phân lập, khảo sát đặc tính và nhận diện vi khuẩn nội sinh ở cây lúa nương trồng tại huyện tuy an, tỉnh phú yên

ết quả thống kê khả năng cố định đạm, hòa tan lân, tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường Nfb .... ết quả thống kê khả năng cố định đạm, hòa tan lân, tổng hợp IAA củ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHÂN LẬP, KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH VÀ NHẬN DIỆN VI KHUẨN NỘI SINH Ở CÂY LÚA NƯƠNG

TRỒNG TẠI HUYỆN TUY AN, TỈNH PHÚ YÊN

MSSV: 3092432 LỚP: CNSHTT K35

Cần Thơ, Tháng 11/2013

PHẦN KÝ DUYỆT

(ký tên) (ký tên)

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

………

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

(ký tên)

Xin bày tỏ lòng sâu sắc biết ơn đến thầy hướng dẫn Gs Ts Cao Ngọc Điệp, đã tận tâm dìu dắt, tận tình chỉ dẫn tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn này!

Cám ơn thầy Huỳnh Xuân Phong - cố vấn học tập lớp Công Nghệ Sinh Học tiên tiến khóa 35 luôn quan tâm, động viên và tạo điều kiện tốt cho tôi trong suốt thời gian học tập cũng như lúc thực hiện luận văn tốt nghiệp!

Cám ơn chị Nguyễn Thị Xuân Mỵ, chị Trần Thị Giang - cán bộ phòng thí nghiệm, chị Văn Thị Phương Như và các anh chị em trong phòng thí nghiệm Vi Sinh Vật Đất - Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học cùng tất cả các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học tiên tiến khóa 35 đã nhiệt tình giúp đỡ và cho tôi nhiều lời khuyên bổ ích trong lúc học tập và thực hiện luận văn!

Cuối lời, xin kính chúc cha mẹ, quý thầy cô và các anh chị em luôn vui vẻ, mạnh khỏe và thành công Chúc các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học tiên tiến khóa 35 báo cáo luận văn thành công tốt đẹp

Cần Thơ, ngày 21 tháng 11 năm 2013

Huỳnh Thúy Phương

TÓM LƯỢC

Vi khuẩn nội sinh là vi khuẩn sống trong mô thực vật, có khả năng cố định đạm, hòa tan lân khó tan và tổng hợp IAA Từ 25 mẫu rễ và thân cây lúa gạo đỏ giống Tàu Cúc thu được ở huyện Tuy An tỉnh Phú Yên phân lập được hai mươi dòng vi khuẩn trên môi trường Nfb và RMR tỉ lệ 10:10 Qua các phép thử sinh hóa thì tất cả các dòng vi khuẩn này đều thỏa mãn những đặc tính của vi khuẩn nội sinh, phù hợp với nhiều công trình nghiên cứu trước đây Kết quả cho thấy các dòng AN6, AN9, AN15

và AN17 có khả năng cố định đạm, hòa tan lân khó tan và tổng hợp IAA tốt nhất Các dòng vi khuẩn đã phân lập đều được xác định là vi khuẩn nội sinh bằng kỹ thuật PCR 16S rRNA Trong đó kết quả giải trình tự cho thấy đoạn DNA của các dòng AN6, AN9, AN15 và AN17 có tỉ lệ đồng hình 99% lần lượt với trình tự DNA của các dòng Pseudomonas hibiscicola, Enterobacter cloacae, Acinetobacter radioresistens, Bacillus sp

Từ khóa: đặc tính, gen 16S rRNA, lúa nương, nhận diện, vi khuẩn nội sinh

ABSTRACT

Plant-associated bacteria that live inside plant tissues without causing any harm

to plants are defined as endophytic bacteria Twenty bacterial isolates were isolated from root and stem of the samples taken in Tuy An, Phu Yen province Ten isolates (AN1-AN10) were cultured on Nfb medium and ten isolates (AN1-AN10) were cultured

on RMR medium All of them were tested about the ability of nitrogen-fixation, phosphate-solubilization and IAA production Twenty isolates were identified as endophytes by PCR 16S rRNA technique Four of twenty isolates (AN6, AN9, AN15, AN17) were chosen to sequence, DNA sequencing was compared with Genbank database of NCBI by BLASTN software The result showed that AN6 isolate was similarity of 99% with JQ659719 Pseudomonas hibiscicola strain R4-790; AN9 isolate was a 99% similarity with JX495602 Enterobacter cloacae strain Bio103; AN15 isolate was 97% of the identity with AB859674 Acinetobacter radioresistens strain MTCC 9821, AN17 isolate was 99% identity with KF417540 Bacillus flexus strain PHCDB8

Key words: characteristics, endophytic bacteria, identification, upland rice, 16S rRNA gene

MỤC LỤC

Trang PHẦN KÝ DUYỆT

LỜI CẢM TẠ

TÓM LƯỢC

MỤC LỤC i

DANH SÁCH BẢNG iv

DANH SÁCH HÌNH v

CÁC TỪ VIẾT TẮT vii

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 1

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

2.1 Vị trí địa lý huyện Tuy An 2

2.2 Sơ lược về c y lú 2

2.3 Vi khuẩn nội sinh 3

2.3.1 Vai trò 4

2.3.2 Nguồn gốc và cách xâm nhập 4

2.3.3 Đa dạng sinh học 5

2.4 Một số đặc tính của vi khuẩn nội sinh 7

2.4.1 Khả năng cố định đạm 7

2.4.2 Khả năng hòa tan lân khó tan 7

2.4.3 Khả năng tổng hợp indole-3-acetic acid (IAA) 8

2.4.4 Đối kháng sinh học 9

2.4.5 Sản phẩm thiên nhiên từ vi khuẩn nội sinh 10

2.4.6 Khả năng phân hủy sinh học 10

2.5 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) 11

2.5.1 Ly trích hay tách chiết DNA 11

2.5.2 Phản ứng PCR 12

2.5.3 Kỹ thuật điện di 13

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

3.1 Phương tiện nghiên cứu 16

3.1.1 Dụng cụ, thiết bị 16

3.1.2 Nguyên vật liệu 16

3.1.3 Hóa chất 16

3.2 Phương pháp nghiên cứu 17

3.2.1 Thu thập và xử lý mẫu 17

3.2.2 Phân lập vi khuẩn 17

3.3.3 Quan sát hình thái, đo kích thước khuẩn lạc 18

3.3.4 Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn 18

3.3.5 Nhuộm Gram tế bào vi khuẩn 18

3.3.6 Khảo sát khả năng cố định đạm 19

3.3.7 Khảo sát khả năng hòa tan lân khó tan 20

3.3.8 Khảo sát khả năng tổng hợp Indole-3-acetic acid (IAA) 21

3.3.9 Nhận diện vi khuẩn nội sinh bằng kỹ thuật PCR 22

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

4.1 Kết quả phân lập 26

4.2 Đặc điểm khuẩn lạc của vi khuẩn 27

4.3 Đặc điểm của tế bào vi khuẩn 28

4.4 Khả năng cố định đạm 29

4.5 Khả năng hò t n l n khó t n 32

4.6 Khả năng tổng hợp IAA 34

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44

5.1 Kết luận 44

5.2 Đề nghị 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 PHỤ LỤC

DANH SÁCH BẢNG

20

ảng 2 Đường chuẩn P2O5 21

ảng 3 Đường chuẩn IAA 22

ảng 4 Thành phần một phản ứng PCR 23

ảng 5 Nguồn gốc các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường Nfb và RMR 26

ảng Đặc điểm khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập được trên môi trường Nfb và RMR 27

ảng Đặc điểm tế bào của 20 dòng vi khuẩn đã phân lập được 28

ảng iá trị dinh dưỡng của lúa gạo tính theo tỉ lệ phần trăm chất khô so với một số cây lấy hạt khác 51

ảng Thành phần môi trường NFb 51

ảng 10 Thành phần môi trường RMR 52

ảng 11 Công thức môi trường Burk 52

ảng 12 Công thức môi trường NBRIP lỏng 53

ảng 13 Thành phần môi trường LB 53

ảng 14 ết quả thống kê khả năng cố định đạm, hòa tan lân, tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường Nfb 53

ảng 15 ết quả thống kê khả năng cố định đạm, hòa tan lân, tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường RMR 58

ảng 1 Kết quả so sánh giữa các nghiệm thức thông qua giá trị LSD của các dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường Nfb và RMR 63

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1 Cây lúa 2

Hình 2 Azospirillum brasilense dưới kính hiển vi điện tử, x15000 6

Hình 3 Herbaspirillum seropedica 6

Hình 4 Azotobacter spp 6

Hình 5 Sơ đồ lộ trình tổng hợp IAA ở Enterobacter cloacae 9

Hình 6 Máy gia nhiệt (máy PCR) và bộ điện di 15

Hình 7 Thang chuẩn 15

Hình 8 Chu trình PCR 16S rRNA 24

Hình 9 Vi khuẩn sau 36 giờ nuôi cấy trên môi trường bán đặc Nfb (trái) và RMR (phải) tạo màng mỏng trên bề mặt môi trường 27

Hình 10 Khuẩn lạc của vi khuẩn nội sinh cấy trên môi trường Nfb và RMR 27

Hình 11 Khả năng tổng hợp NH4+ (mg/l) trung bình của 10 dòng vi khuẩn được phân lập từ môi trường Nfb 30

Hình 12 Khả năng tổng hợp NH4+ (mg/l) của 10 dòng vi khuẩn được phân lập từ môi trường Nfb theo thời gian 30

Hình 13 Khả năng tổng hợp NH4+ (mg/l) trung bình của 10 dòng vi khuẩn được phân lập từ môi trường RMR 31

Hình 14 Khả năng tổng hợp NH4+ (mg/l) của 10 dòng vi khuẩn được phân lập từ môi trường RMR theo thời gian 31

Hình 15 Khả năng hòa tan lân khó tan (mg P2O5/l) trung bình của 10 dòng vi khuẩn được phân lập từ môi trường Nfb 33

Hình 16 Khả năng hòa tan lân khó tan (mg P2O5/l) của 10 dòng vi khuẩn được phân lập từ môi trường Nfb theo thời gian 33

Hình 17 Khả năng hòa tan lân khó tan (mg P2O5/l) trung bình của 10 dòng vi khuẩn được phân lập từ môi trường RMR 34

Hình 18 Khả năng hòa tan lân (mg P2O5/l) của 10 dòng vi khuẩn được phân lập từ môi trường RMR theo thời gian 34

Hình 19 Khả năng tổng hợp IAA (mg/l) trung bình của 10 dòng vi khuẩn được

phân lập từ môi trường Nfb 35Hình 20 Khả năng tổng hợp IAA (mg/l) của 10 dòng vi khuẩn được phân lập từ

môi trường Nfb theo thời gian 35Hình 21 Khả năng tổng hợp IAA (mg/l) trung bình của 10 dòng vi khuẩn được

phân lập từ môi trường RMR 36Hình 22 Khả năng tổng hợp IAA (mg/l) của 10 dòng vi khuẩn được phân lập từ

môi trường RMR theo thời gian 36Hình 23 Khả năng cố định đạm, hòa tan lân và tổng hợp IAA trung bình của 10

dòng vi khuẩn trên môi trường Nfb 37Hình 24 Khả năng cố định đạm, hòa tan lân và tổng hợp IAA trung bình của 10

dòng vi khuẩn trên môi trường RMR 37Hình 25 Phổ điện di của sản phẩm PCR được nhân lên từ đoạn 16S rRNA của 20

dòng vi khuẩn 38Hình 26 Kết quả so sánh trình tự AN6 với trình tự các dòng vi khuẩn trên ngân

hàng dữ liệu NCBI 39Hình 27 Kết quả so sánh trình tự AN9 với trình tự các dòng vi khuẩn trên ngân

hàng dữ liệu NCBI 40Hình 28 Kết quả so sánh trình tự AN15 với trình tự các dòng vi khuẩn trên ngân

hàng dữ liệu NCBI 41Hình 29 Kết quả so sánh trình tự AN17 với trình tự các dòng vi khuẩn trên ngân

hàng dữ liệu NCBI 42Hình 30 Cây phả hệ (phylogenetic tree) trình bày mối quan hệ giữa bốn dòng vi

khuẩn nội sinh thực hiện theo phương pháp Maximum-Likelihood với

1500 lần lặp lại (Bootstrap) dựa theo trình tự gen 16S rRNA 43

CÁC TỪ VIẾT TẮT

RMR medium Rennie medium supplemented with rice extract and malate

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Vi khuẩn nội sinh đã được tìm thấy trong hầu hết tất cả các loài thực vật được nghiên cứu, chúng sống trong các mô của cây chủ và hình thành các mối quan hệ khác nhau, bao gồm cộng sinh, hỗ sinh, hội sinh,… Vi khuẩn nội sinh có nhiều giống rất đa

dạng như Enterobacter, Pseudomonas, Burkholderia, Azospirillum, Azotobacter…

Hầu hết các vi khuẩn nội sinh có nguồn gốc từ vùng rễ tuy nhiên một số có thể được truyền qua hạt giống Vi khuẩn nội sinh có thể thúc đẩy sự tăng trưởng và tăng năng suất của cây cũng có thể hoạt động như tác nhân kiểm soát sinh học Vi khuẩn nội sinh sản xuất các sản phẩm tự nhiên có thể khai thác tiềm năng sử dụng trong nông nghiệp,

y tế hoặc các ngành công nghiệp Ngoài ra, chúng cũng được chứng minh rằng có tiềm năng loại bỏ các chất gây ô nhiễm đất và đóng vai trò quan trọng trong việc cải tạo đất thông qua khả năng hòa tan lân khó tan và cố định đạm

Khai thác vi khuẩn nội sinh dẫn đến việc thúc đẩy sức khỏe thực vật và đóng một vai trò quan trọng trong các ứng dụng nông nghiệp bền vững cho cả thực phẩm và cây trồng Sự hiểu biết về các đặc tính của vi khuẩn nội sinh cùng với phương pháp nghiên cứu và ứng dụng chúng sẽ là điều cần thiết để đạt được đầy đủ tiềm năng và hiệu quả cho các ứng dụng thực tiễn trong tương lai

1.2 Mục tiêu đề tài

Phân lập, khảo sát đặc tính và nhận diện vi khuẩn nội sinh ở cây lúa nương trồng tại huyện Tuy An, tỉnh Phú Yên nhằm chọn ra một số dòng vi khuẩn có đặc tính tốt ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Vị trí địa lý huyện Tuy An

Huyện Tuy An thuộc địa phận hành chính tỉnh Phú Yên, vùng Duyên hải Nam Trung Bộ Vị trí huyện nằm ven biển tỉnh Phú Yên, phía bắc giáp với thị xã Sông Cầu

và Đồng Xuân, phía nam là thành phố Tuy Hòa, phía Tây giáp với huyện Sơn Hòa và phía đông là biển Đông Địa hình ở Tuy An đa dạng gồm có đồi núi, đồng bằng và biển

Tuy An nằm ở phía Đông dãy Trường Sơn và là nơi các nhánh của dãy Trường Sơn đâm ra biển Huyện có địa hình thấp từ Tây sang Đông Điểm cao nhất là núi Hòn Chuông, cao 500 m Nhiều xã núi non hiểm trở, đường giao thông đi lại khó khăn như

, trong đó đất nông nghiệp chiếm 45 , đất đồi núi chiếm 2 ,5 , và đất lâm nghiệp chiếm 12, tổng diện tích đất tự nhiên

2.2 Sơ lược về c y lú

Hình 1 C y lú

(*Nguồn: http://phanbonsumo.com.vn/chi-tiet/Kinh-nghiem-cham-soc-lua-mua 2-xanh-2-vang-.48.html, ngày 23/07/2013)

Chi Lúa (danh pháp khoa học: Oryza) là một chi của 15-20 loài thuộc họ Hòa

thảo (Poaceae) và nằm trong phân họ Oryzoideae, có nguồn gốc ở các khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới của châu Á và châu Phi Chi này bao gồm cả những loài sống lâu năm và một năm

Cây lúa non được gọi là mạ Sau khi ngâm ủ, các hạt thóc đã nảy mầm có thể được gieo th ng vào ruộng lúa đã được cày, bừa kỹ Hoặc các hạt này được gieo mạ trên rượu riêng để cây có sức sống cao hơn, sau một khoảng thời gian thì nhổ mạ rồi cấy trong ruộng lúa chính hi trưởng thành cây có thể cao từ 1-2 m với các lá mỏng, hẹp bản từ 2-2,5 cm và dài 50-100 cm Trên cây có các hoa nhỏ tự thụ phấn mọc thành các cụm hoa phân nhánh cong hay rủ xuống, dài 30-50 cm

Sản phẩm thu được từ cây lúa là thóc, hạt nhỏ thô cứng dài 5-12 mm và dày 2-3

mm Sau khi xát bỏ lớp vỏ ngoài thu được sản phẩm chính là gạo và các phụ phẩm là cám và trấu Gạo là nguồn lương thực chủ yếu của hơn một nửa dân số thế giới (chủ

yếu ở châu Á và châu Mỹ La tinh Tiêu biểu loài lúa tẻ (Oryza sativa đóng góp 20

số ngũ cốc trên thế giới, là cây lương thực có tầm quan trọng toàn cầu

Lúa nương là một loại lúa mọc trên các triền đất khô, chúng thường được đồng bào các dân tộc miền núi gieo trồng ở trên đồi cao hoặc sườn núi, những vùng ít nước Các giống lúa gạo đỏ trên địa bàn huyện Tuy An có khả năng chịu hạn tốt, phù hợp với đất nghèo dinh dưỡng của địa hình đồi núi Phú Yên Ngoài yếu tố phù hợp với điều kiện tự nhiên không thuận lợi ở các vùng đồi núi Phú Yên thì theo báo cáo kết quả kiểm tra do Công ty cổ phần iám định và Khử trùng FCC (TP Hồ Chí Minh) tiến hành: các giống lúa gạo đỏ Tuy An có chứa hàm lượng các chất Protein, Canxi, Kali, Phospho, Vitamin 1… cao hơn so với giống lúa cạn LC93 (giống lúa cạn được Viện Bảo vệ thực vật - Bộ NN-PTNT cung cấp để làm giống đối chứng nên được xem là giống lúa có chứa nguồn gen quý, cần được bảo vệ

Hoạt động sản xuất lúa hiện tại tập trung chủ yếu ở hai xã An Hòa, An Hiệp huyện Tuy An với các giống lúa: Tàu cúc, Bát quạt, Đuôi nai Trong đó, giống lúa Tàu cúc được nhiều người dân lựa chọn vì có thời gian sinh trưởng phù hợp và năng suất khá; 2 giống Bát quạt, Đuôi nai có thời gian sinh trưởng dài hơn nên số hộ dân sản xuất các giống này không còn nhiều

2.3 Vi khuẩn nội sinh

Vi khuẩn nội sinh là vi khuẩn cư trú trong các mô sống của cây chủ mà không làm tổn hại đến cây (Misaghi et al., 1990)

Vi khuẩn nội sinh được phát hiện trong hầu hết các loài thực vật Không những vậy chúng còn rất phong phú về chủng loại, với hầu hết thuộc chi vi khuẩn đất như

Enterobacter, Pseudomonas, Burkholderia, Azospirillum

2.3.1 Vai trò

Vi khuẩn nội sinh có một số cơ chế giúp ích cho sự tăng trưởng và khỏe mạnh của cây Những cơ chế này có vai trò quan trọng hàng đầu cho việc sử dụng cây trồng làm nguyên liệu cho nhiên liệu sinh học và hấp thụ carbon thông qua sản xuất sinh khối

Như vi khuẩn vùng rễ, vi khuẩn nội sinh đã được chứng minh là có khả năng thúc đẩy thực vật tăng trưởng nhờ vào việc sản xuất các phytohormones, các enzyme tham gia vào quá trình trao đổi chất, điều hòa tăng trưởng, như etylen, 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC) deaminase, auxin, indole-3-acetic acid (IAA), acetoin, 2,3-butanediol, cytokinin ( lick et al., 1 Chúng cũng có thể cải thiện sự tăng trưởng thực vật thông qua sự cố định đạm (diazotrophy) (Triplett, 1996)

và cung cấp các khoáng chất như phosphate

Những nghiên cứu gần đây cho thấy vi khuẩn nội sinh có khả năng sinh ra hợp chất kháng mầm bệnh như vi khuẩn, nấm,… Bên cạnh đó chúng cũng có khả năng phân hủy các hóa chất độc hại dùng trong nông nghiệp

các tế bào nhu mô rễ hay biểu bì rễ để sống nội sinh như Azotobacter, Bacillus,

Beijerinckia, Derxia, Enterobacteriaeae (Klebsiella, Enterobacter, Pantonae), Pseudomonas, Alcaligenes, Azoarcus, Burkholderia, Campylobacter, Herbaspirillum Gluconacetobacter, và Paenibacillus (Elmerich, 200 Ngoài ra chúng cũng có thể

xâm nhập vào mô thực vật thông qua khí khổng hay các vị trí bị tổn thương của lá (Roos và Hattingh, 1983)

2.3.3 Đ dạng sinh học

Vi khuẩn Azospirillum

Azospirillum thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, có thể chuyển động, dạng hình que

ngắn; kích thước biến thiên trong khoảng 0,8-1, μm chiều rộng và 1,4-3, μm chiều

dài Các loài Azospirillum biểu hiện sự phân bố sinh thái vô cùng rộng lớn và được gắn

liền với sự đa dạng to lớn của cây trồng (van Berkum và Bohlool, 1980)

Một số loài phổ biến thường xuất hiện ở rễ và thân lúa và hoa màu như:

Azospirillum brasilense, Azospirillum lipoferum, Azospirillum amazonense, Azospirillum irakens

Vi khuẩn Herbaspirillum

Vi khuẩn Herbaspirillum thuộc nhóm β – Proteobacteria, là vi khuẩn cố định

đạm sống trong rễ của nhiều cây không phải là họ đậu, bao gồm các loại cây họ lúa có giá trị kinh tế

Các loài Herbaspirillum seropedicae và Herbaspirillum rubrisubalbicans đã

được tìm thấy ở cây bắp, mía đường, lúa hoang và lúa trồng (Baldani et al., 1986; Olivares et al., 1996) Vi khuẩn này cũng được tìm thấy ở cỏ chăn nuôi và các cây trồng nhiệt đới như khóm, chuối (Cruz et al., 2001)

Hầu hết các loài của Herbaspirillum thuộc nhóm vi khuẩn nội sinh bắt buộc

trong các mô thực vật Trong vùng rễ chúng có khả năng cố định đạm mạnh mẽ (Baldani et al., 1 , ngoài ra chúng còn phát tán đến cả những vùng ở thân và lá (Barraquio et al., 1997)

Vi khuẩn Azotobacter

Chi Azotobacter thường có khả năng di động, hình bầu dục hoặc hình cầu, có thể

sản xuất một lượng lớn chất nhờn nang Chúng thuộc loại vi khuẩn hiếu khí Khi sống

tự do trong đất chúng đóng vai trò quan trọng trong chu trình nitơ trong tự nhiên, cố định nitơ khí quyển, và giải phóng dưới dạng các ion amoni vào đất Đại diện đầu tiên

của chi, Azotobacter chroococcum, được phát hiện và mô tả năm 1 01 bởi nhà vi sinh học và thực vật học người Hà Lan Martinus Beijerinck Azotobacter là vi khuẩn Gram

âm Chúng được tìm thấy trong đất trung tính và kiềm, trong nước và sống nội sinh trong thực vật

Những loài thuộc chi Azotobacter có thể tổng hợp một số loại enzyme

nitrogenase, enzyme quan trọng nhất liên quan đến sự cố định đạm

Hình 2 Azospirillum brasilense dưới kính hiển vi điện tử, x15000

(*Nguồn: http://web.mst.edu/~microbio/bio221_1999/A_brasilense.html , ngày 20/02/2013)

Một số nhóm vi khuẩn nội sinh khác

Ngoài những loài trên, còn có một số nhóm vi khuẩn vừa mới được phát hiện gần

đây như: Gluconacetobacter diazotrophicus, Klebsiella, Enterobacter, Azoarcus,

Pseudomonas, Burkholderi, Cellulomonas, Clavibacter, Curtobacterium, Microbacterium, Gammaproteobacteria, Acinetobacter, Bacillus và Firmicutes cũng

có triển vọng nghiên cứu sâu

2.4 Một số đặc tính củ vi khuẩn nội sinh

2.4.1 Khả năng cố định đạm

Nitơ là một chất cần thiết cho nhiều quá trình; và là chất chủ yếu của bất kỳ dạng sống nào trên Trái Đất Nó là thành phần chính trong tất cả amino acid, và có mặt trong các chất cơ bản cấu thành nên các axit nucleic, như DNA và RNA Trong thực vật, hầu hết nitơ được dùng trong các phân tử chlorophyll, là chất cần thiết cho quá trình quang hợp và sự phát triển về sau của chúng Nitơ là thành phần chính của khí quyển (khoảng 78%) , có thể xem đó là một bể chứa nitơ lớn nhất Tuy nhiên, nitơ trong khí quyển thường tồn tại dưới dạng phân tử nên có giá trị sử dụng rất hạn chế đối với sinh vật

Đạm là dưỡng chất chính giới hạn sự phát triển của lúa, lúa cần 1 kg đạm để sản xuất ra 15-20 kg lúa hạt (Ladha và Reddy, 2003) Cố định đạm sinh học là một quá trình được thực hiện bởi vi khuẩn trong đó phân tử nitơ được biến đổi thành dạng nguyên tử, sau đó thành dạng đạm vô cơ, phân tử amonia, tiếp đó vi khuẩn sẽ biến đổi tiếp một phần thành dạng hữu cơ acid amin để sử dụng cho bản thân vi khuẩn Để đảm bảo an toàn thực phẩm thông qua nền nông nghiệp bền vững, nhu cầu cố định đạm sinh học ngày càng được quan tâm hơn là sử dụng đạm được cố dịnh bằng con đường công nghiệp

Vi sinh vật cố định đạm đóng vai trò quan trọng trong chu trình chuyển hóa nitơ

tự nhiên Đặc biệt nhờ quá trình cố định đạm sinh học mà nhu cầu về nitơ của cây trồng trên trái đất mới được đáp ứng Hàng năm có khoảng 170 tấn nitơ không khí được chuyển thành nitơ hợp chất nhờ quá trình này để cung cấp cho cây trồng

2.4.2 Khả năng hò t n l n khó t n

Trong đất, lân được phân thành 3 loại chính là lân tan, lân vô cơ không tan và lân

hoà tan trong dung dịch đất (dạng dễ tiêu), chủ yếu ở dạng orthophosphate bậc một hoặc bậc hai Nhiều loại đất như đất đỏ bazan, đất đen có hàm lượng lân trong đất khá cao, nhưng cây không hút được vì lân ở dưới dạng khó hoà tan như apatite, hydroxyapatite, và oxyapatite

Trong đất thường tồn tại một nhóm vi sinh vật có khả năng hoà tan lân Nhóm vi sinh vật này được các nhà khoa học đặt tên là nhóm vi sinh vật hoà tan lân (phosphate solubilizing microorganisms)

Nhóm vi sinh vật này dễ dàng nuôi cấy trên môi trường nhân tạo Nhiều nơi người ta trộn sinh khối hoặc bào tử các loại vi sinh vật hoà tan lân sau khi nuôi cấy và nhân lên trong phòng thí nghiệm với bột phosphorit hoặc apatit rồi bón cho cây Các chế phẩm sinh học này đem lại hiệu quả cao ở những vùng đất cây bị thiếu lân

2.4.3 Khả năng tổng hợp indole-3-acetic acid (IAA)

Indole-3-acetic acid (IAA) hay còn gọi là auxin, là chất điều hòa chủ yếu của sự sinh trưởng thực vật IAA chi phối sự phân chia tế bào, sự giãn dài tế bào, phân hóa sinh mô, phát triển trái và hạt, chi phối giai đoạn đầu sự phát triển của cây trồng (Davies, 2004 Tác động của auxin phụ thuộc vào dạng tế bào, ở các nồng độ như nhau IAA kích thích đồng thời sự giãn dài trục lá mầm, ngăn cản sự sinh trưởng của rễ chính, kích thích sự khởi đầu của rễ bên và sự thành lập lông rễ (Theologis và Ray, 1982; Gray et al., 2001)

Có nhiều lộ trình tổng hợp IAA trong thực vật, trong đó dùng tryptophan làm tiền chất để tổng hợp IAA được đề cập nhiều nhất Theo Koga et al (1991), các lộ trình sinh tổng hợp IAA gồm có:

tryptophan => indole-3-acetamine => IAA

Vi khuẩn Enterobacter cloacae có khả năng tổng hợp IAA từ tiền chất

L-tryptophan (Koga et al.,1991)

Hình 5 Sơ đồ lộ trình tổng hợp IAA ở Enterobacter cloacae

(*Nguồn: Kaga et al., 1991)

Vi khuẩn nội sinh có khả năng tổng hợp IAA là do chúng chứa những enzyme đặc hiệu thuộc nhóm dehydrogenase

Biện pháp sinh học không hoặc rất ít gây ô nhiễm môi trường, góp phần vào việc giữ cân bằng sinh thái, không độc hại với người sử dụng, các nông phẩm tạo ra có chất lượng cao, sạch an toàn với sức khoẻ con người và vật nuôi Vì vậy biện pháp sinh học được sử dụng khá phổ biến ở nhiều nước phát triển và hiện đang từng bước được mở rộng, khuyến khích sử dụng ở hầu hết các nước trên thế giới và có nhiều triển vọng phát triển mạnh trong tương lai

Một số vi khuẩn nội sinh kích hoạt hiện tượng gọi là hệ thống đề kháng cảm ứng (induced systemic resistance-ISR , tương tự như hệ thống đề kháng mắc phải (systemic-acquired resistance-SAR) SAR phát triển khi thực vật thành công kích hoạt

cơ chế bảo vệ của chúng để đáp ứng với sự nhiễm trùng do một tác nhân gây bệnh

ISR chống lại các tác nhân gây bệnh có hiệu quả , nhưng khác với SAR vì vi khuẩn gây không gây ra các triệu chứng có thể nhìn thấy trên cây chủ (van Loon et al, 1998) Nhiều thí nghiệm đã chứng minh vi khuẩn nội sinh có khả năng làm yếu đi hay ngăn chặn tác hại của sinh vật gây bệnh Tùy vào các đối tượng gây hại khác nhau mà

có những phương pháp nghiên cứu khác nhau

2.4.5 Sản phẩm thiên nhiên từ vi khuẩn nội sinh

Những chi vi khuẩn nội sinh như Pseudomonas, Burkholderia và Bacillus

(Lodewyckx et al., 2002 được biết đến với khả năng tổng hợp các sản phẩm thứ cấp như kháng sinh, chất kháng ung thư, hợp chất hữu cơ thơm, kháng nấm, kháng virus, kháng sâu,… và tác nhân ức chế miễn dịch

Trong khi hầu hết các nghiên cứu đã tập trung vào sản xuất chế phẩm vi sinh có trọng lượng phân tử nhỏ, hoạt động ở nồng độ thấp chống lại vi khuẩn gây bệnh cho động vật, con người và thực vật

Một thành viên của chi Pseudomonas là Pseudomonas viridiflava, phân lập trong

các mô của nhiều loài cỏ (Miller et al, 1 , đã được tìm thấy để sản xuất hai hợp chất kháng khuẩn mới được gọi là ecomycins Ecomycins là đại của các lipopeptides mới, được tạo thành từ một số acid amin không thông thường bao gồm homoserine và β-hydroxy aspartic acid Những hợp chất đó được cho rằng có khả năng ức chế các

mầm bệnh ở người như Cryptococcus neoformans và Candida albicans (Miller et al,

1998.)

Các sản phẩm thứ cấp nói trên được trích ly từ sự lên men của những loài vi

khuẩn như Pseudomonas, Burkholderia, Bacillus (Lodewyckx et al., 2002)

2.4.6 Khả năng ph n hủy sinh học

Phương pháp phân hu sinh học sử dụng các sinh vật sống, thường là vi sinh vật, thực vật, và sản phẩm sinh ra từ chúng để phân hu , khử độc hay cô lập các chất độc trong môi trường Phương pháp này đã được nghiên cứu từ những năm 1 40 và thành tựu công nghệ phân hu sinh học xử l ô nhiễm dầu xuất hiện đầu tiên vào năm 1 Phân hu sinh học thích hợp trong xử l đất, cặn, nước hoặc ngay cả không khí, dựa trên hoạt tính enzyme của sinh vật sống, thường là vi sinh vật để xúc tác quá trình phân hu các chất độc hoặc chuyển chúng thành dạng ít độc hơn Vi sinh vật được ưu tiên sử dụng do khả năng trao đổi chất đa dạng của chúng Một số có khả năng phân

hu các chất rất độc và khó phân hu như hydrocarbon trong dầu mỏ và hydrocarbon

đã halogen hoá của các ngành công nghiệp Sản phẩm cuối cùng của phân hu sinh

Ví dụ như vi khuẩn nội sinh trong cây trồng phát triển tốt ở vùng đất bị nhiễm độc có chứa gene có khả năng phân hủy các hợp chất độc hại đó (Siciliano et al., 2001)

Nhiều giải pháp kỹ thuật đã phát triển nhằm thích ứng với các kiểu ô nhiễm khác nhau Đánh giá quần thể vi sinh vật có khả năng phân hu các chất ô nhiễm là bước quan trọng nhất để quyết định kỹ thuật thích hợp như lấy chất ô nhiễm từ vùng ô nhiễm ban đầu để xử l ở nơi khác hoặc xử l ô nhiễm tại chỗ

2.5 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)

2.5.1 Ly trích h y tách chiết DNA

Kỹ thuật tinh chiết DNA là một trong những kỹ thuật sinh học phân tử đầu tiên

vô cùng quan trọng, góp phần cho sự thành công trong những bước tiếp theo Hiện nay

có rất nhiều cách làm đơn giản, thời gian thực hiện rút ngắn tùy theo mục đích sử dụng DNA để làm gì, hoặc chiết xuất DNA từ loại mô nào và trên đối tượng gì

Để thu được DNA tinh sạch cần loại bỏ những thành phần tạp nhiễm mà quan trọng nhất là protein Tách chiết DNA giúp ta thực hiện điều đó

Theo Neumann (1992), quy trình chung chiết xuất DNA như sau:

1 Chuẩn bị mẫu

2 Phá vỡ tế bào

3 Hòa tan DNA

4 Loại bỏ các thành phần không phải là DNA

5 Tủa DNA

6 Rửa DNA

7 Làm khô

8 Kiểm tra chất lượng DNA

- Ly trích DNA dựa trên nguyên tắc:

Ly tâm dịch vi khuẩn để phá vỡ màng tế bào, giải phóng DNA vào môi trường

Dung dịch TE pH8 có tác dụng hòa tan tế bào và giúp DNA không bị biến tính Dung dịch SDS 10 để phá vỡ màng nhân làm cho DNA phóng thích vào dung dịch

Proteinase K là một serine protease không đặc biệt, được sử dụng để chiết suất và tinh sạch DNA có trọng lượng phân tử cao, ngoài ra proteinase cũng được dùng để chiết suất RNAse và làm bất hoạt nuclease (RNAse và DNAse Để hoạt động có hiệu quả hơn, proteinase thường được duy trì trong sự hiện diện của SDS, EDTA và urea Proteinase K có tác dụng phân hủy protein

10% CTAB/0,7M NaCl tạo phức tan với DNA, nhưng tạo phức dạng tủa với protein, lipid, …

Chloroform: isoamyl alcohol (24/1) giúp phân tách và kéo các thành phần không phải là DNA xuống mặt dưới dung dịch

Ethanol 70% giúp giữ tủa DNA, loại bỏ muối bám trong DNA và lượng isopropanol còn lại trong DNA

Sấy DNA trong máy sấy chân không để loại bỏ ethanol

2.5.2 Phản ứng PCR

PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction hay phản ứng khuếch đại gen PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuyếch đại một

đoạn DNA (tạo ra nhiều bản sao) mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E

coli hay nấm men PCR được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ

nhiều mục đích khác nhau như phát hiện các bệnh di truyền, nhận dạng, chẩn đoán những bệnh nhiễm trùng, tách dòng gene, xác định huyết thống, vân tay di truyền, gây đột biến điểm, phân tích mẫu DNA cổ, xác định kiểu gene của các đột biến và so sánh mức độ biểu hiện của gene,…

Chu kỳ PCR gồm 3 bước:

(1) Gi i đoạn tách: tăng nhiệt độ lên 94- 5°C để tách hai sợi DNA ước này gọi là

biến tính và nó giúp phá vỡ cầu nối hydrogen nối 2 sợi DNA Trước chu kỳ 1, DNA thường được biến tính đến thời gian mở chuỗi để đảm bảo mẫu DNA và mồi được phân tách hoàn toàn và chỉ còn dạng sợi đơn Thời gian: 1-2 phút

(2) Gi i đoạn gắn mồi: sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ thấp xuống để

mồi có thể gắn vào sợi DNA đơn ước này gọi là gắn mồi Nhiệt độ giai đoạn này phụ thuộc vào đoạn mồi và thường thấp hơn nhiệt độ biến tính 50°C (45-60°C) Nếu

sử dụng sai nhiệt độ trong giai đoạn này sẽ dẫn đến việc đoạn mồi không gắn hoàn

toàn vào DNA mẫu, hay gắn một cách tùy tiện Thời gian: 1-2 phút

(3) Gi i đoạn tổng hợp: DNA polymerase gắn tiếp vào sợi trống Nó bắt đầu bám vào

và hoạt động dọc theo sợi DNA ước này gọi là kéo dài Nhiệt độ kéo dài phụ thuộc

DNA polymerase Thời gian của bước này phụ thuộc vào cả DNA polymerase và

chiều dài mảnh DNA cần khuếch đại

Quy trình PCR thường được tiến hành từ 35-40 chu kỳ

Primer 16S rRNA dùng để nhận dạng vi khuẩn nội sinh có trình tự sau:

2.5.3 Kỹ thuật điện di

Điện di là hiện tượng dịch chuyển của các vật thể mang điện tích dưới tác động

của điện trường Sự dịch chuyển này do thành phần lực điện trong lực Lorentz

Điện di hay điện di trên gel (electrophoresis hay gel electrophoresis) áp dụng

trong sinh học phân tử là một kỹ thuật để phân tích các phân tử DNA, RNA hay

protein dựa trên các đặc điểm vật lý của chúng như kích thước, hình dạng hay điểm

đ ng điện tích (isoelectric point)

Kỹ thuật này sử dụng một dung dịch đệm (buffer để dẫn diện và tạo điện trường

đều, một bản gel (thường là agarose hay polyacrylamide đóng vai trò là thể nền để

phân tách các phân tử, và các chất nhuộm khác nhau (ethidium bromide, bạc, xanh

coomassie để phát hiện vị trí các phân tử trên gel sau khi điện di

Kỹ thuật điện di hoạt động nhờ vào lực kéo của điện trường tác động vào các

phân tử tích điện và kích thước lỗ của thể nền (gel) Gel cấu tạo bởi các chuỗi cao phân tử (polymer được liên kết chéo với nhau tạo thành một hệ thống mạng lưới với

kích thước các mắc lưới tùy thuộc vào nồng độ chất cao phân tử (agarose,

polyacrylamide) và phản ứng tạo liên kết chéo

Các phân tử được phân tách khi di chuyển trong gel với vận tốc khác nhau nhờ

vào sự khác nhau của:

- Lực của điện trường tác động lên chúng (nếu các phân tử tích điện khác nhau)

- ích thước của phân tử so với kích thước lỗ gel

- Hình dạng, độ cồng kềnh của phân tử

Điện di bằng gel agarose bao gồm việc nhỏ mẫu sản phẩm PCR của DNA vào gel agarose và sau đó chạy điện di trên gel Kết quả là các đoạn DNA nhỏ hơn sẽ di chuyển nhanh hơn các đoạn lớn qua gel từ cực âm đến cực dương ích thước của sản phẩm PCR có thể được xác định bằng việc so sánh với thang chuẩn DNA, thang này

có chứa các DNA đã biết trước kích thước, cũng nằm trong gel

Loading buffer là buffer tải DNA chứa glycerol, bromophenol blue và xylencyanol và sucrose Trong đó, xylencyanol và bromophenol blue giúp tạo màu, glycerol và sucrose có t trọng cao giúp kéo DNA nằm trong giếng không bị trôi ra ngoài trong khi load mẫu

DNA thường dùng để làm thang chuẩn là 100bp plus DNA Ladder” Đây là loại DNA được sử dụng phổ biến trong điện di DNA sợi đôi Thang chuẩn bao gồm 14 đoạn DNA có kích thước khác nhau: 3000bp, 2000bp, 1500bp, 1200bp, 1000bp, 00bp, 00bp, 00bp, 00bp, 500bp, 400bp, 300bp, 200bp, và 100bp (trong đó có 2 mẫu với kích thước 1000bp và 500bp rất dễ xác định trên gel Trên thị trường hiện nay, thang chuẩn đã được các nhà cung cấp chuẩn bị s n cùng với thuốc nhuộm X DNA Loading Dye DNA được bảo quản trong TE buffer (gồm 10 mM Tris-HCl

pH 7, và 1 mM EDTA trong 1l Sử dụng 1μl mẫu DNA thang chuẩn cho 1mm giếng trên gel

Hình 6 Máy gia nhiệt (máy PCR) và bộ điện di

(*Nguồn (máy PCR): http://www.cgenetool.com/products/Biorad_c1000.shtml , ngày 20/07/2013)

(*Nguồn (bộ điện di): http://regentsgenetictechnology.wikispaces.com/Gel+Electrophoresis+3-4, ngày

20/07/2013)

Hình 7 Thang chuẩn

(*Nguồn: 100-to-3000-bp/, ngày 20/07/2013)

http://www.thermoscientificbio.com/nucleic-acid-electrophoresis/generuler-100-bp-plus-dna-ladder-CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Các thí nghiệm được thực hiện tại Viện Ngiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, phòng Vi sinh vật đất, phòng Sinh học phân tử

Thời gian thực hiện: từ tháng 01/2013 đến tháng 12/2013

3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Dụng cụ, thiết bị

Một số dụng cụ và máy móc, thiết bị như:

- Ống nghiệm nuôi vi khuẩn, đĩa petri, ống đong, bình tam giác 100 ml - 500 ml, ống Falcon, cốc, chai, que cấy, đèn cồn, lame và lammen …

- Tủ cấy, tủ ủ vi sinh vật, kính hiển vi, cân phân tích, nồi khử trùng nhiệt ướt, máy lắc, máy đo pH, máy đo quang phổ, tủ sấy, micropipette, máy ly tâm, water-bath, máy vortex, tube eppendorf, đầu cole, bộ điện di, bộ nguồn điện di, bộ đọc gel, máy gia nhiệt (máy PCR), máy chụp hình gel, tủ lạnh và các thiết bị thường dùng khác trong phòng thí nghiệm

Iod, Fushin, Crystal Violet, Ethanol (70%), nước cất hai lần vô trùng

tartrate (KSbOC4H4O6), acid ascorbic, acid sulfuric (H2SO4 đậm đặc, FeCl3, HgCl2,

Tris-HCl pH8, EDTA, 10% SDS, proteinase K, CTAB, chloroform, ethanol, isopropanol, nước cất hai lần vô trùng

agarose tinh khiết, thang chuẩn, loading buffer

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Thu thập và xử lý mẫu

Mẫu lúa nương đang ở giai đoạn tăng trưởng mạnh, có sự hiện diện của vi khuẩn nội sinh nhiều nhất được thu tại nhiều địa điểm khác nhau tại huyện Tuy An, tỉnh Phú Yên

Rửa mẫu dưới vòi nước chảy mạnh cho sạch đất, loại bỏ những lá già, để ráo tự nhiên; cắt rời rễ, thân, lá và hạt thành từng đoạn nhỏ bằng dao bén, để riêng trong túi nylon sạch, bảo quản trong ngăn mát tủ lạnh nếu chưa phân lập

Cho mẫu vào bình tam giác 100 ml và tiến hành khử trùng bề mặt lần lượt bằng các hóa chất sau: cồn 96%, HgCl2 0,1% và hydrogen peroxide (H2O2) 3% Hóa chất phải vừa ngập mẫu và phải lắc nhẹ bình Sau 3 phút khử trùng, mẫu phải được rửa sạch bằng nước cất vô trùng

Để kiểm tra độ sạch của mẫu, dùng 200 µl nước rửa mẫu lần cuối chủng lên đĩa chứa môi trường Tryptone - Yeast extract - Glucose agar Nếu sau 24 giờ đĩa môi trường này không xuất hiện khuẩn lạc nghĩa là mẫu đã đạt yêu cầu

Cho khoảng 2 g mẫu rễ (hoặc thân, lá, cuống lá, hạt) vào cối vô trùng giã nhuyễn, thêm 0,5-1 ml nước cất cô trùng vào cối, trộn đều và hút phần dịch trích này cho vào tube 1,5 ml

Sau 2-4 ngày quan sát ống nghiệm, thấy có một lớp màng mỏng trên bề mặt môi trường, đó là dấu hiệu chứng tỏ sự hiện diện của vi khuẩn nội sinh

sau 1-2 ngày, chọn những khuẩn lạc rời, đều nhau nằm trên đường cấy, cấy chuyển sang những đĩa môi trường khác cho tới khi quan sát dưới kính hiển vi thấy vi khuẩn

đã ròng, chuyển mẫu ròng vào ống nghiệm chứa môi trường đặc trữ ở trong tủ lạnh và được xem là một dòng vi khuẩn

3.3.3 Qu n sát hình thái, đo kích thước khuẩn lạc

Khi cấy chuyển vi khuẩn trên đĩa môi trường phân lập đặc ta đồng thời tiến hành

đo kích thước và quan sát hình thái các dạng khuẩn lạc bao gồm các chỉ tiêu: màu sắc, hình dạng, độ nổi và dạng bìa khuẩn lạc bằng mắt thường Tuy nhiên, đối với những khuẩn lạc có kích thước quá nhỏ thì sử dụng kính lúp để quan sát

3.3.4 Qu n sát hình dạng và khả năng chuyển động củ vi khuẩn

Sau khi phân lập, tiến hành quan sát hình dạng và sự chuyển động của vi khuẩn bằng phương pháp nhỏ giọt ép dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần Chuẩn bị mẫu vi khuẩn:

- Nhỏ 15 μl nước cất vô trùng lên kính mang vật (lame)

- Khử trùng kim cấy trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội

- Dùng kim cấy lấy một ít khuẩn lạc rồi trải đều lên giọt nước cất vô trùng trên kính mang vật

- Đậy kính đậy vật (lammelle) lên giọt huyền phù vi khuẩn bằng cách để một cạnh của

nhàng sao cho trong mẫu không có bọt khí

Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn ở độ phóng đại 400 lần

3.3.5 Nhuộm Gr m tế bào vi khuẩn

Nhuộm Gram là một phương pháp thực nghiệm nhằm phân biệt các loài vi khuẩn thành 2 nhóm ram dương ( ram positive và ram âm ( ram negative dựa trên các đặc tính hoá lý của thành tế bào Sau khi quan sát hình dạng và sự chuyển động của vi khuẩn, tiến hành nhuộm ram theo các bước sau:

- Dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ ống giống thạch nghiêng hoà vào 20µl nước cất ở giữa kính mang vật

- Hơ nhanh mẫu vật trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần để gắn chặt vi khuẩn vào kính mang vật

- Nhuộm bằng dung dịch Crystal Violet (1-2 giọt) trong 2 phút, rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô;

- Nhỏ 1-2 giọt dung dịch Iod trải đều và để trong 1 phút, rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô;

- Rửa lại bằng ethanol ( 0 để tẩy màu, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô;

- Nhuộm tiếp bằng dung dịch Fuchsin (1-2 giọt) trong 1 phút, rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô

- Tiến hành quan sát mẫu trên kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần

Vi khuẩn ram dương có màu tím xanh của Crystal Violet, trong khi vi khuẩn Gram âm trở thành màu hồng đỏ của Fuchsin

3.3.6 Khảo sát khả năng cố định đạm

Do có khả năng tổng hợp đạm từ không khí, các vi khuẩn có khả năng cố định đạm có thể phát triển trên môi trường không đạm Cấy chuyển các dòng vi khuẩn phân

1-2 ngày Những dòng phát triển được là những dòng có khả năng cố định đạm

Những dòng vi khuẩn này được nuôi tăng sinh trong môi trường NFb và RMR lỏng trong 1-2 ngày trước khi chủng vào môi trường urk không đạm lỏng để tiến

được vi khuẩn tạo ra trong dung dịch phản ứng với

- Dung dịch mẹ Sodium hypochlorise: cân 1,48 g NaOH và 4,98 g Na2HPO4, chuẩn bị

s n 0 ml nước và 20 ml dung dịch Na Cl, khi thêm Na Cl xong thì thêm nước ngay sau đó cho đủ 100 ml

từ 0 đến 5 như bảng sau

và tiến hành đo lượng đạm tổng hợp được bằng phương pháp quang phổ ở bước sóng

636 nm

3.3.7 Khảo sát khả năng hò t n l n khó t n

Tương tự khảo sát năng cố định đạm, sau khi được cấy chuyển trên môi trường

C, các dòng vi khuẩn nội sinh phát triển tốt trên cả môi trường này và môi trường urk không đạm được nhân sinh khối trong môi trường NFb và RMR rồi chủng vảo môi trường NBRIP lỏng Khả năng hòa tan lân khó tan được định lượng sau 5, 10, 15 và 20 ngày

Chủng 1 ml vi khuẩn gốc vào 25 ml môi trường NBRIP lỏng trong bình tam giác

và lắc trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút ở điều kiện nhiệt độ phòng trong 20 ngày tiến hành thí nghiệm Mỗi nghiệm thức lập lại ba lần

Chuẩn bị hóa chất:

- Dung dịch A: chuẩn bị s n 1 l nước khử khoáng được đặt trong thau nước lạnh, cho

rồi thêm nước cho đủ 2 l

- Dung dịch B: cân 1,056 g acid ascorbic vào 200 ml dung dịch A

Xây dựng đường chuẩn P2O5: chuẩn bị 6 ống nghiệm như sau

3.3.8 Khảo sát khả năng tổng hợp Indole-3-acetic acid (IAA)

Cấy chuyển các dòng vi khuẩn nội sinh trên môi trường Nfb và RMR đặc có bổ

ngày, dòng nào phát triển thì có khả năng tổng hợp IAA Chọn những dòng phát triển trên môi trường này đồng thời phát triển trên môi trường urk không đạm và NBRIP đặc để tiến hành khảo sát khả năng tổng hợp IAA trên môi trường NFb và RMR lỏng

có bổ sung tryptophan sau 2, 4, 6 và 8 ngày

Chủng 150 μl vi khuẩn gốc lần lượt vào các tube eppendorf có chứa 1,5 ml môi trường Nfb và RMR lỏng có bổ sung tryptophan và ủ trong tối trong 8 ngày tiến hành thí nghiệm Mỗi nghiệm thức lập lại ba lần

Chuẩn bị thuốc thử: đong 44 ml nước khử khoáng cho vào cốc có thể tích lớn hơn 1l,

H2SO4 đã được pha loãng vào cốc chứa 4,5g FeCl3, khuấy đều, để nguội; bảo quản trong chai tối màu

Xây dựng đường chuẩn:

Bảng 3 Đường chuẩn IAA

3.3.9 Nhận diện vi khuẩn nội sinh bằng kỹ thuật PCR

A Ly trích DNA của vi khuẩn

Nuôi vi khuẩn trong 3ml môi trường LB lỏng và lắc ủ qua đêm

Chuyển 2 ml dung dịch vi khuẩn vào tube eppendoft 2,2 ml, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút để phá vỡ màng tế bào, giải phóng DNA vào môi trường và tủa

vi khuẩn

Loại bỏ phần dung dịch trong có trong tube, giữ lại phần cặn

Cho 250µl dung dịch TE pH8 vào phần cặn của tube, và đánh tan sinh khối Thêm 50µl dung dịch 10% SDS Bổ sung thêm 5µl proteinase K (20 mg/ml) và ủ

Bổ sung 600µl chloroform: isoamyl alcohol (24/1) (thực hiện trong tủ hút) vào tube và trộn đều, ly tâm ở 12000 vòng/phút trong 10 phút

Chuyển 500µl phần trong DNA phía trên vào tube mới, thêm 500µl isopropanol

Ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ phần trong, lấy phần cặn là DNA tủa

Rửa với 500µl ethanol 70%, ly tâm ở 12000 vòng/phút trong 5 phút, lặp lại 2 lần

Hòa tan trong 30µl nước cất hai lần để trữ DNA

B Nhận diện các dòng vi khuẩn nội sinh bằng kỹ thuật PCR

- Pha mix trong tube 1,5 ml

- Chu kỳ gia nhiệt khi thực hiện

Phản ứng PCR được thực hiện trong chu kỳ nhiệt Máy gia nhiệt là máy đun nóng và làm nguội trong ống phản ứng ở nhiệt độ chính xác cho mỗi phản ứng Để ngăn ngừa sự bay hơi của hỗn hợp phản ứng, phần nắp đậy của máy PCR cũng được đun nóng, trường hợp lượng dung dịch phản ứng quá ít, người ta cho một lớp dầu (natural oil) lên trên bề mặt hỗn hợp phản ứng

Quy trình PCR gồm 35 chu kỳ Mỗi chu kỳ gồm 3 bước:

(1 iai đoạn tách: nhiệt độ tăng lên 4°C, thời gian: 45 giây

(2 iai đoạn gắn mồi: 55°C, thời gian: 45 giây

(3 iai đoạn tổng hợp: 72°C, thời gian: 1 phút

Primer 16S rRNA (Zinniel et al., 2002) dùng để nhận dạng vi khuẩn nội sinh có trình tự sau:

Hình 8 Chu trình PCR 16S rRNA

Sau đó, sản phẩm PCR được giữ ở 4°C

- Kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose

Sau khi phản ứng PCR được thực hiện, sản phẩm PCR được điện di bằng gel agarose 1% có bổ sung ethidium bromide (EtBr)

Quy trình điện di như sau:

- Chuẩn bị gel

hay điện di được đặt s n lược có số răng là 1 ở một đầu khay và được đặt ở nơi bằng ph ng

Gel sử dụng chạy điện di: 40ml với nồng độ 1% agrarose

Cân 0,40g agrarose cho vào chai thủy tinh có chứa 40ml bufer TBE 1X

Lắc chai cho agrarose hòa tan vào buffer TBE 1X

Nung hỗn hợp trong microwave ở mức medium trong 5 phút cho agarose tan hoàn toàn Để nguội (có thể cầm bằng tay được , sau đó thêm 0, µl ethidium bromide vào, lắc đều và đổ nhẹ dung dịch vào một đầu khay Dung dịch sẽ tự trải đều khay Sau khoảng 45 phút gel đặc lại có thể sử dụng được

Đặt khay vào bể điện di, thêm dung dịch điện di (bufer TBE 1X) phủ mặt gel khoảng 2 mm

Sau khi gel chuẩn bị xong, ta tiến hành load mẫu vào các giếng của gel

- Load mẫu:

Dùng micropipette hút dung dịch loading buffer và nhỏ thành từng giọt nhỏ khoảng 2µl ra giấy parafilm Trộn đều 10µl dung dịch mẫu với dung dịch loading buffer rồi nhỏ hổn hợp vào giếng của gel Tiến hành chạy điện di trên gel ở hiệu điện thế 95 volt trong 45 phút

- Quan sát và chụp hình:

Bản gel được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại trên hệ thống máy đọc gel và chụp hình gel Bio-Rad UV 2000 (Hoa Kỳ)

C Giải trình tự DNA để nhận diện các dòng vi khuẩn nội sinh

Sử dụng sản phẩm PCR để giải trình tự bằng máy giải trình tự tự động ABI3130 thông qua công ty MACROGEN, Hàn Quốc Sử dụng chương trình LAST N (Nucleotide asic Local Alignment Search Tool để so sánh trình tự đoạn gen 16S rRNA của các dòng vi khuẩn với trình tự gen 16S rRNA của các loài vi khuẩn có trong ngân hàng dữ liệu của NCBI (National Center for Biotechnology Information) và vẽ cây phả hệ bằng phần mềm MEGA 5.1

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả ph n lập

Sau các giai đoạn phân lập và tách ròng vi khuẩn trên hai môi trường Nfb và RMR, thu được 20 dòng vi khuẩn từ cây lúa nương trồng ở huyện Tuy An, tỉnh Phú Yên Trong đó 10 dòng (AN1-AN10) phân lập trên môi trường Nfb và 10 dòng (AN11-AN20) phân lập trên môi trường RMR

Trong 20 dòng vi khuẩn phân lập được, có 6 dòng vi khuẩn phân lập từ thân, chiếm 30 và 14 dòng phân lập từ rễ , chiếm 0

Bảng 5 Nguồn gốc các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường Nfb và RMR

*Chú thích: xã An Hòa, An Hiệp thuộc huyện Tuy An, tỉnh Phú Yên