nghiên cứu sử dụng các môi trường tế bào sơ cấp từ phôi vịt để phân lập virus viêm gan vịt và xác định kháng thể kháng virus

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG CÁC MÔI TRƯỜNG TẾ BÀO SƠ CẤP TỪ PHÔI VỊT ĐỂ PHÂN LẬP VIRUS VIÊM GAN VỊT VÀ XÁC ĐỊNH KHÁNG THỂ KHÁNG VIRU

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG CÁC MÔI TRƯỜNG TẾ BÀO

SƠ CẤP TỪ PHÔI VỊT ĐỂ PHÂN LẬP VIRUS VIÊM GAN VỊT

VÀ XÁC ĐỊNH KHÁNG THỂ KHÁNG VIRUS

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

LỚP: THÚ Y – K 35

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG CÁC MÔI TRƯỜNG TẾ BÀO

SƠ CẤP TỪ PHÔI VỊT ĐỂ PHÂN LẬP VIRUS VIÊM GAN VỊT

VÀ XÁC ĐỊNH KHÁNG THỂ KHÁNG VIRUS

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN THÚ Y

  

Đề tài: “Nghiên cứu sử dụng các môi trường tế bào sơ cấp từ phôi vịt để phân lập virus viêm gan vịt và xác định kháng thể kháng virus” do sinh viên Dương Duy Khánh thực hiện tại phòng thí nghiệm virus học, Bộ môn Thú y, Khoa

Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại học Cần Thơ, từ tháng 08 năm 2013 đến tháng 12 năm 2013

Cần thơ, ngày … tháng … năm 2013 Cần thơ, ngày … tháng … năm 2013

Duyệt của bộ môn Duyệt của giáo viên hướng dẫn

PGS.TS HỒ THỊ VIỆT THU

Cần thơ, ngày … tháng … năm 2013

Duyệt của Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ luận văn nào trước đây

Cần thơ, ngày … tháng … năm 2013

Tác giả luận văn

Dương Duy Khánh

LỜI CẢM TẠ

Con kính dâng luận văn này với lòng biết ơn vô hạn đến ba mẹ, người đã sinh thành dưỡng dục, suốt đời tận tụy vì con và luôn mong cho con công thành danh toại

Tôi xin tỏ lòng tri ân sâu sắc đến cô Hồ Thị Việt Thu, người đã hết lòng dìu dắt, truyền đạt nhiều kiến thức và kinh nghiệm quí báu cũng như giúp đỡ cho tôi về mọi mặt trong suốt quá trình thực hiện luận văn này

Tôi chân thành cảm ơn đến:

Cô Nguyễn Thị Bé Mười cố vấn học tập đã tận tình chỉ dạy và giúp đỡ tôi trong suốt những năm học vừa qua

Quý thầy cô Trường Đại học Cần Thơ, đặc biệt là thầy cô bộ môn Thú y và bộ môn Chăn nuôi thú y khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng đã tận tình giảng dạy và truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt những năm qua

Xin bày tỏ lòng biết ơn đến anh Lê Trần Hoài Khanh đã tận tình hướng dẫn và tạo điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Cám ơn tất cả các bạn lớp Thú Y K35 đã chia sẻ cùng tôi buồn vui trong quá trình học tập cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua Xin kính gởi đến quý thầy, cô, người thân, anh, chị, bạn bè tôi lời chúc sức khỏe, thành công và xin nhận nơi tôi lòng biết ơn sâu sắc

Cuối cùng tôi xin cảm ơn đến Hội Đồng Giám Khảo đã dành thời gian đọc, xem xét và đóng góp ý kiến quý báu cho đề tài tốt nghiệp của tôi

TÓM LƢỢC

Đề tài: “Nghiên cứu sử dụng các môi trường tế bào sơ cấp từ phôi vịt để phân

lập virus viêm gan vịt và xác định kháng thể kháng virus” do sinh viên Dương Duy Khánh thực hiện tại phòng thí nghiệm virus học, Bộ môn Thú y, Khoa

Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại học Cần Thơ, từ tháng 08 năm 2013 đến tháng 12 năm 2013 Trong đề tài này chúng tôi nghiên cứu phân lập virus viêm gan vịt trên một số môi trường tế bào sơ cấp từ phôi vịt qua các thí nghiệm sau: (i) tính chỉ số TCID50/0,1ml trên tế bào xơ phôi vịt (DEF - Duck Embryo Fibroblast), kết quả cho thấy ở độ pha loãng 10-4,74, 0,1ml huyễn dịch virus gây nhiễm 50% tế bào nuôi cấy và chúng tôi sử dụng liều pha loãng 100TCID50 để dùng trong các thí nghiệm sau; (ii) so sánh tính thích ứng của virus viêm gan vịt type 1 thông qua việc khảo sát thời gian trung bình tạo bệnh tích tế bào (CPE – Cytopathic Effect) đầu tiên trên từng loại tế bào, chúng tôi thu nhận kết quả sau, đối với tế bào xơ phôi vịt (DEF) là 39,13 giờ,

tế bào thận phôi vịt (DEK - Duck Embryo Kidney) là 35,38 giờ và tế bào gan phôi vịt (DEL - Duck Embryo Liver) là 31,63 giờ sau khi gây nhiễm virus; và

so sánh hiệu quả giữa hai loại thuốc nhuộm đều cho thấy khả năng quan sát các bệnh tích tế bào khi nhuộm crystal violet tốt hơn nhuộm neutral red; và (iii) phản ứng vi trung hòa được thực hiện trên ba loại tế bào phôi vịt với 1 mẫu huyết thanh âm tính, 2 mẫu huyết thanh miễn dịch và 4 mẫu huyết thanh kiểm tra Kết quả cho thấy mẫu huyết thanh âm tính và các mẫu huyết thanh kiểm tra đều xuất hiện bệnh tích tế bào, cho kết quả âm tính (hiệu giá kháng thể dưới 4log2) không có kháng thể hoặc có kháng thể với hàm lượng thấp Còn 2 mẫu huyết thanh miễn dịch đều cho kết quả dương tính với hiệu lượng kháng thể cao ≥ 4log2

MỤC LỤC

TRANG DUYỆT LUẬN VĂN i

LỜI CAM ĐOAN ii

LỜI CẢM TẠ iii

TÓM LƯỢC iv

MỤC LỤC v

DANH SÁCH BẢNG vii

DANH SÁCH HÌNH viii

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT ix

Chương 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 2 CƠ SỞ LÝ LUẬN 2

2.1 Tổng quan về nuôi cấy tế bào động vật 2

2.1.1 Đặc tính của tế bào động vật nuôi cấy 2

2.1.2 Các hình thức nuôi cấy tế bào động vật 2

2.1.3 Các giai đoạn phát triển của tế bào nuôi cấy 3

2.1.4 Các dòng tế bào nuôi cấy 3

2.1.5 Dụng cụ nuôi cấy tế bào 3

2.1.6 Một số môi trường nuôi cấy tế bào 4

2.1.7 Các biểu hiện bệnh tích tế bào dưới tác động của virus trong môi trường tế bào lớp đơn 5

2.1.8 Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 6

2.1.9 Đánh giá tình trạng nuôi cấy 6

2.1.10 Các vấn đề cần nuôi cấy trong tế bào động vật 7

2.2 Virus viêm gan vịt 7

2.2.1 Đặc điểm hình thái, cấu trúc và phân loại virus 7

2.2.2 Sức đề kháng của virus viêm gan vịt type 1 8

2.2.3 Cơ chế sinh bệnh của virus viêm gan vịt type 1 8

2.2.4 Đặc tính nuôi cấy virus viêm gan vịt type 1 9

2.2.5 Nuôi cấy tế bào phôi vịt 10

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11

3.1 Thời gian và địa điểm 11

3.1.1 Thời gian 11

3.1.2 Địa điểm 11

3.2 Vật liệu và hóa chất 11

3.2.1 Đối thượng thí nghiệm 11

3.2.2 Các dụng cụ và thiết bị thí nghiệm 11

3.2.3 Các hóa chất và môi trường 12

3.3 Nội dung nghiên cứu 13

3.4 Phương pháp nghiên cứu 13

3.4.1 Chuẩn độ và xác định liều gây nhiễm 50% tế bào nuôi cấy 13

3.4.2 So sánh tính thích ứng của chủng DHV-1 trên ba loại tế bào sơ cấp 14

3.4.3 Xác định kháng thể kháng DHV-1 trên môi trường tế bào qua phản ứng vi trung hòa 16

3.4.4 Phương pháp xử lý số liệu 18

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19

4.1 Kết quả thu nhận lớp tế bào DEF, DEK và DEL 19

4.2 Chuẩn độ virus 22

4.3 So sánh tính thích ứng của chủng DHV-1 trên ba loại tế bào sơ cấp 23

4.3.1 Thời gian trung bình xuất hiện CPE đầu tiên của ba loại tế bào 23

4.3.2 So sánh mức độ xuất hiện CPE trên từng loại tế bào thông qua nhuộm crystal violet và neutral red 25

4.4 Kết quả phản ứng vi trung hòa 28

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 31

5.1 Kết luận 31

5.2 Đề nghị 31

TÀI LIỆU THAM KHẢO 32

Phụ chương 1 CÁC QUY TRÌNH THÍ NGHIỆM 35

Phụ chương 2 XỬ LÝ SỐ LIỆU 37

Phụ chương 3 MỘT SỐ HÌNH ẢNH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI 45

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 4.1 Kết quả tỷ lệ CPE do DHV-1 gây ra theo nồng độ virus trên môi trường

tế bào DEF 22 Bảng 4.2 Thời gian xuất hiện CPE trung bình của ba loại tế bào sau khi gây nhiễm23 Bảng 4.3 So sánh hiệu quả quan sát CPE khi quan sát tươi, nhuộm Crystal violet và

Neutral red trên tế bào DEF 25 Bảng 4.4 So sánh hiệu quả quan sát CPE khi quan sát tươi, nhuộm Crystal violet và

Neutral red trên tế bào DEK 25 Bảng 4.5 So sánh hiệu quả quan sát CPE khi quan sát tươi, nhuộm Crystal violet và

Neutral red trên tế bào DEL 26 Bảng 4.6 Kết quả phản ứng vi trung hòa trên 3 loại tế bào 28

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1 Bình Roux (T-flask) 4

Hình 2.2 Đĩa microplate 4

Hình 2.3 Erlenmeyer 4

Hình 2.4 Spinner flask 4

Hình 2.5 Các môi trường nuôi cấy tế bào 5

Hình 3.1 Bố trí thí nghiệm chuẩn độ virus 14

Hình 3.2 Bố trí thí nghiệm so sánh hiệu quả sử dụng hai loại thuốc nhuộm trên hai loại tế bào 16

Hình 3.3 Bố trí thí nghiệm phản ứng vi trung hòa 17

Hình 4.1 Thời gian tạo lớp của tế bào DEF 20

Hình 4.2 Thời gian tạo lớp của tế bào DEK 20

Hình 4.3 Thời gian tạo lớp của tế bào DEL 21

Hình 4.4 Biểu đồ thời gian trung bình xuất hiện CPE đầu tiên 23

Hình 4.5 Tế bào tạo bệnh tích CPE đầu tiên sau khi gây nhiễm 24

Hình 4.6 Các biểu hiện CPE trên tế bào nhiễm DHV-1 khi quan sát tươi 27

Hình 4.7 Các biểu hiện CPE trên tế bào nhiễm DHV-1 khi nhuộm Crystal violet 27

Hình 4.8 Các biểu hiện CPE trên tế bào nhiễm DHV-1 khi nhuộm Neutral red 28

Hình 4.9 Kết quả phản ứng vi trung hòa trên tế bào 29

Hình 4.10 Kết quả phản ứng vi trung hòa qua nhuộm Crystal violet 29

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT

1 CPE Cytopathic Effect Bệnh tích tế bào

3 DEF Duck Embryo Fibroblast Tế bào xơ phôi vịt

4 DEK Duck Embryo Kidney Tế bào thận phôi vịt

5 DEL Duck Embryo Live Tế bào gan phôi vịt

6 DHV Duck Hepatitis Virus Vi rút viêm gan vịt

7 DMEM Dulbecco – Modified Eagle Medium

8 DPBS Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline

Solution

Muối đệm phosphate Dulbecco

9 EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid

10 EMEM Eagle Minimum Essential Medium

11 FBS Foetal Bovine Serum Huyết thanh bào thai bò

người

13 HEPES

Hydroxy-Ethyl-Piperazine-Ethane-Sulphonic acid

14 MEM Minimum Essential Medium Môi trường nuôi cấy tế bào

16 PD Proportional distance Khoảng cách tỷ lệ

18 TCID50 Tissue Culture Infective Dose 50 Liều gây chết 50%

19 UV Ultraviolet light Ánh sáng tia cực tím

Chương 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Tế bào là đơn vị cấu trúc và chức năng cơ bản của mọi cơ thể sống Các sinh vật đa bào được cấu tạo từ nhiều loại mô Các mô được cấu tạo từ những tế bào cùng loại Thuyết tế bào của Schleiden và Schwan (1938) đã mở ra khả năng nuôi cấy tế bào thực vật và động vật Từ đó, nhiều nhà khoa học đã có những nghiên cứu sâu về khả năng phát triển tế bào từ một tế bào gốc với mục đích cung cấp nguyên liệu cho các nghiên cứu sinh học, y học trong đó việc nuôi cấy virus trên mô tế bào là một thành tựu lớn trong nghiên cứu virus học Nhờ việc phát hiện ra phương pháp này mà công việc nghiên cứu virus đã được đẩy mạnh Đây là phương pháp được ứng dụng rất rộng rãi để phân lập

và chuẩn độ virus Ngoài ra, phương pháp này còn rất hiệu quả trong nghiên cứu các phản ứng huyết thanh và dùng để chế vaccine (Phạm Văn Ty, 2005) Hiện nay, bệnh viêm gan vịt do virus là bệnh truyền nhiễm cấp tính lây lan nhanh gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi vịt (Nguyễn Xuân Bình, 2002) Bệnh chủ yếu xảy ra ở vịt con 1-3 tuần tuổi với tỷ lệ chết cao từ 50-95%, có khi tới 100% Bệnh cũng có thể gặp vịt mới nở hoặc vịt 5-6 tuần tuổi (Hồ Thị Việt Thu và ctv) Virus viêm gan vịt hiện có 3 type: 1, 2 và 3 Type 1 phổ biến hơn cả Cho đến nay bệnh vẫn gia tăng, lưu hành ở nhiều địa phương trên khắp

cả nước, gây thiệt hại nặng nề về kinh tế cho người chăn nuôi

Mặc dù việc nghiên cứu các phương pháp phân lập và khống chế bệnh viêm gan vịt do virus đã nhiều trên môi trường tế bào tuy nhiên vẫn còn nhiều hạn

chế Từ nhu cầu thực tế trên chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu sử dụng

các môi trường tế bào sơ cấp từ phôi vịt để phân lập virus viêm gan vịt và xác định kháng thể kháng virus”

Mục tiêu đề tài:

Nghiên cứu loại môi trường tế bào sơ cấp phù hợp từ phôi vịt để phân lập virus viêm gan vịt và ứng dụng xác định kháng thể kháng virus trên môi trường tế bào

Chương 2 CƠ SỞ LÝ LUẬN 2.1 Tổng quan về nuôi cấy tế bào động vật

2.1.1 Đặc tính của tế bào động vật nuôi cấy

Tế bào động vật có tính cơ học yếu do chúng có kích thước tương đối lớn,

trung bình khoảng 10µm và không có thành tế bào Do đó, trong điều kiện in

vitro, tế bào động vật có thể vỡ bởi những tác động cơ học khi thay đổi môi

trường cho tế bào, tách tế bào,…(Phan Kim Ngọc và Phạm Văn Phúc, 2007) Hầu hết các loại tế bào động vật cần bám vào giá đỡ để sống và phân chia (trừ

tế bào máu và một số giai đoạn của tế bào sinh dục) Nếu tế bào bám dính vào

bề mặt nuôi cấy, chúng sẽ phát triển kéo dài trên bề mặt nuôi cấy và tế bào sẽ ngừng phát triển khi chúng hình thành lớp đơn liên tục trên bề mặt nuôi cấy (Phan Kim Ngọc và Phạm Văn Phúc, 2007)

Trong quá trình nuôi cấy, tế bào có thể bị tổn thương và chết hàng loạt bởi cơ chế ức chế kiềm hãm ngược bởi sản phẩm cuối (negative feed - back) Đây là

cơ chế ức chế sự tổng hợp và tiết ra ngoài một chất nào đó, được thực hiện bởi chính sự gia tăng nồng độ của chất này trong môi trường Do đó, sau một thời gian nuôi cấy cần thay đổi môi trường nuôi

Tế bào động vật có thể được bảo quản trong một thời gian dài bằng phương pháp làm lạnh sâu trong nitơ lỏng (-1960C) Khi giải đông và hoạt hóa, tế bào phục hồi khả năng tăng trưởng và phân chia như ban đầu

Do tế bào có khả năng phân chia và tốc độ phát triển chậm, kém thích nghi với môi trường, nên đa số tế bào động vật cần huyết thanh, hormone, để tăng trưởng và phân chia

2.1.2 Các hình thức nuôi cấy tế bào động vật

Nuôi cấy sơ cấp: Nuôi cấy sơ cấp là giai đoạn nuôi cấy đầu tiên của những tế

bào vừa được tách ra từ mô hay cơ quan (Phan Kim Ngọc, 2002) Việc nuôi cấy được thực hiện sau khi tách các tế bào từ mô bằng phương pháp cơ học hay phương pháp xử lý enzyme và có thể tăng trưởng trong môi trường thích hợp Đây là giai đoạn chọn lọc đầu tiên của quá trình nuôi cấy để thu được các dòng tế bào tương đối đồng dạng

Trong giai đoạn này, các tế bào dễ tách rời nhau, sống và bám vào cơ chất thành một lớp mỏng hoặc tồn tại được trong dịch huyền phù

Nuôi cấy thứ cấp: Khi những tế bào sơ cấp phát triển và làm đầy bề mặt bình

nuôi cấy, chúng cần được cấy chuyền để có bề mặt cho sự phát triển Các tế

bào được tách khỏi bình nuôi cấy bằng enzyme (thường là trypsin), enzyme này phá hủy cấu trúc protein gắn kết tế bào với bề mặt cơ chất Ngay sau khi tế bào được tách rời, enzyme được bất hoạt bằng môi trường nuôi cấy (có huyết thanh), huyền phù tế bào được chia nhỏ ra và cho vào bình nuôi cấy mới

2.1.3 Các giai đoạn phát triển của tế bào nuôi cấy

Giai đoạn thích nghi (lag phage): đây là giai đoạn đầu tiên, nó phụ thuộc rất

nhiều yếu tố như thành phần, mật độ, trạng thái ban đầu của tế bào Pha này xảy ra sớm, không tăng về số lượng tế bào (số lượng tế bào có thể giảm) Nếu mật độ và khả năng sống của tế bào nuôi cấy thấp thì pha này kéo dài hơn

Giai đoạn phát triển (log phage): sau khoảng thời gian nuôi cấy, số lượng tế

bào sẽ bắt đầu tăng lên nhanh chóng Trong chẩn đoán, thường sử dụng bình tế bào đã phủ 80% bề mặt bình (ở pha phát triển)

Giai đoạn ổn định (stationary phage): mật độ tế bào không tăng, số tế bào

chết bằng tế bào sinh trưởng Sự sinh trưởng của tế bào hạn chế do: hết dưỡng chất trong môi trường nuôi cấy, các sản phẩm của quá trình trao đổi chất có thể ức chế sự phát triển của tế bào, tế bào phủ kín trên chất nền nên không còn bám vào và không thể sinh sản được nữa

Giai đoạn suy giảm (decline phage): số lượng tế bào chết tăng nhanh, mật độ

tế bào giảm xuống (trích dẫn Nguyễn Ngọc Thanh Thảo, 2007)

2.1.4 Các dòng tế bào nuôi cấy

Dòng tế bào liên tục (continued cell line, established cell line): là dòng tế bào

được nuôi cấy qua nhiều thế hệ trong điều kiện in vitro và có thể duy trì sự

phân bào trong thời gian dài mà không thay đổi đặc tính Ví dụ: tế bào Vero (tế bào thận khỉ xanh Châu Phi), tế bào Hela (tế bào ung thư cổ tử cung người),…

Dòng tế bào giới hạn (Finite celle line, temporary cell line): là dòng tế bào chỉ

có khả năng sống trong điều kiện nuôi cấy giới hạn Ví dụ: tế bào tế bào xơ phôi gà (CEF - Chicken embryo fibroblast)

2.1.5 Dụng cụ nuôi cấy tế bào

Nuôi cấy lớp đơn (Monolayer culture): thường dùng các đĩa microplate, đĩa

petri, bình Roux (flask) Các dụng cụ được chọn tùy vào số lượng tế bào, bản chất môi trường nuôi cấy, giá thành và thói quen của người sử dụng

Nuôi cấy huyền phù (Suspension culture): nuôi cấy trong bình lắc Erlenmeyer

hoặc trong bình có cánh quạt xoay từ (Spinner flask) Trong đó, tế bào được giữ ở trạng thái huyền phù trong môi trường

2.1.6 Một số môi trường nuôi cấy tế bào

Môi trường MEM (Minimum Essential Medium): là môi trường cơ bản được

bổ sung muối Earle, các thành phần khác như amino acid không thiết yếu, Glutamine, vitamine đảm bảo cho sự phát triển của tế bào, cần bổ sung 5-10% huyết thanh vào môi trường

L-Môi trường E’MEM (Eagle Minimum Essential Medium): còn gọi là môi

trường tối thiểu do H.Eagle thiết lập, là môi trường chứa nồng độ cao các amino acid (không có L-Glutamine) và vitamine, chứa kháng sinh kanamycine, cần bổ sung thêm 5-10% huyết thanh khi nuôi cấy tế bào

Môi trường D’MEM (Dulbeco – Modified Eagle Medium): là môi trường

E’MEM do Dulbeco cải tiến với thành phần một amino acid cao gấp hai lần và

Spinner-Flasks.htm)

số vitamine cao gấp bốn lần, bổ sung thêm glucose để nuôi cấy được nhiều loại tế bào hơn

2.1.7 Các biểu hiện bệnh tích tế bào dưới tác động của virus trong môi trường tế bào lớp đơn

Virus gây nhiễm bệnh viêm gan vịt và đặc điểm gây nhiễm trên môi trường tế bào biểu hiện bệnh tích tế bào khi gây nhiễm virus

Sự nhân lên của virus làm cản trở chức năng bình thường của tế bào và gây ra những biến đổi kiểu hình (phenotypic changes) gọi là bệnh tích tế bào (CPE – cythopathic effect) Theo Cann (2005), các CPE có thể là:

Biến đổi hình dạng (altered shape): tế bào co tròn hoặc có hình tua

(tendril/dendric cell) do: (i) virus cản trở chức năng của bộ khung xương tế bào (cytoskeleton), là thành phần quan trọng duy trì hình thái tế bào và/ hoặc (ii) virus cảm ứng quá trình apoptosis của tế bào bị nhiễm

Hình 2.5 Các môi trường nuôi cấy tế bào

Bong tách khỏi lớp nền nuôi cấy (detachment from the subtrate): do sự phá vỡ

bộ xương tế bào

Ly giải (lysis): một khi tính toàn vẹn tế bào bị mất, tế bào có thể hấp thụ dịch

ngoại bào (extracellular fluid), trương phòng rồi vở ra, giải phóng các hạt viron và tiếp tục xâm nhiễm, phá vở các tế bào lân cận cho đến khi tạo vệt tan (plaque) trên thảm tế bào

Dung hợp màng (membrane fusion): tạo tế bào khổng lồ đa nhân – hợp bào

(syncytia or polykaryocyte, multinucleated giant cell) Các tế bào này chỉ sống trong thời gian ngắn (short - lived) rồi bị ly giải

Thể bao hàm (inclusion body): là vùng trong tế bào tập trung các virion

2.1.8 Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào

Nghiên cứu về sinh lý sinh hóa của tế bào động vật, tương tác giữa tác nhân gây bệnh và tế bào và những nghiên cứu về dinh dưỡng

Nuôi cấy tế bào ứng dụng trong định danh và phân lập virus, cách thức xâm nhập và phát triển trong cơ thể

Đánh giá hiệu quả sử dụng của các loại thuốc: các tế bào nuôi cấy được sử

dụng riêng và kết hợp với xét nghiệm in vitro để nghiên cứu hiệu quả của thực

phẩm, hóa chất tồn tại và phát triển các loại tế bào khác nhau

Cung cấp các hệ thống xét nghiệm để xác định phương pháp và thuốc thích hợp trong điều trị ung thư

Ứng dụng trong điều chế vaccine như: vaccine bại liệt, sởi, dại, trên người Vaccine gumburo, đậu gà, dịch tả vịt, trong chăn nuôi

2.1.9 Đánh giá tình trạng nuôi cấy

Đánh giá sự phát triển tốt của tế bào thường dựa trên 4 đặc điểm: hình thái, tỷ

lệ phát triển, năng suất che phủ và biểu hiện chức năng đặc biệt

Dựa vào hình thái học (hình dạng tế bào) là dễ xác định nhất và được theo dõi thường xuyên khi nuôi cấy nhưng rất khó đưa ra kết luận dựa vào những quan sát này Ngoài ra, đặc điểm này không thể hiện một số lượng hay đo lường chính xác nào

Khi quan sát dưới kính hiển vi và vi trường xấu thì thỉnh thoảng cho kết quả sai, nếu có nghi ngờ, có thể nhuộm bằng các thuốc nhuộm như neutral red (bắt màu lysosome)(Finter, 1969), crystal violet (bắt màu DNA trong nhân tế

bào)(Renault et al., 1991) (trích dẫn Hiến Thị Mỹ Trang, 2011)

Đếm tế bào để ước lượng số lượng tế bào, cho phép xác định tỷ lệ phát triển –

tỷ lệ này nhạy cảm với những thay đổi cơ bản của điều kiện nuôi cấy Dựa vào

đó để thiết lập các thí nghiệm xác định điều kiện (môi trường, chất nền, huyết thanh…) tốt hơn cho tế bào

Năng suất che phủ là phương pháp kiểm tra dựa trên số lượng nhỏ tế bào (từ

20 – 200) bám trên bình nuôi cấy và số lượng các cụm tế bào đặc trưng được xác định Phần trăm các cụm tế bào đặc trưng biểu hiện cho khả năng tồn tại, trong khi kích thước cụm tế bào đặc trưng cho tỷ lệ phát triển Phương pháp này tương tự phương pháp phân tích tỷ lệ phát triển, nhưng nhạy cảm hơn với

sự khác biệt nhỏ

2.1.10 Các vấn đề cần nuôi cấy trong tế bào động vật

Sự tạp nhiễm: có hai loại chính trong nuôi cấy tế bào là nhiễm hóa học và

nhiễm sinh học Nhiễm hóa học gây ra bởi các tác nhân như: endotoxin, ion kim loại hay thuốc tẩy hóa học rất khó phát hiện Nhiễm sinh học: nấm, vi khuẩn phát triển nhanh và thường có thể thấy trong nuôi cấy

Yêu cầu tránh sự tạp nhiễm: là đảm bảo vô trùng tốt ở nơi làm việc, môi

trường dụng cụ phải được tiệt trùng, cất giữ và sắp xếp hợp lý Sử dụng kháng sinh cẩn thận và có giới hạn trong nuôi cấy mô để tránh tạp nhiễm

2.2 Virus viêm gan vịt

2.2.1 Đặc điểm hình thái, cấu trúc và phân loại virus

Virus viêm gan vịt (DHV – Duck Hepatitis Virus) là một ARN virus rất nhỏ,

xuyên qua được màng lọc Beckfeld và Seitz (Levine và Fabricant, 1950); Theo Reuss (1959) dưới kính hiển vi điện tử virus là những hạt tròn bề mặt xù xì, không có vỏ bọc, kích thước từ 20 – 40nm, có 32 capxome

Có 3 type khác nhau: Virus viêm gan vịt type 1 (DHV-1), 2 và 3 Các type 2

và 3 được công nhận tồn tại riêng biệt và nó gây bệnh cho vịt con đã miễn dịch với type 1 (Nguyễn Đức Lưu và Vũ Như Quán, 2002)

Virus viêm gan vịt type 1: là một ARN virus không vỏ bao được xếp loại là

một Picornavirus, có kích thước khoảng 20-40nm Richter et al quan sát

mảnh gan dưới kính hiển vi điện tử khoảng 30nm (Woolcock và Fabricant, 1997)

Virus không gây ngưng kết hồng cầu gà, vịt, cừu, ngựa, chuột, rắn, heo (Nguyễn Đức Hiền, 2012)

Virus viêm gan vịt type 2: là một Astrovirus và có đường kính khoảng

28-30nm khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử Theo Tauraso et al đã nhận định

virus có kích thước dưới 50nm

Virus viêm gan vịt type 2 cũng được so sánh với Atrovirus phân lập từ gà và

gà tây bởi những nghiên cứu sự lây nhiễm và bảo vệ chéo cho thấy sự khác biệt kháng nguyên rõ ràng (Nguyễn Đức Hiền, 2012)

Virus viêm gan vịt type 3: chứa ARN, có đường kính 30nm, virus được phân

loại là Picornavirus nhưng không liên quan đến type 1 vì không có kháng

nguyên chung qua kiểm tra bằng kỹ thuật trung hòa virus và kháng thể quỳnh quang (Nguyễn Đức Hiền, 2012)

Virus kháng với chlorofrorm và pH = 3, nhưng cảm nhiễm khi nhiệt độ đến

500C khi có mặt của MgCl2 1M (Woolcock và Fabricant, 1997)

2.2.2 Sức đề kháng của virus viêm gan vịt type 1

Virus viêm gan vịt có sức đề kháng cao, không bị bất hoạt khi xử lý bằng ether hoặc fluorocarbon, chlorofrorm, trypsin và 30% methanol hoặc ammonium sulfate (Woolcock và Faricant, 1997)

Virus có thể tồn tại ở pH = 3 đến 9 giờ DHV tương đối ổn định ở nhiệt độ dưới 40 – 450C nhưng dể bị bất hoạt ở nhiệt độ cao hơn (Davis, 1987) Với nhiệt độ: Ở 500C virus chết sau 1 giờ, 600C chịu được 30 phút Ở 370C virus tồn tại 48 giờ, 40C trong 2 năm và -200C có thể tồn tại tới 9 năm

Trong chuồng trại ẩm ướt, trong phân vịt, virus có thể tồn tại 10 tuần Các chất sát trùng phải pha ở nồng độ cao và xử lý trong thời gian dài mới tiêu diệt được virus (Nguyễn Bá Hiên và Nguyễn Minh Tâm, 2007)

2.2.3 Cơ chế sinh bệnh của virus viêm gan vịt type 1

Virus xâm nhập vào cơ thể qua niêm mạc đường tiêu hóa, đường hô hấp hoặc qua vết thương rồi vào máu Virus theo máu đến các phủ tạng và tập trung nhiều nhất ở gan Dưới tác động của virus, quá trình trao đổi chất ở gan bị rối loạn, lượng glycogen ở gan giảm thấp, lượng lipit tăng do quá trình chuyển quá mỡ bị đình trệ Bởi vậy, vịt con mắc bệnh bị thiếu năng lượng và sức đề kháng bị giảm sút Virus phát triển trong gan, trực tiếp phá hoại tế bào gan và các tế bào nội mô huyết quản gây nên xuất huyết đặc hiệu Virus nhân lên trong gan, tại các tế bào thuộc hệ võng mạc nội mô như tế bào Kupffer, hình thành các thể bao hàm đặc trưng Tổ chức gan bị phá hoại, gan không giải độc được và con vật bị chết do bị ngộ độc (Phạm Sỹ Lăng và ctv, 2005)

2.2.4 Đặc tính nuôi cấy virus viêm gan vịt type 1

Nuôi cấy trên phôi trứng

Trên phôi vịt: Tiêm virus viêm gan vịt vào xoang niệu mô của phôi vịt 10-14

ngày tuổi, 24 – 72 giờ sau khi gây nhiễm phôi chết với bệnh tích: phôi còi cọc, xuất huyết dưới da đặc biệt ở vùng đầu, bụng, chân, phôi phù, gan sưng có màu đỏ hoặc hơi vàng, có thể có điểm hoại tử Ở những phôi chết muộn nước xoang niệu mô có màu xanh nhạt, bệnh tích rõ hơn

Trên phôi gà: Tiêm virus vào xoang niệu mô của phôi gà 9-10 ngày tuổi Ở lần

cấy chuyển virus đầu tiên, sau khi gây nhiễm 5-6 ngày cho tỷ lệ phôi chết 60%, phôi có bệnh tích còi cọc, phù phôi, xuất huyết dưới da (Levine và Fabricant, 1950)

10-Nuôi cấy trên môi trường tổ chức tế bào

Nuôi cấy virus trên tổ chức tế bào là một thành tựu lớn trong ngành virus học Phương pháp này là lấy một nhóm tế bào của người, hoặc động vật thích hợp, các tế bào sẽ sống và đang phân cắt Nếu cứ sau một thời gian lại rửa và thêm dung dịch dinh dưỡng mới thì tế bào sẽ phân cắt không ngừng và người ta dùng tế bào đó để nuôi cấy virus (Phạm Văn Kim, 2000)

Muốn có tế bào lớp đơn để nuôi cấy trước hết phải dùng trypsin phá vở mô liên kết gắn giữa các tế bào và tách chúng ra thành các tế bào riêng lẻ Sau đó

ly tâm với dung dịch muối đệm để loại trypsin, rồi đổ môi trường dinh dưỡng vào để nuôi tế bào Đem ủ ở nhiệt độ 370C, sau từ 3-7 ngày các tế bào sẽ mọc

và dính chặt vào đáy bình và tạo thành một lớp tế bào

Tùy thuộc vào từng loại virus, số lượng virus được cấy và loại virus tế bào nuôi cấy mà thời gian nhân lên của virus có khác nhau, nói chung là 2-10 ngày Có thể dùng kính hiển vi quan sát các bệnh tích tế bào (CPE) do virus gây ra để phát hiện sự nhân lên của virus trong tế bào (Phạm Văn Ty, 2005)

Có thể nuôi cấy DHV trên môi trường tế bào xơ phôi gà, xơ phôi vịt và thận phôi vịt Virus gây bệnh tích tế bào, thể hiện ở một số điểm: nhân tế bào co tròn, nguyên sinh chất đông đặc, tế bào tan vỡ hoàn toàn (Nguyễn Bá Hiên và Nguyễn Minh Tâm, 2007)

Nuôi cấy trên động vật cảm thụ

Ngày nay tùy từng loại virus mà người ta chọn các động vật thích hợp để nuôi cấy virus Tùy thuộc vào tính chất gây bệnh của virus và mục đích nghiên cứu

mà ta lựa chọn đường tiêm vào cơ quan của con vật cho thích hợp (Nguyễn

Văn Kim, 2000)

Đối với virus viêm gan vịt có thể nhân lên tốt trên cơ thể vịt 6 - 7 ngày tuổi Tiêm vịt con ở lứa tuổi này sẽ phát ra giống như bệnh có trong tự nhiên (Nguyễn Bá Hiên và Nguyễn Minh Tâm, 2007)

2.2.5 Nuôi cấy tế bào phôi vịt

Theo Maiboroda (1972), sự xuất hiện CPE đầu tiên là các tế bào co tròn sau 8 giờ gây nhiễm DHV-1

Trên tế bào xơ phôi vịt và thận phôi vịt khi gây nhiễm DHV sự thay đổi bệnh

lý cũng được quan sát bởi Hwang (1965; 1966) Các bệnh tích đặc trưng bởi

sự thoái hóa và hoại tử của tế bào lớp đơn Các bệnh lý thường thấy rõ từ 24

đến 36 giờ sau khi gây nhiễm (Fitzgerald el al., 1963)

Theo Hwang (1966), tế bào gan được lấy từ phôi vịt 20 ngày tuổi và mật độ nuôi cấy là 5.105 tế bào/ml Sự nhân giống DHV trên nuôi cấy tế bào thận phôi

vịt đã được kiểm tra trong một nghiên cứu cho phù hợp trong hệ thống in

vitro, trong đó DHV cho hiệu giá cao kèm với thay đổi bệnh lý tế bào quan sát

được trong chuẩn độ virus và kháng huyết thanh Theo Woolcock (1989), khi gây nhiễm trên tế bào gan phôi vịt xảy ra các bệnh tích tế bào co tròn và hoại

tử

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm

Huyết thanh điều tra (thu từ các đàn vịt trên địa bàn tỉnh Trà Vinh)

Huyết thanh âm tính (Navetco)

3.2.2 Các dụng cụ và thiết bị thí nghiệm

Dụng cụ

Kéo lớn, kéo nhỏ, kẹp

Phểu lọc thủy tinh, vải gạc

Đĩa petri đường kính 9-10cm

Becher nhỏ 20-50ml, 250ml

Ống đong các loại

Ống ly tâm falcon loại 15ml

Lame và lamelle, các tube nhỏ (Eppendorf)

Đầu lọc 0,22µm, 0,45µm (Milipore filter)

Ống nghiệm, cá từ

Pipette 1ml, 2ml, 5ml, pipetteman, micropipette, pipette-aid

Đầu cone 100µl, 1ml

Đĩa nuôi cấy microplate 96 giếng (Nunc A/S, Denmark)

Buồng đếm Neubauer (Haematocytometer, Marienfeld, Germany)

Thiết bị

Máy ảnh kỹ thuật số SONY

Máy ấp trứng (Dengenkiki Co., Ltd)

Tủ cấy vô trùng (Bio Clean Bench, SANYO Electric Biomedical Co., Ltd) Water bath (As One, Japan)

Cân phân tích (Sartorius AG, Germany)

Máy hấp autoclave (Sturdy Industrial Co., Ltd)

Tủ sấy (Memmert GmbH + Co.KG)

Nước cất vô trùng, nước muối sinh lý

Trypsine (Difco, USA)

EDTA (Dojindo Co., Ltd)

Đệm DPBS (-) (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd)

Trypan blue (Wako Pure Chemical Industries, Ltd)

Neutral red (Division of the Matheson Company, Inc.)

Crystal violet (Kanto Chemical Co, Inc.)

Formalin

Môi trường MEM (Gibco BRL., Grand Land, NY, USA)

Penicillin và Streptomycin (Invitrogen, UK)

Kháng nấm Amphotericin-B (Sigma)

Glutamine (Wako Pure Chemical Industries, Ltd)

HEPES 1M

NaHCO3 7%

Môi trường tăng trưởng: môi trường EMEM + 10%FBS + Glutamine 3% + HEPES 1M + NaHCO3 7% + 100 IU/ml Penicillin + 100 µg/ml Streptomycin + Amphotericin-B 2,5µg/ml

Môi trường duy trì: môi trường EMEM + 5% FBS + Glutamine 3% + HEPES 1M + NaHCO3 7% + 100 IU/ml Penicillin + 100 µg/ml Streptomycin + Amphotericin-B 2,5µg/ml

Môi trường pha loãng virus: EMEM + Glutamine 3% + HEPES 1M + NaHCO3 7% + 100 IU/ml Penicillin + 100 µg/ml Streptomycin + Amphotericin-B 2,5µg/ml

3.3 Nội dung nghiên cứu

Chuẩn độ và xác định chỉ số TCID50 trên tế bào DEF

So sánh tính thích ứng của chủng DHV-1 trên ba loại tế bào sơ cấp

Xác định hiệu giá kháng thể kháng DHV-1 qua phản ứng vi trung hòa trên môi trường tế bào

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Chuẩn độ và xác định liều gây nhiễm 50% tế bào nuôi cấy

Nguyên tắc: Dựa trên đặc tính gây bệnh tích của virus cho tế bào, chuẩn độ

virus được xác định qua chỉ số TCID50/0,1ml, là sự pha loãng virus tới nồng

độ thấp nhất tạo bệnh tích cho 50% giếng tế bào nuôi cấy trong môi trường Quy trình chuẩn độ virus được thực hiện qua 3 bước:

- Thu nhận virus từ huyễn dịch bệnh phẩm (phụ chương 1.3)

- Hoạt hóa, nhân số lượng virus qua cấy truyền virus 3-5 lần trên tế bào DEF (phụ chương 1.4)

- Chuẩn độ virus (phụ chương 1.5)

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được tiến hành trên 2 đĩa 96 giếng Virus viêm

gan vịt type 1 được pha loãng theo log10 từ 10-1 đến 10-8 Mỗi độ pha loãng được lặp lại 24 lần trên 24 giếng tế bào

Hình 3.1 Bố trí thí nghiệm chuẩn độ virus

Với 2 độ pha loãng cho tỷ lệ trên 50% và dưới 50% giếng DEF, ta tiến hành xác định chỉ số TCID50/ml theo phương pháp Reed và Muench (1938):

Khoảng cách tỷ lệ PD (Proportional distance) (khoảng cách tỷ lệ giữa 2 độ pha loãng cho tỷ lệ xuất hiện CPE>50% và tỷ lệ xuất hiện CPE<50%)

PD =

lg TCID50/0,1ml = lg CPE<50% + PD

3.4.2 So sánh tính thích ứng của chủng DHV-1 trên ba loại tế bào sơ cấp

Nguyên tắc: Dựa vào đặc tính của DHV-1 gây bệnh tích trên ba loại tế bào qua

thời gian và mật độ CPE trên từng loại tế bào Tế bào nào có mật độ CPE cao thì tính thích ứng của DHV-1 đối với tế bào đó cao

3.4.2.1 Phương pháp nhuộm bằng neutral red

- Dùng micropipette hút bỏ môi trường duy trì trong các giếng chứa tế bào đã nhiễm virus viêm gan vịt và cho biểu hiện bệnh lý tế bào ổn định

- Rửa tế bào có virus bằng đệm DPBS (đĩa 96 giếng: 100µl)

- Rút đệm ra, cho vào 0,4ml dung dịch neutral red (32µg/ml) 1:2000 ở các giếng

- Ủ đĩa mocroplate 2 giờ trong tủ ấm CO2 (370C, 5%CO2)

- Đem đĩa đã ủ và rửa 2 lần với nước muối 0,85%

- Úp ngược đĩa để khô và quan sát kết quả (Finter, 1969)

3.4.2.2 Phương pháp nhuộm tế bào bằng crystal violet

- Loại môi trường duy trì ra khỏi các giếng bằng micropipette

- Rửa nhẹ tế bào hấp thụ virus 1-2 lần bằng dung dịch đệm DPBS (giữ lạnh) (đĩa 96 giếng: 200µl)

- Hút bỏ DPBS rồi cố định bằng methanol (hoặc formalin) trong 10 phút (giữ lạnh) (đĩa 96 giếng: 50µl)

- Loại methanol (hoặc formalin), cho vào dung dịch crystal violet 0,5% (đĩa 96 giếng: 50µl) phủ bề mặt giếng Để nhiệt độ phòng 10-50 phút

- Rút bỏ thuốc nhuộm rồi dùng nước cất rửa 2 lần các giếng đến khi nước trong Tránh làm bong tróc tế bào

- Lật úp đĩa cho khô trên khăn giấy ở nhiệt độ phòng và quan sát kết quả

nhuộm (Renault et al., 1991)

3.4.2.3 Bố trí thí nghiệm

Mục tiêu thí nghiệm: Xác định thời gian xuất hiện CPE đầu tiên do DHV-1

gây ra trên 3 loại tế bào (DEF, DEK và DEL) và so sánh mức độ xuất hiện CPE trên từng loại tế bào thông qua nhuộm crystal violet và neutral red

Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được thực hiện trên 48 giếng cho mỗi loại tế bào

trên 3 đĩa 96 giếng với mật độ tế bào 5.105 tế bào/ml, môi trường E’MEM Mỗi giếng được đưa vào liều 100TCID50 và theo dõi cho đến khi có biểu hiện CPE ổn định, sau đó đem nhuộm

Các chỉ tiêu theo dõi

Thời gian xuất hiện CPE đầu tiên của các giếng tế bào

Khả năng bắt màu của tế bào sống

Mức độ gây bệnh tích tế bào (CPE)

3.4.3 Xác định kháng thể kháng DHV-1 trên môi trường tế bào qua phản ứng vi trung hòa

Nguyên lý: Trên các đối tượng nuôi cấy như phôi vịt, động vật cảm thụ, môi

trường tế bào, virus sẽ nhân lên và gây bệnh tích Còn khi hỗn hợp virus với huyết thanh miễn dịch đặc hiệu thì virus sẽ bị trung hòa, không nhân lên được

và không gây bệnh tích

Mục tiêu thí nghiệm: Đánh giá khả năng trung hòa DHV-1 của các mẫu huyết

thanh miễn dịch và điều tra trên 3 loại tế bào

Chuẩn bị thí nghiệm

Môi trường tế bào đã tạo lớp trên 90% (được chuẩn bị ở trên)

Pha DHV-1 với môi trường E’MEM không huyết thanh liều 100TCID50 trong 100µl dịch virus

Mẫu huyết thanh âm tính (-) (Navetco)

Mẫu huyết thanh miễn dịch (lấy từ vịt đã được gây nhiễm virus) và huyết thanh kiểm tra lấy từ thực địa (các đàn vịt tại tỉnh Trà Vinh)

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được tiến hành trên 3 đĩa 96 giếng lần lượt là 3

loại tế bào DEF, DEK và DEL Mỗi nồng độ huyết thanh được pha loãng theo

cơ số 2 từ 1/2, 1/4 đến 1/4096 Thí nghiệm sử dụng 1 mẫu huyết thanh đối chứng âm, 2 mẫu huyết thanh miễn dịch lấy từ vịt đã nhiễm virus và 4 mẫu huyết thanh kiểm tra được bố trí như hình 3.3

Tế bào

DPBS

DPBS

Nhuộm Neutral red Nhuộm Crystal violet DPBS

Hình 3.2 Bố trí thí nghiệm so sánh hiệu quả sử dụng hai loại thuốc nhuộm

trên ba loại tế bào

Hình 3.3 Bố trí thí nghiệm phản ứng vi trung hòa

Ghi chú:

HT(-): huyết thanh vịt âm tính với kháng thể kháng DHV-1

HTMD 1, 2: huyết thanh miễn dịch được lấy sau 7 ngày gây nhiễm virus cho vịt con 14 ngày tuổi liều

10 4 TCID 50 /0,5ml

HT 1, 2, 3, 4: các mẫu huyết thanh lấy từ 4 đàn vịt tại tỉnh Trà Vinh

Phương pháp vi trung hòa được tiến hành theo Woolcock (1989):

Phản ứng vi trung hòa được thực hiện trên ba loại tế bào DEF, DEK và DEL Pha loãng bậc 2 mỗi mẫu huyết thanh (huyết thanh đã bất hoạt bằng Water bath) bằng môi trường BME (Eagle’s basal medium) cho vào 50µl mỗi giếng

và cho tiếp vào 100TCID50 DHV-1 trong 50µl/giếng, ủ hổn hợp ở 370C trong

1 giờ

Tế bào đã tạo lớp, bổ sung thêm 10% tryptose phosphate, 2mM L- glutamine, 0,17% sodium bicarbonate và 2-4% huyết thanh bào thai bò (FBS)

Sau khi ủ hỗn hợp huyết thanh và virus rút 100µl cho vào mỗi giếng tế bào sau

đó ủ trong thời gian 96 giờ ở 370

C, 5% CO2 Sau khi ủ, các tế bào được cố định bằng 10% formol-buffered saline và nhuộm với 1% crystal violet Quan sát bằng mắt thường khả năng bắt màu và dưới kính hiển vi soi ngược

Hoạt động trung hòa virus được thể hiện ở độ pha loãng cao nhất của huyết thanh mà tại đó lớp tế bào đơn vẫn còn, tức là, không có xuất hiện CPE và lúc

đó đã xảy ra hiện tượng trung hòa virus

Hiệu giá kháng thể dưới 4log2 (độ pha loãng huyết thanh ở 1/16) được coi là

âm tính

1 32

1 64

1 128

1 256

1 512

1 1024

1 2048

1 4096 1