tinh sạch và khảo sát một số đặc điểm của endoglucanase từ bacillus subtilis s20

Cellulase được ứng dụng để cải thiện giá trị dinh dưỡng của thức ăn gia súc, gia cầm; chế biến thực phẩm; trích ly các chất từ thực vật, từ cây thuốc; đường hóa các phế liệu giàu cellulo

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TINH SẠCH VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA

ENDOGLUCANASE TỪ BACILLUS SUBTILIS S20

TS DƯƠNG THỊ HƯƠNG GIANG MSSV: 3092509

Cần Thơ, 12/2013

PHẦN KÝ DUYỆT

(ký tên) (ký tên)

Ths Võ Văn Song Toàn Hà Công Thắng

TS Dương Thị Hương Giang

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

………

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

(ký tên)

LỜI CẢM TẠ

Trải qua hơn bốn năm học tập và rèn luyện tại trường Đại học Cần Thơ, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm và động viên của gia đình, sự hướng dẫn và chỉ dạy tận tình của quý thầy cô cùng với sự giúp đỡ nhiệt tình của các bạn Với việc hoàn thành được luận văn tốt nghiệp này, tôi xin được bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc của mình đến Thạc sĩ Võ Văn Song Toàn và Tiến sĩ Dương Thị Hương Giang, hai cán bộ hướng dẫn đã tận tình chỉ dạy, truyền đạt những kinh nghiệm quý báu trong việc thực hiện thí nghiệm, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài này

Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến quý thầy cô Viện Nghiên cứu

và Phát triển Công nghệ Sinh học đã tận tình giảng dạy, giúp tôi có những kiến thức hữu ích phục vụ cho việc thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn các bạn sinh viên và các anh chị học viên cao học của phòng thí nghiệm Sinh hóa và phòng thí nghiệm Công nghệ Enzyme cũng như tập thể lớp Công nghệ sinh học tiên tiến Khóa 35 đã nhiệt tình giúp đỡ và chia sẻ nhiều kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian tôi học tập và thực hiện đề tài này

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình và người thân đã động viên, khích lệ và luôn ủng hộ tôi về mặt vật chất cũng như tinh thần trong suốt thời gian tôi học tập và thực hiện đề tài nghiên cứu này

Kính chúc quý vị nhiều sức khỏe, hạnh phúc và thành đạt

Xin trân trọng cảm ơn!

Cần Thơ, ngày 10 tháng 12 năm 2013

TÓM LƢỢC

Đề tài “Tinh sạch và khảo sát một số đặc điểm của endoglucanase từ Bacillus subtilis S20” được thực hiện nhằm mục tiêu thiết lập quy trình tinh sạch endoglucanase từ Bacillus subtilis S20 và xác định một số đặc điểm cơ bản của endoglucanase tinh sạch Dịch nuôi của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis S20, sau khi được ủ kỵ khí trong 5 ngày ở 38 o C, được thu nhận và ly tâm để loại cơ chất và tế bào Endoglucanase được tinh sạch bằng cách tủa phân đoạn với AS và sắc ký trao đổi ion trên gel Uno Sphere Q Kết quả, ở bước tủa phân đoạn, hai phân đoạn 70% và 80% có hoạt tính riêng cao nhất lần lượt là 105 và 119 (U/mg), hai phân đoạn này được giữ lại và tinh sạch tiếp tục Sau khi qua cột sắc ký, phân đoạn F1 thể hiện hoạt tính riêng cao nhất (720 U/mg) với hàm lượng protein tổng là 0,24 mg Toàn bộ quá trình tinh sạch đạt hiệu suất và độ tinh sạch lần lượt là 24,3 và 23 lần Endoglucanase thu được

là 2 đồng phân của nhau với trọng lượng phân tử là 79,6 kDa và 74 kDa Endoglucanase tinh sạch có nhiệt độ và pH tối ưu lần lượt là 60 o C và 8 Hoạt tính của endoglucanase được kích hoạt bởi ion K +

(đạt 148% so với mẫu đối chứng 100%) và

bị bất hoạt bởi các ion như Cu 2+ , Fe 3+ và Mn 2+ (hoạt tính còn lại lần lượt là 41,2%, 51,9% và 81,2% so với mẫu đối chứng 100%) Endoglucanase thể hiện hoạt tính cao nhất trên cơ chất CMC, tuy nhiên, enzyme này vẫn có hoạt tính trên avicel và giấy lọc nhưng không đáng kể

Từ khóa: Bacillus subtilis S20, đặc hiệu cơ chất, endoglucanase, khảo sát, tinh sạch

MỤC LỤC

Trang

PHẦN KÝ DUYỆT

LỜI CẢM TẠ

TÓM LƯỢC i

MỤC LỤC ii

DANH SÁCH BẢNG v

DANH SÁCH HÌNH vi

TỪ VIẾT TẮT vii

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 2

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về Bacillus subtilis 3

2.1.1 Lịch sử phát hiện 3

2.1.2 Phân loại 3

2.1.3 Đặc điểm của Bacillus subtilis 3

2.2 Tổng quan về Endoglucanase 4

2.2.1 Cấu trúc và cơ chế hoạt động của endoglucanase 4

2.2.2 Ảnh hưởng của một số yếu tố đến hoạt tính của endoglucanase 7

2.2.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 7

2.2.2.2 Ảnh hưởng của pH 7

2.2.2.3 Tính đặc hiệu cơ chất của endoglucanase 7

2.2.2.4 Ảnh hưởng của một số chất ức chế và hoạt hóa 7

2.2.3 Một số đặc điểm khác của endoglucanase 7

2.3 Các phương pháp nghiên cứu 8

2.3.1 Phương pháp kết tủa protein 8

2.3.2 Phương pháp sắc ký 9

2.3.3 Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide (Sodium dodecyl sulfate –

polyacrylamide gel electrophoresis SDS-PAGE) 11

2.3.4.2 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme 13

2.3.5 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 13

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

3.1 Phương tiện nghiên cứu 16

3.1.1 Thời gian và địa điểm 16

3.1.2 Dụng cụ, thiết bị 16

3.1.3 Nguyên vật liệu 16

3.1.4 Hóa chất 16

3.2 Phương pháp nghiên cứu 17

3.2.1 Tinh sạch endoglucanase bằng phương pháp tủa phân đoạn với ammonium sulphate 17

3.2.2 Tinh sạch endoglucanase bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion 17

3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của endoglucanase đã tinh sạch 18

3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của endoglucanase đã tinh sạch 19 3.2.5 Khảo sát ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính của endoglucanase đã tinh sạch 19

3.2.6 Khảo sát tính đặc hiệu cơ chất của endoglucanase đã tinh sạch 20

3.3 Xử lý số liệu 20

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21

4.1 Tinh sạch endoglucanase bằng phương pháp tủa phân đoạn với ammonium sulphate 21

4.2 Tinh sạch endoglucanase bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion 24

4.3 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của endoglucanase đã tinh sạch 27

4.4 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của endoglucanase đã tinh sạch 28

4.5 Khảo sát ảnh hưởng của một số ion kim loại đến hoạt tính của endoglucanase đã

tinh sạch 29

4.6 Khảo sát tính đặc hiệu cơ chất của endoglucanase đã tinh sạch 30

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31

5.1 Kết luận 31

5.2 Kiến nghị 31

TÀI LIỆU THAM KHẢO 32

PHỤ LỤC

DANH SÁCH BẢNG

Trang Bảng 1 Kết quả tủa phân đoạn với ammonium sulphate 21Bảng 2 Kết quả sắc ký trên gel Uno Sphere Q 24Bảng 3 Tóm tắt quy trình tinh sạch 26Bảng 4 Ảnh hưởng của một số ion kim loại đến hoạt tính của endoglucanase tinh sạch 29Bảng 5 Tính đặc hiệu cơ chất của endogluclanase tinh sạch 30

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 1 Mô hình cấu trúc của endoglucanase 4

Hình 2 Cơ chế hoạt động của endoglucanase 5

Hình 3 Giản đồ minh họa tâm hoạt động của endoglucanase khi gắn với cellobiose 6

Hình 4 Cơ chế lập thể của phản ứng thủy phân cellulose 6

Hình 5 Biểu đồ minh họa quá trình tủa bằng muối 8

Hình 6 Minh họa sắc ký trao đổi ion 10

Hình 8 Công thức cấu tạo của Coomassie Brilliant Blue G-250 12

Hình 9 Kết quả định tính hoạt tính các phân đoạn tủa với AS 22

Hình 10 Kết quả điện di SDS-PAGE 23

Hình 11 Sắc ký đồ trên gel Uno Sphere Q 24

Hình 12 Kết quả định tính endoglucanase tinh sạch 25

Hình 13 Kết quả điện di SDS-PAGE 25

Hình 14 Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của endoglucanase tinh sạch27 Hình 15 Biểu đồ ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của endoglucanase tinh sạch 28

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Cellulose là nguồn carbon và năng lượng tái tạo dồi giàu Cellulose được xem là vật chất hữu cơ tồn tại với lượng lớn nhất trên trái đất và là thành phần chiếm ưu thế tuyệt đối trong giới thực vật Nguồn nguyên liệu sinh học này có tiềm năng to lớn trong việc thay thế nhiên liệu hóa thạch, đang ngày càng cạn kiệt Kể từ năm 1910, khi công ty sản xuất ethanol đầu tiên từ mùn cưa được thành lập bởi Ewan và các cộng sự, sau đó nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để tìm cách sử dụng hiệu quả nguồn nguyên liệu này

Quá trình phân giải sinh học của cellulose đã được nghiên cứu từ nhiều năm trước đây và các enzyme phân giải cellulose, đặc biệt là cellulase cũng đã được nghiên cứu và khảo sát Cellulase, được phân loại vào nhóm enzyme glycosyl hydrolase, là một enzyme đa cấu tử xúc tác quá trình chuyển hóa cellulose thành glucose qua một chuỗi các phản ứng với sự tham gia của các cấu tử bao gồm endoglucanase, exoglucanase và β- glucosidase Mỗi cấu tử có một cơ chế tác động khác nhau để phân cắt cấu trúc polymer phức tạp của cellulose nhưng có chung đặc diểm là đều cắt liên kết β-1,4-glycosidic trong phân tử cellulose

Cellulase được ứng dụng để cải thiện giá trị dinh dưỡng của thức ăn gia súc, gia cầm; chế biến thực phẩm; trích ly các chất từ thực vật, từ cây thuốc; đường hóa các phế liệu giàu cellulose để sản xuất ethanol sinh học (Trần Thạnh Phong et al., 2007); ứng dụng trong công nghiệp dệt, công nghiệp giấy, công nghiệp chất tẩy rửa bột giặt hay ứng dụng trong việc tạo các chế phẩm hỗ trợ tiêu hóa, các kháng sinh thuộc dạng chitooligosaccharide, trong nghiên cứu để tạo tế bào trần (Sukumaran et al., 2005);…

Trong một số trường hợp ứng dụng nhất định, đặc biệt như trong y học, để sử dụng đạt hiệu quả và an toàn thì vấn đề đặt ra là enzyme được sử dụng phải có độ tinh sạch cao và các đặc điểm của enzyme phải được nghiên cứu Như vậy, tinh sạch là một bước rất cần thiết cho việc nghiên cứu và ứng dụng cellulase Theo Sukumaran et al (2005), cellulase có thể thu được từ nhiều nguồn như nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn; trong

số các vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp cellulase, Bacillus subtilis là một trong các

loài vi khuẩn có khả năng tổng hợp cellulase ngoại bào khá cao Nhưng trên thực tế các nghiên cứu về cellulase từ Bacillus vẫn còn hạn chế so với các nghiên cứu được

thực hiện trên nấm Ở nước ta các nghiên cứu về cellulase cũng chủ yếu đang tập trung trên đối tượng là các loài nấm Với những vấn đề và tồn tại nêu trên đề tài “Tinh sạch

và khảo sát một số đặc điểm của endoglucanase từ Bacillus subtilis S20” được đề xuất

thực hiện nhằm mở ra hướng nghiên cứu mới về cellulase từ vi khuẩn trong nước ta

1.2 Mục tiêu đề tài

Tinh sạch endoglucanase từ Bacillus subtilis S20 và xác định một số đặc điểm cơ

bản của nó

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về Bacillus subtilis

2.1.1 Lịch sử phát hiện

Bacillus subtilis được phát hiện lần đầu tiên bởi Ehrenberg vào năm 1835 với tên

gọi là Vibrio subtilis, sau đó được đổi tên thành Bacillus subtilis vào năm 1872 bởi

Cohn

Năm 1941, Bacillus subtilis được phát hiện lần đầu tiên trong phân ngựa bởi Tổ chức y học Nazi của Đức Thời điểm này, Bacillus subtilis được sử dụng để điều trị

bệnh kiết lỵ cho các binh sĩ Đức đang chiến đấu ở Bắc Phi

Ngày nay, Bacillus subtilis đã và đang được nghiên cứu rộng rãi để khai thác các

tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như y học, chăn nuôi, công nghiệp,…

2.1.3 Đặc điểm của Bacillus subtilis

Bacillus subtilis thuộc nhóm vi khuẩn hiếu khí hoặc kị khí không bắt buộc, chúng

là loài vi khuẩn phổ biến thường được tìm thấy trong đất, nước, không khí, và các loại

rác thải có nguồn gốc thực vật, tuy nhiên nhiều bằng chứng cho thấy Bacillus subtilis

cũng tồn tại trong ruột người, động vật (http://menvisinh.org/content/bacillus-subtilis ngày 28/07/2013)

Bacillus subtilis thuộc nhóm trực khuẩn, Gram dương, có kích thước khoảng

2,5-6,5 μm tùy vào môi trường nuôi cấy (Sargent, 1975) Bacillus subtilis có khả năng sinh

bào tử và tồn tại trong điều kiện khắc nghiệt (Claus và Berkeley, 1986)

Hệ enzyme của Bacillus subtilis rất phong phú và đa dạng gồm protease, amylase, glucoamylase, glucanase, cellulase, dextranase, pectinase Bacillus subtilis đã

được ứng dụng khá nhiều đặc biệt là trong công nghiệp sản xuất enzyme như protease,

amylase, cellulase,… Bacillus subtilis c n được đánh giá là một trong những loại vi

khuẩn an toàn và hiệu quả nhất để sử dụng trong ngành công nghệ sinh học sản xuất các axit amin quan trọng như: lysine, valine, tyrozine, proline, threonine, isoleusine,

aspastic…Ngoài ra Bacillus subtilis c n có khả năng tổng hợp một số chất kháng sinh

có tác dụng ức chế sinh trưởng hoặc tiêu diệt một số vi sinh vật khác, tác dụng lên cả

vi khuẩn gram âm lẫn gram dương, nấm gây bệnh như: Bacitracin, Bacilysin, Baxilomicin (A,B,C,R), Bacillopectin, Mycobacillin, Subtilin (A,B,C), Prolimicin…( http://menvisinh.org/content/bacillus-subtilis-va-dac-tinh-tri-lieu-0)

2.2 Tổng quan về Endoglucanase

2.2.1 Cấu trúc và cơ chế hoạt động của endoglucanase

Endoglucanase (EC 3.2.1.4) còn có các tên gọi khác như Beta-1,4-endoglucan hydrolase, Beta-1,4-glucanase, Carboxymethyl cellulase, Celludextrinase, Endo-1,4-beta-D-glucanase, Endo-1,4-beta-D-glucanohydrolase, Endo-1,4-beta-glucanase Endoglucanase thuộc họ glycosyl hydrolase 5

Giống như những cấu tử khác của phức hệ enzyme cellulase, endoglucanase gồm

2 domain chính là domain xúc tác (catalytic domain-CD) và domain gắn kết cellulose (cellulose binding domain-CBD), hai domain này có cấu trúc và chức năng độc lập Ngoài ra, còn có một đoạn acid amin ngắn có vai trò kết nối giữa CD và CBD (Zvidzai

và C Johnson, 2012)

Hình 1 Mô hình cấu trúc của endoglucanase

(*Nguồn: Zvidzai và Johnson, 2012)

CD chịu trách nhiệm thủy phân liên kết β-1,4-glycosidic trong vùng vô định hình của phân tử cellulose để tạo ra các đoạn oligosaccharide có chiều dài khác nhau; tuy nhiên,

theo Ogawa et al (1991) endoglucanase từ Trichoderma reesei có thể thủy phân được

cellulose tinh thể nhỏ

Hình 2 Cơ chế hoạt động của endoglucanase

(*Nguồn http://discovery.kcpc.usyd.edu.au/9.2.2-short/9.2.2_CellulosetoEthene.html ngày 15/02/2013)

Phản ứng thủy phân liên kết β-1,4-glycosidic được xúc tác theo cơ chế acid/base với sự tham gia của các amino acid là aspartic acid và/hoặc glutamic acid Sự hình thành ion oxicarbonium được hỗ trợ và duy trì bền vững bởi các amino acid cận kề trong tâm hoạt động như aspartic acid, glutamic acid, tryptophan hay histidine (Henrissat et al., 1989; Gilkes et al., 1991; Kawaminami et al., 1998; Gebler et al., 1992) Tâm hoạt động của endoglucanase của vi khuẩn thường có trình tự bảo tồn gồm

8 amino acid, 2 tryptophan, lysine, serine, 2 tyrosine, glutamate và histidine (hình 3) (Zvidzai và Johnson, 2012)

Có hai cơ chế lập thể khác nhau trong sự thủy phân liên kết β-1,4-glycosidic: thủy phân đảo cấu hình (inversion mechanism) và thủy phân duy trì cấu hình β (retetion mechanism) của liên kết bị phân cắt (hình 4)

Hình 3 Giản đồ minh họa tâm hoạt động của endoglucanase

khi gắn với cellobiose

(*Nguồn: Davies et al., 1998)

Hình 4 Cơ chế lập thể của phản ứng thủy phân cellulose

(*Nguồn: Schülein, 2000)

CBD có vai trò gắn kết cơ chất với enzyme với sự tham gia của các amino acid dạng v ng như tryptophan (Kawaminami et al., 1998) Domain này cải thiện khả năng bám và hỗ trợ hoạt tính của CD trên các cơ chất không h a tan nhưng không có ảnh hưởng trên các cơ chất hòa tan (Linder và Teeri, 1997)

2.2.2 Ảnh hưởng của một số yếu tố đến hoạt tính của endoglucanase

2.2.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Tùy vào từng chủng vi khuẩn cụ thể mà nhiệt độ tối ưu của endoglucanase có thể khác nhau nhưng nhìn chung phần lớn endoglucanase vi khuẩn thể hiện hoạt tính cao nhất ở nhiệt độ khoảng 55oC – 60oC Tương tự, độ bền nhiệt của endoglucanase cũng phụ thuộc vào nguồn vi khuẩn được nuôi để trích ly, endoglucanase thường giữ được khoảng 90% - 100% hoạt tính ở nhiệt độ 0oC – 50oC (Yin et al., 2010)

2.2.2.2 Ảnh hưởng của pH

Endoglucanase từ các loài Bacillus khác nhau thường có hoạt tính cao nhất trong

khoảng pH dao động 5-7, ví dụ, endoglucanase của Bacillus subtilis YJ1 có hoạt tính cao nhất ở pH 6-6,5 (Yin et al., 2010), trong khi của Bacillus subtilis CH43 và HR68 ở

pH 6,5 (Mawadza et al., 2000) Endoglucanase bền trong khoảng pH 6-10 tùy vào từng loài cụ thể

2.2.2.3 Tính đặc hiệu cơ chất của endoglucanase

Endoglucanase thể hiện hoạt tính cao nhất với carboxmethyl cellulose (CMC) và β-glucan Ngoài ra, endoglucanase cũng thể hiện hoạt tính với một số cơ chất khác như avicel, cotton, giấy lộc, xylan nhưng hoạt tính không cao (Yin et al., 2010; Mawadza

et al., 2000)

2.2.2.4 Ảnh hưởng của một số chất ức chế và hoạt hóa

Hoạt tính của endoglucanase có thể được tăng lên đáng kể khi bổ sung một số chất hoạt hóa như Co2+, Mn2+ và β-Mercaptoethanol Trong khi Fe3+, Cd2+, Hg2+, Sodium dodecyl sulfate hay Iodoacetic acid làm giảm hoạt tính của endoglucanase Các ion K+, Na+, Ca2+, NH4+ không ảnh hưởng đến hoạt tính của endoglucanase khi được thêm vào phản ứng (Yin et al., 2010; Mawadza et al., 2000)

2.2.3 Một số đặc điểm khác của endoglucanase

Endoglucanase của mỗi chủng vi khuẩn khác nhau thường có trọng lượng phân

tử (M) khác nhau Thông thường, endoglucanase của vi khuẩn thường có M khoảng

23-146 kDa (Gilkes et al., 1991) Tuy nhiên, endoglucanase của Bacilli dao động trong khoảng 35-82 kDa (Park et al., 1991; Han et al., 1995; Kim et al., 1995; Mawadza et al., 2000)

Endoglucanase cũng có giá trị điểm đẳng điện khác nhau tùy vào nguồn trích ly Thông thường, một chủng vi khuẩn thường tổng hợp một loại endoglucanase duy nhất Tuy nhiên, có một số chủng có thể tổng hợp nhiều loại endoglucanase khác nhau,

sự kết hợp hoạt động giữa các loại endoglucanase này góp phần làm tăng hiệu quả thủy phân CMC (Akhtar, 1998)

2.3 Các phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp kết tủa protein

Phương pháp tủa được sử dụng tương đối phổ biến để thu nhận protein Protein

có thể được kết tủa theo nhiều cách khác nhau như: tủa bằng muối, tủa bằng dung môi hữu cơ, thay đổi pH của dung dịch có chứa protein hay có thể tủa bằng nhiệt

Phương pháp tủa bằng muối

Đây là cách phổ biến để tủa protein Ở nồng độ muối thấp, tính tan của protein tăng nhẹ (salting in) do lượng muối được thêm vào làm trung h a các điện tích bề mặt của protein, làm giảm tính trật tự của lớp áo nước bên ngoài nên sẽ làm tăng entropy của hệ thống Tuy nhiên, ở nồng độ muối cao, tính tan của protein giảm mạnh (salting out) Lượng ion dư thừa trong giai đoạn salting out sẽ tranh giành dung môi với protein và làm giảm hiện tượng solvat hóa, đồng thời trung h a các điện tích trái dấu trên protein nên sẽ cho phép protein kết tủa

Hình 5 Biểu đồ minh họa quá trình tủa bằng muối

(*Nguồn: http://www.lsbu.ac.uk/water/hofmeist.html ngày 10/07/2013)

Các muối thường được dùng để tủa protein (NH4)2SO4, Na2SO4, MgSO4 Tuy nhiên, người ta đã nhận thấy muối (NH4)2SO4 là tốt nhất vì nó không những không phá hủy cấu trúc mà còn làm ổn định hầu hết các loại protein Loại muối này lại rẽ tiền và phổ biến Độ hòa tan của nó lại rất lớn (bão hòa 767g/l ở 25oC) (Cao Đăng Nguyên, 2006)

Nồng độ (NH4)2SO4 cần thiết để kết tủa các protein enzyme khác nhau thì khác nhau nhiều

2.3.2 Phương pháp sắc ký

Phương pháp sắc ký là một trong những phương pháp phân tích được ứng dụng rộng rãi nhất hiện nay vì đây là phương pháp hiệu quả nhất để tách các chất ra khỏi một hỗn hợp ngay cả với những hỗn hợp phúc tạp Phương pháp này do nhà bác học Nga Txvet phát minh ra vào năm 1930

Nguyên tắc cơ bản của sắc ký là dựa vào sự khác biệt về ái lực của các cấu tử trong hỗn hợp chất cần phân tích với pha động và pha tĩnh Pha động có thể là chất lỏng hoặc khí có tác dụng lôi kéo các chất cần tách di chuyển ra khỏi cột sắc ký có chứa pha tĩnh Pha tĩnh là chất lỏng nhớt được phủ trên bề mặt bên trong của cột mao quản hoặc là những hạt chất rắn nhỏ được nhồi vào cột có tác dụng giữ chất ở lại Để tách được các chất từ một hỗn hợp cần có sự tác động của cả pha tĩnh và pha động Sự tác động này đối với từng cấu tử khác nhau là khác nhau Vì vậy khi cho hỗn hợp chất cần phân tích vào cột và rửa giải bằng pha động thì các cấu tử sẽ bị tách khỏi nhau và

từ đó có thể định tính cũng như định lượng chúng

Tùy theo bản chất pha động mà ta chia thành hai loại sắc ký sau:

- Sắc ký lỏng: pha động là chất lỏng, có thể sử dụng một loại dung môi hay hỗn hợp nhiều loại dung môi

- Sắc ký khí: pha động là khí trơ không có lực tương tác hóa học hay vật lý với chất cần phân tích

Các phương pháp sắc ký lỏng thường được sử dụng bao gồm: sắc ký trao đổi ion, sắc ký lọc gel, sắc ký tương tác kỵ nước, sắc ký ái lực

Sắc ký trao đổi ion

Tại một điểm pH bất kỳ trừ điểm đẳng điện, các protein đều có mang một điện tích nhất định tương ứng với điểm pH đó Dựa vào điện tích thực của chúng tại một

điểm pH nhất định, ta có thể phân tách được hỗn hợp protein Phương pháp này gọi là phương pháp sắc ký trao đổi ion Trong phương pháp này,pha tĩnh là những hạt có khả năng trao đổi ion gọi là chất trao đổi ion (ion exchanger) Các hạt này được cấu tạo từ chất nền không tan và được gắn với các nhóm mang điện tích Các hạt này sẽ tương tác với các phân tử (protein) mang điện tích trái dấu với chúng Cụ thể, nếu hạt mang điện âm (chất trao đổi ion dương-cation exchanger) thì sẽ tương tác với những phân tử mang điện tích dương và được gọi là sắc ký trao đổi ion dương Ngược lại, nếu hạt mang điện tích dương (chất trao đổi ion âm-anion exchanger) sẽ tương tác với phân tử mang điện tích âm, được gọi là sắc ký trao đổi ion âm Trong quá trình sắc ký các phân

tử protein trong dung dịch sẽ liên kết ion thuận nghịch với pha tĩnh Các protein không bám sẽ đi ra trước theo dòng dung dịch đệm, các protein bám sẽ được giữ lại trên pha tĩnh và sẽ được rửa giải ra bằng dung dịch muối hoặc pH Có hai phương pháp rửa giải

là rửa giải gradient liên tục (continuous gradient) và rửa giải từng bước (stepwise) Các protein sẽ được đẩy ra khỏi cột dựa vào mức độ tích điện của từng protein, nói cách khác dựa vào lực tương tác mạnh hay yếu của protein và pha tĩnh Các protein

có tương tác yếu sẽ được đẩy ra trước và ngược lại

Hình 6 Minh họa sắc ký trao đổi ion

(*Nguồn: Biochemistry, 7 th edition)

2.3.3 Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide (Sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gel electrophoresis SDS-PAGE)

Phương pháp SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) hay c n được gọi là phương pháp điện di không liên tục và gây biến tính mẫu được phát triển từ năm 1964 và hiện vẫn được sử dụng phổ biến ở các phòng thí nghiệm protein cũng như được nghiên cứu cải tiến đáp ứng nhu cầu của thực tiễn nghiên cứu Trong kĩ thuật này protein được xử lý với SDS là tác nhân làm biết tính và

âm tính hóa các phân tử protein và β-mercaptoethanol hoặc dithiotheitol (DTT) là tác nhân khử cầu nối disulfite Khi xử lý protein với 2- mercaptoethanol hay dithiotheitol thì các tác nhân này sẽ cắt đứt các cầu nối disulfite (S–S) của protein, vì vậy protein từ cấu trúc bậc 2, 3, 4 được biến đổi thành chuỗi polypeptide bậc một và nhờ sự có mặt của SDS tất cả các protein đều được tích điện âm Nhờ đó, dưới tác động của điện trường các phân tử tích điện âm sẽ di chuyển về cực dương và sự di chuyển này chỉ phụ thuộc vào kích thước, những phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn những phân tử có kích thước nhỏ khi đi qua một lỗ gel có kích thước nhất định

SDS-PAGE sử dụng hệ thống gel không liên tục gồm hai lớp: lớp gel tập trung hay gel gom (stacking gel) và lớp gel phân tích (running gel hoặc separating gel) Lớp gel tập trung là nơi để tạo giếng bơm mẫu, thông thường có nồng độ gel thấp vào khoảng 4-5%, do đó có kích thước lỗ gel lớn giúp tập trung các protein trong giếng về cùng một vạch xuất phát (hình thành nên một lớp băng màu mỏng nằm ngay phía trên lớp gel phân tích) trước khi các protein đi vào gel phân tích dưới tác dụng của điện trường Lớp gel phân tích nằm bên dưới được chuẩn bị trong khuôn trước khi đổ gel tập trung, có nồng độ gel cao hơn so với gel tập trung, tại đây, các protein trong hỗn hợp ban đầu sẽ được phân tách ra thành các băng riêng biệt tùy thuộc vào trọng lượng phân tử của chúng Kỹ thuật SDS-PAGE được dùng để xác định phân tách những phân

tử protein có trọng lượng phân tử trong khoảng từ 10-200 kDa Những phân tử protein

có trọng lượng phân tử lớn hơn 200 kDa thường được xác định trên gel có nồng độ acrylamide ít hơn 2,5% (http://congnghesinhhoc24h.com/tai-lieu/thiet-lap-quy-trinh-dien-di-protein-sds-page-va-ung-dung-danh-gia-phan-427.html ngày 15/07/2013)

2.3.4 Một số phương pháp khác

2.3.4.1 Phương pháp Bradford

Đây là phương pháp để xác định nồng độ protein nhanh và chính xác Phương pháp này được Bradford đưa vào năm 1976 và ngày nay nó trở thành một phương pháp định lượng protein được sử dụng phổ biến ở nhiều phòng thí nghiệm

Protein được định lượng bằng phương pháp Bradford là protein tan trong dung dịch Vì vậy, muốn xác định hàm lượng protein một mẫu ta phải trích ly protein Hàm lượng protein xác định sẽ phụ thuộc vào hiệu quả trích ly (khả năng h a tan của protein trong dung môi trích ly) (Bài giảng thực tập sinh hóa, 2011)

Phương pháp Bradford dựa trên sự liên kết các chất nhuộm Coomassie Blue G250 và protein Những nghiên cứu chi tiết cho thấy chất nhuộm tự do này có thể tồn tại ở bốn dạng ion có giá trị pKa là 1,15; 1,82 và 12,4 Trong môi trường mang tính acid trong dung dịch, khi chưa gắn với protein thì thuốc nhuộm ở dạng màu đỏ có bước sóng hấp thu cực đại 465nm và khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm chuyển sang dạng màu xanh dương và hấp thu cức đại ở bước sóng 595nm Độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm có liên hệ một cách trực tiếp tới nồng độ protein Vì vậy, lượng protein

có thể được biết bằng cách xác định lượng thuốc nhuộm ở dạng tích điện âm màu xanh dương khi đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 595nm

Để xác định protein trong mẫu, đầu tiên ta xây dựng một đường chuẩn với dung dịch protein chuẩn đã biết trước nồng độ Dung dịch protein chuẩn thường là bovine serum albumin (BSA) Sau khi cho dung dịch protein vào dung dịch thuốc nhuộm, màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và bền tới 1 giờ Tiến hành đo mật độ quang hỗn hợp dung dịch bằng máy quang phổ kế (Bài giảng thực hành sinh hóa, 2009)

Hình 8 Công thức cấu tạo của Coomassie Brilliant Blue G-250

(*Nguồn: http://www.piercenet.com/browse.cfm?fldID=02051005 ngày 4/07/2013)

2.3.4.2 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme

* Phương pháp định tính bằng cách đo đường kính vòng halo

Mục đích: Xác định mẫu có hoạt tính hay không, để tiếp tục thực hiện các đánh giá khác

Nguyên tắc: Congo red liên kết với cầu nối β-1-4-glycosidic nguyên vẹn trên CMC tạo màu đỏ trên bề mặt môi trường và không bị rửa trôi bởi dung dịch NaCl Khi liên kết này bị cắt bởi endoglucanase, congo red không còn tiếp tục bám và bị rửa trôi Phương pháp này được tiến hành bằng cách nhỏ giọt mẫu enzyme vào các giếng đục sẵn trên môi trường chứa CMC (trong đĩa petri), các đĩa được ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp để enzyme phản ứng Sau đó tiến hành nhuộm trong 15 - 60 phút, rồi rửa lại bằng dung dịch NaCl 1M (Wood và Bhat, 1988), khi đó các mẫu có hoạt tính thủy phân cầu nối β-1-4-glycosidic sẽ tạo vùng không bắt màu với congo red xung quanh giếng (vòng halo), vùng này có đường kính càng lớn thể hiện enzyme có hoạt tính càng mạnh (Teather và Wood, 1981)

* Định lượng đường khử sinh ra bằng phương pháp Nelson

Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử Nelson Đường khử sẽ tác dụng với thuốc thử đồng khi đun nóng cho màu đỏ gạch Khi cho thuốc thử Aseno Moblybdate sẽ làm chuyển sang màu xanh da trời Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định và được tiến hành đo ở bước sóng 520nm Kết hợp với đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử Nelson sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu

Khi enzyme endoglucanase phản ứng với cơ chất sẽ tạo thành các loại đường khử

có chứa nhóm C=O Lượng đường khử này sẽ được xác định và từ đó tính được hoạt tính của enzyme

2.3.5 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

Các nghiên cứu về tinh sạch endoglucanase trên các dòng Bacillus subtilis hiện

vẫn còn rất hạn chế

Trong nước ta, đến nay vẫn chưa có nghiên cứu nào về tinh sạch cellulase nói chung hay endoglucanase nói riêng trên vi khuẩn Bacilus được công bố Các nghiên cứu trong nước chủ yếu chỉ tập trung vào cellulase thu nhận từ nấm

Trên thế giới, các nghiên cứu về cellulase từ vi khuẩn Bacillus vẫn còn hạn chế

Enzyme cellulase từ hai chủng Bacillus subtilis là CH43 và HR68 đã được tinh

sạch và khảo sát trong nghiên cứu của Mawadza et al (2000) Kết quả cho thấy đối với

chủng Bacillus subtilis CH43 sau khi trải qua quá trình tinh sạch gồm tủa bằng

acetone, sắc ký tương tác kị nước, sắc ký lọc gel và sắc ký trao đổi ion đã thu được enzyme endoglucanase với độ tinh sạch đã tăng lên 117 lần so với dịch enzyme thô

ban đầu và hiệu suất tinh sạch đạt 12%; đối với chủng Bacillus subtilis HR68 sau khi

trải qua quá trình tinh sạch gồm tủa bằng acetone, sắc ký tương tác kị nước và điện di điểm đẳng điện (Isoelectic focusing-IEF) đã thu được endoglucanase với độ tinh sạch

là 113, 5 lần và hiệu suất đạt 35,3 %, Endoglucanase từ hai chủng vi khuẩn này có cùng trọng lượng phân tử và pI là 40kDa và 5,4 Cả hai có pH tối ưu trong khoảng 5-6,5 và có nhiệt độ tối ưu lần lượt là 65 oC và 70oC đối với CH48 và HR68 Ion Co2+ có khả năng hoạt hóa cả enzyme của cả hai chủng, trong khi, Mn2+ và Hg2+ ức chế hoạt tính của hai enzyme này Ion Ag+ có khả năng kích hoạt enzyme của chủng HR68 nhưng lại bất hoạt chủng CH43 Hai enzyme này có hoạt tính cao nhất trên β-glucan

và kế đến là CMC, ngoài ra chúng cũng có hoạt tính với một số cơ chất khác như hydroxyethylcellulose, avicel, giấy lọc nhưng không có hoạt tính với hemicellulose như xylan

Vijayaraghavan và Vincent (2011) cũng đã có báo cáo về kết quả tinh sạch Carboxymethyl Cellulase (Endoglucanase) từ một chủng Bacillus, được phân lập từ ruộng lúa Trong nghiên cứu này Vijayaraghavan và Vincent đã sử dụng phướng pháp tủa bằng ammonium sulphate (AS) và tiến hành tinh sạch lần lượt bằng sắc ký trao đổi ion trên gel diethylaminoethyl (DEAE) cellulose và sắc ký lọc gel với gel Sephadex G-

75 Sản phẩm tinh sạch được đánh giá bằng kỹ thuật SDS-PAGE Kết quả cho thấy sau quá trình tinh sạch gồm ba bước kể trên độ tinh sạch là 14,5 lần và hiệu suất đạt 24% Carboxymethyl Cellulase tinh sạch từ chủng vi khuẩn này có trọng lượng phân tử 58 kDa, có nhiệt độ và pH tối ưu là 50oC và 6 Hoạt tính của enzyme này được cải thiện bởi ion Mn2+ và bị bất hoạt bởi các ion như Hg2+, Cu2+, Zn2+, Mg2+, Na2+ và Ca2+

Một endoglucanase khác được tinh sạch từ chủng Bacillus subtilis YJ1 cũng đã

được công bố trong nghiên cứu của Yin et al (2010) Enzyme này được tinh sạch qua

ba bước bao gồm kết tủa với AS, sắc ký trao đổi ion trên gel Macro-Prep và sắc ký lọc gel (Bio-Gel P-100) Quá trình đạt hiệu suất 9,7% và độ tinh sạch 289 lần enzyme tinh

sạch có trọng lượng 32,5 kDa, hoạt động tối ưu ở 60oC và pH 6 Enzyme này có hoạt tính cao nhất trên CMC và được kích hoạt bởi Mn2+ và Co2+, bị ức chế bởi SDS, DTT hay Fe2+, Fe3+, Hg+, Cd2+

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Thời gian và địa điểm

và một số thiết bị khác của phòng thí nghiệm

Các dụng cụ sử dụng bao gồm đĩa petri, ống nghiệm, bình tam giác, ống đong, cốc thủy tinh/nhựa, chai lọ thủy tinh, eppendorf, bộ micropipet Biorad …

3.1.3 Nguyên vật liệu

- Dòng vi khuẩn Bacilus subtilis S20 từ phòng thí nghiệm Sinh hóa, Viện Nghiên

cứu và Phát triển Công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ

- Bã mía được nghiền mịn, rửa sạch và xử lý loại lignin, sấy khô

3.1.4 Hóa chất

- Sodium clorua, Magnesium sulfate, Dipotassium phosphate, Monopotassium phosphate, Ammonium sulfate, Bovin Serum Albumin , Tris, β-mercaptoethanol, Acrylamide (Bio Rad), Sodium hydroxide, Sodium Dodecyl Sulfate, Bromophenol blue, Acetic acid, Hydrochloric acid, thuốc thử Nelson, thuốc thử Bradford, Glucose, Glycerol, Commassie blue R250, Glycine, Methanol, Ammonium persulfate, Carboxy methylcellulose, Tetramethylethylenediamine

- Gel sắc ký: Uno Sphere Q

- Dung dịch protein chuẩn (Bio Basic Inc): β-galactosidase (116 kDa), bovine serum albumin (66,2 kDa), ovalbumin (45 kDa), lactate dehrogenase (35 kDa), REase Bsp981 (25 kDa), β-lactoglobulin (18,4 kDa) và lysozyme (14,4 kDa)

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Tinh sạch endoglucanase bằng phương pháp tủa phân đoạn với ammonium sulphate

Mục đích: Xác định phân đoạn có hoạt tính và độ tinh sạch của endoglucanase

cao nhất

Tiến hành thí nghiệm:

- Chuẩn bị dịch enzyme thô: Chủng 1% dịch vi khuẩn (mật số khoảng 107CFU/ml) vào 1000ml môi trường lỏng (Ryckeboer, 2003) cải tiến bằng cơ chất bã mía (Bùi Thị Thiên Thanh, 2010), ủ kị khí ở 38oC trong 5 ngày

- Dịch trích enzyme thô được thu nhận bằng cách ly tâm dịch nuôi cấy vi khuẩn 7.500 rpm, trong 20 phútở 4oC để loại bỏ cơ chất và tế bào

- Dịch trích enzyme thô được tủa phân đoạn bằng ammonium sulphate với các nồng độ bão hòa lần lượt là 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% và 90% ở 4oC trong 1h Kết tủa ở mỗi phân đoạn được thu nhận bằng cách ly tâm 7.500 rpm, trong 20 phút ở

4oC Enzyme thu được sau ly tâm được hòa tan trong dung dịch đệm Tris-HCl 50mM

pH = 7, sau đó thẩm tích trong dung dịch đệm Tris-HCl 50mM pH = 7 trong 24 giờ ở

4oC

Chỉ tiêu đánh giá:

- Hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford (1976)

- Định lượng hoạt tính endoglucanase bằng phương pháp Nelson (1944), (Phụ lục 1)

- Xác định trọng lượng phân tử và độ tinh sạch của endoglucanase bằng phương pháp SDS-PAGE

Phân đoạn có hoạt tính cao nhất được giữ lại để tiếp tục tinh sạch ở bước kế tiếp

3.2.2 Tinh sạch endoglucanase bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion

Mục đích: Tách endoglucanase ra khỏi các tạp chất khác dựa vào điện tích bề

mặt của protein

Tiến hành thí nghiệm:

a Chuẩn bị gel: Cân 10 gram gel Uno Sphere Q cho vào cốc chứa dung dịch đệm Tris-HCl 20mM pH = 8,75 ngâm 1-2 ngày ở nhiệt độ phòng, rửa gel bằng dung dịch

đệm Tris-HCl 50mM pH = 8,75 Lặp lại quá trính rửa 2 lần

b Nhồi gel vào cột: Nhồi gel vào cột sắc kí (1,5x10cm) Cân bằng cột bằng dung dịch đệm Tris-HCl 20mM pH = 8,75 (3 lần thể tích cột) Tốc độ dòng chảy 1ml/phút

c Bơm mẫu: Dung dịch protein được giữ lại ở thí nghiệm 1 (trong dung dịch đệm Tris-HCl 20mM pH 8,75) được bơm vào cột với tốc độ 1 ml/phút

d Rửa cột: Cột được rửa bằng dung dịch đệm Tris-HCl 20mM pH = 8,75, theo dõi quá trình rửa cột qua sắc kí đồ đến khi protein không bám được đẩy ra hết khỏi cột Tốc độ dòng chảy là 1 ml/phút

Thu phân đoạn protein không bám UB

e Rửa giải enzyme: Rửa giải bằng gradient nồng độ muối NaCl từ 0M-1M, trong dung dịch đệm Tris-HCl 20mM pH = 8,75, tốc độ dòng chảy 1 ml/phút Thu các phân đoạn bằng máy sắc kí

Mỗi phân đoạn được tiến hành thẩm tích trong dung dịch đệm Tris-HCl 50mM

pH = 7 trong 24 giờ ở 4oC

Chỉ tiêu đánh giá:

- Hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford (1976)

- Định lượng hoạt tính endoglucanase bằng phương pháp Nelson (1944), (Phụ lục 1)

- Xác định trọng lượng phân tử và độ tinh sạch của endoglucanase bằng phương pháp SDS-PAGE

- Lập bảng đánh giá kết quả tinh sạch

3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của endoglucanase đã tinh sạch

Mục đích: Xác định nhiệt độ phản ứng tối ưu của endoglucanase

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, một nhân tố,

bảy nghiệm thức, ba lần lập lại, tổng cộng 21 đơn vị thí nghiệm

Tiến hành thí nghiệm: 900 μl CMC 1% trong dung dịch đệm Tris-HCl 50mM

(pH=7) và 100 μl enzyme được ủ ở các nhiệt độ khác nhau (30, 40, 50, 60, 70, 80,

90oC) trong 30 phút

Chỉ tiêu đánh giá: Hoạt tính endoglucanase bằng phương pháp Nelson (1944),

(Phụ lục 1)

3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của endoglucanase đã tinh sạch

Mục đích: Xác định pH phản ứng tối ưu của endoglucanase

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, một nhân tố,

tám nghiệm thức, ba lần lập lại, tổng cộng 24 đơn vị thí nghiệm

Tiến hành thí nghiệm: 900 μl CMC 1% trong các dung dịch đệm với pH khác

nhau (pH 3-6: dung dịch đệm phosphate citrate, pH 7-10: dung dịch đệm Tris-HCl 50mM) và 100 μl enzyme được ủ ở 50oC trong 30 phút

Chỉ tiêu đánh giá: Hoạt tính endoglucanase bằng phương pháp Nelson (1944),

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, một nhân tố, 5

nghiệm thức, ba lần lập lại, tổng cộng 15 đơn vị thí nghiệm

Tiến hành thí nghiệm: Endoglucanase trong đệm Tris-HCl 50mM (pH = 7)

được ủ với các ion kim loại khác nhau ( Mn2+, K+, Fe3+, Cu2+, nồng độ 10mM) trong

30 phút ở 25 oC

Chỉ tiêu đánh giá: Hoạt tính endoglucanase còn lại bằng phương pháp Nelson

(1944), (Phụ lục 1)