân từ đất dưới dạng hòa tan trong dung dịch đất Tỷ lệ lân hòa tan trong dung dịch đất chiếm rất nhỏ do khả năng phản ứng cao Lân vô cơ tan trong dung dịch đất tồn tại chủ yếu ở dạng orthophosphate bậc một hoặc bậc hai tùy thuộc vào pH môi trường và đây cũng là loại lân

mà tế bào hấp thụ nhiều nhất Tuy nhiên, dạng lân tồn tại phổ biến trong đất lại là lân vô

cơ khó tan như apatite, hydroxyapatite và oxyapatite (Cao Ngọc Điệp, 2011) Tuy nhiên, những dạng lân không tan này lại là nguồn dự trữ lân cho cây, trong điều kiện thích hợp chúng có thể chuyển thành dạng hòa tan và trở nên sẵn sàng cung cấp cho thực vật (Cao Ngọc Điệp et al., 2012) Phosphate vô cơ có thể được tìm thấy ở dạng kết hợp với sắt, nhôm, manganese mà chúng cũng khó tan và đồng hóa

Hầu hết đất nông nghiệp chứa lượng lớn lân, một phần đáng kể trong đó được tích tụ

là kết quả của việc bón phân thường xuyên Tuy nhiên, một lượng lớn phosphate vô cơ hòa tan cung cấp cho đất dưới dạng phân bón hóa học thì nhanh chóng bị cố định và trở thành dạng khó sử dụng với cây Hiện tượng cố định và kết tủa lân trong đất thường phụ thuộc lớn vào pH và dạng đất Về dạng phosphate hữu cơ, do chiếm tỉ lệ thấp trong đất khoáng nông nghiệp nên vai trò của dạng phosphate này trong đất thường được bỏ qua (Dalal, 1977) Phosphate hữu cơ trong đất chủ yếu ở dạng inositol phosphate (phytate đất) (Cao Ngọc Điệp, 2011)

Theo Cao Ngọc Điệp (2011), nhiều loài vi khuẩn có khả năng chuyển hóa dạng lân khó tan trong đất như calcium monohydrogen phosphate (CaHPO4), calcium monohydrogen dihydrat phosphate (CaHPO4.2H2O), calcium orthophosphate (Ca3(PO4)2) thành dạng lân dễ tan để cây trồng sử dụng Kucey et al (1989) giải thích sự hòa tan trên

là do sự bài tiết các acid hữu cơ và xác định tác nhân này làm giảm pH đất, điều quan trọng trong cơ chế hòa tan lân khó tan trong đất Trong sự khoáng hóa của những hợp chất này, các enzyme phosphatase đóng vai trò quan trọng Enzyme này có khả năng cắt bỏ nhóm phosphate của một cơ chất bằng cách thủy phân gốc acid phosphoric thành ion

phosphate và một phân tử có nhóm hydroxy tự do (http://en.wikipedia.org/wiki/ Phosphatase, 28/07/2013)

2.3.2.3 Khả năng tổng hợp Indole-3-acetic aicd (IAA)

Indole-3-acetic acid (IAA) là chất điều hòa sinh trưởng chủ yếu kiểm soát nhiều khía cạnh trong sự tăng trưởng và phát triển của thực vật, đây cũng là một dạng auxin Auxin có tác dụng tốt đến các quá trình sinh trưởng của tế bào, hoạt động của tầng phát sinh, sự hình thành rễ, hiện tượng ưu thế ngọn, tính hướng của thực vật, sự sinh trưởng của quả và tạo ra quả không hạt,

Auxin kích thích sự sinh trưởng giãn của tế bào Nhưng nếu kích thích với hàm lượng quá cao, tác dụng quá mạnh sẽ xảy ra hiện tượng ức chế ngược trở lại, lúc này auxin sẽ trở thành chất ức chế

Có nhiều lộ trình tổng hợp IAA trong thực vật, trong đó sử dụng tryptophan làm tiền chất để tổng hợp IAA được đề cập nhiều nhất Theo Koga et al (1991), những lộ trình sinh tổng hợp IAA gồm có:

Hình 3 Sơ đồ lộ trình tổng hợp IAA ở Enterobacter cloacae

(*Nguồn: Koga et al., 1991)

IAA được hình thành theo ba con đường: khử amin (deamination), khử carbon (decarboxylation) và thủy giải (hydrolysis) (Cao Ngọc Điệp, 2011) Những vi khuẩn nội sinh có khả năng tổng hợp IAA là do chúng chứa những enzyme đặc hiệu thuộc nhóm dehydrogenase

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện

Thí nghiệm được thực hiện tại phòng Vi sinh vật đất và phòng Vi sinh vật môi trường thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học (Viện NC&PT CNSH), trường Đại học Cần Thơ

Thời gian thực hiện: từ tháng 01/2013 đến tháng 12/2013

3.2 Phương tiện nghiên cứu

Bromothymol blue 0,5% trong KOH 0,2N 2 ml/l

Môi trường Burk không đạm

Bảng 3: Công thức môi trường Burk (Park et al, 2005)

1,8 cho môi trường bán đặc

Môi trường NBRIP

Bảng 4: Công thức môi trường NBRIP lỏng (Nautiyal, 1999)

 FeCl3, H2O2, H2SO4 đậm đặc, NaOH, NaOCl

 Dung dịch NH4+ 1 mg/l, dung dịch P2O5 10 mg/l, dung dịch IAA chuẩn 10 mg/l

3.2.3 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm

Các máy móc và thiết bị phục vụ cho thí nghiệm đều có sẵn ở viện NC&PT CNSH, trường Đại học Cần Thơ

- Kính hiển vi Olympus CHT (Nhật), kính hiển vi Olympus BH-2 (Nhật)

- Cân điện tử Sartorius (Đức)

- Nồi khử trùng nhiệt ướt Pbi-international (Đức)

- Tủ cấy vi sinh vật (Pháp), tủ ủ vi sinh vật Incucell 111 (Đức)

- Máy đo quang phổ

- Tủ sấy EHRET (Đức)

- Máy lắc mẫu GFL 3005 (Đức), máy Vortex

- pH kế Orion 420A (Hoa Kỳ)

- Máy ly tâm Eppendorf Centrifuge 5417C (Đức)

- Đĩa Petri, ống nghiệm, ống đong, ống Falcon, bình Erlenmeyer 100 ml – 500 ml, que cấy, đèn cồn, lame và lammen, tuýp eppendorf 1,5 ml và 2 ml, bộ micropipette Gibson P10, P20, P50, P200, P1000 (Đức) và các thiết bị thường dùng khác trong phòng thí nghiệm

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Thu thập và xử lý mẫu

- Mẫu lúa đang ở giai đoạn tăng trưởng mạnh được thu tại 5 địa điểm khác nhau tại huyện Phú Hòa, tỉnh Phú Yên, mỗi địa điểm chọn 4 – 5 mẫu tại vị trí khác nhau trên cánh đồng

- Rửa mẫu dưới vòi nước chảy mạnh cho sạch đất, loại bỏ những là già; cắt rời rễ, thân, lá và hạt thành từng đoạn nhỏ, để riêng trong túi nylon sạch, bảo quản ở 4oC nếu chưa phân lập

- Cho mẫu vào bình tam giác 100 ml và tiến hành khử trùng bề mặt lần lượt bằng các hóa chất sau: cồn 96%, và hydrogen peroxide (H2O2) 3%; sau mỗi lần khử trùng, rửa lại bằng nước cất vô trùng

- Rửa sạch mẫu bằng nước cất vô trùng 4 lần để tẩy rửa hóa chất còn thừa Để kiểm tra vi sinh vật còn sót lại trên bề mặt mẫu sau khi khử trùng, lấy 200 μl nước cất tiệt trùng rửa lần thứ 4 chủng trên môi trường Trypton – Yeast extract – Glucose agar, nếu sau 24 giờ, trên các đĩa môi trường này không xuất hiện khuẩn lạc thì các mẫu trên đã đạt yêu cầu

- Cho khoảng 2 g mẫu rễ (hoặc thân, lá, cuống lá, hạt) cho vào cối vô trùng giã nhuyễn, thêm 0,5 – 1 ml nước cất cô trùng vào cối, trộn và hút phần dịch trích cho vào tuyp 1,5 ml

- Sau 2 – 4 ngày, quan sát ống nghiệm, thấy có một lớp màng mỏng trên bề mặt môi trường, đó là dấu hiệu chứng tỏ sự hiện diện của vi khuẩn nội sinh

- Cấy chuyển vi khuẩn sang môi trường NFb đặc và ủ ở 30oC; sau 1-2 ngày, chọn những khuẩn lạc rời, đều nhau nằm trên dường cấy, cấy chuyển sang những đĩa môi trường khác cho tới khi quan sát dưới kính hiển vi thấy vi khuẩn đã ròng, chuyển mẫu ròng vào ống nghiệm chứa môi trường NFb đặc trữ ở -5oC và được xem là một dòng vi

khuẩn

3.3.3 Quan sát hình thái, đo kích thước khuẩn lạc

Khi cấy chuyển vi khuẩn trên đĩa môi trường phân lập đặc đồng thời tiến hành đo kích thước và quan sát hình thái các dạng khuẩn lạc bao gồm các chỉ tiêu: màu sắc, hình

dạng, độ nổi và dạng bìa khuẩn lạc bằng mắt thường Đối với những khuẩn lạc có kích thước quá nhỏ thì sử dụng kính lúp để quan sát

3.3.4 Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn

Sau khi phân lập, tiến hành quan sát hình dạng và sự chuyển động của vi khuẩn bằng phương pháp nhỏ giọt ép dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần theo Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp (2002)

Chuẩn bị mẫu vi khuẩn:

- Nhỏ 15 μl nước cất vô trùng lên kính mang vật (lame)

- Khử trùng kim cấy trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội

- Dùng kim cấy lấy một ít khuẩn lạc rồi trải đều lên giọt nước cất vô trùng trên kính mang vật

- Đậy kính đậy vật (lammelle) lên giọt huyền phù vi khuẩn bằng cách để một cạnh của kính đậy vật tiếp xúc với lame một góc 45o rồi hạ kính đậy vật xuống từ từ và nhẹ nhàng sao cho trong mẫu không có bọt khí

Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn ở độ phóng đại 400 lần

3.3.5 Nhuộm Gram vi khuẩn

Hình 4 Cấu trúc màng tế bào của vi khuẩn Gram âm và Gram dương

(*Nguồn: http://osamahiep.wordpress.com/2012/11/28/vi-khuan-gram-am-gram-duong-la-gi/, 18/11/2013)

Nguyên tắc:

Vi khuẩn Gram dương có thành tế bào dày, dạng lưới cấu tạo bởi peptidoglycan, chất này có khả năng giữ phức hợp tím tinh thể iot Trong khi đó, lớp thành tế bào peptidoglycan của các vi khuẩn Gram âm thì mỏng hơn và thường có thêm lớp màng lipopolysaccharide bên ngoài

Sau khi nhuộm với phức hợp tím tinh thể iot, mẫu được xử lí tiếp với hỗn hợp khử màu, làm mất nước của các lớp peptidoglycan trong thành tế bào Gram dương, từ đó làm giảm khoảng trống giữa các phân tử và khiến thành tế bào bắt giữ phức hợp tím tinh thể iot bên trong tế bào, nên tế bào vi khuẩn Gram dương có màu tím xanh của Crystal violet Đối với vi khuẩn Gram âm, hỗn hợp khử màu đóng vai trò là chất hoà tan lipid và làm tan màng ngoài của thành tế bào Lớp peptidoglycan mỏng không thể giữ lại phức hợp tím tinh thể-iot và tế bào Gram âm bị khử màu Vậy, tế bào Gram âm có màu hồng của Fushin

Quy trình:

- Lấy 10 μl nước cất vô trùng nhỏ lên kính mang vật

- Dùng que cấy đã khử trùng lấy một ít vi sinh vật trải đều lên kính

- Hơ mẫu vật trên ngọn lửa đền cồn, cố định vi sinh vật

- Nhỏ 1-2 giọt Crystal violet lên kính, trải đều khoảng 2 phút

- Rửa lại bằng nước cất vô trùng, để mẫu khô

- Rửa mẫu lại bằng cồn 70% đến khi mất hết nàu tím

- Rửa lại bằng nước cất vô trùng, để khô vài giây

- Nhỏ 1-2 giọt Fushin, trải đều, để yên 1 phút

- Rửa lại bằng nước cất vô trùng đến khi khi mất hết màu Fushin

- Dùng giấy thấm chấm nhẹ khô nước

- Quan sát dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần

3.3.5 Khảo sát khả năng tổng hợp NH 4 + bằng phương pháp Indolephenol Blue (Page

et al., 1982)

Do có khả năng tổng hợp đạm từ không khí, các vi khuẩn có khả năng cố định đạm

có thể phát triển trên môi trường không đạm Cấy chuyển các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường Burk không đạm đặc, ủ ở 30oC, theo dõi sự phát triển trong 1 – 2 ngày Những dòng phát triển được là những dòng có khả năng cố định đạm Những dòng

vi khuẩn này được nuôi tăng sinh trong môi trường NFb lỏng trong 1 – 2 ngày trước khi chủng vào môi trường Burk không đạm lỏng để tiến hành khảo sát khả năng cố định đạm sau 2, 4, 6 và 8 ngày

hypochloride (ở pH 8-11,5) hình thành hợp chất trung gian monochloramine Chất này sẽ kết hợp với phenol và hypochloride dư với sự xúc tác của nitroprusside tạo thành hợp chất Indolephenol có màu xanh

- Dung dịch mẹ Sodium hypochloride: cân 1,48 g NaOH và 4,98 g Na2HPO4, chuẩn

bị sẵn 80 ml nước và 20 ml dung dịch NaOCl, khi thêm NaOCl xong thì thêm nước ngay sau đó cho đủ 100 ml

0 đến 5 như bảng sau

Mẫu: ly tâm mẫu 12000 vòng/phút trong 5 phút; ống nghiệm được lần lượt thêm

vào: 2 ml nước khử khoáng, 0,5 ml mẫu đã ly tâm, 0,5 ml dung dịch EDTA, 1 ml dung dịch phenol – nitroprusside, 2 ml dung dịch sodium hypochloride; trộn đều bằng máy vortex, để ổn định ở nhiệt độ phòng trong 15 – 20 phút và tiến hành đo lượng đạm tổng hợp được bằng phương pháp quang phổ ở bước sóng 636 nm

3.3.6 Khảo sát khả năng hòa tan lân khó tan (Barrows et al., 1985)

Tương tự khảo sát năng cố định đạm, sau khi được cấy chuyển trên môi trường NBRIP đặc trong 1 – 2 ngày ở 30oC, các dòng vi khuẩn nội sinh phát triển tốt trên cả môi trường này và môi trường Burk không đạm được nhân sinh khối trong môi trường NFb lỏng rồi chủng vào môi trường NBRIP lỏng Khả năng hòa tan lân khó tan được định lượng sau 5, 10, 15 và 20 ngày

Nguyên tắc: Đánh giá hoạt tính phân giải phosphate của các chủng vi sinh vật dựa

trên nồng độ P2O5 có trong dịch nuôi cấy Nồng độ P2O5 càng cao chứng tỏ lượng phosphate khó tan bị phân giải càng nhiều Nồng độ P2O5 được xác định bằng phương pháp xanh molybdate Nguyên tắc của phương pháp là ion P2O5 sẽ phản ứng với ammonium molybdate tạo ra phức chất PMo12O40 3− màu vàng Phức chất này bị ascorbic acid khử thành phức màu xanh PMo12O40 7− Màu xanh càng đậm thì chứng tỏ lượng P2O5

càng nhiều

Chuẩn bị hóa chất:

- Dung dịch A: chuẩn bị sẵn 1 lít nước khử khoáng được đặt trong thau nước lạnh, cho từ từ 140 ml H2SO4 đậm đặc vào, để nguội; cân 12 g ammonium molybdate ((NH4)6Mo7O24) cho vào 100 ml nước khử khoáng; cân 0,2908 g potassium antymonyl tartrate (KSbOC4H4O6) cho vào 100 ml nước khử khoáng; trộn ba dung dịch trên lại rồi thêm nước cho đủ 2 l Chú ý: cẩn thận khi thao tác với H2SO4 đậm đặc

- Dung dịch B: cân 1,056 g acid ascorbic vào 200 ml dung dịch A

Mẫu: ly tâm mẫu 12000 vòng/phút trong 5 phút; ống nghiệm được lần lượt thêm

vào: 4 ml nước khử khoáng, 0,5 ml mẫu đã ly tâm, 4 ml dung dịch B, 4 ml nước khử khoáng; trộn đều bằng máy vortex, để ổn định ở nhiệt độ phòng trong 15 – 20 phút và tiến hành đo lượng lân được hòa tan bằng phương pháp quang phổ ở bước sóng 880 nm

3.3.7 Định lượng IAA bằng phương pháp Salkowski (Glickmann và Dessaux, 1995)

Cấy chuyển các dòng vi khuẩn nội sinh trên môi trường NFb đặc có bổ sung tryptophan (100 μl/ 100 ml) và ủ ở 30oC, theo dõi sự phát triển của chúng từ 1 – 2 ngày, dòng nào phát triển thì có khả năng tổng hợp IAA Chọn những dòng phát triển trên môi trường này đồng thời phát triển trên môi trường Burk không đạm và NBRIP đặc để tiến hành khảo sát khả năng tổng hợp IAA trên môi trường NFb lỏng có bổ sung tryptophan sau 2, 4, 6 và 8 ngày Mẫu được ủ trong tối

Nguyên tắc: IAA phản ứng với thuốc thử Salkowski cho màu hồng nhạt đến đỏ tùy

theo hàm lượng IAA trong dung dịch nuôi cấy

Chuẩn bị thuốc thử: đong 447 ml nước khử khoáng cho vào cốc có thể tích lớn

hơn 1 lít, đặt cốc này trong thau nước lạnh, cho từ từ 553 ml H2SO4 đậm đặc vào cốc trên,

để nguội; cân 4,5 g FeCl3 trong cốc khác cũng có thể tích lớn hơn 1 l; rót từ từ dung dịch

H2SO4 đã được pha loãng vào cốc chứa 4,5 g FeCl3, khuấy đều, để nguội; bảo quản trong chai tối màu

Xây dựng đường chuẩn:

Bảng 7: Đường chuẩn IAA

Mẫu: ly tâm mẫu 12000 vòng/phút trong 5 phút; ống nghiệm được lần lượt thêm

vào 0,5 ml mẫu đã ly tâm và 1 ml thuốc thử rồi được khuấy đều bằng máy vortex, ổn định

15 – 20 phút ở nhiệt độ phòng rồi đo lượng IAA tổng hợp được bằng phương pháp quang phổ ở bước sóng 530 nm Các bước trên đều phải được thực hiện trong tối

3.3.8 Xử lý số liệu

Số liệu thí nghiệm được xử lý và phân tích bằng phần mềm Microsorf Excel 2003 và các trị số trung bình của các nghiệm thức được đánh giá sự khác biệt bằng LSD.01