ảnh hưởng của naa và atonik lên giai đoạn ra rễ và thuần dưỡng huệ trắng (polianthes tuberosa l.) in vitro trong điều kiện ánh sáng nhân tạo và ánh sáng tự nhiên trong nhà lưới

TÓM LƯỢC Nghiên cứu này được thực hiện để xác định ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng và điều kiện ánh sáng lên giai đoạn ra rễ in vitro và khả năng thích nghi của huệ trắng Polian

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ẢNH HƯỞNG CỦA NAA VÀ ATONIK LÊN

GIAI ĐOẠN RA RỄ VÀ THUẦN DƯỠNG HUỆ TRẮNG

(POLIANTHES TUBEROSA L.) IN VITRO TRONG ĐIỀU

KIỆN ÁNH SÁNG NHÂN TẠO VÀ ÁNH SÁNG

TỰ NHIÊN TRONG NHÀ LƯỚI

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

PGS.TS NGUYỄN BẢO TOÀN LÊ LÝ VŨ VI

MSSV:3093169 LỚP:CNSHTT K35

Cần Thơ, Tháng 11/2013

PHẦN KÝ DUYỆT

PGs.Ts Nguyễn Bảo Toàn Lê Lý Vũ Vi DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

LỜI CẢM TẠ

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến:

Thầy Nguyễn Bảo Toàn, cô Phùng Thị Hằng, thầy và cô đã tận tình hướng dẫn, đóng góp nhiều ý kiến và kinh nghiệm quý báu để tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Mọi người trong gia đình đã chăm sóc và ủng hộ cho tôi

Chị Lan, chị Hạnh, Phú, Diệu, Ngân, em Thu và Linh đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện nghiên cứu

Xin chân thành cảm ơn!

Lê Lý Vũ Vi

TÓM LƯỢC

Nghiên cứu này được thực hiện để xác định ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng

và điều kiện ánh sáng lên giai đoạn ra rễ in vitro và khả năng thích nghi của huệ trắng (Polianthes tuberosa L.) trong giai đoạn thuần dưỡng Nghiên cứu gồm 2 thí nghiệm Thí nghiệm 1 nhằm xác định ảnh hưởng của NAA và atonik ở các nồng độ khác nhau trên giai đoạn ra rễ in vitro của cây huệ trắng trong điều kiện ánh sáng nhân tạo và tự nhiên trong nhà lưới Thí nghiệm 2 nhằm xác định khả năng thích nghi của cây con trong giai đoạn thuần dưỡng Kết quả thí nghiệm cho thấy, atonik ở nồng độ 2 ml/l và 4 ml/l kích thích ra rễ in vitro hiệu quả hơn NAA ở nồng độ 0,5 mg/l và 1 mg/l Điều kiện ánh sáng tự nhiên (120 µmol.m -2 s -1 ) kích thích sự ra rễ in vitro hiệu quả hơn điều kiện ánh sáng nhân tạo (50 µmol.m -2 s -1 ) Nghiệm thức atonik

2 ml/l kết hợp ánh sáng tự nhiên là thích hợp để tạo rễ in vitro Cây huệ trắng đã được nuôi cấy trong môi trường có atonik thích nghi tốt hơn so với cây trong môi trường có NAA Không có sự khác biệt về khả năng thích nghi giữa cây được nuôi cấy trong điều kiện ánh sáng nhân tạo và ánh sáng tự nhiên Cây thích nghi tốt sau khi được nuôi cấy trong môi trường có atonik 2 ml/l và atonik 4 ml/l trong cả hai điều kiện ánh sáng (tỉ lệ sống hơn 93%) Rễ ex vitro có cấu trúc cải thiện hơn rễ in vitro

Từ khóa: ánh sáng, atonik, NAA, Polianthes tuberosa L., ra rễ in vitro, thuần dưỡng

ii

MỤC LỤC

PHẦN KÝ DUYỆT

LỜI CẢM TẠ

TÓM LƯỢC i

MỤC LỤC ii

DANH SÁCH BẢNG iv

DANH SÁCH HÌNH v

TỪ VIẾT TẮT vi

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu 2

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về giống huệ Polianthes tuberosa L 3

2.1.1 Đặc điểm chung của huệ trắng (Polianthes tuberosa L.) 3

2.1.2 Giá trị thực tiễn của cây huệ 3

2.1.3 Tình hình nghiên cứu và sản xuất cây huệ trắng 3

2.2 Giai đoạn ra rễ in vitro 4

2.2.1 Chất điều hòa sinh trưởng 4

2.2.2 Điều kiện ánh sáng 5

2.3 Giai đoạn thuần dưỡng 6

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 6

3.1 Phương tiện nghiên cứu 8

3.1.1 Vật liệu thí nghiệm 8

3.1.2 Thiết bị và hóa chất 8

3.1.3 Điều kiện thí nghiệm 8

3.2 Phương pháp nghiên cứu 8

3.2.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy 8

iii

3.2.2 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của NAA và atonik lên giai đoạn ra rễ

in vitro của cây huệ trắng (Polianthes tuberosa L.) trong điều kiện ánh

sáng nhân tạo và tự nhiên 9

3.2.3 Thí nghiệm 2: Đánh giá khả năng thích nghi của cây con trong giai đoạn thuần dưỡng tại nhà lưới 11

CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 13

4.1 Ảnh hưởng của NAA và atonik lên giai đoạn ra rễ in vitro của cây huệ trắng (Polianthes tuberosa L.) trong điều kiện ánh sáng nhân tạo và tự nhiên 13

4.1.1 Hiệu quả của NAA và atonik lên số rễ, chiều dài rễ, đường kính rễ, chỉ số SPAD của cây huệ trắng in vitro trong điều kiện ánh sáng nhân tạo và tự nhiên 13

4.1.2 Hình thái của rễ in vitro 16

4.1.3 Cấu trúc giải phẫu của rễ in vitro 17

4.2 Đánh giá khả năng thích nghi của cây con trong giai đoạn thuần dưỡng tại nhà lưới 21

4.2.1 Tỉ lệ sống (%) của cây con trong giai đoạn thuần dưỡng ở nhà lưới 21

4.2.2 Cấu tạo rễ của cây huệ trắng đã thích nghi 24

4.2.3 Chỉ số SPAD của cây huệ trắng cấy mô vào ngày 7 và ngày 30 trong giai đoạn thuần dưỡng 25

CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 28

5.1 Kết luận 28

5.2 Đề nghị 28

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

iv

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 3.1 Bảng phối hợp nhân tố chất điều hòa sinh trưởng và điều kiện ánh sáng 10 Bảng 4.1 Hiệu quả của chất điều hòa sinh trưởng và điều kiện ánh sáng lên số rễ,

chiều dài, đường kính rễ và chỉ số SPAD của cây huệ trắng in vitro thời điểm 60

ngày sau khi cấy 14 Bảng 4.2 Tỉ lệ sống (%) của cây con sau 30 ngày thuần dưỡng tại nhà lưới 22 Bảng 4.3 Chỉ số SPAD của cây con vào ngày 7 và ngày 30 trong giai đoạn thuần

dưỡng 26

v

DANH SÁCH HÌNH

Hình 3.1 Bao cấy nhựa PP được dùng trong thí nghiệm 9 Hình 4.1 Sự hình thành rễ ở các nghiệm thức vào thời điểm 60 ngày sau cấy 17

Hình 4.2 Sự hình thành lông hút của rễ in vitro ở các nghiệm thức vào thời điểm

60 ngày sau cấy nhìn dưới vật kính X4 18

Hình 4.3 Mặt cắt rễ in vitro ở các nghiệm thức vào thời điểm 60 ngày sau cấy

nhìn dưới vật kính X10 19

Hình 4.4 Hệ mạch của rễ in vitro ở các nghiệm thức vào thời điểm 60 ngày sau cấy

nhìn dưới vật kính X40 21 Hình 4.5 Cây huệ trắng cấy mô sau 30 ngày thuần dưỡng 23

Hình 4.6 Rễ con mới tạo thành trong điều kiện ex vitro sau 30 ngày thuần dưỡng 24 Hình 4.7 Cấu tạo rễ ex vitro sau 30 ngày thuần dưỡng nhìn dưới vật kính X10 25 Hình 4.8 Hệ mạch của rễ ex vitro sau 30 ngày thuần dưỡng và của rễ in vitro 60 ngày sau cấy 25

vi

TỪ VIẾT TẮT

IAA Indole-3-acetic acid

MS Murashige and Skoog

NAA Napthalene acetic acid

SPAD Soil and Plant Analysis Development

PP Polypropylen

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề

Huệ trắng (Polianthes tuberosa L.) là loài có giá trị cao trong canh tác hoa cắt

cành ở Việt Nam Thông thường, huệ được nhân giống vô tính bằng củ Tuy nhiên, bất lợi của kỹ thuật này là dễ mang theo mầm bệnh và côn trùng sang các củ con, làm giảm năng suất và chất lượng hoa (Huang và Chiang, 1975), (Cuc và Pilon, 2007) Hơn nữa, hệ số nhân giống từ củ tương đối thấp (Rees, 1969) Do đó, việc nghiên cứu các giai đoạn vi nhân giống huệ trắng là cần thiết vì kỹ thuật này tạo ra được số lượng rất lớn cây con sạch mầm bệnh trong thời gian ngắn Trong vi nhân giống, giai đoạn ra

rễ in vitro và thuần dưỡng đóng vai trò quan trọng vì 2 giai đoạn này ảnh hưởng đáng

kể đến sức sống của cây cấy mô Chất điều hòa sinh trưởng thường dùng để kích thích

sự tạo rễ in vitro Trong các chất được sử dụng, atonik là chất điều hòa sinh trưởng

tổng hợp có thành phần chính gồm sodium-s-nitrogualacolate, sodium-o- nitrophenolate và sodium-p–nitrophenolate, có tác dụng kích thích cây ra rễ Nguyễn

Minh Kiên (2011) báo cáo atonik có tác dụng kích thích sự ra rễ in vitro ở cây huệ trắng Trong khi đó, NAA là auxin thường được sử dụng để kích thích sự tạo rễ in

vitro Tuy nhiên, hiệu quả của NAA trên sự ra rễ cây huệ in vitro vẫn còn hạn chế trên

cây huệ trắng Trong nuôi cấy in vitro, ánh sáng nhân tạo thường được sử dụng Do đó,

giá thành cây con cao do chi phí thắp sáng cao Hơn nữa, việc sử dụng ánh sáng nhân tạo còn làm cây con thích nghi kém với bức xạ cao của ánh sáng tự nhiên trong giai đoạn thuần dưỡng Vì vậy, sử dụng nguồn ánh sáng tự nhiên có thể giảm giá thành và tăng khả năng thích nghi của cây con trong giai đoạn thuần dưỡng (Pospisilova et al.,

1998) Việc sử dụng ánh sáng tự nhiên trong nuôi cấy in vitro đã được nghiên cứu trên nhiều loài như khóm (Ananas comosus) (Be và Debergh, 2006), cỏ vertiver (Vetiveria

zizanioides L.) (Be et al., 2008) Đối với cây huệ trắng, ảnh hưởng của ánh sáng nhân

tạo và tự nhiên lên sự ra rễ in vitro và thuần dưỡng vẫn chưa được công bố Vì vậy,

nghiên cứu về “Ảnh hưởng của NAA và atonik lên giai đoạn ra rễ và thuần dưỡng cây

huệ trắng (Polianthes tuberosa L.) in vitro trong hai điều kiện ánh sáng nhân tạo và ánh sáng tự nhiên trong nhà lưới” được tiến hành

1.2 Mục tiêu đề tài

Xác định ảnh hưởng NAA và atonik trong giai đoạn ra rễ in vitro của huệ trắng (Polianthes tuberosa L.) trong điều kiện ánh sáng nhân tạo trong phòng tăng trưởng và

điều kiện ánh sáng tự nhiên tại nhà lưới

Xác định khả năng thích nghi của cây huệ trắng trong trong giai đoạn thuần

dưỡng tại nhà lưới

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về giống huệ Polianthes tuberosa L

2.1.1 Đặc điểm chung của huệ trắng (Polianthes tuberosa L.)

Huệ trắng (Polianthes tuberosa L.) là loài đơn tử diệp, thân thảo, rễ chùm, thuộc

họ Agavaceae (Patil và Pai, 2011), nguồn gốc từ Mexico, ưa sáng, ưa nhiệt và nở hoa quanh năm (Sangavai và Chellapand, 2008) Huệ có lá đơn, dài, màu xanh, mọc thẳng

và là loài nở hoa vào ban đêm Một nhánh huệ dài 100 cm có thể cho 20 hoa màu trắng (Cuc và Pilon, 2007) Theo Huỳnh Thị Huế Trang et al (2007), huệ trắng có hai giống

là huệ trắng đơn và huệ trắng kép Huệ trắng đơn còn gọi là huệ xẻ, cây thấp, hoa ngắn

và thưa Huệ trắng kép còn gọi là huệ tứ diện, cây cao, hoa dài và dày Huệ kép được

nhiều người ưa chuộng hơn

2.1.2 Giá trị của cây huệ

Huệ trắng là loại cây có giá trị kinh tế cao trong công nghiệp hoa cắt cành, mỹ phẩm và dược liệu (Sangavai và Chellapand, 2008) Tại đồng bằng sông Cửu Long, cành hoa huệ trắng được sử dụng để thờ cúng trong các dịp lễ tết (Cuc và Pilon, 2007) Tinh dầu chiết xuất từ hoa huệ được sử dụng là hoạt chất tạo hương và chăm sóc da trong công nghiệp mỹ phẩm Ngoài ra, tinh dầu hoa huệ được sử dụng để xông hơi thư giãn nhờ vào mùi hương dễ chịu (Roberts, 2000) Majima et al (1995), Sadiqa et al (1999) báo cáo củ huệ có nhiều saponin, hoạt chất có khả năng tăng cường trao đổi chất trong cơ thể động vật và bảo vệ tế bào trước sự tấn công của vi khuẩn

2.1.3 Tình hình nghiên cứu và sản xuất cây huệ trắng

Nhu cầu về cây huệ trắng là khá lớn nhưng nguồn cung cấp huệ bị giảm sút do sự ảnh hưởng của côn trùng và bệnh hại Điển hình là bệnh chai bông do tuyến trùng

Aphelenchoides besseyi Christie, gây thiệt hại nghiêm trọng cho người canh tác Đặc

điểm nhận dạng là các đốm nâu trên nhánh huệ, làm mất giá trị sử dụng của cây, sau

đó dẫn đến cây huệ bị chết dần (Cuc và Pilon, 2007) Theo Huang và Chiang (1975), tuyến trùng có thể tồn lưu trong củ huệ trong thời gian dài, cây huệ mới có nguy cơ nhiễm bệnh cao nếu tiếp tục sử dụng nguồn củ huệ đã nhiễm tuyến trùng để nhân giống Ngoài ra, tốc độ nhân giống bằng củ huệ với phương pháp truyền thống tương

đối thấp Đối với cây huệ trắng, một củ chỉ có thể tạo ra 1.000 củ con trong vòng 16 năm (Rees, 1969)

Yêu cầu đặt ra là sản xuất số lượng lớn cây huệ sạch bệnh để cung cấp cho nhu cầu thị trường Giải pháp cho vấn đề trên chính là nuôi cấy mô cây huệ Từ một vài mẫu cấy sạch bệnh có thể sản xuất ra số lượng lớn cây con sạch bệnh và khoẻ mạnh nếu được nuôi cấy và thuần dưỡng trong điều kiện thích hợp (George, 1993) Theo Nguyễn Bảo Toàn (2010), vi nhân giống có thể chia làm các giai đoạn như sau:

Giai đoạn 0: Chuẩn bị và lựa chọn mẫu cấy (explant) từ cây mẹ

Giai đoạn 1: Tiệt trùng mẫu cấy bằng các chất khử trùng bề mặt như NaOCl, HgCl2

Giai đoạn 2: Nhân chồi bằng cách bổ sung cytokinin và auxin vào môi trường Giai đoạn 3: Kích thích rễ và tiền thuần dưỡng bằng auxin và tăng khả năng tự dưỡng cho cây con bằng cách giảm bớt nồng độ carbohydrate trong môi trường nuôi cấy

Giai đoạn 4: Thuần dưỡng cây cấy mô bằng cách chuyển từ điều kiện in vitro

sang điều kiện nhà lưới hoặc ngoài đồng

Mỗi giai đoạn đều có vai trò quan trọng, ảnh hưởng đến chất lượng và khả năng

thích nghi của cây cấy mô ở điều kiện ex vitro

Hiện nay, nhiều nghiên cứu về vi nhân giống cây huệ trắng (Polianthes tuberosa

L.) đã được công bố trên thế giới (Nasreen et al., 1994), (Naz et al., 2012) Tại Đại học Cần Thơ, Huỳnh Thị Huế Trang et al (2007) đã thực hiện thành công qui trình vi nhân giống cây huệ trắng sạch bệnh từ mô phân sinh chồi

2.2 Giai đoạn ra rễ in vitro

Theo George (1993), cây thân thảo cần ra rễ in vitro trước khi được thuần dưỡng trong điều kiện ex vitro vì bộ rễ giúp cây hấp thu chất dinh dưỡng và nước từ môi trường ex vitro tốt hơn

2.2.1 Chất điều hòa sinh trưởng

NAA (Napthalene acetic acid)

Auxin là chất điều hòa sinh trưởng đóng vai trò chính trong sự tạo và phát triển

rễ in vitro Trong các auxin được sử dụng, auxin tổng hợp NAA được đề xuất sử dụng

vì tính bền vững và có khả năng giữ hoạt tính khi bị hấp khử trùng ở 1210C, 100kPa

(Dai et al., 1987) NAA đã được dùng để kích thích sự ra rễ in vitro ở nhiều loài khác nhau (George, 1993) Tuy nhiên, Huỳnh Thị Huế Trang et al (2007) báo cáo số rễ in

vitro của cây huệ trắng sau 4 tuần nuôi cấy ở các nồng độ NAA 0,5 mg/l, 1 mg/l và đối

chứng không khác biệt ý nghĩa thống kê

Atonik

Atonik là chất điều hòa sinh trưởng gồm các nitrophenol nitrogualacolate, sodium-nitrophenolate và sodium-p-nitrophenolate), có tác dụng kích thích ra rễ ở cây trồng Đây là sản phẩm giá thành thấp, được đóng gói ở dạng bột khô hoặc dung dịch Theo tài liệu được công bố vào tháng 11 năm 2008 của Cục Bảo vệ Môi trường Hoa Kì (EPA), atonik không gây độc cho cây và động vật tiêu thụ khi được sử dụng làm chất điều hòa sinh trưởng thực vật (plant growth regulator), với liều

(sodium-s-sử dụng thấp, các hoạt chất nitrophenol nhanh chóng được chuyển hóa thành những

sản phẩm vô hại Theo kết quả nghiên cứu trên cây kê (Pennsetum glaucum), Datta et

al (1986) atonik có tác dụng điều hòa sinh trưởng của cây vì chất này tăng sự tổng hợp auxin nội sinh của cây Djanaguiraman et al (2005) báo cáo atonik làm tăng hàm lượng auxin nội sinh IAA là nhờ sự ức chế enzyme IAA oxidase-loại enzyme phân hủy IAA của cây trồng Đã có nhiều nghiên cứu về khả năng kích thích và phát triển rễ trên cây trồng của atonik Ví dụ, Bhonde et al (1992), báo cáo atonik làm tăng số rễ

và năng suất trên củ hành (Allium cepa) Tuy được sử dụng rộng ở điều kiện ex vitro, atonik vẫn chưa được sử dụng rộng trong giai đoạn ra rễ in vitro Tại trường Đại học Cần Thơ, đã có những nghiên cứu về sử dụng atonik trong giai đoạn ra rễ in vitro ở cây lan giáng hương (Aerides sp.) (Bùi Xuân Vinh, 2013), (Nguyễn Thị Mai Hạnh, 2013) Đối với cây huệ trắng in vitro, các nồng độ atonik 10 ml/l, 15 ml/l kích thích sự

ra rễ, tuy nhiên, nồng độ atonik 15 ml/l cho số rễ thấp hơn atonik 10 ml/l (Nguyễn

Minh Kiên, 2011)

2.2.2 Điều kiện ánh sáng

Diệp lục tố hấp thu chủ yếu phần quang phổ xanh dương (430 nm) và đỏ (660 nm) Tuy nhiên, ánh sáng đèn compact trắng trong phòng tăng trưởng chủ yếu là phần quang phổ xanh dương, rất ít phần quang phổ đỏ (Aube et al., 2013) Hơn nữa, bức xạ thấp của ánh sáng nhân tạo lại làm cây khó thích nghi khi chuyển sang bức xạ cao trong giai đoạn thuần dưỡng Trong khi đó, ánh sáng tự nhiên có đủ quang phổ xanh dương, đỏ và bức xạ ánh sáng gần giống như bức xạ trong giai đoạn thuần dưỡng Vì

vậy, ánh sáng tự nhiên có thể được dùng trong giai đoạn in vitro để giúp cây sinh

trưởng tốt và thích nghi với bức xạ cao, giúp tăng tỉ lệ sống trong giai đoạn thuần

dưỡng ex vitro (Pospisilova et al., 1998) Ngoài ra, ánh sáng tự nhiên còn được dùng

để giảm chi phí thắp sáng Nhiều nghiên cứu trên cây lan đã tận dụng điều kiện ánh sáng tự nhiên trong nhà lưới (Bùi Xuân Vinh, 2013), (Nguyễn Thị Mai Hạnh, 2013) Nguyễn Thị Mai Hạnh (2013) báo cáo cây lan được đặt trong điều kiện ánh sáng tự

nhiên cho nhiều rễ in vitro hơn so với cây ở điều kiện ánh sáng nhân tạo Tuy nhiên, rễ

in vitro lại ngắn hơn so với tại điều kiện ánh sáng nhân tạo Ngoài ra, nghiên cứu của

Be et al (2008) trên sự ra rễ in vitro lại nhận thấy điều kiện ánh sáng nhà lưới (95–125

µmol.m-2.s-1) và phòng tăng trưởng (30 µmol.m-2.s-1) không ảnh hưởng khác biệt đến

số rễ in vitro của cỏ Vertiver (Vetiveria zizanioides L.) Tuy nhiên, Kyte (1987) vẫn đề xuất không sử dụng ánh sáng tự nhiên trong giai đoạn in vitro vì tính không ổn định và

khó kiểm soát của yếu tố này; chồi cấy dễ chết khi tiếp xúc với điều kiện bức xạ và nhiệt độ cao

2.3 Giai đoạn thuần dưỡng

Mục tiêu của giai đoạn thuần dưỡng là giúp cây con sống sót và thích nghi với

điều kiện độ ẩm thấp, bức xạ cao ở môi trường ex vitro Aracama et al (2008) đề xuất

bộ rễ phát sinh in vitro của cây Uniola paniculata có thể hấp thu nước và muối khoáng trong điều kiện ex vitro Ngược lại, Nguyễn Bảo Toàn (2010) đề xuất rằng bộ rễ phát sinh in vitro trên nhiều loài không hấp thu được nước và muối khoáng từ giá thể trong giai đoạn thuần dưỡng ex vitro, điều này làm giảm sức sống của cây

Nguyên nhân chính làm cây chết trong giai đoạn thuần dưỡng là: rễ không thể hấp thu nước từ giá thể do chưa hoàn chỉnh chức năng (George, 1993) và mất nước qua lá do thiếu lớp cutin và sự đóng khí khổng (Saez et al., 2012) Cây con cần đủ thời gian để hoàn thiện chức năng và thích nghi với điều kiện thuần dưỡng Sự thích nghi

của cây cấy mô khi chuyển từ điều kiện in vitro (bức xạ ánh sáng thấp) sang điều kiện

ex vitro (bức xạ ánh sáng cao) còn thể hiện ở sự gia tăng hàm lượng diệp lục

(Pospisilova et al., 1998) trong thời gian thuần dưỡng Sự thích nghi diễn ra nhanh hay chậm là tùy thuộc vào mỗi loại cây (Pospisilova et al., 1999)

Sự thích nghi của cây cấy mô trong điều kiện ex vitro

Tỉ lệ sống và sự thích nghi của cây liên quan đến khả năng hút nước và khoáng

của bộ rễ Bộ rễ phát sinh in vitro có thể tăng tỉ lệ sống của cây trong giai đoạn ex vitro

nhờ vào sự khả năng giữ và hấp thu nước (Diaz-Perez et al., 1995) Nghiên cứu trên

cây lan Cymbidium Joy Polis cho thấy, bộ rễ phát sinh trong giai đoạn in vitro vẫn

thích nghi tốt với điều kiện nhà lưới, mặc dù bộ rễ có các mạch gỗ kém phát triển, thành mạch gỗ chưa hoàn thiện (Mayer et al., 2008) Tuy nhiên, không phải lúc nào rễ

được tạo ra trong điều kiện in vitro cũng thích nghi với điều kiện môi trường bên ngoài Trong những ngày đầu của giai đoạn thuần dưỡng ex vitro của dây nho (Vitis

vinifera), rễ thiếu khả năng hấp thu nước, đây là một trong những nguyên nhân làm

cây mất nước và dễ chết (Fila et al., 1998) Tuy vậy, những bất thường về cấu tạo rễ

phát sinh in vitro vẫn có thể được chỉnh sửa và hoàn chỉnh chức năng sau một thời gian thuần dưỡng ở điều kiện ex vitro ( McClelland et al., 1990)

Hàm lượng diệp lục lá

Sau một thời gian thuần dưỡng, hàm lượng diệp lục lá của cây Azadirachta

indica cao hơn hẳn so với lúc bắt đầu giai đoạn, tác giả cũng cho rằng sự gia tăng hàm

lượng diệp lục có thể phản ánh khả năng quang hợp và thích nghi tốt hơn của cây

(Lavanya et al., 2009) Tuy nhiên, nghiên cứu trên cây thân thảo Spathiphyllum

floribundum của Van Huylenbroeck et al (1995) lại ghi nhận sự mất màu diệp lục

(photobleaching) khi cây cấy mô được thuần dưỡng trong điều kiện bức xạ ánh sáng cao (300 µmol.m-2.s-1), đây là biểu hiện của sự quang ức chế (photoinhibition) do cây kém thích nghi với bức xạ ánh sáng cao Nemali và Iersel (2004) kiến nghị rằng bức xạ ánh sáng có thể làm tăng hoặc giảm hàm lượng diệp lục, điều này phụ thuộc vào đặc tính sinh lý của từng loài

Để trích xuất diệp lục trong lá, các phương pháp thường được dùng là nghiền mẫu lá trong các dung môi hữu cơ như acetone, dimethylsulfoxide hoặc methanol (Porra, 2002) Tuy nhiên, hàm lượng diệp lục của lá cũng có thể được đánh giá một cách nhanh chóng bằng chỉ số SPAD (Soil and Plant Analysis Development) mà không làm hư hại mẫu lá Đây là thiết bị cầm tay được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu trên nhiều loài khác nhau (Markwell et al., 1995) Thiết bị này sử dụng 2 diot phát sáng và 1 cảm biến ánh sáng để đo ánh sáng được truyền qua lá, từ đó cho phép đánh giá hàm lượng diệp lục có trong lá cây được đo (Lê Duy, 2011) Nghiên cứu trên

Arabidopsis thaliana, cho thấy chỉ số SPAD có mối liên hệ rất chặt với hàm lượng

diệp lục lá với r2

>0,996, chỉ số SPAD thể hiện độ xanh của lá, chỉ số SPAD càng cao thì hàm lượng diệp lục càng cao và ngược lại (Ling et al., 2011)

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Phương tiện thí nghiệm

3.1.1Vật liệu thí nghiệm

Mẫu chồi huệ trắng (Polianthes tuberosa L.) in vitro được tạo từ Phòng Thí

nghiệm Vi nhân giống của Trại nghiên cứu và thực nghiệm nông nghiệp, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Đại học Cần Thơ

3.1.2 Thiết bị và hóa chất

Tủ cấy vô trùng, nồi khử trùng nhiệt ướt, bếp điện, cân kỹ thuật, máy đo pH, bao cấy bằng nhựa PP, máy đo ánh sáng Lux meter Extech, SPAD Chlorophyll meter 502 Minolta

Môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962), nước dừa, cồn, NAA (naphthalene acetic acid), atonik 1,8 DD là sản phẩm của công ty Asahi (Nhật Bản) và

do công ty TNHH ADC đóng gói và phân phối Thành phần gồm các nitrophenol với tỉ

lệ sodium-s-nitrogualacolate 0,03%, sodium-o- nitrophenolate 0,06%, sodium-p- nitrophenolate 0,09%, loại gói nhỏ 10 ml/l được pha loãng với 1 lít nước Lượng sử dụng cho thí nghiệm là lượng đã được pha loãng

3.1.3 Địa điểm và điều kiện thí nghiệm

Điều kiện thí nghiệm

Nguồn ánh sáng trong phòng tăng trưởng là ánh sáng nhân tạo từ đèn compact trắng, ngoài ra còn có một phần nhỏ ánh sáng tự nhiên khuếch tán qua cửa sổ phòng; cường độ ánh sáng trong phòng là 50 µmol.m2.s-1 Ánh sáng tự nhiên ngoài nhà lưới là ánh sáng mặt trời chiếu xuống nhà lưới qua lớp lưới che sáng để giảm bớt cường độ sáng Cường độ ánh sáng trung bình trong nhà lưới là 120 µmol.m2.s-1 Cường độ ánh sáng tự nhiên được ghi nhận vào lúc 8 giờ, 12 giờ, 16 giờ vào mỗi tuần

Nhiệt độ phòng 29 ± 10C Nhiệt độ ngoài nhà lưới 30 ± 10C

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy

Môi trường sử dụng là môi trường MS được bổ sung nước dừa (80 ml/l), các vitamin và chất điều sinh trưởng ở các nồng độ tương ứng cho từng nghiệm thức Môi

trường nuôi cấy được chỉnh ở pH 5,8 Sau đó, phân phối môi trường vào chai thủy tinh

có thể tích 0,5 lít và đưa đi hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C trong 30 phút dưới áp suất

100 kPa Sau khi hấp khử trùng môi trường được phân phối vào trong bao nhựa PP với kích thước 15 cm x 25 cm xếp vuông góc dưới đáy Mỗi bao nhựa chứa 100 ml môi trường (Hình 3.1)

3.2.2 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của NAA và atonik lên giai đoạn ra rễ in vitro ở

huệ trắng trong điều kiện ánh sáng nhân tạo và tự nhiên

Mục tiêu

Xác định hiệu quả của NAA và atonik lên giai đoạn ra rễ in vitro của huệ trắng

trong điều kiện ánh sáng nhân tạo và tự nhiên

Mô tả thí nghiệm

Chồi được kích thích ra rễ in vitro bằng chất điều hòa sinh trưởng (0 ml/l, NAA

0,5 mg/l, NAA 1 mg/l, atonik 2 ml/l và atonik 4 ml/l) và đặt trong hai điều kiện ánh

sáng (ánh sáng nhân tạo và ánh sáng tự nhiên) Chọn các chồi có chiều cao từ 7-8 cm,

mỗi bao cấy chứa 3 chồi Sau khi cấy, gắp miệng bao lại và dán kín bằng băng keo trong Hai tuần đầu sau khi cấy, chồi cây được giữ trong phòng tăng trưởng Đến tuần thứ 3, chồi cây được đặt trong điều kiện ánh sáng tương ứng với từng nghiệm thức

Hình 3.1 Bao cấy nhựa PP được dùng trong thí nghiệm

T: ánh sáng nhân tạo; N: ánh sáng tự nhiên

Chỉ tiêu theo dõi

Số rễ /chồi: Đếm số rễ hình thành trên mỗi chồi, bắt đầu ghi nhận khi rễ dài 0,3

Quan sát hình thái giải phẫu của rễ phát sinh in vitro ở các nghiệm thức bằng

phương pháp nhuộm sôn phèn lục iod, chụp ở kính hiển vi quang học (Olympus optical Co., LTD Japan) với các độ phóng đại vật kính X4, X10 và X40 Phương pháp được thực hiện theo qui trình nhuộm hai màu của Hà Thị Lệ Ánh (2000) Với phương pháp nhuộm này, sôn phèn nhuộm màu hồng vách cellulose và lục iod nhuộm xanh vách tế bào tẩm mộc tố (lignin)

Tiếp tục ngâm các lát rễ trong dung dịch acetic acid trong 5 phút Sau đó rửa sạch bằng nước cất

Nhuộm dung dịch sôn phèn iod trong vòng 15 phút Rửa lại các lát rễ bằng nước cất

Quan sát dưới kính hiển vi quang học

Các chỉ tiêu được ghi nhận 1 lần khi thí nghiệm kết thúc

3.2.3 Thí nghiệm 2: Đánh giá khả năng thích nghi của cây con trong giai đoạn

thuần dưỡng tại nhà lưới

Chỉ tiêu theo dõi

Tỉ lệ sống sót (%): Tính tỉ lệ cây sống sót sau 30 ngày thuần dưỡng

Chỉ số SPAD: Mỗi cây lấy đại diện 1 lá, lấy lá thứ 2 từ trong ra

Quan sát hình thái giải phẫu của rễ phát sinh ex vitro ở các nghiệm thức

Thí nghiệm được tiến hành trong 30 ngày Tỉ lệ sống và giải phẫu rễ được ghi nhận vào ngày 30 Chỉ số SPAD được ghi nhận vào ngày 7 và ngày 30

Xử lý số liệu

Số liệu được xử lý bằng phần mềm phân tích thống kê SPSS 16.0 để phân tích phương sai và phép kiểm định Duncan mức 5%

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Ảnh hưởng của NAA và atonik lên giai đoạn ra rễ in vitro ở huệ trắng (Polianthes tuberosa L.) trong điều kiện ánh sáng nhân tạo và tự nhiên

4.1.1 Hiệu quả của NAA và atonik lên số rễ, chiều dài rễ, đường kính rễ, chỉ số

SPAD của cây huệ trắng in vitro trong điều kiện ánh sáng nhân tạo và tự nhiên

Kết quả được trình bày ở Bảng 4.1 cho thấy chất điều hòa sinh trưởng và điều kiện ánh sáng đều có tác động lên số rễ, chiều dài, đường kính và chỉ số SPAD của

chồi in vitro Các nghiệm thức có số rễ nhiều, chiều dài rễ và chỉ số SPAD lớn thuộc

nhóm nghiệm thức atonik Trong khi đó, đường kính rễ lớn rơi vào các nghiệm thức NAA Những nghiệm thức trong điều kiện ánh sáng tự nhiên thể hiện sự sinh trưởng

rễ và chỉ số SPAD tốt hơn các nghiệm thức trong ánh sáng nhân tạo Kết quả tương tác cho thấy, kết hợp giữa nhân tố chất điều hòa sinh trưởng và ánh sáng không ức chế các

chỉ tiêu sinh trưởng được khảo sát của cây trong giai đoạn rễ in vitro

Số rễ

Các nghiệm thức có số rễ nhiều là atonik 2 ml/l (9,5 rễ) và atonik 4 ml/l (9,0 rễ), khác biệt thống kê so với những nghiệm thức còn lại Đối với điều kiện ánh sáng, các nghiệm thức trong điều kiện ánh sáng tự nhiên có số rễ nhiều hơn và có ý nghĩa thống

kê so với các nghiệm thức trong điều kiện ánh sáng nhân tạo Kết quả tương tác cho thấy nghiệm thức atonik 2 ml/l trong điều kiện ánh sáng tự nhiên có số rễ cao nhất (13,1 rễ) và có khác biệt thống kê so với các nghiệm thức còn lại

Các nghiệm thức atonik có số rễ nhiều có thể vì atonik đã ức chế hoạt động của enzyme giải IAA oxidase, từ đó làm tăng lượng IAA nội sinh (Djanaguiraman et al., 2005) và IAA đã kích thích sự tạo rễ ở chồi cấy Như vậy, atonik ở nồng độ 2 ml/l và 4

ml/l có thể kích thích huệ trắng ra rễ in vitro Các nghiệm thức trong ánh sáng tự nhiên

có số rễ nhiều hơn có thể là do ánh sáng tự nhiên đã kích thích sự quang hợp của cây (Saez et al., 2012) Quang hợp tăng lên dẫn đến việc tạo ra nhiều carbohydrate hơn Do

đó, chồi cây cần nhiều rễ hơn để tăng khả năng hấp thu nitrogen từ môi trường để đảm bảo sự ổn định của tỉ lệ C/N (Zheng, 2009) Thêm vào đó, cường độ cao hơn của ánh sáng tự nhiên làm tăng sự vận chuyển auxin từ chồi đỉnh xuống, kích thích sự tạo rễ

(Halliday et al., 2009) Phân tích kết quả tương tác cho thấy nghiệm thức atonik 2 ml/l

kết hợp với điều kiện ánh sáng tự nhiên là hiệu quả cho việc kích thích rễ in vitro

Bảng 4.1 Hiệu quả của chất điều hòa sinh trưởng và điều kiện ánh sáng lên

số rễ, chiều dài, đường kính rễ và chỉ số SPAD của cây huệ trắng in vitro

thời điểm 60 ngày sau khi cấy

Nhân tố Số rễ Chiều

dài (cm)

Đường kính (mm)

dài hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức trong ánh sáng nhân tạo Kết quả tương tác cho thấy các nghiệm thức cho rễ dài và khác biệt có ý nghĩa thống kê là atonik 2 ml/l trong ánh sáng tự nhiên và các nghiệm thức atonik 4 ml/l ở hai điều kiện ánh sáng

Như đã thảo luận, chồi cấy trong môi trường có atonik có thể có lượng IAA nội sinh cao, tế bào rễ được kéo dài theo chiều dọc, dẫn đến chiều dài rễ gia tăng Kết quả

cho thấy, nghiệm thức atonik 4 ml/l có tác dụng rõ rệt lên sự kéo dài rễ in vitro Các

nghiệm thức ở điều kiện ánh sáng tự nhiên có rễ dài hơn có thể là do quang phổ đầy đủ

và bức xạ cao của ánh sáng tự nhiên đã giúp cây quang hợp tốt, dẫn đến tăng cường sự sinh trưởng và kéo dài của rễ để tăng diện tích tiếp xúc với môi trường dinh dưỡng (Webb, 1976) Kết quả tương tác cho thấy sử dụng atonik 2 ml/l trong điều kiện ánh sáng tự nhiên và atonik 4 ml/l ở hai điều kiện ánh sáng là thích hợp cho sự kéo dài của

rễ in vitro

Đường kính rễ

Các nghiệm thức NAA 1 mg/l cho đường kính rễ lớn nhất và khác biệt thống kê với những nghiệm thức còn lại Đường kính rễ ở các nghiệm thức ánh sáng tự nhiên lớn hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức trong ánh sáng nhân tạo Kết quả tương tác cho thấy, các nghiệm thức NAA 0,5 mg/l, NAA 1 mg/l trong ánh sáng tự nhiên cho đường kính rễ lớn hơn và có nghĩa thống kê với những nghiệm thức còn lại

Nghiên cứu trên cây Karwinskia Humboldtiana in vitro cho thấy, rễ ở các

nghiệm thức có bổ sung NAA có đường kính rễ lớn (Kollarova et al, 2004) Kết quả tương tự cũng được ghi nhận ở đường kính rễ của các nghiệm thức NAA trong thí nghiệm này Như vậy, việc bổ sung NAA vào môi trường kích thích sự tăng trưởng

theo chiều ngang của rễ cây huệ trắng in vitro Đường kính rễ ở các nghiệm thức trong

ánh sáng tự nhiên cao hơn có thể là do quang phổ và bức xạ cao của ánh sáng tự nhiên

đã tác động tích cực lên sự sinh trưởng và trao đổi chất của của cây, làm tăng đường kính bộ rễ (Taiz và Zeiger, 2002) Kết quả tương tác cho thấy, sử dụng NAA 0,5 mg/l

và NAA 1 mg/l trong điều kiện ánh sáng tự nhiên có tác động tăng đường kính rễ rõ rệt

Chỉ số SPAD

Đối với chất điều hòa sinh trưởng, các nghiệm thức atonik 2 ml/l và atonik 4 ml/l cho chỉ số SPAD cao và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại