phân lập chất từ cao ethyl acetate của lá cây chùm ngây moringa oleifera lam. họ chùm ngây (moringaceae)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN PHẠM THỊ MAI NGÂN PHÂN LẬP CHẤT TỪ CAO ETHYL ACETATE CỦA LÁ CÂY CHÙM NGÂY MORINGA OLEIFERA LAM.. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

PHẠM THỊ MAI NGÂN

PHÂN LẬP CHẤT TỪ CAO ETHYL ACETATE

CỦA LÁ CÂY CHÙM NGÂY

MORINGA OLEIFERA LAM

HỌ CHÙM NGÂY (MORINGACEAE)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NG ÀNH: CỬ NHÂN HOÁ HỌC

2013

PHẠM THỊ MAI NGÂN

PHÂN LẬP CHẤT TỪ CAO ETHYL ACETATE

CỦA LÁ CÂY CHÙM NGÂY

MORINGA OLEIFERA LAM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Năm học 2013-2014

Đề tài: “PHÂN LẬP CHẤT TỪ CAO ETHYL ACETATE CỦA LÁ CÂY

CHÙM NG ÂY MORINGA OLEIFERA LAM.,

HỌ CHÙM NGÂY (MORINGACEAE)”

LỜI CAM ĐOAN

Tôi tên Phạm Thị Mai Ngân tác giả của luận văn này, tôi xin cam đoan luận văn đã được chỉnh sửa hoàn chỉnh theo ý kiến đóng góp của các thầy, cô trong hội đồng chấm bảo vệ luận văn

Ts Tôn Nữ Liên Hương

Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hoà Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Khoa Khoa Học Tự Nhiên Độc Lập-Tự Do-Hạnh Phúc

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

1 Cán bộ hướng dẫn: Ts Tôn Nữ Liên Hương

2 Đề tài: Phân lập chất từ cao ethyl acetate của lá cây Chùm ngây

Moringa oleifera Lam (Moringaceae)

3 Sinh viên thực hiện: Phạm Thị Mai Ngân MSSV: 2102462

4 Nội dung nhận xét:

a Nhận xét về hình thức của LVTN:

b Nhận xét về nội dung của LVTN (đề nghị ghi chi tiết đầy đủ):

 Đánh giá nội dung thực hiện đề tài:

 Những vấn đề còn hạn chế:

c Nhận xét đối với từng sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):

d Kết luận, đề nghị và điểm:

Cần Thơ, ngày……tháng……năm 2013

Cán bộ hướng dẫn

Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hoà Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Khoa Khoa Học Tự Nhiên Độc Lập-Tự Do-Hạnh Phúc

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ CHẤM PHẢN BIỆN

1 Cán bộ hướng dẫn: Ts Tôn Nữ Liên Hương

2 Đề tài: Phân lập chất từ cao ethyl acetate của lá cây Chùm ngây

Moringa oleifera Lam (Moringaceae)

3 Sinh viên thực hiện: Phạm Thị Mai Ngân MSSV: 2102462

4 Nội dung nhận xét:

a Nhận xét về hình thức của LVTN:

b Nhận xét về nội dung của LVTN (đề nghị ghi chi tiết đầy đủ):

 Đánh giá nội dung thực hiện đề tài:

 Những vấn đề còn hạn chế:

c Nhận xét đối với từng sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):

d Kết luận, đề nghị và điểm:

Cần Thơ, ngày……tháng……năm 2013

Cán bộ phản biện

LỜI CẢM ƠN - -

Trong suốt quá trình học tập ở bậc đại học, được sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô trong Bộ môn Hóa và bên cạnh việc thực hiện luận văn tốt nghiệp

đã giúp em tiếp thu được nhiều kiến thức bổ ích, tích lũy được nhiều kinh nghiệm quan trọng để hỗ trợ cho công việc sau này Đạt được kết quả như ngày hôm nay, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:

Tất cả các thầy cô trường Đại học Cần Thơ, đặc biệt là quý thầy cô của

Bộ môn Hóa - Khoa Khoa Học Tự Nhiên đã tận tình giảng dạy và truyền đạt kiến thức cho chúng em trong suốt quá trình học tập ở giảng đường Đại học Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô Tôn Nữ Liên Hương giảng viên chính Bộ môn Hóa - Khoa Khoa Học Tự Nhiên đã tận tình hướng dẫn và luôn tạo điều kiện để em hoàn thành tốt luận văn

Em xin gởi cảm ơn sâu sắc đến cô Ngô Kim Liên, thầy Lê Hoàng Ngoan,

đã luôn quan tâm, chỉ bảo và cho em những lời khuyên chân thành nhất trong quá trình theo học tại trường

Cảm ơn các anh chị và các bạn phòng thí nghiệm Hóa hữu cơ 1 đã giúp

đỡ và cho lời khuyên quý báu trong quá trình em thực hiện luận văn

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, người thân và các bạn trong lớp Hoá dược K36 Những người đã luôn bên em, động viên, ủng hộ và giúp đỡ em cả về vật chất lẫn tinh thần để em có thể hoàn thành tốt luận văn của mình

Em xin chân thành cảm ơn!

TÓM TẮT

Mục tiêu: Phân lập chất có trong cao ethyl acetate của lá cây chùm ngây

Moringa oliefera Lam., họ chùm ngây Moringaceae

Phương pháp: Lá chùm ngây được thu hái ở Tri Tôn - An Giang, mang

về phòng thí nghiệm phơi khô (tránh ánh nắng trực tiếp), xay thành bột và ly trích các hợp chất tự nhiên bằng dung môi methanol nóng theo phương pháp ngấm kiệt Chiết lỏng - lỏng cao methanol tổng để thu các phân đoạn có độ phân cực tăng dần gồm: cao hexane, cao dichloromethane, cao ethyl acetate và còn lại là cao nước Tiến hành sắc ký cột cao ethyl acetate cô lập được hợp chất tự nhiên MO-EA2

Kết quả: Trên cơ sở dữ liệu phổ MS, NMR một chiều và hai chiều xác định được MO-EA2 là Niazirine (C14H17O5N)

Kiến nghị: Các phân đoạn còn lại trong cao ethyl acetate được kiến nghị tiếp tục phân lập để tìm ra các hợp chất tự nhiên có giá trị khác

Từ khoá: Lá chùm ngây Moringa oleifera Lam., Niazirine

AB STRACT

Objectives: Isolate phytochemicals from the ethyl acetate extract of

Moringa oleifera (Moringaceae) leaves

Method: Moringa oleifera leaves collected from Tri Ton - An Giang,

Viet Nam, drying without the directed sun linght, milled and ground into coarse powder with the help of the mixer Extracting phytochemicals with warm methanol by percolation Methanol extract was partitioned with the different solvents to give up four polarity extracts as hexane, dichloromethane, ethyl acetate and water extract From the ethyl acetate extract after using column chromatography method, one pure phytochemical MO-EA2 was isolated

Results: The chemical structure of pure compound MO-EA2 was elucidaded base on its data of NMR (1D and 2D), MS and the comparision with some previous reports Show it is Niazirine (C14H17O5N)

There are some other phytochemicals from the ethyl acetate extract, they should be detected in the next theses

Keywords: Moringa oleifera leaves, Niazirin

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam kết luận văn này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi và kết quả của nghiên cứu này chưa được dùng cho bất cứ luận văn cùng cấp nào khác

Cần Thơ, ngày 8 tháng 12 năm 2013

MỤC LỤC

Trang

Lời cảm ơn iv

Tóm tắt v

Abstract vi

Lời cam đoan vii

Mục lục viii

Danh sách bảng x

Danh sách hình xi

Danh mục từ viết tắt và ký hiệu xii

Chương 1: Giới thiệu đề tài 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích nghiên cứu chính của đề tài 1

1.3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 2: Tổng quan tài liệu 3

2.1 Khái quát về họ chùm ngây (Moringaceae) 3

2.2 Đại cương về cây chùm ngây 3

2.2.1 Tên gọi 3

2.2.2 Vị trí trong hệ thống phân loại thực vật 3

2.2.3 Hình thái thực vật 4

2.2.4 Sinh thái phân bố 5

2.2.5 Thành phần dinh dưỡng trong cây chùm ngây 5

2.2.6 Công dụng của cây chùm ngây 7

2.2.7 Những nghiên cứu về tác dụng dược lý của cây chùm ngây 9

2.2.8 Những nghiên cứu về thành phần hoá học của chùm ngây 11

2.3 Giới thiệu về hợp chất glycosid 13

2.4 Cơ sở lý thuyết và một số phương pháp thực nghiệm 14

2.4.1 Các kỹ thuật chiết tách hợp chất thiên nhiên ra khỏi cây 14

2.4.2 Sắc ký cột hở 16

2.4.3 Sắc ký lớp mỏng 20

2.4.4 Sự kết tinh lại (Recrystallization) 24

Chương 3: Phương pháp nghiên cứu 25

3.1 Phương tiện nghiên cứu 25

3.1.1 Dụng cụ 25

3.1.2 Hoá chất 25

3.1.3 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 25

3.2 Phương pháp nghiên cứu 26

3.2.1 Phương pháp thu mẫu và sử lý mẫu 26

3.2.2 Phương pháp tách chiết 26

3.2.3 Phương pháp phân lập và tinh chế 26

3.2.4 Phương pháp khảo sát và xác định cấu trúc hoá học 26

3.3 Thực nghiệm 27

3.3.1 Điều chế cao 27

3.3.2 Khảo sát cao ethyl acetate 30

Chương 4: Kết quả và thảo luận 35

4.1 Kết quả thực nghiệm 35

4.2 Biện luận cấu trúc của MO-EA2 35

4.2.1 Thông tin nhận được từ phổ MS của MO-EA2 35

4.2.2 Thông tin nhận được từ phổ 1 H-NMR của MO-EA2 35

4.2.3 Thông tin từ phổ 13 C-NMR và DEPT-NMR của MO-EA2 36

4.2.4 Thông tin từ phổ HMBC và HSQC của MO-EA2 37

Chương 5: Kết luận và kiến nghị 40

5.1 Kết luận 40

5.2 Kiến nghị 40

Tài liệu tham khảo 41

Phụ lục 43

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2 1: Phân tích thành phần dinh dưỡng của Moringa oleifera Lam 6

Bảng 2 2: Các loại hợp chất có tính phân cực tăng dần 16

Bảng 2 3: Một vài thuốc thử hiện hình trong SKLM 23

Bảng 3 1: Kết quả SKC cao Ea 31

Bảng 3 2: Kết quả SKC phân đoạn Ea1 32

Bảng 3 3: Kết quả SKC phân đoạn Ea1.2 33

Bảng 4 2: Số liệu phổ 1 H-NMR, 13C-NMR và HMBC của MO-EA2 .38

Bảng 4 3: So sánh số liệu phổ 13 C-NMR của MO-EA2 và Niazirin 38

Bảng 4 4: So sánh số liệu phổ 1 H-NMR của MO-EA2 và Niazirin 39

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2 1: Vị trí cây chùm ngây trong hệ phân loại thực vật 3

Hình 2 2: Lá, hoa, quả và hạt của cây chùm ngây 4

Hình 2 3: Cấu trúc hoá học của một vài hợp chất glycosid 14

Hình 2 4: Cách tính giá trị Rf 20

Hình 3 1: Điều chế cao tổng bằng phương pháp ngấm kiệt .27

Hình 3 2: Quy trình điều chế các loại cao 29

Hình 3 3: SKLM cao Ea 30

Hình 3 4: SKC cao Ea 31

Hình 3 5: SKLM các phân đoạn Ea1, Ea2, Ea3 31

Hình 3 6: SKLM phân đoạn Ea1.1 và Ea1.2 32

Hình 3 7: SKLM các phân đoạn Ea1.2a, Ea1.2b, Ea1.2c, Ea1.2d 33

Hình 3 8: Phân đoạn chứa vết chính sau khi SKC phân đoạn Ea1.2d 34

Hình 3 9: Tinh thể MO-EA2 34

Hình 3 10: SKLM MO-EA2 với 3 hệ dung môi 34

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU ĐỀ TÀI 1.1 Đặt vấn đề

Lãnh thổ Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa - với điều kiện môi trường tự nhiên thuận lợi tạo nên một hệ thực vật rất phong phú và đa dạng Theo các số liệu thống kê mới nhất, thảm thực vật Việt Nam - nguồn tài nguyên sinh học quý giá có trên 12.000 loài Trong số đó có hơn 3.200 loài được sử dụng làm thuốc hay thực phẩm chức năng trong Y học dân gian Trong số các loài cây đang được quan tâm như là một loại thảo dược,

phải kể đến cây chùm ngây (Moringa oleifera Lam.) Cây phân bố tại nhiều

quốc gia nhiệt đới và cận nhiệt đới Các bộ phận của cây chứa nhiều khoáng chất quan trọng và là nguồn cung cấp chất đạm, vitamin, beta-carotene, acid amin và nhiều hợp chất biến dưỡng thứ cấp,…

Chùm ngây (Moringa oleifera Lam.) hiện được khoảng 80 quốc gia tiên

tiến sử dụng rộng rãi trong công nghệ dược phẩm, mỹ phẩm, nước giải khát và thực phẩm chức năng Các quốc gia đang phát triển sử dụng chùm ngây như một loại dược liệu chữa một số bệnh hiểm nghèo và nhiều bệnh thông thường Chùm ngây được xem là một cây đa dụng, rất hữu ích tại nhữ ng quốc gia nghèo nên được nghiên cứu khá nhiều về các hoạt tính dược dụng, giá trị dinh dưỡng và công nghiệp Đa số các nghiên cứu được thực hiện tại Ấn Độ, Philippines, và châu Phi

Ở Việt Nam, chưa có nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hoá học của cây chùm ngây Phần lớn các tác dụng của chùm ngây được biết đến thông qua truyền miệng hoặc từ một số nguồn sách báo quảng cáo của nước ngoài

Vì vậy, đề tài “Phân lập chất từ cao ethyl acetate của lá cây Chùm ngây

Moringa oleifera Lam., họ chùm ngây (Moringaceae)” được thực hiện với

mong muốn làm sáng tỏ kinh nghiệm sử dụng trong dân gian, nâng cao tính hiệu quả, an toàn trong việc sử dụng chùm ngây tại Việt Nam

1.2 Mục đích nghiên cứu chính của đề tài

Phân lập chất từ cao ethyl acetate của lá cây chùm ngây Moringa oleifera

Lam., họ chùm ngây ( Moringaceae)

Xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất phân lập được

1.3 Nội dung nghiên cứu

Tìm hiểu về cây chùm ngây Moringa oleifera Lam

Thu hái lá chùm ngây, rửa sạch, phơi trong mát đến khi khô, bóp nhuyễn, sấy ở 60ºC, sau đó nghiền thành bột

Chiết bột lá cây bằng phương pháp ngấm kiệt với methanol nóng, sau đó

cô quay để thu cao tổng

Tiến hành chiết lỏng - lỏng cao tổng lần lượt với các dung môi hexane, dichloromethane, ethyl acetate để thu các cao phân đoạn

Sử dụng sắc ký cột kết hợp với sắc ký lớp mỏng để phân lập chất trong cao ethyl acetate

Xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp hoá lý hiện đại (phổ MS, 1

H-NMR, 13C-NMR,…)

Tổng hợp, đánh giá kết quả và viết báo cáo

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Khái quát về họ chùm ngây (Moringaceae)

Họ chùm ngây chỉ gồm một chi duy nhất là chi chùm ngây, bao gồm khoảng 10 loài phân bố ở các vùng nhiệt đới trên thế giới Các loài trong chi

có hoa lưỡng tính, không đối xứng ở hai bên Bộ nhị 7-10, nhị đơn bào có cấu tạo uốn ngược, quả nang thuôn dài [1]

2.2 Đại cương về cây chùm ngây

2.2.1 Tên gọi

Tên khoa học: Moringa oleifera Lam., Moringa pterygosperma Gaertn

Tên Việt Nam: Bồn bồn, cải ngựa, độ sinh,

Tên nước ngoài: Drum - stic plant, horse - radish tree, ben seed (Anh); moringe à gaine ailée, bois néphrétique (Pháp) [2 ]

2.2.2 Vị trí trong hệ thống phân loại thực vật

Vị trí cây chùm ngây trong hệ thống phân loại thực vật [3]

Giới thực vật bậc cao

Lớp Ngọc lan Ngành Ngọc lan

Bộ Cải

Họ Chùm ngây (Moringaceae)

Chi Chùm ngây

(Moringa)

Loài

(Moringa oleifera Lam.)

Hình 2 1: Vị trí cây chùm ngây trong hệ phân loại thực vật

http://moringa.clb4u.com/2013/11/chua-benh-tu-cay-chum-ngay-2.2.4 Sinh thái phân bố

Moringa là một chi nhỏ, gồm một số loài thân gỗ mềm, mọc nhánh phân

bố ở vùng nhiệt đới châu Á và châu Phi Ở Ấn Độ có 2 loài

Chùm ngây có vùng bản địa là Tây Bắc Ấn Độ và Pakistan, sau được đưa vào trồng rộng rãi ở Ấn Độ và nhiều nước Đông Nam Á khác Hiện nay vẫn tồn tại quần thể chùm ngây mọc hoang dại ở cận Hymalaya, từ vùng Chenab phía Đông của Sarda (Ấn Độ)

Ở Việt Nam, chùm ngây được trồng rải rác ở các tỉnh phía Nam, từ Quảng Nam trở vào Cây ưa sáng và ưa khí hậu nhiệt đới nóng ẩm Chùm ngây có thể sống và phát triển tốt trên nhiều loại đất, từ loại đất đỏ bazan ở Tây Nguyên đến đất sét pha cát hoặc trên đất cát vùng ven biển Cây trồng bằng hạt hay bằng cành, sau 2 năm bắt đầu có hoa Cây trồng ở miền Nam thường ra hoa, quả một vụ trong năm Ở vùng Nam Ấn Độ, hàng năm có 2 vụ hoa quả thậm chí có hoa quả rải rác quanh năm [5]

Chùm ngây thường rụng lá vào mùa khô hoặc mùa đông (ở miền Nam) Mùa ra lá và chồi non thường trùng với mùa hoa Ở Ấn Độ và các nước Đông Nam Á, chùm ngây được coi là một cây cho quả non và lá làm rau ăn thông dụng Người ta có thể thu hái quả non làm rau sau 55-70 ngày kể từ ngày hoa

nở và quả chín sau 100-115 ngày [6]

2.2.5 Thành phần dinh dƣỡng trong cây chùm ngây

Cây chùm ngây chứa hơn 90 chất dinh dưỡng tổng hợp Những chất dinh dưỡng cần thiết để giữ gìn sức khỏe con người, giảm nguy cơ từ những chứng bệnh suy thoái, chữa trị nhiều bệnh thông thường Lá và thân non chùm ngây giàu chất dinh dưỡng hiện được hai tổ chức WHO và FAO xem là giải pháp

ưu việt cho các bà mẹ thiếu sữa và trẻ em suy dinh dưỡng [7]

Thành phần dinh dưỡng của cây c hùm ngây theo số liệu báo cáo của Campden and Chorleywood Food Research Association in Conjunction được trình bày trong Bảng 2 1

Bảng 2 1: Phân tích thành phần dinh dưỡng của Moringa oleifera Lam

STT Thành phần dinh dưỡng/100 g Trái tươi Lá tươi Bột lá khô

2.2.6 Công dụng của cây chùm ngây [8]

2.2.6.1 Thực phẩm

Tất cả các sản phẩm thực phẩm của Moringa oleifera Lam đều có giá trị

dinh dưỡng rất cao Có thể ăn lá, đặc biệt là chồi non, quả non, hoa, rễ và cả

vỏ cây Lá ít chất béo và carbohydrate, giàu khoáng chất, sắt và vitamin B Lá chùm ngây đặc biệt hữu ích như là một loại thực phẩm của con người vì lá xuất hiện vào cuối mùa khô khi các nguồn rau xanh khác ít đi

2.2.6.2 Thức ăn gia súc

Trâu bò, cừu, lợn, dê, gia cầm gặm vỏ cây, lá và chồi non của Moringa

oleifera Lam các chế độ ăn uống tốt nhất cho lợn là 70% Moringa oleifera

Lam., 10% Leucaena và 20% các lá khác Chế độ ăn uống có thể đổi thành 100% Moringa oleifera Lam nhưng không quá 30% Leucaena

2.2.6.3 Làm trong nước

Bột của hạt được sử dụng như một phương pháp nhanh và đơn giản để làm trong nước bị đục Bột này kết hợp với chất rắn trong nước và lắng xuống đáy Cách này cũng có thể làm giảm từ 90-99% lượng vi khuẩn trong nước Sử

dụng Moringa oleifera Lam để làm trong nước có thể thay thế cho các hóa

chất như nhôm sulfate, vừa độc cho môi trường lại đắt tiền

2.2.6.4 Dược liệu tự nhiên

Cọ xát lá vào thái dương có thể làm giảm đau đầu

Dùng lá tươi đắp vào vết cắt nông để cầm máu

Có tác dụng chống vi khuẩn và chống viêm khi áp dụng cho vết thương hoặc vết côn trùng cắn

Dịch chiết từ lá có thể được sử dụng để chống lại lở loét da do vi khuẩn hay nấm

Trà lá chùm ngây được dùng để điều trị loét dạ dày và tiêu chảy

Sử dụng chùm ngây làm thực phẩm tốt cho những người bị suy dinh dưỡng do có hàm lượng protein và chất xơ cao

b Hoa

Nước ép hoa cải thiện chất lượng của sữa mẹ khi đang cho con bú

Nước ép hoa cũng hữu ích trong các vấn đề tiết niệu, giúp nhuận tiểu

có thể được sử dụng để điều trị các bệnh tương tự

Hạt rang và dầu giúp lợi tiểu

2.2.6.6 Hàng rào xanh

Chùm ngây còn được trồng để làm hàng rào, chắn gió và tạo bóng mát Cây phát triển rất nhanh và nếu trồng gần nhau chúng sẽ tạo thành một hàng rào chỉ trong 3 tháng

2.2.6.7 Thuốc trừ sâu tự nhi ên

Bằng cách chôn lá chùm ngây vào đất trước khi trồng cây giống, nó giúp

làm giảm mầm bệnh (Pythium debaryanum) cho cây giống

2.2.6.8 Củi và sử dụng vào mục đích khác

Gỗ làm nhiên liệu tốt để nấu ăn Tuy nhiên, nó không thích hợp cho việc xây dựng Vỏ cây được dần ra tạo thành sợi được sử dụng để làm dây thừng, thảm và sản xuất thuốc nhuộm màu Dăm gỗ được sử dụng để làm bột giấy chất lượng tốt

2.2.7 Những nghiên cứu về tác dụng dƣợc lý của cây chùm ngây

Chùm ngây được xem là một cây đa dụng, rất hữu ích tại những quốc gia nghèo nên được nghiên cứu khá nhiều về các hoạt tính dược dụng, giá trị dinh dưỡng và công nghiệp Đa số các nghiên cứu được thực hiện tại Ấn Độ, Philippines và châu Phi

2.2.7.1 Hoạt tính kháng nấm gây bệnh

Nghiên cứu tại Institute of Bioagricultural Sciences, Academia Sinica, Đài Bắc (Taiwan) ghi nhận dịch chiết từ lá và hạt chùm ngây bằng ethanol có

hoạt tính diệt được nấm gây bệnh loại Trichophyton rubrum, Trichophyton

mentagrophytes, Epidermophyton floccosum và Microsporum canis [9]

2.2.7.2 Tác dụng của quả chùm ngây trên cholesterol và lipid trong máu

Nghiên cứu tại Đại học Baroda, Kalabhavan, Gujarat (Ấn Độ) về hoạt tính trên lipid của quả chùm ngây thử trên thỏ, ghi nhận: Thỏ cho ăn chùm ngây (200 mg/kg/ngày) hay uống Lovastatin (6 mg/kg/ngày) trộn trong một hỗn hợp thực phẩm có tính tạo cholesterol cao, thử nghiệm kéo dài 120 ngày Kết quả cho thấy chùm ngây và Lovastatin có tác dụng gây hạ cholesterol, phospholipid, triglyceride, VLDL, LDL hạ tỷ số cholesterol/phospholipid trong máu, so với thỏ trong nhóm đối chứng Riêng chùm ngây còn có thêm

tác dụng làm tăng sự thải loại cholesterol qua phân [10]

2.2.7.3 Các hoạt tính chống co - giật, chống sƣng và gây lợi tiểu

Dịch chiết bằng nước nóng của hoa, lá, rễ, hạt và vỏ thân chùm ngây đã được nghiên cứu tại trung tâm nghiên cứu kỹ thuật (CEMAT) tại Guatamala

về các hoạt tính dược học thử trên chuột Hoạt tính chống co giật được chứng minh bằng thử nghiệm trên chuột đã cô lập, hoạt tính chống sưng thử trên chân chuột bị gây phù bằng carrageenan và tác dụng lợi tiểu bằng lượng nước tiểu thu được khi chuột được nuôi nhốt trong lồng Nước chiết từ hạt cho thấy tác động ức chế khá rõ sự co giật gây ra bởi acetylcholine ở liều

ED50 = 65,6 mg/mL môi trường, tác động ức chế phù gây ra do carrageenan được định ở 1000 mg/kg và hoạt tính lợi tiểu cũng ở 1000 mg/kg [11]

2.2.7.4 Các chất gây đột biến genes từ hạt chùm ngây rang chín

Một số hợp chất gây đột biến genes đã được tìm thấy trong hạt chùm ngây rang chín: Các chất quan trọng nhất được xác định là 4-(α-L-rhamnosyloxy) phenylacetonitrile; 4-hydroxyphenylacetonitrile và 4-hydroxyphenyl-acetamide [12]

2.2.7.5 Khả năng ngừa thai của rễ chùm ngây

Nghiên cứu tại Đại học Jiwaji, Gwalior (Ấn Độ) về các hoạt tính estrogenic, kháng estrogenic và ngừa thai c ủa nước chiết từ rễ chùm ngây Thử nghiệm trên chuột đã bị cắt buồng trứng, cho uống nước chiết, có sự gia tăng trọng lượng của tử cung Hoạt tính estrogenic được chứng minh bằng sự kích thích hoạt động mô tế bào tử cung Khi cho chuột uống nước chiết này chung với Estradiol dipropionate (EDP) thì có sự tiếp nối tụt giảm trọng lượng của tử cung so sánh với sự gia tăng trọng lượng khi chỉ cho chuột uống riêng EDP Trong thử nghiệm deciduoma liều cao nhất 600 mg/kg có tác động gây rối loạn sự tạo deciduoma ở 50% số chuột thử Tác dụng ngừa thai của rễ chùm ngây được cho là do nhiều yếu tố phối hợp [13]

2.2.7.6 Hoạt tính kháng sinh của hạt chùm ngây

4-(α-L-rhamnosyloxy) benzyl isothiocyanate được xác định là có hoạt tính kháng sinh mạnh nhất trong các hoạt chất chiết từ hạt chùm ngây (trong hạt chùm ngây còn có benzyl isothiocyanate) Hợp chất trên ức chế sự tăng trưởng của nhiều vi khuẩn và nấm gây bệnh Nồng độ tối thiểu để ức chế

Bacillus subtilis là 56 μmol/L và để ức chế Mycobacterium phlei là

40 μmol/L [14]

2.2.7.7 Hoạt tính của rễ chùm ngây trên sạn thận loại oxalate

Thử nghiệm tại Đại học Dược K.L.E.S, Nehru Nagar, Karnakata (Ấn Độ) trên chuột bị gây sạn thận oxalate bằng ethylen glycol ghi nhận dịch chiết bằng nước và alcohol của rễ cùng lõi gỗ chùm ngây làm giảm rõ rệt nồng độ oxalate trong nước tiểu bằng cách can thiệp vào sự tổng hợp oxalate trong cơ thể Sự kết đọng tạo sạn trong thận cũng giảm rất rõ khi cho chuột dùng dịch

2.2.8 Những nghiên cứu về thành phần hoá học của chùm ngây 2.2.8.1 Trong nước

Được biết ở Việt Nam chưa có nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hóa học của cây chùm ngây

lá non tương ứng là 27 mg/g, 15 mg/g [16]

Năm 2007, Manguro L.O và Lemmen P đã phân lập trong lá cây chùm

ngây các hợp chất phenolic như: Kaempferol 3-O-(2˝,3˝-diacetylglucoside),

Kaempferol 3-O-(2˝-O-galloyrhamnoseside), Kaempferol galloyrutinose)-7-O-α-rhramnose, Kaempferol 3-O-[β-glucosyl-(12)]-[α- rhamnosyl-(16)]-β-glucoside-7-O-α-rhamnoside, Kaempferol 3-O-[β- rhamosyl-(12)]-[α-rhamnosyl-(14)]-β-glucoside-7-O-α-rhamnoside,

3-O-(2˝-O-Benzoic acid 4-O-β-glucoside, 3-O-(2˝-O-Benzoic acid glucoside, Benzaldehyde 4-O-β-glucoside, Kaempferol 3-O-α-rhamnoside,

4-O-α-rhamnosyl-(12)-β-Kaempferol, Syringic acid, Gallic acid, Rutin, Quercetin [17]

Năm 2001, Makkar H.P.S., Becker K., Anwar F., Ashraf M., và Bhangger M.I đã công bố lá, hoa và quả chùm ngây là nguồn cung cấp lý tưởng với hàm lượng cao các acid ascorbic, các hormon estrogen, β-sitosterol, sắt, canxi, phosphor, đồng, vitamin A, B, C, α-tocopherol, riboflavin, acid nicotinic, acid folic, pyridoxin, β-carotene, protein và những acid amin thiết yếu như Methionine, Cystein, Tryptophan, Lysine, Leucine, Isoleucine, Phenyl alanin, Tyrosine, Valine, Histidine, Threonine, [18, 19]

Năm 2010, Patel S., Thakur A.S., Chandy A., và Manigauha A., đã phân

lập được Niazirin, Niazirinin, Niaziminin A và B, 4-(4´-O-acetyl-α-Lrhamnosyloxy) benzyl isothiocyanate [20]

-Năm 1945, RuBeena Saleem cùng cộng sự đã phân lập được các hợp

chất: Niazicinin A và B, 4-(2´,3´,4´-tri-O-acetyl-α-L-rhamnosyloxy) benzyl

nitrile, Methyl-4-(2´,3´,4´-tri-O-acetyl-α-L-rhamnosyloxy) benzyl carbamate

(E), Methyl-4-(2´,3´,4´-tri-O-acetyl-α-L-rhamnosyloxy) benzyl carbamate (Z),

O-Methyl-4-(2´,3´,4´-tri-O-acetyl-α-L-rhamnosyloxy) benzyl thiocarbamate

(E), O-Methyl-4-(2´,3´,4´-tri-O-acetyl-α-L-rhamnosyloxy) benzyl

thiocarbamate (Z), Ethyl-4-(2´,3´,4´-tri-O-acetyl-α-L-rhamnosyloxy) benzyl

carbamate (E), O-Ethyl-4-(2´,3´,4´-tri-O-acetyl-α-L-rhamnosyloxy) benzyl isothiocyanate,… [8]

b Cấu trúc của một vài hợp chất đƣợc phân lập từ lá chùm ngây

O

O HO

OH O

OH

OH OH OH

O O HO

H 3 C

HO OH

H 3 C

OH

O HO

OH HO

OH OH

O

O HO

C S

O

O O

N

HO

H 3 C

OH HO

C S

4-(4'-O-acetyl-α-L-rhamnopyranosyloxy) 4-(α-L-rhamnopyranosyloxy)

benzyl isothiocyanate benzyl isothiocyanate

O

N

O

N

O

CH 3

OH HO

O

Methyl-4-(2´,3´,4´-tri-O-acetyl-α-L-rhamnosyloxy) benzyl carbamate

2.3 Giới thiệu về hợp chất glycosid

Các glycosid hiện diện trong rất nhiều họ thực vật và ở tất cả các bộ phận cây: lá, vỏ, hạt, Các glycosid thường là chất kết tinh và có vị đắng

Glycosid là hợp chất mà cấu trúc hoá học gồm hai phần: phần đường và phần không đường thường được gọi là aglycon Dưới tác dụng của enzyme thực vật hoặc acid hoặc kiềm, glycoside bị thuỷ phân thành aglycon và phần đường

Phần đường của glycosid: Phần đường phổ biến là D-glucose,

D-galactose, L-arabinose, L-rhamnose, D-xylose, acid glucuronic, acid galacturonic và một số đường khác

Phần aglycon của glycosid: Phần aglycon rất đa dạng gồm tất cả các loại hợp chất tự nhiên như: monoterpen, sesquiterpen, diterpen, triterpen, steroid, iridoid, flavonoid, alcoloid, quinonoid, polyphenol, [21] Một số hợp chất tiêu biểu được trình bày trong Hình 2.3

HO HOH 2 C

Ptaquilosid

(Hypolepis punctata)

Sesquiterpen glucosid

O HO

O HOH 2 C O OH HO

H

CH 3 COO

C OCH 3 S

HO OH

HO HO OH O

O OH

OH

CH 3

OH OH

Hình 2 3: Cấu trúc hoá học của một vài hợp chất glycosid

2.4 Cơ sở lý thuyết và một số phương pháp thực nghiệm

2.4.1 Các kỹ thuật chiết tách hợp chất thiên nhiên ra khỏi cây

Có nhiều cách để chiết tách hợp chất hữu cơ ra khỏi cây cỏ Các kỹ thuật đều xoay quanh hai phương pháp chính là chiết lỏng - lỏng và chiết rắn - lỏng [21]

2.4.1.1 Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng

Kỹ thuật này còn được gọi là sự chiết bằng dung môi, thường được sử dụng để chia cao alcol thô ban đầu, hoặc dung dịch ban đầu thành các phân

Việc chiết lỏng - lỏng được thực hiện bằng bình lóng ở nhiệt độ phòng, trong đó cao alcol thô ban đầu được hòa tan vào pha nước Việc chiết sẽ được thực hiện lần lượt từ dung môi hữu cơ kém phân cực đến dung môi hữu cơ phân cực Dung dịch thu được sau các lần chiết sẽ được gom chung lại, làm khan nước, đuổi dung môi thu được cao chiết

Sự chiết bởi một dung môi cụ thể nào đó được coi là hoàn tất khi lần chiết thứ n, trên bản mỏng không còn nhìn thấy vết của chất đó trong pha nước cũng như trong pha hữu cơ Cũng có thể kiểm tra bằng cách nhỏ một giọt dung dịch chiết lần thứ n lên trên một tấm kiếng sạch, sau khi bay hết dung môi, không còn để lại vết gì trên mặt kiếng

2.4.1.2 Kỹ thuật chiết rắn - lỏng

a Kỹ thuật chiết ngấm kiệt

Ngấm kiệt là một phương pháp chiết liên tục trong đó dung môi được cho đi qua mẫu theo một hướng nhất định, với một tốc độ nhất định Quá trình hòa tan xảy ra trong phương pháp ngấm kiệt theo gradient nồng độ

Dụng cụ: Gồm một bình ngấm kiệt bằng thủy tinh, hình trụ đứng, dưới đáy bình là một van khóa để điều chỉnh vận tốc của dung dịch chảy ra, một bình chứa đặt bên dưới để hứng dung dịch chiết Phía trên cao của bình ngấm kiệt là bình lóng để chứa dung môi tinh khiết

Bột cây được xay thô đến kích cỡ thích hợp Đáy của bình ngấm kiệt được lót bằng một lớp bông, tốt hơn là bông thủy tinh và một tờ giấy lọc Bột cây được đặt vào bình, lên trên lớp bông thủy tinh, lên gần đầy bình Đậy bề mặt lớp bột bằng một tờ giấy lọc và chặn lên bằng những viên bi thủy tinh để dung môi không làm xáo trộn bề mặt lớp bột Từ từ rót dung môi cần chiết vào bình cho đến khi dung môi phủ xấp xấp phía trên lớp mặt Có thể sử dụng dung môi nóng hoặc nguội

Để yên một thời gian, thường là 12-24 giờ Mở van bình ngấm kiệt cho dịch chiết chảy ra từng giọt nhanh và đồng thời mở khóa bình ló ng để dung môi tinh khiết chảy xuống bình ngấm kiệt Điều chỉnh sao cho vận tốc dung môi tinh khiết chảy vào bình ngấm kiệt bằng vận tốc dung dịch chiết chảy ra khỏi bình này

b Kỹ thuật chiết ngâm dầm

Kỹ thuật ngâm dầm cũng tương tự như kỹ thuật chiết ngấm kiệt nhưng không đòi hỏi thiết bị phức tạp, vì thế có thể dễ dàng thao tác với một lượng lớn mẫu cây

Ngâm dầm là một phương pháp chiết gián đoạn trong đó toàn bộ lượng dung môi được tiếp xúc đồng thời với toàn bộ lượng mẫu trong những dụng cụ thích hợp.

Ngâm bột cây trong một bình chứa bằng thủy tinh, bình có nắp đậy Rót dung môi tinh khiết vào bình cho đến xấp xấp bề mặt của lớp bột cây Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày, để cho dung môi xuyên thấm vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên Sau đó, dung dịch chiết được lọc ngang qua một tờ giấy lọc, thu hồi dung môi

sẽ có được cao chiết Tiếp theo, rót dung môi mới vào bình chứa bột cây và tiếp tục quá trình chiết thêm một số lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây

2.4.2 Sắc ký cột hở

Sắc ký cột hở được tiến hành ở áp suất khí quyển Pha tĩnh là chất hấp thu, mẫu chất cần phân tích được nạp lên đầu cột, phía trên pha tĩnh Pha động

là các dung môi giải ly cột [21]

2.4.2.1 Lựa chọn chất hấp thu và dung môi để khởi đầu giải ly

Trong loại sắc ký cột với pha tĩnh là silica gel loại thường, hợp chất không phân cực được giải ly ra khỏi cột trước, hợp chất phân cực được giải ly sau

Bảng 2 2: Các loại hợp chất có tính phân cực tăng dần

Loại hợp chất Thứ tự giải ly ra khỏi cột

Hydrocarbon Nhanh, với dung môi không phân cực

Các hợp chất kiềm mạnh Chậm nhất, cần dung môi phân cực

a Lựa chọn chất hấp thu để nhồi cột

b Chọn dung môi bắt đầu cho quá trình sắc ký cột

Trước khi triển khai sắc ký cột, nhất thiết phải sử dụng sắc ký lớp mỏng

để dò tìm hệ dung môi giải ly cho phù hợp Các bước tuần tự như sau:

Mẫu chất cần sắc ký được hòa tan trong dung môi phù hợp, với nồng độ

10 mg/mL Gọi là dung dịch mẫu (A)

Chuẩn bị 5-6 tấm bản mỏng (2×5 cm), chấm lên những tấm bảng này, mỗi chấm khoảng 2-5 µL dung dịch mẫu (A)

Mỗi bảng được giải ly với các dung môi hoặc hệ dung môi có độ phân cực khác nhau, tiến hành hiện hình các vết ở mỗi bảng bằng UV hay thuốc thử

Đối với mẫu cao thô chiết xuất từ cây cỏ, chọn dung môi giải ly đầu tiên

là dung môi có thể đẩy vết ít phân cực nhất của cao chiết lên vị trí ở bảng với

Rƒ = 0,5 và chọn dung môi chấm dứt sắc ký cột là dung môi có thể đẩy vết phân cực nhất của cao chiết với Rƒ = 0,2

Sau khi chọn được hệ dung môi phù hợp, có thể áp dụng dung môi này cho sắc ký cột Giải ly trước tiên bằng dung môi không phân cực và tăng dần

độ phân cực cho dung môi giải ly

2.4.2.2 Tỉ lệ giữa lượng mẫu chất cần tách đối với kích thước cột

a Tỷ lệ lượng mẫu cần tách và lượng chất hấp thu sử dụng

Trọng lượng của chất hấp thu phải lớn hơn 25-50 lần lượng mẫu cần sắc

ký Tuy nhiên, đối với những hỗn hợp mẫu chất khó tách riêng thì cần sử dụng lượng chất hấp thu nhiều hơn (lớn hơn 100-200 lần), còn với các hỗn hợp dễ tách thì có thể sử dụng lượng chất hấp thu ít hơn

b Tỷ lệ giữa chiều cao chất hấp thu trong cột và đường kính trong của cột sắc ký

Các khảo sát thực nghiêm cho thấy muốn tách chất tốt, chiều cao của chất hấp thu nạp trong cột cần đạt tỉ lệ: Chiều cao chất hấp thu : Đường kính trong của cột vào khoảng (10 : 1)

2.4.2.3 Nạp chất hấp thu vào cột

Muốn tách riêng các hợp chất trong hỗn hợp một cách có hiệu quả, chất hấp thu phải được nạp trong cột một cách đồng nhất để hạn chế những dày xéo, bất thường

Có hai kiểu nạp chất hấp thu vào cột: nạp sệt và nạp khô

a Nạp chất hấp thu dạng sệt vào cột

Dùng kẹp giữ cho cột thẳng đứng trên giá Phần đầu ra của cột không có miếng thuỷ tinh xốp để chặn thì có thể dùng một bông thuỷ tinh để chặn Chất hấp thu được nạp vào cột ở dạng sệt, được chuẩn bị như sau:

Trong một cốc đã chứa sẵn dung môi (dung môi bắt đầu cho quá trình giải ly cột), cho chất hấp thu từ từ vào cốc, đều đặn, mỗi lần một lượng nhỏ, vừa rót vừa khuấy nhẹ đều

Nhờ một phễu lọc có đuôi dài đặt trên đầu cột, rót hỗn hợp sệt vào cột, vừa mở nhẹ khóa ở bên dưới cột để dung môi chảy ra

Tiếp tục rót hỗn hợp sệt vào cột cho đến khi hết số lượng, vừa rót vừa dùng một thanh cao su gõ nhẹ vào bên ngoài thành cột để chất hấp thu nén đều trong cột

Sau khi nạp xong, cho dung môi chảy ra và rót trở lại vào đầu cột vài ba lần để cột được nạp chặt hơn, cho đến khi chất hấp thu trong cột có dạng đồng nhất

b Nạp chất hấp thu dạng khô vào cột

Dùng kẹp giữ cho cột thẳng đứng trên giá, cho dung môi loại kém phân cực nhất có thể vào khoảng hai phần ba chiều cao cột Ngang qua một phễu lọc có đuôi dài, cho chất hấp thu ở dạng bột khô vào thẳng trong cột, đều đặn mỗi lần một lượng nhỏ, vừa cho vừa gõ nhẹ thành cột Khi lớp chất hấp thu đạt được chiều cao khoảng 2 cm trong cột, thì mở nhẹ khoá ở bên dưới cho dung môi chảy ra, hứng vào một becher trống để ở bên dưới cột, dung môi này được sử dụng lại để rót trả lại lên đầu cột

Sau khi nạp xong cho dung môi chảy qua chất hấp thu vài lần đến khi thấy chất hấp thu trong cột có dạng đồng nhất

2.4.2.4 Nạp mẫu chất cần tách lên đầu cột sắc ký

a Nạp mẫu chất ở dạng dung dịch

Nếu mẫu ở dạng lỏng có thể cho trực tiếp lên đầu cột sắc ký Nếu mẫu ở dạng rắn, hòa tan mẫu chất vào một lượng nhỏ dung môi, loại dung môi khởi đầu cho SKC Thực hiện nạp mẫu lên cột như sau: