phân lập vi khuẩn từ ruột tôm sú và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết lá cỏ mực (eclipta alba h.)

PHẦN KÝ DUYỆT Đề tài: “Phân lập vi khuẩn từ ruột tôm sú bệnh và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao cây cỏ mực Eclipta alba H.” do sinh viên Trương Phạm Thảo Quỳnh thực hiện đã đượ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ALBA H.)

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

TS ĐÁI THỊ XUÂN TRANG

KHOA: KHOA HỌC TỰ NHIÊN

SINH VIÊN THỰC HIỆN TRƯƠNG PHAM THẢO QUỲNH MSSV: 3102677

LỚP: CỬ NHÂN SINH HỌC – K36

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của cán bộ hướng dẫn và tôi Các kết quả trình bày trong luận văn này là trung thực và chưa từng được ai nghiên cứu trong bất kì công trình nghiên cứu của luận văn nào

PHẦN KÝ DUYỆT

Đề tài: “Phân lập vi khuẩn từ ruột tôm sú bệnh và khảo sát hoạt tính

kháng khuẩn của cao cây cỏ mực (Eclipta alba H.)” do sinh viên Trương Phạm

Thảo Quỳnh thực hiện đã được duyệt thông qua hội đồng phản biện luận văn tốt

nghiệp đại học

Cần Thơ, ngày….tháng….năm 2013 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

TS: Đái Thị Xuân Trang

LỜI CẢM TẠ

Để đề tài luận văn này được hoàn thành thuận lợi, bên cạnh sự cố gắng của chính bản thân, tôi còn nhận được rất nhiều sự động viên, giúp đỡ từ thầy, cô, gia đình, bạn bè và các anh, chị khóa trên Tôi chân thành gửi lời tri ân đến:

Cô Đái thị Xuân Trang và cô Võ Thị Tú Anh đã tận tâm hướng dẫn, truyền đạt những kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian học tập cũng như trong tiến trình làm luận văn tốt nghiệp

Thầy Quách Quang Huy và Phạm Kháng Nguyên Huân đã luôn đồng hành và giúp đỡ tận tình trong suốt 4 năm học qua

Toàn thể Cán bộ của bộ môn Sinh học, khoa Khoa học tự nhiên đã truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý báu và luôn quan tâm, giúp đỡ tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho chúng em học tập - nghiên cứu

Gia đình thân yêu luôn ở bên chăm sóc, cổ vũ và động viên

Tập thể lớp Sinh học K36, các anh, chị khóa trên và các em khóa dưới đã giúp

đỡ, chia sẽ nhiều kinh nghiệm trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn này

Những người bạn thân thiết đã gắn bó, chia sẽ mọi niềm vui nổi buồn trong suốt thời gian qua

Trương Phạm Thảo Quỳnh

Xin chân thành cảm ơn !!!

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC i

DANH SÁCH BẢNG ii

DANH SÁCH HÌNH iii

DANH MỤC VIẾT TẮT iv

TÓM LƯỢC v

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Sơ lược về tôm sú 3

2.2 Sơ lược về hệ vi khuẩn gây bệnh đường ruột trên tôm 4

2.3 Cỏ mực 5

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 8

3.1 Phương tiện nghiên cứu 8

3.2 Phương pháp nghiên cứu 9

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 12

4.1 Phân lập vi khuẩn từ ruột tôm sú 12

4.2 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao lá cây cỏ mực 16

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 20

5.1 Kết luận 20

5.2 Đề nghị 20

5.3 TÀI LIỆU THAM KHẢO 21 PHỤ LỤC

DANH SÁCH BẢNG

Trang

Bảng 1 Đặc điểm cơ bản các dòng vi khuẩn 14 Bảng 2 Khả năng kháng vi khuẩn đường ruột tôm của cao lá cây cỏ mực 16

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 1 Cây cỏ mực (Eclipta alba) 6

Hình 2 Vi khuẩn đường ruột tôm trên môi trường TCBS 12 Hình 3 Các dạng khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn đã phân lập 13 Hình 4 Hình dạng vi khuẩn dưới kính hiển vi quang học khi đã nhuộm Gram 14 Hình 5 Vòng vô khuẩn của cao lá Cỏ Mực lên một số dòng vi khuẩn 15 Hình 6 Biểu đồ thể hiện đường kính vòng vô khuẩn ở các nồng độ cao chiết khác

nhau ở các dòng vi khuẩn khác nhau 17

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

TCBS Thiosulphate citrate bile-salts sucrose ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long

NA nutrition agar

TÓM LƯỢC

Mười hai dòng vi khuẩn được phân lập từ ruột tôm sú của huyện Trần Văn Thời, tỉnh Cà Mau trên môi trường thạch TCBS Các dòng vi khuẩn có dạng tròn hoặc không đều, bìa nguyên hoặc răng cưa, một số dòng vi khuẩn tạo bao nhày xung quanh khuẩn lạc, đường kính khuẩn lạc biến thiên từ 0,5 – 4 mm Tất cả 12 dòng vi khuẩn đều là vi khuẩn Gram âm và có khả năng di động trên môi trường TCBS bán lỏng Trong 12 dòng vi khuẩn phân lập được có 10 dòng vi khuẩn bị ức chế bởi cao chiết lá cây cỏ mực trong đó, dòng vi khuẩn G2, G3, G4, G7, Y8, và Y9 bị ức chế bởi cao lá cây cỏ mực ở nồng độ 6 µg/mL, dòng vi khuẩn Y4 bị ức chế bởi cao từ nồng độ 8 µg/mL, dòng vi khuẩn Y6 bị ức chế bởi cao từ nồng độ 16 µg/mL, dòng vi khuẩn G1 và Y6 bị ức chế bởi cao từ nồng độ 32 µg/mL Hai dòng

vi khuẩn Y2 và Y5 không bị ức chế bởi cao chiết cây cỏ mực ở tất cả các nồng độ khảo sát Trong đó, các dòng bị ức chế mạnh nhất bởi cao chiết lá cây cỏ mực đáng kể đến là dòng vi khuẩn G7 (đường kính vòng vô khuẩn 30,3 mm ở nồng

độ 8 µg/mL), G3 (đường kính vòng vô khuẩn 59,6 mm ở nồng độ 128 µg/mL) và G4 (đường kính vòng vô khuẩn 57,3 mm ở nồng độ 128 µg/mL)

Từ khóa: Tính kháng khuẩn, vi khuẩn đường ruột tôm, bệnh tôm sú, cây

cỏ mực, Eclipta alba H

Chương 1: GIỚI THIỆU

Đồng bằng sông Cửu Long được biết đến là vùng cung cấp thuỷ sản lớn nhất nước, đa dạng về hình thức nuôi và có hơn 1.200.000 ha nuôi thuỷ sản chiếm

khoảng 60% tổng diện tích nuôi cả nước [1] Trong đó, tôm sú (Penaeus monodon)

là đối tượng nuôi truyền thống và có giá trị kinh tế cao Trước đây, tôm sú (Penaeus monodon) chỉ được nuôi ở vùng nước lợ, mặn nhưng hiện nay tôm sú cũng được

nuôi kết hợp với trồng lúa, nghề nuôi tôm không những phát triển kinh tế mà còn góp phần cải thiện đời sống người dân

Tuy nhiên, việc quản lý môi trường nuôi thủy sản chưa thật sự chặc chẽ và hợp lý Nhiều vùng nuôi tôm thâm canh hoá với mật độ cao, không theo qui hoạch,

sự gia tăng diện tích nuôi, đa dạng hóa đối tượng nuôi, sử dụng giống sinh sản nhân tạo ở mật độ cao, thức ăn công nghiệp, sự di nhập tôm giống và tôm bố mẹ,…các nguyên nhân trên dẫn đến tình trạng dịch bệnh bùng phát và thường xuyên xảy ra trong nhiều khu vực nuôi, sự xuất hiện và lây lan của nhiều bệnh nguy hiểm, đặc biệt là bệnh do virus và vi khuẩn gây ra Nhiều nhóm vi khuẩn gây dịch bệnh trên

tôm như Leucothrix spp., Vibrio spp., Photobacterium, Aeromonas và nium (phylum Fusobacteria) [2] đang trở thành mối lo ngại của người dân Vibrio

Propionige-spp gây bệnh dịch tả ở người, độc tố của vi khuẩn này gây tiêu chảy nặng và mất nước, có khả năng bùng phát thành đại dịch trong thời gian rất ngắn và trên phạm vi rất rộng

Người dân thường sử dụng một số loài thảo dược như cỏ mực, sài đất, hoàng

kỳ, tỏi, xuyên tâm liên, xoan, thầu dầu tía để trị bệnh trên tôm cá Tuy nhiên, việc

sử dụng chỉ dừng lại ở mức kinh nghiệm và thường chưa có cơ sở khoa học và liều lượng cụ thể Trong những năm gần đây, hoạt tính kháng khuẩn của các loài thảo dược đã được nghiên cứu trên nhiều đối tượng như cây tràm, húng chanh, sống đời, diệp hạ châu Trong tương lai, việc sử dụng thảo dược để điều trị bệnh động vật thủy sản được xem là tối ưu do có tính an toàn cho con người, môi trường và không

để lại tồn dư, phù hợp với các quy định về an toàn thực phẩm

Do đó, đề tài “Phân lập vi khuẩn từ ruột tôm sú bệnh và Khảo sát hoạt tính

kháng khuẩn của cao chiết cây cỏ mực (Eclipta alba H.)” là cần thiết Đề tài đóng

góp cơ sở khoa học cho việc ứng dụng thảo dược trong điều trị bệnh trên thủy sản

Mục tiêu của đề tài là đánh giá hoạt tính kháng vi khuẩn được phân lập từ

ruột tôm sú (Penaeus monodon) bệnh của cao chiết cây cỏ mực (Eclipta alba)

Chương 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược về tôm sú

Khoá phân loại tôm sú:

Tôm sú có tên tiếng anh phổ biến black tiger shrimp Tôm sú (Penaeus monodon) có khả năng sinh trưởng nhanh Tôm sẽ đạt mức trưởng thành sau

khoảng 4-5 tháng nuôi trồng Tôm trưởng thành có chiều dài đến 27 cm và trọng lượng khoảng 250 g/con, đây là trọng lượng lý tưởng cho tôm thương phẩm tiêu thụ quốc tế [3]

Trong tự nhiên, tôm nước mặn sinh trưởng ở xa bờ Đến mùa sinh sản, tôm trưởng thành tiến vào gần bờ để đẻ trứng Trứng nở ra ấu trùng trải qua 3 thời kì biến thái Naupilus, Zoea, Mysis Ấu trùng theo các làn sóng biển dạt vào các cửa sông, nơi nước biển và nước sông pha với nhau tạo nên vùng nước lợ có độ mặn thấp hơn ngoài biển, thích hợp cho ấu trùng phát triển Trong môi trường này, ấu trùng tiến sang thời kì hậu ấu trùng Sau đó, hậu ấu trùng chuyển sang thời kì ấu niên đồng thời bơi ra biển, tiếp tục tăng trưởng thành tôm sú hoàn chỉnh và sinh sản Tôm sú có thể chịu được sự biến động về độ mặn rất lớn, độ mặn tối ưu là 15-25‰ Tôm sú thuộc loài hoạt động về đêm và hay ăn thịt lẫn nhau Lúc còn nhỏ, ấu trùng tôm sú có khuynh hướng sống bám vào thành ao hồ, các góc hồ hoặc chui sâu dưới lớp cát, đáy ao hồ về ban ngày, đến đêm nổi lên hoạt động, kiếm tìm thức ăn [3]

Tôm sú thuộc loài động vật máu lạnh, thân nhiệt thay đổi theo nhiệt độ môi trường bên ngoài Nhiệt độ ảnh hưởng đến nhiều phương diện trong đời sống của

lớn tương đố chậm, ở 30°C, tôm lớn nhanh hơn nhưng rất dễ mắc các dịch bệnh như

bệnh MBV (Monodon Baculovirus)…

2.2 Sơ lược về hệ vi khuẩn gây bệnh đường ruột trên tôm

Ở Việt Nam, những dạng nhiễm vi khuẩn phát sáng thường thấy ở trại sản xuất hoặc ương tôm giống Khi vi khuẩn phát sáng hiện trong cơ thể tôm với số lượng lớn có thể làm tôm nhiễm bệnh phát sáng, có thể quan sát được trong bóng

tối Vibrio phát sáng có thể phát thành dịch và gây chết đến 100% ấu trùng tôm, tôm

giống và kể cả tôm trưởng thành [4] Chính vì vậy mà bệnh phát sáng ở tôm được liệt kê vào danh sách các chỉ tiêu kiểm dịch tôm giống Ở các trại sản xuất tôm giống, thuốc kháng sinh hiện vẫn là cách phổ biển được sử dụng để phòng trị bệnh phát sáng Trong một nghiên cứu về vị trí phân loại và khả năng kháng thuốc kháng

sinh của vi khuẩn Vibrio phát sáng phân lập từ hậu ấu trùng tôm sú (Penaeus monodon) ở ĐBSCL cho thấy vị trí phân loại của 27 chủng vi khuẩn phát sáng phân

lập từ tôm sú giống và nước tại trại ương được xác định bằng phương pháp phân tích cụm so sánh với 26 chủng vi khuẩn chuẩn và chủng tham khảo dựa vào khoảng cách Euclid-UPGMA Kết quả so sánh qua 41 chỉ tiêu về hình thái, sinh lý và sinh hóa cho thấy các chủng vi khuẩn phát sáng được phân thành ba nhóm chủ yếu cùng với vi khuẩn chuẩn và vi khuẩn tham khảo Tuy nhiên chúng chỉ thuộc vào hai loài

vi khuẩn là V harveyi và V carchariae Kết quả kháng sinh đồ 26 trong số 27

chủng nói trên với 6 loại thuốc kháng sinh thông dụng trong nuôi thủy sản cho thấy 100% chủng thử nghiệm kháng với ampicilin, và có khoảng từ (hoặc ít hơn) 15% kháng với trimethoprim/sulfamethoxazole, tetracillin, chloramphenicol, nitrofurantoin và norfloxacin Phần lớn (77%) các chủng chỉ kháng với một loại kháng sinh Số chủng kháng với 2 loại kháng sinh là 15% Có một chủng kháng 4 loại và một chủng kháng với cả 6 loại kháng sinh thử nghiệm [4]

Nhóm vi khuẩn γ-Proteobacteria là nhóm vi khuẩn thường gặp trong ruột tôm

sú ở các trại nuôi Hệ vi khuẩn đường ruột tôm sú phong phú và đa dạng ở các trại

nuôi tôm khác nhau Các nhóm vi khuẩn này bao gồm Vibrio, Photobacterium, Aeromonas và Propionige-nium (ngành Fusobacteria) Một số nhóm vi khuẩn thường gặp khác, bao gồm Actinomyces, Anaerobaculum, Halospiru-lina, Pseudomonas, Mycoplasma và Shewanella [2] Hai nhóm vi khuẩn là nguyên nhân

gây ra nhiều bệnh khác nhau ở tôm bao gồm Leucothrix spp và một vài loài Vibrio Hiện nay có khoảng 28 loài thuộc Vibrio spp Trong đó, có 4 loài thuộc tác nhân gây bệnh cho con người gồm V cholera, V parahaemolyticus, V vulnificus, V alginolyticu [5]

Vibrio spp Được tìm thấy phổ biến ở trong nước biển và ven bờ, trong nước

bể ương tảo, bể ương Artemia, trong bể ươm ấu trùng Trong bể ương lượng ấu

trùng Vibrio tăng theo thời gian nuôi, tầng đáy cao hơn tầng mặt Đối với cá, Vibrio spp gây bệnh nhiễm khuẩn máu là chủ yếu Đối với tôm, Vibrio spp gây bệnh phát

sáng, đỏ dọc thân, ăn mòn vỏ kitin, gây bệnh máu vón cục ở cua, bệnh ấu trùng

nhuyễn thể Những loài gây bệnh cho động vật thuỷ sản là V alginolyticus, V anguillarum, V ordalii, V salmonicida, V parahaemolyticus, V harvey, V vulnificus… V anguillarum, V vulnificus gây bệnh nhiễm khuẩn máu ở cá chình V anguillarum được Hofer mô tả lần đầu năm 1904 V salmonicida gây bệnh ở vùng nước lạnh V parahaemolyticus gây bệnh phát sáng ở ấu trùng tôm sú V alginolyticus gây bệnh

đỏ dọc thân ấu trùng tôm sú [5] Phân lập ở trong mắt tôm sắp chết có các loài vi

khuẩn V harveyi chiếm 29,6% và các loài khác V vulnificus 21,6%, V alginolyticus 10,2%, V anguillarum 10,2%, V parahaemolyticus 4,2% [5] Trước đây Vibrio được xem là nhóm vi khuẩn cơ hội, tuy nhiên gần đây qua nhiều ổ dịch xảy ra trên tôm sú nuôi đều do vi khuẩn Vibrio gây ra Do đó, loài này được xem là tác nhân chính chứ không phải là tác nhân cơ hội Vibrio gây chết ấu trùng tôm, tôm

giống kể cả tôm trưởng thành Khi dịch bệnh xuất hiện trên họ tôm biển có thể gây chết 100% [6]

2.3 Cây Cỏ Mực

Trong dân gian từ rất lâu cây thảo dược đã được sử dụng để trị nhiều bệnh phổ biến đặc biệt là các bệnh nhiễm khuẩn, các loại cao chiết từ thảo dược cũng được sử dụng để trị bệnh nhưng chỉ dừng lại ở kinh nghiệm dân gian, chưa có phương pháp khoa học cụ thể Trong những năm gần đây đã có nhiều nghiên cứu về

tính kháng khuẩn của một số cây thảo dược như cây tràm (Melaleuca leucadendra) [7], cây sống đời (Kalanchoe pinnata) [8], cây húng chanh (Plectranthus

Cây Cỏ mực (Eclipta alba) còn gọi là cây Nhọ nồi Cỏ mực thuộc loại cây

thân thảo hằng niên, cao từ 10-60 cm, mọc bò hoặc có khi gần như thẳng đứng, có lông trắng, cứng, thưa Thân màu lục hay màu nâu nhạt hay hơi đỏ tía Lá mọc đối, phiến lá dài và hẹp khoảng 2,5 х 1,2 cm Mép lá nguyên hay có răng cưa cạn, hai mặt đều có lông Hoa trắng tập hợp thành đầu ở nách lá hay đầu cành, các hoa cái hình lưỡi ở ngoài, các hoa lưỡng tính hình ống ở giữa… Quả bế dẹt có 3 cạnh, có cánh dài 3 mm Vùng phân bố của cây Cỏ mực trên thế giới khá rộng vì nó là loài cây nhiệt đới, mọc hoang ở chỗ ẩm mát [11]

Khóa phân loại cây cỏ mực:

Cỏ mực (Eclipta alba) được dùng để điều trị các bệnh như nôn ra máu từ dạ

dày, chảy máu cam, tiểu ra máu, xuất huyết tử cung, viêm gan mãn tính, viêm ruột,

lỵ, trẻ em suy dinh dưỡng, ù tai, rụng tóc do đẻ non, suy nhược thần kinh, nấm da, ezecma, vết loét, bị thương, chảy máu, viêm da Ngoài ra, Cỏ mực còn được dùng làm thuốc sát trùng trong bệnh ho lao, viêm cổ họng, ban chẩn, lở ngứa, đau mắt, sưng răng, đau dạ dày, bệnh nấm ngoài da gây rụng tóc [11]

Viện chống lao Trung ương và Bệnh viện lao K71 đã pha chế thành thuốc

tiêm cầm máu, tiêm bắp thịt từ cây cỏ mực (Eclipta alba), mỗi ngày 1-3 ống (2 ml)

Có nơi đã sản xuất thành công dạng cao nén thành viên dùng cầm máu [11] Đã có nghiên cứu cho thấy cỏ mực được dùng để điều trị cho bệnh nhân bị viêm âm đạo

do tạp khuẩn, do nấm và do Trichomonas, và được cho có độc tính rất thấp, giới hạn

an toàn rộng, cầm máu tốt, trong vài trường hợp cá biệt, tác dụng này của cỏ mực thể hiện rõ rệt hơn cả tác dụng của vitamin K (rõ rệt trong các trường hợp suy gan)

Hình 1: Cây cỏ mực (Eclipta alba)

http://benhvathuoc.com/wp-content/uploads/2012/10/co-nho-noi.jpg

[10] Cỏ mực được nghiên cứu là có khả năng kháng một số loài vi khuẩn như Edwardsiella tarda, Edwardsiella ictaluri, Staphylococcus aureus và Aeromonas hydrophila [10]

● Thiết bị

Tủ cấy vô trùng (Laminar low, Việt Nam)

Nồi khử trùng nhiệt ướt (t = 121°C, P = 1 bar Hirayama)

Tủ sấy (Memmer, Đức)

Tủ ủ ( t = 32°C Memmer, Đức)

Cân phân tích (Mettle Toler, Switzerland)

Kính hiển Vi (CH20BIMF200, Olympus, Japan; Nikon Eclipse E200)

Mẫu tôm sú (Penaeus monodon) lớn có dấu hiệu nhiễm bệnh đường ruột

được thu thập từ các trại giống và các ao nuôi tôm tại ấp Tân Thành, xã Lợi An, huyện Trần Văn Thời, tỉnh Cà Mau

Cây cỏ mực (Eclipta alba) được thu lá tại xã Thới Hưng, huyện Cờ Đỏ,

thành phố Cần Thơ