khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu của danofloxacin, doxycycline, ceftiofur, cefquinome đối với một số loại vi khuẩn gây bệnh trên gia súc gia cầm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN Năm học 2013-2014 Đề tài: “KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU CỦA DANOFLOXACIN,DOXYCYCLINE, CEFTIOFUR, CEFQUINOME ĐỐ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên Ngành: HÓA DƯỢC K36

CẦN THƠ – 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên Ngành: HÓA DƯỢC K36

Hướng dẫn khoa hoc

TS Lê Thanh Phước ThS Huỳnh Minh Trí

CẦN THƠ − 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Năm học 2013-2014

Đề tài: “KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU CỦA

DANOFLOXACIN,DOXYCYCLINE, CEFTIOFUR, CEFQUINOME

ĐỐI VỚI MỘT SỐ LOẠI VI KHUẨN GÂY BỆNH

TRÊN GIA SÚC GIA CẦM”

LỜI CAM ĐOAN

Tất cả dữ liệu và số liệu sử dụng trong nội dung luận văn được tham khảo từ nhiều nguồn tài liệu khác nhau và được ghi nhận từ những kết quả thực nghiệm trong suốt quá trình thực nghiệm Tôi xin cam đoan về sự tồn tại

và tính trung thực khi sử dụng những dữ liệu và số liệu này

Cần thơ, ngày tháng năm 2013

Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam

Bộ Môn Hóa Học

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

1 Cán bộ hướng dẫn: Ts Lê Thanh Phước

Ths Huỳnh Minh Trí

2 Đề tài: Khảo sát hoạt nồng độ ức chế tối thiểu của Danoflaxacin, Doxycycline, Ceftiofur, Cefquinome đối với một số loại vi khuẩn gây bệnh trên gia súc gia cầm

3 Sinh viên thực hiện: Nguyễn Vũ Linh MSSV: 2102457

4 Nội dung nhận xét:

a Nhận xét về hình thức của LVTN:

b Nhận xét về nội dung của LVTN ( Đề nghị ghi chi tiết đầy đủ):

 Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:

 Những vấn đề còn hạn chế:

c Nhận xét đối với từng sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):

d Kết luận, đề nghị và điểm:

Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2013

Cán bộ hướng dẫn

Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam

3 Sinh viên thực hiện: Nguyễn Vũ Linh MSSV: 2102457

2 Nội dung nhận xét:

a Nhận xét về hình thức của LVTN:

b Nhận xét về nội dung của LVTN ( Đề nghị ghi chi tiết đầy đủ):

 Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:

 Những vấn đề còn hạn chế:

c Nhận xét đối với từng sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):

d Kết luận, đề nghị và điểm:

Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2013

Cán bộ phản biện

LỜI CẢM ƠN

- -

Quá trình thực hiện luận văn giúp tôi tích lũy thêm nhiều kinh nghiệm từ thực tế, làm hoàn thiện kiến thức học được từ giảng đường đại học và hổ trợ cho công việc sau này Để được kết quả như ngày hôm nay tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến:

Quí thầy cô trong khoa Khoa học Tự nhiên, đặc biệt là thầy cô trong bộ môn hóa đã tận tụy truyền thụ kiến thức quí báo cho thế hệ mai sao

Thầy Lê Thanh Phước đã trực tiếp giảng dạy, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm trong học tập và chỉ dẫn cho tôi hoàn thành luận văn này

Thạc sĩ Huỳnh Minh Trí đã nhiệt tình quan tâm, theo dõi, hướng dẫn, chỉ bảo và chia sẻ kinh nghiệm cho tôi trong suốt quá trình làm thực nghiệm Đồng thời xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị tại Trung tâm Nghiên cứu

và Phát triển Vemedim cùng ban lãnh đạo Trung tâm đã tạo mọi điều kiện tốt nhất đễ tôi hoàn thành tốt luận văn này

Cảm ơn cha mẹ và người thân đã thương yêu, lo lắng, động viên, giúp đỡ con trong suốt quá trình học tập

Xin chân thành cảm ơn!

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013

Nguyễn Vũ Linh

TÓM TẮT

Đánh giá đề kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh là một yêu cầu cần thiết để có thể biết được tình trạng đề kháng và hiệu quả của kháng sinh Nghiên cứu này được thực hiện nhằm xác định mức độ đề kháng đối với 4 loại kháng sinh danofloxacin, doxycycline, ceftiofur, cefquinome bởi vi khuẩn

gây bệnh cho gia súc gia cầm và so sánh hiệu quả in-vitro của 4 loại thuốc với

nhau

Thông qua xác định MIC trong môi trường lỏng và MBC của 4 loại kháng sinh trên 81 chủng vi khuẩn thuộc 5 nhóm Staphylococcus, E coli,

Salmonella, Klebsiella, Pseudomonas Kết quả nhạy cảm và đề kháng dựa

theo tiêu chuẩn CLSI

Kết quả cho thấy đề kháng kháng sinh xuất hiện phổ biến trên vi khuẩn

gây bệnh cho gia súc gia cầm với nhiều mức độ khác nhau Vi khuẩn E coli vẫn còn nhạy cảm cao với cefquinome Vi khuẩn Pseudomonas spp vẫn còn

nhạy cảm cao với cefquinome và danoloxacin Ngoài ra vi khuẩn còn thể hiện mạnh tính đa kháng Kết quả MIC và MBC cho thấy khả năng ức chế và tiêu diệt vi khuẩn của cefquinome cao hơn các kháng sinh còn lại trong thử nghiệm

Từ khóa danofloxacin, doxycycline, ceftiofur, cefquinome, Klebsiella spp., E coli, Staphylococcus spp., Salmonella spp., Pseudomonas spp., MIC,

MBC

ABSTRACT

Evaluation of antibiotic-resistant bacteria is a necessary requirement to

be able to see the status of the resistance and the effective of antibiotics In this study, we examine the antibiotic-resistant of bacteria with 4 antibiotics:

danofloxacin, doxycycline, ceftiofur, cefquinome and compare the effect in

vitro of these antibiotics together

Through determining the MIC in liquid and the MBC of 4 antibiotics on

81 strains, consist of Staphylococcus spp., E coli, Salmonella spp., Klebsiella spp., Pseudomonas spp resistance and susceptibility are interpreted with CLSI

breakpoints

The results showed that antimicrobial resistance is common on bacterial

pathogens of veterinary E coli is more sensitive than Staphylococcus spp.,

Salmonella spp., Klebsiella spp., Pseudomonas spp with cefquinome Pseudomonas spp is more sentitive than Staphylococcus spp., Salmonella

spp., Klebsiella spp., E coli with cefquinome and danofloxacin

Mutildrug-resistant bacteria is strong with 2-4 antibiotics (>80%) Mutildrug-resistance of Gram negative bacteria is common with 2-3 antibiotics Mutildrug-resistant of Gram positive bacteria is common with 3-4 antibiotics Cefquinome is able to inhibit and bactericidal better than the rest

of the test by results of MIC and MBC

Keyword: Danofloxacin, doxycycline, ceftiofur, cefquinome, Klebsiella spp., E coli, Staphylococcus spp., Salmonella spp., Pseudomonas spp., MIC,

MBC

MỤC LỤC

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN iv

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ CHẤM PHẢN BIỆN iii

LỜI CẢM ƠN vi

TÓM TẮT vii

MỤC LỤC viii

DANH MỤC HÌNH xii

DANH MỤC BẢN xiii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT xiv

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Nội dung thực hiện: 2

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Kháng sinh và cơ chế đề kháng kháng sinh 3

2.1.1 Kháng sinh 3

2.1.2 Khái niệm đề kháng kháng sinh 4

2.1.3 Cơ chế đề kháng kháng sinh 5

2.2 Tình hình đề kháng kháng sinh 6

2.2.1 Đề kháng kháng sinh trong cộng đồng 6

2.2.2 Tình hình sử sụng kháng sinh và đề kháng kháng sinh trong chăn nuôi 9

2.3 Giới thiệu một số phương pháp nghiên cứu, đánh giá khả năng đề kháng kháng sinh của vi khuẩn 10

2.3.1 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC

methods) 10

2.3.2 Phương pháp đo vòng vô khuẩn (Disk-diffusion method) 12

2.4 Một số vi khuẩn gây bệnh trên người, vật nuôi điển hình và các kháng sinh trong thử nghiệm 13

2.4.1 Một số vi khuẩn gây bệnh trên người và vật nuôi 13

2.4.2 Kháng sinh 20

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM 24

3.1 Phương tiện nghiên cứu 24

3.1.1 Hóa chất 24

3.1.2 Thiết bị và dụng cụ 24

3.1.3 Vi khuẩn 26

3.2 Địa điểm tiến hành 26

3.3 Phương pháp nghiên cứu 26

3.3.1 Phương pháp pha huyền dịch vi khuẩn 26

3.3.2 Chuẩn bị môi trường nước thịt 27

3.3.3 Phương pháp pha loãng dãy nồng độ kháng sinh 28

3.3.4 Phương pháp đọc kết quả 29

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

4.1 Kết quả khảo sát MIC 30

4.1.1 Khảo sát giá trị MIC của 4 loại kháng sinh trên vi khuẩn E coli tại mật độ 106 CFU/ml và 105 CFU/ml 30

4.1.2 Khảo sát giá trị MIC của 4 loại kháng sinh trên vi khuẩn Staphylococcus spp tại mật độ 106CFU/ml và 105 CFU/ml 33

4.1.3 Khảo sát giá trị MIC của 4 loại kháng sinh trên vi khuẩn Salmonella spp 36

4.1.4 Khảo sát giá trị MIC của 4 loại kháng sinh trên vi khuẩn Klebsiella spp 39

4.1.5 Khảo sát giá trị MIC của 4 loại kháng sinh trên vi khuẩn

Pseudomonas spp 42

4.1.6 So sánh mức độ đề kháng của vi khuẩn 45

4.2 Kết quả khảo sát MBC 48

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52

5.1 Kết luận 52

5.2 Kiến nghị 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

PHỤ LỤC A 56

PHỤ LỤC B 59

PHỤ LỤC C 62

PHỤ LỤC D 64

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 2.1: Gia tăng đề kháng của Streptococcus pneumoniae

với peniciline tại một số nước Đông Nam Á (1996-2001) 7

Hình 2.2: Gia tăng đề kháng của Streptococcus pneumoniae với erythromycin tại một số nước Đông Nam Á (2000-2001) 8

Hình 2.3: Thực trạng đề kháng của Streptococcus pneumoniae tại Việt Nam (2006) 8

Hình 2.4: Phương pháp MIC trong tube 11

Hình 2.5: Phương pháp pha loãng kháng sinh trong thạch (môi trường đặc) .12

Hình 2.6: Phương pháp thử nghiệm E-test dùng trong xác định MIC .13

Hình 2.7: Xác định khả năng kháng thuốc của vi khuẩn thông qua phương pháp khuếch tán qua thạch .14

Hình 2.8: Vi khuẩn Staphylococcus aureus dưới kính hiển vi điện tử 15

Hình 2.9: Khuẩn lạc Staphylococcus aureus trên môi trường thạch NA 15

Hình 2.10: Vi khuẩn E coli dưới kính hiển vi điện tử 16

Hình 2.11: Khuẩn lạc E coli trên môi trường thạch NA 16

Hình 2.12: Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa dưới kính hiển vi điện tử 17

Hình 2.13: Khuẩn lạc Pseudomonas fluorescens trên môi trường thạch NA 17

Hình 2.14: Vi khuẩn Salmonella typhimurium dưới kính hiển vi điện tử 18

Hình 2.15: Khuẩn lạc Samonella typhimurium trên môi trường thạch TSA .19

Hình 2.16: Vi khuẩn Klebsiella spp dưới kính hiển vi điện tử 20

Hình 2.17: Khuẩn lạc Klebsiella pneumonia trên môi trường thạch TSA .20

Hình 2.18: Đặc diểm cấu trúc phân tử ceftiofur 22

Hình 2.19: Đặc điểm cấu trúc phân tử cefquinome 23

Hình 3.1: Một số thiết bị dùng trong thử nghiệm MIC .25

Hình 3.2: Cách chuẩn độ đục với Mac Farland trên thẻ Wickerham 27

Hình 3.3: Dãy nồng độ kháng sinh trước khi chưa thêm vi khuẩn 28

Hình 3.4: Dãy nồng độ kháng sinh khi thêm vi khuẩn 29

Hình 3.5: Cách xác định giá trị MIC 29

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 3.1: Các dung môi hòa tan 28

Bảng 4.1: Kết quả đề kháng của 20 chủng vi khuẩn E coli .30

Bảng 4.2: Kết quả kiểm tra tính đa kháng của vi khuẩn E.coli 31

Bảng 4.3: Kết quả đề kháng của 20 chủng vi khuẩn Staphylococcus spp .32

Bảng 4.4: Kết quả kiểm tra tính đa kháng của vi khuẩn Staphylococcus spp 33

Bảng 4.5: Kết quả đề kháng của 15 chủng vi khuẩn Salmonella spp .34

Bảng 4.6: Kết quả kiểm tra tính đa kháng của vi khuẩn Salmonella spp 36

Bảng 4.7: Kết quả đề kháng của 15 chủng vi khuẩn Klebsiella spp .37

Bảng 4.8: Kết quả kiểm tra tính đa kháng của vi khuẩn Klebsiella spp 38

Bảng 4.9: Kết quả đề kháng của 11 chủng vi khuẩn Pseudomonas spp .39

Bảng 4.10: Kết quả kiểm tra tính đa kháng của vi khuẩn Pseudomonas spp 40

Bảng 4.11: Đề kháng với danofloxacin trên các dòng vi khuẩn 41

Bảng 4.12: Đề kháng với doxycycline trên các dòng vi khuẩn 42

Bảng 4.13: Đề kháng với ceftiofur trên các dòng vi khuẩn 43

Bảng 4.14: Đề kháng với cefquinome trên các dòng vi khuẩn 43

Bảng 4.15: Kết quả MBC tại mật độ vi khuẩn 106 CFU/ml 45

Bảng 4.16: Kết quả MBC tại mật độ vi khuẩn 105 CFU/ml 45

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

AMR Antimicrobial Resistance

ANSORP Asian Network for Surveillance of Resistant

Pathogens CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute ESBL Extended Spectrum Beta Lactamase

GRAP Global Antiboitic Resistance Partnership MIC Minimum Inhibitory Concentration

MBC Minimum Bactericidal Concentration

MDR-TB Multidrug Resistant Tuberculosis

XDR-TR Extensively Drug Resistant Tuberculosis PABA para-aminobenzoic acid

UNICEF Quĩ nhi đồng quốc tế

WHO World Health Organization

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Đề kháng kháng sinh không là vấn đề mới, nhưng trước tình hình phát triển của dịch bệnh như hiện nay thì việc ngăn chặn, khác phục tình trạng đề kháng kháng sinh là vô cùng quan trọng và cấp bách, mang tính toàn cầu

Đề kháng kháng sinh hay còn gọi là kháng thuốc là tình trạng các vi khuẩn, virus, nấm, kí sinh trùng không mẩn cảm với các thuốc kháng sinh đã nhạy cảm trước đó Đề kháng kháng sinh là hệ quả tất yếu của của quá trình sử dụng thuốc trong điều trị và đặc biệt là sự gia tăng sử dụng, lạm dụng thuốc kháng sinh Sự đề kháng với kháng sinh làm cho các loại thuốc đặc hiệu mất dần tác dụng điều trị, hiệu quả điều trị kém, kéo dài (thậm chí có thể tử vong) gây tốn kém tiền của, thời gian, công sức của bệnh nhân, gây hao hụt ngân sách quốc gia Không dừng lại ở đó, đề kháng với kháng sinh còn xuất hiện trong lĩnh vực chăn nuôi, nhất là chăn nuôi gia súc gia cầm Trong khi nước ta là một nước nông nghiệp và chăn nuôi là một thế mạnh thì thiệt hại đối với ngành này

là không phải nhỏ Bên cạnh đó, đề kháng kháng sinh trong chăn nuôi có khả năng truyền các gen kháng thuốc cho vi khuẩn gây bệnh trên người hoặc gây bệnh trực tiếp cho người [1, 2]

Tổ chức Y tế Thế giới nhận định, chúng ta đang sống trong kỷ nguyên phụ thuộc vào kháng sinh và yêu cầu toàn cầu có trách nhiệm bảo vệ nguồn thuốc kháng sinh quý giá cho thế hệ sau Vì Trong tương lai, kháng sinh có thể mất khả năng chữa bệnh, khi đó loài người có khả năng quay trở lại thời kỳ trước khi thuốc kháng sinh được phát hiện, hàng tỷ người sẽ có nguy cơ tử vong cao khi mắc các bệnh nhiễm trùng mà không được kháng sinh bảo vệ nếu tình trạng

đề kháng cứ tiếp tục diển ra như hiện nay Chính vì những lý do trên, nhân ngày Sức khỏe Thế giới 2011, WHO lấy khẩu hiệu: "Không hành động hôm nay, ngày mai không thuốc chữa" [3] nhằm kêu gọi các quốc gia phải có kế hoạch kịp thời để đối phó với tình trạng kháng thuốc như hiện nay

Ở nước ta, ngay từ năm 1996, Bộ Y tế đã ban hành chính sách Quốc gia về thuốc, trong đó có nêu rõ chính sách về thuốc kháng sinh như sau: “Thuốc kháng sinh có vai trò rất quan trọng trong điều trị, đặc biệt đối với tình hình bệnh tật của một số nước khí hậu nhiệt đới như nước ta Do đó, cần phải chấn chỉnh việc kê đơn và sử dụng kháng sinh, kiểm soát tình trạng kháng kháng sinh của một số vi khuẩn gây bệnh thường gặp, đồng thời cải thiện khả năng chẩn đoán của các phòng xét nghiệm vi sinh lâm sàng” [4] Điều này cho thấy đề kháng kháng sinh rất được quan tâm

Nhằm gớp phần nghiên cứu về tình trạng đề kháng kháng sinh đặc biệt là trong lĩnh vực chăn nuôi, bởi đây không chỉ là ngành kinh tế trọng điểm mà còn

có mối quan hệ trực tiếp tới đời sống và sức khỏe của cộng đồng Nên đề tài:

"Khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu của Danoflaxacin, Doxycycline, Cefquinome, Ceftiofur đối với một số loại vi khuẩn gây bệnh trên gia súc gia cầm" được thực hiện tại Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Vemedim - Công ty Cổ phần SXKD vật tư thuốc thú y Vemedim Đề tài như một bản

báo cáo nhỏ về tình hình đề kháng của vi khuẩn gây bệnh trên gia súc, gia cầm giúp cộng đồng có cái nhìn tổng quan về thực trạng đề kháng kháng sinh trên vật nuôi, gớp phần nâng cao ý thức và trách nghiệm cá nhân trong sử dụng kháng sinh [5]

1.2 Nội dung thực hiện

Khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ tiêu diệt 99% vi khuẩn (MBC) của 4 loại kháng sinh: Danoflaxacin, doxycycline, ceftiofur,

cefquinome trên 5 loại vi khuẩn thường gây bệnh trên gia súc gia cầm: E coli, Salmonella spp., Klebsiella spp., Staphylococcus spp., Pseudomonas spp tại

mật độ vi khuẩn 106 UFC/ml

Khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ tiêu diệt 99% vi khuẩn (MBC) của 4 loại kháng sinh: Danoflaxacin, doxycycline, ceftiofur,

cefquinome trên 5 loại vi khuẩn thường gây bệnh trên gia súc gia cầm: E.coli,

Salmonella spp., Klebsiella spp., Staphylococcus spp., Pseudomonas spp tại

mật độ vi khuẩn 105 UFC/ml

So sánh khả năng ức chế, khả năng diệt khuẩn của 4 kháng sinh hàng đầu trong chăn nuôi

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Kháng sinh và cơ chế đề kháng kháng sinh

2.1.1 Kháng sinh

2.1.1.1 Định nghĩa

Kháng sinh là những hợp chất có nguồn gốc từ vi sinh vật, tổng hợp hoặc bán tổng hợp Với nồng độ rất thấp có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt vi khuẩn

mà không ảnh hưởng hoặc ảnh hưởng rất ít đến cơ thể vật chủ

Từ khi penicillin ra đời cho tới hôm nay, hàng trăm loại kháng sinh mới đã được phát minh và đưa vào sử dụng Sự ra đời của kháng sinh đánh dấu một bước tiến quan trọng trong nền y học về điều trị và phòng các bệnh nhiễm khuẩn trên người Ngoài ra kháng sinh còn được sử dụng rộng rãi và phổ biến trong chăn nuôi gia súc, gia cầm, thủy sản và trồng trọt nhằm điều trị, phòng chống dịch bệnh và gia tăng năng suất Hiện có 11 nhóm kháng sinh được sử dụng trong chăn nuôi và nuôi trồng thuỷ sản, bao gồm: β-lactam, aminoglycoside, macrolide, tetracycline, (fluoro)quinolone, phenicol, polymyxi (colistin), pleuromutilin, lincosamide, sulfamide, diaminopyrimidine (trimethoprim), trong đó bao gồm các kháng sinh được sử dụng trong điều trị bệnh nhiễm khuẩn trên người như penicillin, ampicillin, amoxicillin, gentamycin, doxycyclin [5]

Việc dùng kháng sinh mang lại hiệu quả cao trong điều trị, đặc biệt là làm giảm tỉ lệ tử vong do các bệnh nhiễm trùng gây ra

Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein Nhóm aminoglycoside, tetracycline gắn với receptor trên tiểu phần 30S của ribosome làm cho quá trình dịch mã không chính xác Nhóm chloramphenicol gắn với tiểu phần 50S của ribosome ức chế enzyme peptidyltransferase ngăn cản việc gắn các acid amin mới vào chuỗi polypeptide Nhóm macrolides và lincoxinamid gắn với tiểu phần 50S của ribosome làm ngăn cản quá trình dịch mã các acid amin đầu tiên của chuỗi polypeptide

Ức chế quá trình tổng hợp acid nucleic Nhóm refampin gắn với enzyme RNA polymerase ngăn cản quá trình sao mã tạo thành mRNA (RNA thông tin) Nhóm quinolone ức chế tác dụng của enzyme DNA gyrase (làm cho hai mạch đơn của DNA không thể duỗi xoắn) làm ngăn cản quá trình nhân đôi của DNA Nhóm sulfamide có cấu trúc giống PABA (p-aminobenzonic acid) có tác dụng cạnh tranh PABA và ngăn cản quá trình tổng hợp acid nucleotid Nhóm trimethoprim tác động vào enzyme xúc tác cho quá trình tạo nhân purin làm ức chế quá trình tạo acid nucleic

2.1.2 Khái niệm đề kháng kháng sinh

Đề kháng với kháng sinh hay AMR (Antimicrobial Resistance) là hiện tượng vi khuẩn có thể tồn tại và phát triển dưới sự tác động của kháng sinh

Đề kháng với kháng sinh gồm có hai dạng là đề kháng tự nhiên (instrinsic resistance) và đề kháng thu nhận (acquired resistance)

Vi khuẩn đề kháng tự nhiên với kháng sinh do chúng không có cơ chế tế bào để kháng sinh phát huy tác dụng Ví dụ vi khuẩn Gram dương kháng polymyxin, vi khuẩn Gram âm kháng penicillin

Đề kháng thu nhận có thể xảy ra do đột biến nhiễm sắc thể của tế bào vi khuẩn hoặc do vi khuẩn nhận các vật liệu di truyền (gene) liên quan đến kháng thuốc từ vi khuẩn khác

Do vi khuẩn có chu kỳ phát triển khá ngắn nên chúng rất linh hoạt trong biến đổi để thích ứng với những thay đổi của môi trường sống Đề kháng do đột biến nhiễm sắc thể nhìn chung xảy ra từ từ và là một tiến trình tích lũy Tuy

nhiên, trên thực tế lâm sàng (in-vivo), các kiểu đột biến này không đáng kể do

hệ thống phòng vệ của cơ thể tiêu diệt đa số các chủng vi khuẩn đề kháng dạng này

Đề kháng do trao đổi thông tin di truyền đóng vai trò quan trọng trong sự lan tràn đề kháng với kháng sinh Do vi khuẩn không có màng nhân, gen kháng thuốc có khả năng di chuyển dễ dàng từ chromosom đến vật liệu di truyền khác

trong tế bào như plasmid Giữa các vi khuẩn khác nhau, gene kháng thuốc có thể được trao đổi qua 3 cách:

 Tải nạp (transduction) là quá trình DNA được thực khuẩn thể (phage) sát nhập và chuyển cho một vi khuẩn khác

 Biến đổi hay còn gọi là chuyển dạng (transformation) là quá trình một đoạn DNA trần (có nguồn gốc từ 1 tế bào vi khuẩn chết) đi vào một tế bào vi khuẩn và gắn vào các yếu tố di truyền của vi khuẩn đó nhờ tương đồng nhiễm sắc thể (crossover)

 Tiếp hợp (conjugation) là quá trình tế bào vi khuẩn cho (donor) tổng hợp yếu tố giới tính (sex pili) và gắn vào tế bào vi khuẩn nhận (recipient) Từ cầu nối này, một bản sao (copy) gen kháng thuốc nằm trên plasmid được chuyển cho vi khuẩn nhận

Trong quá trình tải nạp, vi khuẩn cần có điểm tiếp nhận phù hợp với phage trên bề mặt của chúng Trong tiến trình biến đổi, DNA phải chèn vào bộ gen nhờ tương đồng về di truyền Như vậy, với cả hai tiến trình này, vi khuẩn phải tương đồng về di truyền để sự tái tổ hợp có thể xảy ra Dạng trao đổi này chỉ có thể xảy ra ở các loài vi khuẩn có mối liên hệ về di truyền Trong khi đó, tiến trình tiếp hợp không có giới hạn này

Đề kháng với kháng sinh là vấn đề thường gặp đối với vi khuẩn Sự đề kháng với kháng sinh vô cùng nguy hiểm vì tạo ra các chủng vi khuẩn kháng thuốc (lờn thuốc) trong cộng đồng

2.1.3 Cơ chế đề kháng kháng sinh

Việc sử dụng kháng sinh trong phòng và trị bệnh cho người và vật nuôi đã

có ý nghĩa to lớn trong điều trị Tuy nhiên việc sử dụng kháng sinh đã đồng thời tạo nên một áp lực chọn lọc đối với vi khuẩn Bằng chứng rõ ràng nhất là khi kiểm tra các chủng vi khuẩn thời kỳ chưa sử dụng kháng sinh, các nhà khoa học không phát hiện sự đề kháng với kháng sinh cũng như bất kì gen liên quan đến tình trạng đề kháng thường gặp ở các chủng vi khuẩn đương thời Áp lực chọn lọc đề kháng kháng sinh xuất phát từ nhiều nguồn như việc sử dụng kháng sinh trong phòng và trị bệnh trên người, trên động vật và thực vật, kháng sinh dùng với mục đích kích thích tăng trọng trong chăn nuôi gia súc

Sự đề kháng với kháng sinh của vi khuẩn đã được nghiên cứu và ghi nhận với các cơ chế sau:

 Sản xuất enzyme làm vô hoạt kháng sinh: Staphylococcus sản xuất

beta-lactamase làm mở vòng beta-lactam làm penicillin G mất tác dụng Vi

khuẩn Gram âm sản xuất adenylase, phosphorylase, acetylase phá hủy aminoglycoside, Vi khuẩn Gram âm sản xuất chloramphenicol acetyltransferase kháng chloramphenicol,

 Tạo ra enzym thay thế cho enzym mà kháng sinh tác động vào

 Đột biến ở điểm tiếp nhận làm giảm gắn kết của kháng sinh với điểm tiếp nhận: một số VK đột biến nhiễm sắc thể làm mất hoặc thay đổi protein đặc biệt trên tiểu đơn vị 30S kết quả làm mất điểm gắn của aminoglycosides

 Sửa đổi điểm tiếp nhận để giảm gắn kết của kháng sinh với điểm tiếp nhận

 Giảm hấp thu kháng sinh vào tế bào vi khuẩn

 Đẩy kháng sinh ra ngoài bằng bơm thoát dòng làm nồng độ kháng sinh trong tế bào giảm

Dường như không thể loại bỏ hoàn toàn hiện tượng đề kháng của vi khuẩn một khi chúng xuất hiện Ngoài sự linh hoạt do đặc tính sinh học, vi khuẩn còn

có khả năng bảo tồn sự đề kháng một khi gen kháng thuốc nằm trên nhiễm sắc thể của nó Ngược lại, khi yếu tố di truyền liên quan đến đề kháng nằm trên plasmid nhất là plasmid tiếp hợp, vi khuẩn sẽ có khả năng truyền sự đề kháng này cho vi khuẩn khác cùng hay khác loài Từ đó sự kháng kháng sinh gia tăng dần lên trong quần thể vi khuẩn Chính vì vậy mà việc sử dụng kháng sinh hợp

lý, đúng mục đích và đối tượng gây bệnh, hạn chế sử dụng kháng sinh phổ rộng, các kháng sinh thế hệ mới khi không cần thiết là đang gớp phần ngăn chặn sự tiến triển của AMR, kéo dài khả năng điều trị của kháng sinh trong tương lai

2.2 Tình hình đề kháng kháng sinh

2.2.1 Đề kháng kháng sinh trong cộng đồng

Hiện tượng đề kháng kháng sinh đang ngày càng gia tăng trong nhiều loài

vi khuẩn gây bệnh cho người và gia súc, là mối quan tâm lo lắng của toàn xã hội Vi khuẩn đề kháng kháng sinh làm giới hạn khả năng điều trị Một số trường hợp dẫn đến tử vong do vi khuẩn gây bệnh đề kháng với hầu hết các kháng sinh đang điều trị Ngoài ra các chủng vi khuẩn không gây bệnh nhưng

có khả năng đề kháng kháng sinh là nơi tồn trữ tính kháng thuốc để truyền cho những vi khuẩn gây bệnh khác

Trên thế giới, mỗi năm có khoảng 440,000 trường hợp nhiễm lao đa kháng thuốc (MDR-TB), làm ít nhất 150,000 người chết Theo thống kê từ WHO, năm

2011 toàn cầu hiện có khoảng 640,000 trường hợp lao đa kháng thuốc

(MDR-TB), trong đó siêu lao kháng thuốc (XDR-TB) chiếm khoảng 9% tại 64 quốc gia [6]

Theo thông kê từ UNICEF mới đây cho thấy, Streptococcus pneumoniae

là nguyên nhân gây ra 50% các ca tử vong do viêm phổi ở trẻ trên toàn thế giới

[4] Một nghiên cứu khác từ trung tâm nghiên cứu giám sát ANSORP từ 1-2000 đến 6-2001 tại 14 trung tâm của 11 nước trong khu vực Asian cho thấy các

chủng vi khuẩn Streptococcus pneumoniae tại một số nước như Việt Nam, Hàn

Quốc, Hồng Kong, và Đài Loan có tỷ lệ đề kháng khá cao với penicillin (71,4%, 54,8%, 43,2%, 38,6%) và erythromycin (92.1%, 80,6%, 76,8%, 86%) [7] Các số liệu từ ANSORP cho thấy một số quốc gia ở khu vực Đông Nam Á

là điểm nóng về kháng thuốc trên toàn cầu, trong đó có Việt Nam

Hình 2.1: Gia tăng đề kháng của Streptococcus pneumoniae với peniciline tại

một số nước Đông Nam Á (1996-2001)

(Nguồn Song JH and ANSORP, 2004 Antimicrob Agents Chemother, p 2101.)

Hình 2.2: Gia tăng đề kháng của Streptococcus pneumoniae với erythromycin

tại một số nước Đông Nam Á (2000-2001)

(Nguồn: Song JH and ANSORP, 2004 Antimicrobial Agents and Chemother, p:

2101-2107)

Hiện tại các chủng Enterbacteriaceae đang đề kháng với nhiều loại kháng

sinh với nhiều mức độ khác nhau Tại nhiều bệnh viện Hàn Quốc, Klebsiella

pneumoniae kháng ceftazidime, fluoroquinolone, và cephalosporin thế hệ 3 là

rất phổ biến Trong khi đó Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa,

Acinetobacter spp đã kháng với floroquinolone (27%, 33%, 48) [8] Theo báo

cáo từ bệnh viện chấn thương chỉnh hình Tp Hồ Chí Minh (2004) cho thấy các

chủng Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae đã kháng với cephalosporins

phổ rộng, hơn 25% kháng với cephalosporins thế hệ 3 và 16% kháng với cefoperazone, phần lớn điều có khả năng sinh ESBL [6] Một nghiên cứu khác cho thấy 42% các chủng Enterobacteriaceae kháng ceftazidime, 63% kháng với

gentamicin và 74% kháng acid nalidixic Ngoài ra Staphylococcus aureus kháng

với Methicillin lên tới 64% [9, 10]

Shigella là vi khuẩn gây nên bệnh kiết lỵ, các kháng sinh nhạy cảm trước

đây như trimethoprim-sulfamethoxazole, tetracycline, ampicillin ciprofloxacin

và ceftriaxone đã bị đề kháng (81%, 74%, 53%, 10%, 5%) Số chủng đa kháng chiếm hơn 75% [5] Gần đây, WHO khuyến cáo nên dùng ciprofloxacin để tiêu

diệt Shigella thay vì dùng các kháng sinh đặc hiệu trước đó Tuy nhiên tỷ lệ đề

kháng với kháng sinh nầy đang tăng lên nhanh chóng

Các chủng Salmonella typhimurium tại Viêt Nam đề kháng kháng sinh với

tỉ lệ khá cao (khoảng 50%, 2004), đề kháng với acid nalidixic tăng lên rõ rệt

trong vòng 12 năm, từ 4% lên 97% năm 2005 [5] Một báo cáo khác cho thấy

hơn 80% các chủng S typhimurium phân lập được kháng với kháng sinh acid nalidixic [11] Salmonella là nguyên nhân chủ yếu gây nên các vụ ngộ độc thực phẩm (chỉ sau E coli) và bệnh thương hàn

Đề kháng kháng sinh đang trở nên nghiêm trọng và không còn là vấn đề riêng của ngành y tế mà là vấn đề chung của toàn xã hội Việc ngăn chặn đề kháng kháng sinh phát triển là chính sách phát triển của mỗi quốc gia Đặc biệt đối với các nước đang phát triển, đề kháng kháng sinh còn là gánh nặng trong phát triển kinh tế và gây đe dọa đến an sinh xã hội

2.2.2 Tình hình sử sụng kháng sinh và đề kháng kháng sinh trong chăn nuôi

Trong chăn nuôi, nhằm mục đích kích thích tăng trưởng, hoặc phòng bệnh

và điều trị, nên nhiều loại kháng sinh đã được đưa vào sử dụng Việc tiếp xúc với dư lượng kháng sinh có trong các sản phẩm từ trứng, thịt, sữa, Và tồn dư kháng sinh trong phân, nước tiểu, nguồn nước là nguyên nhân làm gia tăng khả năng đề kháng của vi khuẩn trong môi trường và trên người

Giám sát cả hai lĩnh vực chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản tại Việt Nam cho thấy, tất cả các trang trại chăn nuôi đều sử dụng kháng sinh Các kháng sinh được sử dụng là: tylosin (16%), amoxicillin (12%), gentamicin (9%), enrofloxacin (7%), penicillin (6%), lincomycin (6%), tiamulin (6%), colistin (5%), streptomycin (5%), norfloxacin (5%), tetracyclin (4%), ampicillin (4%)

và florphenicol (3%) [12]

Theo báo cáo của Bộ Nông nghiệp, tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi chưa hợp lý, 27% số hộ chăn nuôi lợn thịt, 24% số hộ chăn nuôi lợn con và 10 % số hộ chăn nuôi gà thịt có sử dụng kháng sinh từ 3-6 hoạt chất [11]

Theo một cuộc khảo sát cho thấy có 44% chủ hộ tự chọn kháng sinh và liều theo kinh nghiệm để điều trị, 33% theo sự hướng dẫn của bác sỹ thú y, 17% theo hướng dẫn của nhà sản xuất, 6% có làm xét nghiệm kháng sinh đồ Hầu hết các hộ chăn nuôi không tuân thủ theo qui chế về việc ngưng sử dụng kháng sinh trước khi cung cấp các sản phẩm từ động vật [12]

Theo báo cáo từ chính phủ Ha Lan có khoảng 700 g kháng sinh được sử dụng trên mỗi tấn cá trong nuôi trồng thuỷ sản ở Việt Nam, cao gấp 7 lần so với các quốc gia khác [Báo cáo từ Cục Quản lý Thực phẩm, Hà Lan, 2009, mã VWA/BuR/2009/13186] Một số nghiên cứu khác cho thấy tỉ lệ dư lượng kháng sinh trong thịt lên đến 52,17% [13].Mặc dù một số hộ ý thức được việc

sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi nhưng dư lượng kháng sinh vẩn hiện diện trong các sản phẩm thịt, sữa, trứng bởi một số nhà cung cấp thức ăn chăn nuôi

đã thêm kháng sinh vào sản phẩm của họ Đây cũng là một trong những nguyên nhân khiến cho các mặc hàng thịt trứng sữa của Việt Nam không đạt chuẩn về dư lượng kháng sinh [14]

Từ những kết quả trên có thể thấy rằng kháng sinh được sử dụng một cách phổ biến trong chăn nuôi nhưng kém hiệu quả khiến cho tỉ lệ đề kháng của vi

khuẩn kháng thuốc gây bệnh trên vật nuôi tăng cao Hiện tại, E coli gây bệnh

trên vật nuôi kháng hầu hết các kháng sinh như amoxicillin, bactrim, colistin

với mức khá cao là 86,45%, 81,82% và 77,19% trong khi đó Salmonella spp đề

kháng đề kháng hoàn toàn với bactrim và colistin [15]

2.3 Giới thiệu một số phương pháp nghiên cứu, đánh giá khả năng

đề kháng kháng sinh của vi khuẩn

2.3.1 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC methods) MIC (Minimum Inhibitory Concentration) là thuật ngữ chỉ nồng độ tối

thiểu của kháng sinh ức chế sự phát triển của vi khuẩn MIC được sử dụng trong các thử nghiệm đánh giá độ nhạy cảm của kháng sinh, các thử nghiệm phát triển kháng sinh mới hoặc thử nghiệm xác định mức độ đề kháng của vi khuẩn trong giám sát tình hình dịch tễ

Nguồn gốc: Từ khi penicillin ra đời đã làm thay đổi bước tiến của y học, nhiều hợp chất kháng khuẩn mới được tìm thấy đã mang lại nhiều hi vọng cho các nhà khoa học rằng các bệnh truyền nhiễm sẽ được loại bỏ hoàn toàn nhờ vào việc sử dụng kháng sinh Nhưng không may, sự phát triển của vi khuẩn đề kháng với kháng sinh đã làm giảm bớt sự lạc quan của các nhà khoa học Việc xác định các kháng sinh nhạy và bị đề kháng là rất cần thiết cho mục đích điều trị nên các bác sỉ đã yêu cầu các phòng thí nghiệm vi sinh kiểm tra các tác nhân gây bệnh với nồng độ khác nhau của kháng sinh để xác định tính nhạy cảm hay

đề kháng của vi khuẩn với kháng sinh đó Phương pháp đầu tiên được xử dụng

là pha loãng kháng sinh trong nước thịt và đã trở thành tiêu chuẩn vàng cho đến ngày nay trong việc xác tính nhạy cảm của kháng sinh

2.3.1.1 Phương pháp pha loãng kháng sinh trong môi trường lỏng

Mục đích: Kỹ thuật này nhằm mục đích xác định chính xác nồng độ nhỏ nhất của kháng sinh có tác dụng ức chế sự phát triển của một chủng vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy (phương pháp định lượng) Thông qua giá trị MIC ta

có thể xác định được tính nhạy cảm (susceptible), nhạy trung gian

(intermediate), kháng (resistant) của chủng vi khuẩn thử nghiệm với kháng sinh

đó bằng cách so sánh kết quả với kết quả chuẩn được công bố trên CLSI, NCCLS,

Nguyên lý: Kháng sinh được pha loãng theo cấp độ giảm 1/2 trong môi trường nước thịt Huyền dịch vi khuẩn được pha loãng tới mật độ xác định và được nuôi với thời gian, nhiệt độ thích hợp cùng với sự hiện diện của kháng sinh trong môi trường nước thịt Với nồng độ thấp nhất của kháng sinh khi không thấy sự phát triển của vi khuẩn (trong như ban đầu) được ghi nhận là giá trị MIC của kháng sinh đó trên chủng vi khuẩn đó

Hình 2.3: Phương pháp MIC trong tube

2.3.1.2 Phương pháp pha loãng kháng sinh trong môi trường thạch

Phạm vi áp dụng: Phương pháp này ít được áp dụng để thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh với các vi khuẩn kỵ khí do những vi khuẩn này phát triển chậm trên môi trường thạch

Mục đích: Kỹ thuật này nhằm mục đích xác định chính xác nồng độ nhỏ nhất của kháng sinh có tác dụng ức chế sự phát triển của một chủng vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy (phương pháp định lượng) Thông qua giá trị MIC ta

có thể xác định được tính nhạy cảm (susceptible), nhạy trung gian (intermediate), kháng (resistant) của chủng vi khuẩn thử nghiệm với kháng sinh

đó bằng cách so sánh kết quả với kết quả chuẩn được công bố trên CLSI, NCCLS,

Nguyên lý: Kháng sinh được pha loãng trong môi trường thạch theo cấp

độ giảm 1/2 Vi khuẩn được cấy trên đĩa kháng sinh và được được ủ ấm cho phát triển Nồng độ thấp nhất khi quan sát bằng mắt thường với khuẩn lạc  3 được xác định là giá trị MIC

Hình 2.4: Phương pháp pha loãng kháng sinh trong thạch (môi trường đặc)

2.3.1.3 Phương pháp E-Test

Để giảm bớt các thao tác thí nghiệm, đơn giản hóa các phương pháp thử nghiệm, nhiều công ty đã cho ra đời những Kit phục vụ cho thử nghiệm phát hiện tính kháng kháng thuốc của vi khuẩn Trong số đó, E-Test cho kết quả chính xác nhất và đơn giản nhất

Phạm vi áp dụng: Phương pháp này không áp dụng để thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh với các vi khuẩn kỵ khí do những vi khuẩn này phát triển chậm trên môi trường thạch

Nguyên lý: E-Test là phương pháp đơn giản với một thanh plastic mỏng chứa dải nồng độ kháng sinh đã được định sẵn từ thấp đến cao Kháng sinh được khuếch tán từ thanh plastic sang môi trường thạch gây sự ức chế sự phát triển của vi khuẩn trên môi trường thạch, giá trị MIC được xác định là giá trị thấp nhất của vùng ức chế trên thanh E-Test Việc đọc kết quả MIC thường theo chỉ dẫn của nhà sản xuất

Hiện E-Test đã phổ biến với rất nhiều loại kháng sinh khác nhau Tuy nhiên chi phí cho phương pháp này thường cao

Hình 2.5: Phương pháp thử nghiệm E-test dùng trong xác định MIC

2.3.2 Phương pháp đo vòng vô khuẩn (Disk-diffusion method)

Vào đầu năm 1950, các phòng thí nghiệm vi sinh lâm sàng tại Hoa Kỳ đã

sử dụng phương pháp khuếch tán kháng sinh trên đĩa thạch để xác định tính nhạy cảm của kháng sinh Tuy nhiên không có sự thống nhất giữa các phương pháp Năm 1956, Kirby cùng các đồng nghiệp đã xây dựng một phương pháp chung cho các thử nghiệm kháng sinh trên đĩa thạch [16] Phương pháp này có

tên: The Kirby-Bauer disk diffusion test hoặc phương pháp khuếch tán qua

thạch (Agar diffusion method, Disk-diffusion methol) Hiện nay, Viện tiêu chuẩn phòng thí nghiệm lâm sàng (CLSI) có trách nghiệm cập nhật và sửa đổi các quy trình nhằm đạt được sự thống nhất trên toàn cầu

Phạm vi sử dụng: Phương pháp này không áp dụng để thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh với các vi khuẩn kỵ khí do những vi khuẩn này phát triển chậm trên môi trường thạch

Mục đích: Xác định kháng sinh nhạy cảm hoặc khả năng đề kháng của vi khuẩn với nhiều loại kháng sinh khác nhau trên cùng một đĩa (phương pháp định tính)

Nguyên lý: Vi khuẩn được nuôi cấy trên đĩa thạch với sự hiện diện của các đĩa giấy 6 mm tẩm kháng sinh và được ủ với ấm với thời gian, nhiệt độ thích hợp Kháng sinh từ đĩa giấy khuếch tán trên mặt thạch gây ức chế sự phát triển của vi khuẩn Bằng cách đo đường kính vùng ức chế vi khuẩn do đĩa giấy chứa kháng sinh tạo ra, so sánh với đường kính chuẩn của từng loại kháng được công bố trong các tài liệu chuyên khảo do CLSI, NCCLS, công

2.4.1 Một số vi khuẩn gây bệnh trên người và vật nuôi

Sự lây truyền dịch bệnh trên vật nuôi sang người ngày càng nguy hiểm Gần đây một số trường hợp vi khuẩn kháng thuốc trên người được xem là có nguồn gốc từ động vật, nguyên nhân bắt nguồn từ việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi

Tuy chưa có các số liệu công bố về tình hình gây bệnh của vi khuẩn kháng thuốc trong chăn nuôi gây bệnh trên người Nhưng khả năng đề kháng tiếp nhận giữa các chủng là rất cao Chính vì vậy mà việc giám sát tình hình dịch tể, khả năng đề kháng trong chăn nuôi thú y cũng gớp phần quan trọng trong công tác bảo vệ sức khỏe cộng đồng

Theo nhiều nghiên cứu cho thấy trong số các bệnh do vi khuẩn gây ra thì

E coli, Staphylococcus, Salmonella, Klebsiella, Pseudomonas là thường gặp

nhất [13, 17] E coli, Staphylococcus, Salmonella, Klebsiella, Pseudomonas có

khả năng gây bệnh trên người và vật nuôi Tỉ lệ nhiễm khuẩn từ vật nuôi sang người là rất cao, chủ yếu theo đường ăn uống không nấu chín, thực phẩm không hợp vệ sinh, …

Hình 2.8: Khuẩn lạc Staphylococcus aureus trên môi trường thạch NA

Đặc tính gây bệnh: Là vi khuẩn gây bệnh trên người và động vật, sinh mủ điển hình làm cho các tổ chức cơ thể sưng gây viêm mủ, một số trường hợp chuyển sang huyết nhiễm mủ và bại huyết [19] Một số chủng có khả năng gây tiêu huyết, làm đông đặc huyết tương, và độc tố (thường thấy trong các vụ độc thực phẩm)

Khả năng đề kháng: Hiện nay đang đề kháng với nhiều loại kháng sinh khác nhau và đang là vấn đề khó khăn trong điều trị [20] Một số chủng đã có khả năng đề kháng kháng sinh beta-lactam như nafcillin, methicillin [21]

2.4.1.2 Escherichia coli

Đặc điểm hình thái: Là trực khuẩn hình gậy ngắn, có tiêm mao, kích thước 2×0,6 µm Đôi khi xếp thành chuỗi ngắn, không có khả năng hình thành nha bào [19] Là vi khuẩn Gram âm sống trong đường ruột người và các loài động vật khác

Hình 2.9: Vi khuẩn E coli dưới kính hiển vi điện tử

(Nguồn: http://en.wikipedia.org/wiki/File:EscherichiaColi_NIAID.jpg)

Đặc điểm nuôi cấy: Là vi khuẩn hiếu khí hoặc yếm khí tùy nghi Thuận lợi phát triển trong nhiều môi trường nuôi cấy Một số hóa chất như chlorine, muối

mật có thể ức chế sự phát triển của vi khuẩn Phát triển tốt trong môi trường nước thịt, hình thành cặn và đôi khi hình thành màng xám nhạt Trong môi trường thạch, khuẩn lạc màu trắng nhạt, tròn ướt, hơi lồi, đường kính 2-3 mm

Hình 2.10: Khuẩn lạc E coli trên môi trường thạch NA

Đặc tính gây bệnh: E coli thường tiết ra các nội độc tố và ngoại độc tố

Nội độc tố gây ra bệnh tiêu chảy, ngoại độc tố gây tan huyết và phù thủng

Khả năng đề kháng: Hiện E coli đang đề kháng với nhiều loại kháng sinh khác nhau Theo một vài báo cáo gần đây, 12% E coli kháng với 7 loại kháng

sinh, 32% kháng với 6 loại kháng sinh, 40% kháng với 5 loại kháng sinh, 10 kháng với 4 loại kháng sinh, 6% kháng với 3 loại kháng sinh [22] Khả năng đề kháng với ampicillin, chloramphenicol, gentamicin, kanamycin, streptomycin, tetracycline, trimethoprim là 86%, 13,5%, 1,1%, 2,3%, 80,3%, 47,2%, 65,7% [23]

2.4.1.2 Pseudomonas spp

Đặc điểm hình thái: Pseudomonas spp là vi khuẩn Gram âm, tế bào hình

que, không sinh nha bào di động nhờ roi ở đầu Một số chủng được biết như một tác nhân xử lý ô nhiễm môi trường Một số chủng có thể gây hư hỏng thức

ăn Một số chủng P aeruginosa, P oryzihabitans, và P plecoglossicida, P

aeruginosa có trong môi trường bệnh viên, là những nguyên nhân gây nhiễm

trùng phổ biến nhất (nhiễm trùng bệnh viện)

Đặc điểm nuôi cấy: Là vi khuẩn hiếu khí hoặc yếm khí tùy nghi Sinh trưởng tốt trong điều kiện nhiệt độ 37 oC Trong môi trường thạch, khuẩn lạc tròn, bóng, trong suốt Trong môi trường nước thịt, xuất hiện màng xanh

Hình 2.11: Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa dưới kính hiển vi điện tử

Đặc tính gây bệnh: Các chủng Pseudomonas gây bệnh có thể phát triển ở

hầu hết các bộ phận của cở thể sinh vật gây ra bệnh viêm phổi và các bệnh nhiểm trùng bao gồm máu, tim, xương, khớp, phổi, hệ thống thần kinh, mắt, tai, đường tiết niệu, da và mô mềm với nước mũ màu xanh Bệnh thường diển biến

ở các cơ thể có hệ miễn dịch suy yếu, tỉ lệ tử vong do nhiểm trùng bởi

Pseudomonas thường cao [24]

Khả năng đề kháng: Pseudomonas có khả năng đề kháng với nhiều kháng

sinh, bao gồm penicillin, ampicillin, tetracyclin, cephalosporin thế hệ 1 và 2, sulfonamides, neomycin, streptomycin, kanamycin, chloramphenicol, nitrofuran, và trimethoprim-sulfonamide Chỉ có một số kháng sinh beta-lactam phổ rộng như imipenem, carbapenem, các fluoroquinolones, amikacin, gentamicin, các cephalosporin thế hệ 4 như cefepime mới có khả năng điều trị [25]

2.1.1.2 Salmonella spp

Đặc điểm hình thái: Là vi khuẩn Gram âm thuộc họ trực khuẩn đường ruột, hình gậy ngắn, hai đầu tròn, kích thước 0,4-0,6×1-3 µm, không có khả năng hình thành giáp mô và nha bào, có khả năng di động nhờ chiêm mao

Hình 2.13: Vi khuẩn Salmonella typhimurium dưới kính hiển vi điện tử (Nguồn: http://textbookofbacteriology.net/salmonella_2.html)

Đặc điểm nuôi cấy: Salmonella là vi khuẩn vừa hiếu khí vừa kỵ khí tùy

tiện, phát triển tốt trong môi trường thạch thường với nhiệt độ thích hợp là

35-37 oC, sau 20-24 h hình thành khuẩn lạc tròn, trong suốt hoặc hơi đục Trong môi trường nước thịt sau 18 h môi trường chuyễn sang đục Nuôi lâu xuất hiện cặn dưới đáy ống nghiệm, phía trên có màng mỏng [18]

Hình 2.14: Khuẩn lạc Salmonella typhimurium trên môi trường thạch TSA

(Nguồn: http://academic.pgcc.edu/~kroberts/web/colony/styphi.gif)

Đặc tính gây bệnh: Salmonella spp có khả năng sinh nội độc tố và ngoại

độc tố Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể thông qua đường ăn uống là chính, khi vào đến ruột non, vi khuẩn chui qua niêm mạc ruột để xâm lấn tới các hạch bạch huyết, sinh trưởng và phát triển tại đó Một số vi khuẩn có khả năng tự li

giải, phóng thích ra các nội độc tố, nội độc tố gây độc thần kinh, hôn mê, co giật, gây xung huyết và mụn loét, một số vi khuẩn xâm nhập vào hệ bạch huyết

và hệ tuần hoàn máu gây nhiễm trùng huyết Ngoại độc tố tác động vào hệ tiêu

hóa gây tiêu chảy [18] Một số chủng S typhimurium, S enteritidis không chỉ

gây bệnh trên vật nuôi mà còn có khả năng gây bệnh trên người, là những nguyên nhân gây nên các vụ ngộ độc thực phẩm [26]

Khả năng đề kháng: Có 37,40-68,10% số chủng vi khuẩn kháng lại chloramphenicol, 33,40-59,60% kháng lại tetracycline, 74,60-89,24% kháng lại streptomycin Những kháng sinh dùng nhiều và phổ biến có tỉ lệ kháng cao như streptomycin, sulfonamide [22]

2.1.1.2 Klebsiella spp

Đặc điểm hình thái: Là trực khuẩn Gram âm, hình gậy nhắn, sống kị khí tuỳ nghi, không có khả năng di động, có lớp vỏ polysaccharide đặc trưng và không có khả năng sinh nha bào

Hình 2.15: Vi khuẩn Klebsiella spp dưới kính hiển vi điện tử

Đặc điểm nuôi cấy: Vi khuẩn dễ mọc trên môi trường nuôi cấy thông thường Trên thạch dinh dưỡng hay thạch máu xuất hiện khuẩn lạc nhầy, màu xám Trong môi trường canh thang, xuất hiện cặn dưới đáy

Hình 2.16: Khuẩn lạc Klebsiella pneumonia trên môi trường thạch TSA

Đặc tính gây bệnh: Klebsiella spp có mặc khắp nơi trong tự nhiên như

đất, nước thải, các sản phẩm thực vật, những thức ăn có hàm lượng đường và

acid cao Ở người có thể tìm thấy Klebsiella spp ở da, cổ họng, đường ruột, nước tiểu, hoặc vết thương Các chủng Klebsiella gây ra nhiều chứng bệnh đặc

nhiêm trọng như viêm phổi, viêm màng phổi, apxe phổi, nhiễm trùng đường tiểu, nhiễm trùng huyết, viêm cứng đốt sống, viêm màng não và viêm mô mềm

[27] Klebsiella là một trong những nguyên nhân gây nhiễm trùng bệnh viện

nhiều nhất hiện nay

Khả năng đề kháng: Hiện tại tính đề kháng của Klebsiella là rất cao Hầu

hết đã đề kháng với ampicillin do sự hiện diện của gene mã hoá beta-lactamase đặc hiệu với penicillin Một số chủng còn có khả năng tiết ra men beta-lactamase phổ rộng hay còn gọi là ESBL (extended spectrum beta-lactamase) đề kháng các kháng sinh phổ rộng thế hệ mới như cephalosporin thế hệ 3, thế hệ 4

và nhiều kháng sinh khác như aminoglycoside, fluoroquinolone Cơ chế sinh kháng ESBL được xác định là thu nhận từ plasmid [27]

N N

Khối lượng phân tử: 357,37 g/mol

Dạng tinh thể màu trắng Tan tốt trong nước và có độ ổn định cao trong môi trường acid lẫn base

Danofloxacin là kháng sinh tổng hợp thuộc nhóm fluoroquinolone có phổ kháng khuẩn rộng trên vi khuẩn Gram âm và vi khuẩn Gram dương Danofloxacin được sử dụng trong việc điều trị các bệnh đường hô hấp ở gà, trâu, bò và lợn

Danofloxacin hấp thu tốt thông qua đường uống và được dùng cho tiêm dưới da hoặc tiêm bắp Thời gian bán thải phụ thuộc vào từng loài, đào thải chủ yếu theo nước tiểu và phân

Khối lượng phân tử: 444,43g/mol

Doxycycline thuộc dẫn chất nhóm tetracycline, có phổ kháng khuẩn rộng, được chỉ định dùng trên người và động vật Thuốc hấp thu tốt thông qua đường uống (95 %) và dạng bột dùng để tiêm tĩnh mạch Là thuốc ít gây độc trên gan nhất trong họ tetracycline

Giống như các tetracycline khác, doxycycline có tác dụng kiềm khuẩn do

ức chế tổng hợp protein của vi khuẩn khi gắn vào vị trí 30S thậm chí là trên 50S của ribosome bởi khả năng tạo phức với các ion Mg2+, thuốc có thể làm thay đổi màng bào tương Hiệu quả ức chế trên vi khuẩn hiếu khí và kị khí,

Gram âm lẫn Gram dương như Rickettsia, Coxiella burnetii, Mycoplasma

pneumoniae, Chlamydia spp., Legionella spp., Ureaplasma, một số

Mycobacterium không điển hình và Plasmodium spp Vi khuẩn kháng với một

thuốc thuộc nhóm tetracycline thì cũng có khả năng kháng với các thuốc thuộc tetracyclin khác

HN N O

Khối lượng phân tử: 523,56 g/mol

Là kháng sinh cephalosporin thế hệ thứ 3, được chỉ định điều trị trên gia súc gia cầm Có phổ kháng khuẩn rộng trên cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương

Với cấu trúc 2-aminothiazol làm mở rộng phổ kháng khuẩn trên vi khuẩn Gram âm, tăng cường hoạt lực diệt khuẩn

Nhóm methoxyimino có tác dụng tăng tính bền với men lactamase Trong khi cấu trúc furanylcarbonylthiomethy làm tăng cường khả năng diệt khuẩn và kéo dài tác động

N

S

S

O HO

HN N O

S N

Hình 2.17: Đặc điểm cấu trúc phân tử ceftiofur

Ceftiofur được cho là có khả năng tiêu diệt trên các chủng có sinh men beta-lactamase

S

N

O O

H 2 N

O

H

Khối lượng phân tử: 528,60 g/mol

Cefquinome là một kháng sinh thuộc nhóm cephalosporin thế hệ thứ tư

S N

O O

Hình 2.18: Đặc điểm cấu trúc phân tử cefquinome

Với cấu trúc zwitterionic, có thể thẩm thấu nhanh qua màng sinh học, bao gồm cả màng porins của tế bào vi khuẩn Thêm vào đó, nó có ái lực thấp với beta-lactamase và ái lực cao hơn trong việc gắn kết trên các protein của vi khuẩn tương tự penicillin Với cấu trúc chính là khung sườn beta-lactam, trong khi các nhóm chức ngoại vi chính là một quinolinium bậc bốn, một phân nữa aminothiazolyl và nhóm thế O-alkyl oxime làm tăng hoạt tính trên vi khuẩn Gram âm

Cefquinome là kháng sinh dùng trong thú y với phổ kháng khuẩn rộng trên

cả vi khuẩn Gram dương lẫn Gram âm, có hoạt tính tốt trên cầu khuẩn S pneumoniae đề kháng penicillin G, các Enterobacteriaceae bao gồm các chủng

tiết beta-lactamase Hoạt tính tốt trên Pseudomonas aeruginosae Cơ chế tác

động được biết là ức chế sự tổng hợp thành tế bào,

Cefquinome được dùng ở dạng tiêm, chỉ định trên các bệnh nhiễm trùng

đường hô hấp, viêm phổi, và các bệnh nhiễm trùng do E.coli, Streptococcus

suis

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM 3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Hóa chất

 Môi trường Nutrient Broth (NB), Merck

 Môi trường Nutrient Agar (NA), Merck