ảnh hưởng của thời gian tồn trữ lên mức độ nhiễm vi sinh vật và thành phần hóa học của một số loại thức ăn chăn nuôi

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNGTRẦN NGỌC THÔNG ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN TỒN TRỮ LÊN MỨC ĐỘ NHIỄM VI SINH VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA MỘT SỐ LOẠI THỨC ĂN CHĂN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

TRẦN NGỌC THÔNG

ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN TỒN TRỮ LÊN MỨC ĐỘ NHIỄM VI SINH VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA MỘT

SỐ LOẠI THỨC ĂN CHĂN NUÔI

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

NGÀNH: THÚ Y

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

NGÀNH: THÚ Y

ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN TỒN TRỮ LÊN MỨC ĐỘ NHIỄM VI SINH VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA MỘT

SỐ LOẠI THỨC ĂN CHĂN NUÔI

Giáo viên hướng dẫn:

Lớp: Thú Y – K35

Cần Thơ, 2013

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN THÚ Y

Đề tài: “Ảnh hưởng của thời gian tồn trữ lên mức độ nhiễm vi sinh vật và

thành phần hóa học của một số loại thức ăn chăn nuôi”, được thực hiện bởi

sinh viên Trần Ngọc Thông tại phòng thí nghiệm Vệ Sinh Thực Phẩm, Bộ Môn

Thú Y và phòng thí nghiệm Dinh Dưỡng Thức Ăn, Bộ Môn Chăn Nuôi, KhoaNông Nghiệp và SHƯD, trường Đại học Cần Thơ từ tháng 08 năm 2013 đến 12

năm 2013

Cần Thơ, ngày….tháng… năm 2013

Duyệt Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng

Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2013

Duyệt Bộ Môn

Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2013

Duyệt Giáo viên hướng dẫn

Lưu Hữu Mãnh Nguyễn Nhựt Xuân Dung

LỜI CẢM TẠ

Đầu tiên tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Cha Mẹ - người đã sinh ra tôi, vất

vã nuôi dưỡng, dạy dỗ, chịu nhiều gian khó, luôn động viên và tạo điều kiệntốt nhất cho tôi thực hiện và hoàn thành đề tài này

Xin chân thành cảm ơn Thầy Lưu Hữu Mãnh, Cô Nguyễn Nhựt Xuân Dung,Thầy Nguyễn Thanh Lãm đã hết lòng hướng dẫn, quan tâm và truyền đạtnhững kinh nghiệm quý báu để tôi hoàn thành tốt đề tài này Thầy Cô luôn làtấm gương sáng, là nguồn động lực rất lớn cho tôi phấn đấu, học hỏi và noitheo để trở thành người có ích cho xã hội

Xin chân thành cảm ơn Cô cố vấn học tập Nguyễn Thị Bé Mười cùng QuýThầy Cô Bộ môn Thú y và Bộ môn Chăn nuôi đã truyền đạt những kiến thức

và kinh nghiệm quý báu cho tôi trong những năm học vừa qua

Tôi xin chân thành cảm ơn anh Nguyễn Thanh Phi Long, Tạ Trung Linh, TrầnThanh Hải, Nguyễn Thanh Duy, Nguyễn Văn Thịnh và chị Ngô Thị MinhSương cùng các anh em ở công ty TNHH Nhất A đã tạo điều kiện thật tốt đểtôi hoàn thành đề tài

Chân thành cám ơn các Bạn lớp Thú y K35 và các Em lớp Chăn nuôi – Thú yK37 đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian tiến hành thí nghiệm

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến Hội Đồng Giám Khảo đã dành thời gianđọc và xem xét đề tài tốt nghiệp này

TÓM LƯỢC

Đề tài: “Ảnh hưởng của thời gian tồn trữ lên mức độ nhiễm vi sinh vật

và thành ph ần hóa học của một số loại thức ăn chăn nuôi” được tiến hành

với mục tiêu khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian lên mức độ nhiễm vi sinh và thành phần hóa học của 7 loại mẫu bao gồm: bắp (An Giang), bắp (Đắc Lắc), cám gạo, bã khoai mì, bánh dầu đậu nành, bột xương thịt (Đức), bột xương thịt (Cộng Hòa Séc) được tiến hành phân lập vi sinh vật và phân tích thành phần hóa học ở 3 thời điểm tồn trữ mẫu: ngày 0, ngày 15 và ngày 30 Kết quả nghiên cứu như sau:

Tất cả các mẫu đều nhiễm VKHK với mức độ tăng dần theo thời gian Trong đó, mẫu bánh dầu đậu nành nhiễm VKHK với mật độ cao nhất (ở ngày

0 là 1200x10 2 CFU/g, sau đó tăng lên 1600x10 2 , 2114x10 2 CFU/g tương ứng ở ngày 15 và 30); mẫu bột xương thịt (Đức) nhiễm VKHK với mật độ thấp nhất (ở ngày 0 là 2,60x10 2 , sau đó tăng lên 9,30x10 2 , 17,2x10 2 CFU/g tương ứng ở ngày 15 và 30) Mẫu bắp (Đắc Lắc) và bã khoai mì nhiễm Coliforms với mật

độ rất thấp và tăng dần theo thời gian tồn trữ Vi khuẩn E coli không nhiễm vào các mẫu thí nghiệm.

Về dưỡng chất: mẫu bắp (An Giang) bị ảnh hưởng bởi thời gian tồn trữ như DM (P<0,01), ở ngày 0 hàm lượng DM là 87,58 sau đó tăng lên 88,15%

ở ngày 30; CP (P<0,01), hàm lượng CP ở ngày 0 là 6,65 đến ngày 30 tăng lên 7,04% Bột xương thịt (Đức) cũng bị ảnh hưởng bởi thời gian tồn trữ như CP (P<0,01), ở ngày 0, hàm lượng CP là 36,22 sau đó giảm xuống 36,17% ở ngày 30; Ca (P<0,01), ở ngày 0, hàm lượng Ca là 12,99 sau đó giảm xuống 11,47 và 10,98 ở ngày thứ 15 và 30; Phospho (P<0,01), ở ngày 0 hàm lượng phospho là 10,26 và tăng lên 11,70% ở ngày 15 Bột xương thịt (Cộng Hòa Séc) có hàm lượng phospho bị ảnh hưởng bởi thời gian tồn trữ (P=0,04), ở ngày 0, hàm lượng phospho là 9,95 sau đó tăng lên 10,73 và 11,34% ở ngày

15 và 30.

Từ khóa: thực liệu thức ăn chăn nuôi, mức độ nhiễm vi sinh, thành phần hóa học, thời gian tồn trữ.

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân Tất cả các sốliệu, kết quả được trình bày trong thí nghiệm hoàn toàn trung thực và chưatừng được ai công bố trong bất kỳ tạp chí khoa học hay luận văn khác

Nếu có gì sai trái tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước Khoa và Bộ Môn

Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2013

Sinh viên thực hiện

Trần Ngọc Thông

MỤC LỤC

LỜI CẢM TẠ i

TÓM LƯỢC ii

LỜI CAM ĐOAN iii

MỤC LỤC iv

DANH SÁCH HÌNH vi

DANH SÁCH SƠ ĐỒ vii

DANH SÁCH BẢNG viii

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT ix

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 2 CƠ SỞ LÝ LUẬN 2

2.1 Một số vi sinh vật nhiễm vào thực liệu thức ăn chăn nuôi 2

2.1.1 Tổng số vi sinh vật hiếu khí (VKHK) 2

2.1.2 Coliforms 2

2.1.3 Vi khuẩn Escherichia coli (E coli) 2

2.2 Tình hình thực liệu thức ăn bị vấy nhiễm vi khuẩn E coli 4

2.4 Một số loại thực liệu thức ăn dùng trong chăn nuôi 5

2.4.1 Bắp 5

2.4.2 Tấm gạo 5

2.4.3 Cám gạo 6

2.4.4 Bã khoai mì 6

2.4.5 Bột xương thịt 7

2.4.6 Bột cá 7

2.4.7 Đậu nành và bánh dầu đậu nành 8

2.4.8 Khô dầu dừa 8

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10

3.1 Phương tiện nghiên cứu 10

3.1.1 Thời gian thực hiện 10

3.1.2 Địa điểm thực hiện 10

3.1.3 Đối tượng nghiên cứu 10

3.1.4 Dụng cụ và trang thiết bị 10

3.1.5 Hóa chất và môi trường 10

3.2 Phương pháp tiến hành thí nghiệm 11

3.2.1 Phương pháp lấy mẫu 11

3.2.2 Phương pháp phân tích thành phần hóa học của thực liệu thức ăn 11

3.2.5 Phương pháp phân tích các chỉ tiêu vi sinh vật 13

3.3 Xử lý thống kê 19

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20

4.1 Ảnh hưởng của thời gian tồn trữ lên mức độ nhiễm vi sinh của thực liệu thức ăn chăn nuôi 20

4.1.1 Bắp 20

4.1.2 Cám gạo 23

4.1.3 Bã khoai mì 23

4.1.4 Bánh dầu đậu nành 23

4.1.5 Bột xương thịt 24

4.2 Ảnh hưởng của thời gian tồn trữ lên thành phần hóa học của thực liệu thức ăn chăn nuôi 24

4.2.1 Bắp 24

4.2.2 Cám gạo 27

4.2.3 Bã khoai mì 28

4.2.4 Bánh dầu đậu nành 29

4.2.4 Bột xương thịt 30

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 33

5.1 Kết luận 33

5.2 Đề nghị 33

TÀI LIỆU THAM KHẢO 34

PHỤ CHƯƠNG

DANH SÁCH HÌNH

Hình 4.1 So sánh mức độ nhiễm VKHK và Coliforms của 2 loại bắp qua các

thời gian tồn trữ 20Hình 4.2 So sánh mức độ nhiễm VKHK giữa các loại thức ăn năng lượng quacác thời gian tồn trữ 23Hình 4.3 So sánh sự ảnh hưởng của thời gian lên mức độ nhiễm VKHK của 2loại bột thịt xương qua các thời gian tồn trữ 24Hình 4.4 So sánh sự thay đổi của DM và CP của hai loại bắp theo thời gian

tồn trữ 26Hình 4.5 So sánh năng lượng giữa các loại thức ăn qua các thời gian tồn trữ 29Hình 4.6 Ảnh hưởng của thời gian tồn trữ lên hàm lượng DM và CP của hai

loại bột thịt xương qua các thời gian tồn trữ 30Hình 4.7 So sánh hàm lượng CP giữa các loại thức ăn qua thời gian tồn trữ 31

DANH SÁCH SƠ ĐỒ

Sơ đồ 3.1 Cách pha loãng mẫu 13

Sơ đồ 3.2 Quy trình định lượng tổng số vi khuẩn hiếu khí 14

Sơ đồ 3.3 Quy trình định lượng Coliforms 15

Sơ đồ 3.4 Quy trình định lượng vi khuẩn E coli 17

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 4.1 Tình hình nhiễm VKHK, Coliforms và E coli trong nguyên liệu thức

ăn chăn nuôi theo thời gian tồn trữ .21

Bảng 4.2 Mật độ VKHK và Coliforms trong thực liệu thức ăn chăn nuôi theo

thời gian tồn trữ .22Bảng 4.3 Ảnh hưởng của thời gian dự trữ lên thành phần hóa học (%) và năng

lượng của bắp 25Bảng 4.4 Ảnh hưởng của thời gian dự trữ lên thành phần hóa học (%) và năng

lượng của cám gạo 27Bảng 4.5 Ảnh hưởng của thời gian dự trữ lên thành phần hóa học (%) và năng

lượng của bã khoai mì 28Bảng 4.6 Ảnh hưởng của thời gian dự trữ lên thành phần hóa học (%) và năng

lượng của bánh dầu đậu nành 29Bảng 4.7 Ảnh hưởng của thời gian dự trữ lên thành phần hóa học (%) và nănglượng của bột xương thịt 32

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngành chăn nuôi nước ta phát triển ngày càng mạnh để đáp ứng nhu cầutiêu dùng trong nước và xuất khẩu Theo Cao Đức Phát (2011) tỷ trọng ngànhchăn nuôi trong nông nghiệp năm 2010 đạt từ 27 đến 28%, chăn nuôi heochiếm 45 đến 50% và gia cầm chiếm 30 đến 35% trong cơ cấu ngành Tuynhiên ngành chăn nuôi nước ta trong những năm gần đây gặp rất nhiều khókhăn, nhiều dịch bệnh nguy hiểm xảy ra như heo tai xanh, lở mồm lông móng,dịch tả, cúm gia cầm, Gumboro, … bên cạnh đó giá các loại nguyên liệu thức

ăn tăng mạnh trong đó chi phí thức ăn chiếm 70% tổng chi phí sản xuất nhưnggiá sản phẩm lại giảm làm người chăn nuôi không có lãi thậm chí bị lổ vốn.Ngày nay, nhiều quy trình kỹ thuật mới được áp dụng rộng rãi trong chănnuôi nhằm rút ngắn thời gian và giảm chi phí sản xuất Đồng thời để có thểđứng vững trong tình hình khó khăn hiện nay đòi hỏi nhà chăn nuôi phải cónhiều chiến lược mới, trong đó việc sử dụng thức ăn tự phối trộn là xu hướngđang rất được quan tâm đặc biệt là ở các trại chăn nuôi hiện nay nhằm giảmgiá thành sản phẩm Điều này đã đặt ra cho chúng ta một vấn đề là làm thế nào

để chất lượng thức ăn được tốt cả về mặt vi sinh vật và hàm lượng dưỡng chấtnhằm đảm bảo sức khỏe và khả năng sinh trưởng tốt của vật nuôi

Các loại nguyên liệu thức ăn có thể bị vấy nhiễm nhiều loại vi sinh vật

gây bệnh đặc biệt là vi khuẩn Escherichia coli, bệnh tiêu chảy do E coli làm

giảm khả năng chuyển hóa thức ăn, heo chậm lớn và có thể gây chết 100% ởheo con sơ sinh (Hồ Thị Việt Thu, 2012)

Xuất phát từ những vấn đề trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Ảnh hưởng

của thời gian tồn trữ lên mức độ nhiễm vi sinh vật và thành phần hóa học của một số loại thức ăn chăn nuôi”

CHƯƠNG 2 CƠ SỞ LÝ LUẬN2.1 Một số vi sinh vật nhiễm vào thực liệu thức ăn chăn nuôi

2.1.1 Tổng số vi sinh vật hiếu khí (VKHK)

Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn tăng trưởng và hình thành khuẩn lạctrong điều kiện có sự hiện diện của oxy phân tử Tổng số vi khuẩn hiếu khíhiện diện trong thực phẩm chỉ thị ở mức độ vệ sinh an toàn thực phẩm (LưuHữu Mãnh, 2007)

Vi khuẩn hiếu khí được chia làm 2 nhóm:

Nhóm vi khuẩn ưa nhiệt phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 37oC và khôngphát triển ở nhiệt độ thấp khoảng 1oC

Nhóm vi khuẩn ưa lạnh có thể phát triển ở nhiệt độ 0oC nhưng khôngsinh trưởng ở nhiệt độ 20oC và nhiệt độ tối ưu đối với vi khuẩn này khoảng từ

0oC – 15oC

2.1.2 Coliforms

Coliforms là những trực khuẩn gram âm không sinh bào tử, hiếu khí hoặc

kỵ khí tùy ý Coliforms hiện diện rộng rãi trong tự nhiên, trong ruột người và động vật Nhóm Coliforms gồm có 4 giống là Escherichia coli với một loài duy nhất là E.coli, Citrobacter, Klebslella và Enterobacter Coliforms được

xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị Số lượng hiện diện của chúng trong thựcphẩm, nước hay trong các loại mẫu môi trường được dùng để chỉ thị khả nănghiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng

khi số lượng của Coliforms trong thực phẩm cao thì khả năng hiện diện của vi sinh vật gây bệnh khác cũng rất cao Coliforms được chia thành 2 nhóm là Coliforms chịu nhiệt và Coliforms phân Coliforms chịu nhiệt là những Coliforms có khả năng lên men lactose sinh hơi trong vòng 24 giờ khi được ủ

ở 44oC trong môi trường Electrical Conductivity Borth Coliforms phân là Coliforms chịu nhiệt có khả năng sinh Indole khi được ủ ở 44,5oC trong môi

trường canh Trypton Coliforms phân là một thành phần của hệ vi sinh vật

đường ruột ở người và động vật máu nóng khác Vì vậy, chúng được sử dụng

để chỉ thị mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản, vận chuyển thựcphẩm cũng như chỉ thị sự ô nhiễm phân trong mẫu môi trường (Trần LinhThước, 2006)

2.1.3 Vi khuẩn Escherichia coli (E coli)

2.1.3.1 Đại cương về vi khuẩn Escherichia coli

Escherichia coli được gọi tên là E coli thuộc họ Enterobacteriaeceae

được bác sĩ người Đức là Theodor Esherich phân lập đầu tiên và đưa ra đặc

điểm của vi khuẩn vào năm 1885 E coli là loài quan trọng được tìm thấy trong phân Năm 1940 người ta đã tìm thấy những serotype của E coli gây ra

một trận dịch tiêu chảy nặng bộc phát ở bệnh viện Từ đó serotype được xem

là phương pháp tốt nhất để xác định E coli gây bệnh, những E coli này được gọi là Enteropathogenic E coli (EPEC) (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977).

E coli thường xuất hiện rất sớm bên trong đường ruột của người và động vật

sơ sinh (sau đẻ 2 giờ) chúng thường ở phần sau của ruột, ít ở dạ dày hay ruộtnon Trong nhiều trường hợp chúng được tìm thấy ở niêm mạc của nhiều bộphận khác nhau trong cơ thể (Nguyễn Như Thanh, 1997) Trong các vi khuẩn

đường ruột loài Escherichia coli là loài phổ biến nhất, chúng sinh sống bình

thường trong đường ruột của người và động vật Khi sức đề kháng của con vậtsuy yếu do thời tiết, thức ăn thay đổi hay điều kiện nuôi dưỡng chăm sóc và vệ

sinh thú y kém thì E coli trở nên cường độc và có khả năng gây bệnh.

2.1.3.2 Đặc điểm hình thái cấu tạo

E coli là trực khuẩn có hình gậy ngắn, kích thước 2 – 3 m x 0,6m

Phần lớn E coli di động do có lông ở xung quanh, một số không di động Vi

khuẩn không xin nha bào, có thể có giáp mô Thân được bao phủ bởi protein

có chức năng bám dính và giúp cơ thể di động E coli bắt màu gram âm, có thể

bắt màu đều hoặc xẫm ở hai đầu, khoảng giữa nhạt Nếu cố định bằng acid

osmic rồi quan sát dưới kính hiển vi thấy tế bào E coli có nhân, đó là một

khối tối nằm trong nguyên sinh chất màu sáng (Nguyễn Như Thanh, 1997)

2.1.3.3 Đặc điểm nuôi cấy

E coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, một số còn phát triển ở môi trường tổng hợp đơn giản E coli là trực khuẩn

hiếu khí và yếm khí tùy tiện, có thể sống được ở nhiệt độ từ 5 – 40oC, nhiệt độthích hợp là 37oC, pH thích hợp là 7,2 – 7,4; phát triển được ở pH 5,5 – 8,0(Lưu Hữu Mãnh, 2009)

Môi trường nước thịt vi khuẩn phát triển tốt, môi trường rất đục, có cặnmàu tro lắng xuống đáy, đôi khi có màu xám nhạt trên mặt môi trường, môitrường có mùi phân thối (Nguyễn Như Thanh, 1997)

Trong những điều kiện thích hợp E coli phát triển rất nhanh Trên môi

trường NA (Nutrient Agar), TSA (Tripticase Soy Agar) qua 18 – 24 giờ ủ ở

37oC hình thành những khuẩn lạc tròn ướt, màu trắng nhạt, mặt khuẩn lạc hơilồi, đường kính 2 – 3mm (Nguyễn Vĩnh Phước, 1970)

Trên môi trường MC (MacConkey agar) vi khuẩn hình thành khuẩn lạc

to, tròn, đều, màu hồng cánh sen hoặc hồng đậm đến đỏ, mặt khuẩn lạc hơi lồi,kích thước 2 – 3mm

Trên môi trường EMB (Eosin methyl blue) khuẩn lạc E coli to, tròn, hơi

lồi, bóng, màu thẫm tím, có ánh kim

Một số hóa chất ức chế sự phát triển của E coli như chlorine và dẫn xuất

của nó, muối mật

2.1.3.4 Đặc điểm sinh hóa

E coli lên men có sinh hơi glucose, galactose, lactose, maltose,

aribinose, xylose, mannitol, fructose,… không sinh H2S, hoàn nguyên nitratethành nitrite, không sử dụng urea, không sử dụng citrate làm nguồn cung cấp

carbon Tất cả vi khuẩn E coli đều lên men đường lactose nhanh và lên men

glucose sinh hơi, đây là một đặc điểm quan trọng, người ta dựa vào đó để phân

biệt E coli và Salmonella (Nguyễn Như Thanh, 1997).

Dùng các phản ứng IMViC (Indole – Methyl red – Voges proskauer –

Citrate) để phân biệt E coli với các vi khuẩn đường ruột khác.

-Phản ứng Indole dương tính (+)

-Phản ứng MR (Methyl red) dương tính (+)

-Phản ứng VP (Voges – proskauer) âm tín (–)

-Phản ứng Citrate âm tính (–)

2.2 Tình hình thực liệu thức ăn bị vấy nhiễm vi khuẩn E coli

Theo Nguyễn Thúy Nga (2006) tỷ lệ nhiễm E coli trên thức ăn gia súc là

18,69% Trong đó tỷ lệ nhiễm trên bột cá là cao nhất (37,50%) kế đó thức ănđậm đặc 25% và thức ăn hỗn hợp 15,19% Trương Phước Đức (2010) tỷ lệ

nhiễm E coli trên thức ăn trên máng ăn của gà là 53,33% Nguyễn Văn Hiệp (2000) tỷ lệ nhiễm E coli trên thức ăn gà công nghiệp là 11,11%.

Theo Costa et al (2007) tỷ lệ nhiễm E coli trên thức ăn gà là 50% và trên nguyên liệu thức ăn gà là 32% Beilei (2013) tỷ lệ nhiễm E coli trên nguyên liệu thức ăn gà là 39,3% Dargatz et al (2005) tỷ lệ nhiễm E coli trên nguyên liệu thức ăn là 48,2% Lynn et al (1998) tỷ lệ nhiễm E coli trong thức

ăn gia súc là 30%

Theo Stotzky (1997) nguyên liệu thức ăn có nguồn gốc thực vật bị nhiễm

vi sinh vật từ bụi do gió, mưa to và đất bị xáo trộn bởi máy móc trong suốtthời gian thu hoạch Đất bị xáo trộn là môi trường sống cho cả vi sinh vật hiếu

khí và kị khí Bakken (1997 ) cho rằng vi sinh vật chiếm ưu thế trong đất là vikhuẩn gram âm Multon (1988) côn trùng đặc biệt là động vật chân đốt và ve

Arachnid gieo rắc vi sinh vật trên bề mặt ngũ cốc trước khi thu hoạch và trong

khi lưu trữ Ruồi và gián là nguồn chứa mầm bệnh trong môi trường có thể

gây nhiễm vi sinh vật cho thức ăn (Maciorowski et al., 2004).

Một số loại vi sinh vật gây bệnh có thể tồn tại trong thức ăn Chúng làmgiảm pH của thức ăn (thức ăn dự trữ, thức ăn ủ chua) hoặc làm khô thức ăn(ngủ cốc, bột thịt), vì vậy có thể kéo dài thời gian lưu trữ thức ăn

(Maciorowski et al., 2006).

2.4 Một số loại thực liệu thức ăn dùng trong chăn nuôi

2.4.1 Bắp

Bắp là nguồn cung cấp thức ăn năng lượng chủ yếu trong chăn nuôi ở

nước ta Theo Dương Thanh Liêm và ctv (2002) nguyên nhân giúp bắp có giá

trị năng lượng cao là do ngô có hàm lượng chất béo khoảng 4% trong khi hầuhết các loại hạt cốc khác có hàm lượng béo thấp Dầu bắp chứa nhiều acid béochưa no thiết yếu Các acid này quan trọng trong trao đổi chất của động vật vàđược tiết ra trong các nang lông nên giúp thú nhất là heo có lớp da bóng vàlông mướt

Theo Lã Văn Kính (2003) vật chất khô của bắp là 87,30%, protein thô8,4%, chất béo 3,98%, xơ thô 2,34%, canxi 0,1%, phospho 0,3% và nănglượng trao đổi dao động từ 3.296 – 3.404 kcal/kg

Bắp vàng có nhiều xantophyll (1kg ngô chứa 13,67mg xantophyll) là sắc

tố nhuộm màu chủ yếu của lòng đỏ trứng gà, mỡ và da gà Ngoài ra bắp cònchứa nhiều acid linoleic đây là nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến kích thướctrứng của gà mái đẻ (Tôn Thất Sơn, 2005)

Trong khẩu phần cho heo, gà bắp thường được dùng với tỷ lệ 60 – 70%.Tuy nhiên, do chất béo trong bắp chứa nhiều acid béo không no nên làm mỡmềm, nên cần cho ăn ở mức thấp hơn ở cuối kì vỗ béo

2.4.2 Tấm gạo

Tấm gạo là những mảnh gạo nhỏ vỡ ra từ hạt gạo nguyên trong quá trìnhxay xát Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng củ tấm gần tương đươnggạo, giàu năng lượng (3.340 kcal ME/kg), ít xơ (0,9%) Hàm lượng proteincủa tấm gạo dao động trong khoảng 6,73 – 12,49%, nhưng mức trung bìnhthường là 9 – 10% Nếu chỉ sử dụng tấm gạo là nguồn cung cấp năng lượngchính trong khẩu phần cho gà đẻ sẽ dễ dẫn đến hiện tượng lòng đỏ trứng và da

gà bị trắng nhợt nhạt, vậy cần bổ sung sắc tố tạo màu hoặc thưc ăn giàucarotene như bột cỏ, bột lá sắn (Lã Văn Kính, 2003).

2.4.3 Cám gạo

Cám gạo là phụ phẩm của lúa khi xay xát Lượng cám thu được bìnhquân là 10% khối lượng lúa Tùy theo lượng trấu còn lẫn trong cám ít haynhiều mà cám được phân làm cám loại I và loại II Ngoài ra còn có cám lau làphụ phẩm của việc lau bóng gạo cho xuất khẩu nhưng cám lau khó sử dụngtrong thức ăn công nghiệp do độ ẩm cao, rất mau đóng vón, ôi và làm hư hỏng

các dưỡng chất khác trong thức ăn (Dương Thanh Liêm và ctv., 2002).

Cám gạo là một loại thức ăn giàu vitamin nhóm B Tỷ lệ protein trongcám gạo mịn từ 12 – 14%, chất béo 12 – 14% (các acid béo trong dầu cám chủyếu là không no, nên dễ bị oxy hóa, làm giảm giá trị dinh dưỡng và tính ngonmiệng của gia súc, do vậy không nên dự trữ cám quá 15 ngày), xơ thô khoảng

7 – 8% và giá trị năng lượng có thể đạt 2600 – 2700 kcal ME/kg

Theo Lã Văn Kính (2003) vật chất khô của cám gạo là 88,91%, proteinthô 11,90%, béo thô là 11,68%, dẫn xuất không đạm 48,93%, xơ thô 8,36%,canxi 0,27%, phospho 1,20% và ME dao động từ 2.481 – 2.501 kcal/kg

Trong cám gạo có chứa 5,1% acid phytic Trong khẩu phần ăn có nhiềucám gạo thì dễ gây cho gia súc bị bệnh parakeratosis do acid phytic kết hợpvới kẽm tạo thành phytat kẽm không hấp thu được và thải ra ngoài làm cho gia

súc thiếu kẽm (Tôn Thất Sơn, 2005) Theo Dương Thanh Liêm và ctv (2002)

cám gạo chứa nhiều phospho dưới dạng phytin cao sẽ ức chế tiêu hóa cácdưỡng chất như protein, acid amin và các loại vi khoáng như kẽm

Tỷ lệ dùng cho gà 25% khẩu phần, cho heo 30 – 40% khẩu phần

2.4.4 Bã khoai mì

Củ khoai mì thường được dùng để sản xuất tinh bột chất lượng cao, dùvậy củ vẫn được sử dụng cho bò, heo và gia cầm ăn dưới dạng khô hoặc tươi.Thường dùng nhất là ở dạng xắt lát hoặc khúc phơi khô, khi dùng đem nghiềnthành bột

Theo Dương Thanh Liêm và ctv (2002) bột khoai mì có hàm lượng

protein rất thấp (2,5%) nên thường chỉ dùng trong thức ăn heo thịt nhưng hạnchế dùng cho heo ở giai đoạn cuối vì heo sẽ tích lũy nhiều mỡ, quày thịt cómàu đỏ nhạt làm giảm giá trị thương phẩm của thịt heo

Theo Lã Văn Kính (2003) vật chất khô của bã khoai mì là 86,34%,protein thô 1,98%, béo thô 1,02%, xơ thô 8,06%, dẫn xuất không đạm 73,52%,canxi 0,32%, phospho 0,06% và năng lượng trao đổi từ 1.967 – 2.544 kcal/kg.Một số giống khoai mì cao sản có chứa hàm lượng HCN (acidcyanhydric) rất cao trong lá và củ khoai mì HCN trong khoai mì dưới dạngglycoside, khi tiêu hóa các glycoside bị enzyme phân hủy tạo thành gốc CN-(cyanide) tự do rất độc với sự hô hấp tế bào Các biện pháp xử lý như ngâmnước, phơi nắng, sấy sẽ làm gốc CN- bay hơi, giảm bớt độc tính (Dương

Bột xương thịt Mông Cổ: protein thô 27 – 28%, canxi 4%, phot pho 2%,

2000 – 2200 kcal ME/kg

Theo Lã Văn Kính (2003) vật chất khô của bột xương thịt là 95,36%,protein thô 55,18%, béo thô 10,05%, canxi 9,60%, phospho 4,65% và nănglượng trao đổi từ 2.749 - 3040 kcal/kg

Theo Viện Chăn nuôi (1998) vật chất khô của bột xương thịt là 91,68%,protein thô 42,71%, béo thô 2,69%, tro 39,76%, canxi 14,04%, phospho6,53% và ME 2.133 kcal/kg

Bột xương thịt cũng như các sản phẩm được chế biến từ động vật phảiđược xử lý nhiệt hợp lý để tránh mầm bệnh còn hiện diện Trước đây mầm

bệnh được quan tâm nhiều là Salmonella nhưng ngày nay bệnh bò điên là mối

quan tâm hang đầu vì nó rất dễ lây lan qua các sản phẩm động vật Vì vậy hiệnnay xu hướng các nước Châu Âu hạn chế hoặc ngừng hẳn việc sử dụng bộtxương thịt trong khẩu phần ăn động vật (Nguyễn Duy Hoan, 2010)

2.4.6 Bột cá

Bột cá là nguồn thức ăn protein động vật có chất lượng rất tốt được dùngrộng rãi cho gia cầm trên toàn thế giới Protein bột cá có chất lượng cao vì rất

giàu lysine, methionine, tryptophan và các acid amin không thay thế khác (LãVăn Kính, 2003).

Thành phần dinh dưỡng của bột cá phụ thuộc vào loại cá, công nghệ chếbiến và hãng sản xuất Nhưng nói chung bột cá tốt có hàm lượng protein thô từ

55 – 65%, lysine 4,8 – 5,2%, methionine 1,6 – 1,8%, canxi 5%, phospho tổng

số hấp thụ 2,5%, béo 6 – 7%, độ ẩm 9% Bột cá dễ hút ẩm, dễ nhiễm khuẩn

đặc biệt là E coli và Salmonella gây bệnh tiêu hóa nguy hiểm Bột cá có mùi

tanh, nên khi gia cầm ăn thức ăn hỗn hợp chúa nhiều bột cá sẽ gây mùi tanhcủa cá trong trứng, thịt làm giảm chất lượng Vì vậy không nên cho tỷ lệ bột

cá quá cao trong khẩu phần (không quá 15%) và trước khi giết thịt 3 – 5 ngàykhông nên cho gia cầm ăn bột cá (Bùi Đức Lũng và Lê Hồng Mận, 1999)

2.4.7 Đậu nành và bánh dầu đậu nành

Đậu nành và bánh dầu đậu nành là loại thức ăn cung cấp đạm được xếpvào loại hạng nhất trong các loại thức ăn cung cấp đạm thực vật trên thế giớicũng như trong nước

Thành phần dinh dưỡng của đậu nành hạt: protein thô 36 – 39%, chất béo14% (trong chất béo này có nhiều acid béo thiết yếu acid linoleic, acidlinolenic), xơ 3,7%, canxi 0,3%, phospho hữu dụng 0,21%, năng lượng traođổi 3.380 – 3.400 kcal/kg (Bùi Đức Lũng và Lê Hồng Mận, 1999) Hàm lượnglysine trong đậu nành rất cao vì vậy giá trị sinh học của đậu nành cũng cao.Đậu nành tương đối nghèo methionine, một số tài liệu cho rằng nó có chứachất kháng giáp trạng thiocianat gây ảnh hưởng đến hoạt động của cáchocmon do tuyến giáp trạng tiết ra Đậu nành khi rang, xử lý nhiệt có mùithơm kích thích tính thèm ăn của gia cầm Gia cầm ăn ngô và đậu tương thìchất lượng thịt thơm ngon hơn ăn những loại thức ăn khác Trong hạt đậutương sống có chất kháng men tiêu hóa (antitrypsine) và men urease, chúngđều bị tiêu hủy ở 105 – 110oC trong 10 – 30 phút

Bánh dầu đậu nành là loại thức ăn cung cấp đạm phổ biến hiện nay, nóchứa hàm lượng protein cao từ 42 – 45% đồng thời nó đảm bảo acid amin vànăng lượng có giá trị sinh học cao và cân đối Theo Bùi Đức Lũng và Lê HồngMận (1999) thành phần dinh dưỡng của khô dầu đậu tương: protein thô từ 44đến 47%, béo thô 1,1 – 2%, xơ thô 5 – 6%, canxi 0,3%, phospho hữu dụng0,29 – 0,3%, 2.250 – 2.850 kcal ME/kg

Tỷ lệ dùng: gà con và gà nuôi thịt 15 – 20% khẩu phần

2.4.8 Khô dầu dừa

Cùi dừa là phần thịt dừa khô được lấy ra sau khi đã bỏ vỏ và gáo dừa, có

chứa khoảng 65% dầu Cùi dừa gồm 2 phần: phần thịt và phần vỏ bọc Phần

vỏ bên ngoài cùi dừa thường khá cứng, màu nâu, bề mặt thô, ráp; còn phần thịtcùi dừa màu trắng đục, nhiều dầu Sau khi được ép dầu phần còn lại của cùidừa là khô dầu dừa, thường có màu nâu nhạt hoặc nâu sậm, gồm các mãnhkhông đều, khô, dầy, giòn, mùi khét Khô dầu dừa loại tốt thường có: proteinthô 17 – 18%, béo 9%, xơ 14 – 15% Tỷ lệ khô dầu dừa không nên vượt quá5% trong khẩu phần gà đẻ (Lã Văn Kính, 2003)

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Thời gian thực hiện

Đề tài được thực hiện từ tháng 8 năm 2013 đến tháng 12 năm 2013

3.1.2 Địa điểm thực hiện

Địa điểm lấy mẫu: tại Công Ty TNHH Nhất A, ấp 1, xã Thường Tân,huyện Tân Uyên, tỉnh Bình Dương

Địa điểm phân tích mẫu: phòng thí nghiệm Vệ Sinh Thực Phẩm, Bộ MônThú Y và phòng thí nghiệm Dinh Dưỡng Gia Súc, Bộ Môn Chăn Nuôi, KhoaNông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ

3.1.3 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu thực liệu thức ăn chăn nuôi đươc lấy tại Công Ty TNHH Nhất A,huyện Trảng Bom, tỉnh Đồng Nai bao gồm 7 loại mẫu: bắp (An Giang), bắp(Đắc Lắc), cám gạo (Sóc Trăng), bã khoai mì (Trảng Bom), bánh dầu đậunành (Argentina), bột xương thịt (Đức) và bột xương thịt (Cộng Hòa Séc)

Máy chưng cất đạm, máy đo quang phổ, bộ Soxhlet

Cân điện tử, ống nghiệm, đĩa petri, ống hút, ống đong, cốc thủy tinh, ốngnhỏ giọt, phểu, kẹp, dao, kéo, que cấy, đèn cồn, bếp điện, bếp chưng cáchthủy, túi nylon, giấy lọc

3.1.5 Hóa chất và môi trường

3.1.5.1 Hóa chất

Nước cất, Natri Chlorua, cồn 96o, cồn 90o, cồn 70o, H2O2 30%, ether,thuốc thử Methyl Red (MR), Bromocresol Green, thuốc thử Kovac’s, VogesProskauer, phenolphthalein 0,1%, dihydroxylamin HCl 5%, fluorexone vàTrilon B

-Acid boric 2%, acid ascorbic, H2SO4 98%, H2SO40,765N, H2SO40,1N

-NaOH 40%, NaOH 33%, NaOH 25%, NaOH 15%, KOH 20%

-Hexaamonium heptamolybdate tetrahydrate (NH4)6MO7O24.4H2O),Kaliumantimon (III) oxid – tartrat hemihydrate reinst psstasium antimong III(K(SbO)C4H4O6.0.5H2O).

3.1.5.2 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật

Nutrient Agar (NA), Brilliant – green 2% – Bile Broth (BGBL), VioletRed Bile Agar (VRBL), MR – VP Broth, Voges Proskauer Semisolid Medium(VP), Simmons Citrate Agar (SCA), Buffered Pepton Water (BPW), MC(MacConkey Agar), KIA (Kligler Iron Agar)

3.2 Phương pháp tiến hành thí nghiệm

3.2.1 Phương pháp lấy mẫu

Mẫu được chứa trong bao, lấy mẫu ở 3% số bao của lô hàng Tại mỗi baođược chỉ định lấy mẫu tiến hành lấy mẫu ở giữa bao Dùng ống xông (sende)đặt lòng máng úp xuống dưới và ấn vào bao, sau đó quay ngược ống xông lên

và rút ra Để cho thực liệu không trào ra ở vị trí ấn ống xông, dùng mũi ốngxông tải đều sợi đan bao lại

Mẫu được kiểm tra vi sinh vật gồm: tổng số vi khuẩn hiếu khí, Coliforms

và E coli Ở 3 thời điểm là: ngày 0 (ngày lấy mẫu), ngày 15 và ngày 30 (thời

gian trữ mẫu ở nhiệt độ phòng thí nghiệm sau 15 và 30 ngày)

Mẫu được phân tích hàm lượng dưỡng chất gồm: vật chất khô (DM),protein thô (CP), béo thô (EE), xơ thô (CF), tro, canxi (Ca) và phospho (P)cũng ở 3 thời điểm như trên

3.2.2 Phương pháp phân tích thành phần hóa học của thực liệu thức ăn

Các phương pháp dưới đây được tham khảo theo tài liệu của Lưu HữuMãnh và Nguyễn Nhựt Xuân Dung, năm 2008

3.2.4.1 Phương pháp xác định hàm lượng nước ở trạng thái gần khô

Dùng sức nóng để làm bay hết hơi trong mẫu Cân trọng lượng mẫutrước và sau khi sấy khô, từ đó tính ra phần trăm nước có trong mẫu

Hàm lượng nước được tính bằng cách lấy trọng lượng mẫu trước khi sấytrừ trọng lượng mẫu sau sấy

3.2.4.2 Phương pháp xác định hàm lượng khoáng tổng số

Mẫu thức ăn sau khi thiêu cháy ở nhiệt độ cao 550 – 600oC chất hữu cơ

sẽ bị hủy hết, chất còn lại là tro thô (khoáng tổng số)

Hàm lượng tro được xác định bằng cách lấy trọng lượng mẫu trước khinung trừ cho trọng lượng mẫu sau nung.

3.2.4.3 Phương pháp xác định hàm lượng protein thô (CP)

Phương pháp Kjeldahl là phương pháp tiêu chuẩn dùng để xác định hàmlượng nitrogen Phương pháp gồm 3 bước:

Mẫu được vô cơ hóa bằng acid đậm đặc (H2SO4 98%) đun nóng với sự

có mặt của chất xúc tác (H2O2 30%) để gia tăng vận tốc phản ứng, nitrogentrong protein bị phân giải thành NH3.

NH3lập tức biến thành (NH4)2SO4.

Tác dụng với base mạnh (NaOH 33%), NH3 lại được giải phóng khỏidung dịch acid Căn cứ vào lượng acid đã tiêu hao để trung hòa NH3, ta sẽ tínhđược lượng NH3 từ đó tính được lượng nitrogen tổng số và suy ra lượngprotein thô

Hàm lượng protein thô được xác định như sau:

25 6

%

%CP Nx

3.2.4.4 Phương pháp xác định hàm lượng canxi (Ca)

Phương pháp xác định complexon của Ca với chất chỉ thị fluorexonedựa vào sự hình thành trong môi trường kiềm một phức hợp của ion và trilon

B (Na2 – KDTA: muối dinatri của acid ethylene diamintetracetic complexonIII) Chất chỉ thị kim loại fluorexone có màu hồng, trong môi trường basemạnh (pH = 13) cùng với các ion Ca++nó tạo ra phức chất fluorexon hóa (màulục huỳnh quang), trilon B có thể loại Ca++ra khỏi phức hợp với fluorexon làmmất màu lục khi chuẩn độ

3.2.4.5 Phương pháp xác định hàm lượng phospho (P)

Dùng phương pháp so màu cho kết quả nhanh và độ chính xác cao.Trong môi trường acid ascorbic phản ứng với ammonium phosphate cho raphức hợp có màu xanh dương, phản ứng hoàn tất nhanh và tương đối bền Somàu sau 5 phút ở bước sóng 720nm

3.2.4.6 Phương pháp xác định hàm lượng béo thô (EE)

Chất béo bị hòa tan trong dung môi hữu cơ (ether ethylic) Ngoài chấtbéo hòa tan, trong dung môi còn có các chất tương tự như sáp, hắc ín,phosphatid, các sắc tố, … cho nên chất béo nhận được gọi là “béo thô”

Cả ether và mẫu phải khô để tránh sự kết hợp giữa nước và các thànhphần khác trong mẫu như carbohydrate, urea, lactic acid, glycerol, …

3.2.4.7 Phương pháp xác định hàm lượng xơ thô (CF)

Mẫu được xử lý lần lượt bằng H2SO4 và base loãng được đun nóng Sau

Acid và base có thể hòa tan được một phần chất khoáng

Cồn hòa tan những chất hữu cơ tan trong dung môi và chất béo còn lại.Hàm lượng xơ thô được xác định bằng cách lấy trọng lượng trước khinung trừ cho trọng lượng sau nung

3.2.5 Phương pháp phân tích các chỉ tiêu vi sinh vật

3.2.5.1 Phương pháp đồng nhất và pha loãng mẫu

Cân chính xác 1 gram mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước muốisinh lý vô trùng đã chuẩn bị trước, đồng nhất mẫu ta sẽ được dung dịch huyềnphù có độ pha loãng là 10-1 so với ban đầu Dung dich mẫu đồng nhất tiếp tụcđược pha loãng theo dãy thập phân

Tiếp tục hút 1ml ở ống nghiệm thứ nhất cho vào ống nghiệm thứ hai cóchứa sẵn 9ml nước muối sinh lý vô trùng, trộn đều bằng Vortex Độ pha loãngcủa mẫu lúc này là 10-2 Cứ tiếp tục như vậy để có mẫu ở các độ pha loãng

10-3, 10-4, 10-5…

3.2.5.2 Phương pháp xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí

Định lượng tổng số vi khuẩn hiếu khí bằng phương pháp đếm khuẩn lạctheo tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN 4884 – 2005)

Cách tiến hành: sau khi pha loãng mẫu, chọn 2 nồng độ liên tiếp, mỗinồng độ chan lên 2 đĩa NA, dùng que chan chan đều trên mặt thạch, lật ngượcđĩa lại, ủ trong tủ ấm ở 37oC trong 24 giờ

Cách tính kêt quả: đếm tất cả những khuẩn lạc mọc trên mặt thạch, chọnnhững đĩa có số khuẩn lạc từ 25 – 300

Công thức tính:

C A

-A: Tổng số vi khuẩn hiếu khí trong 1 gram mẫu (CFU/g)

-C: số khuẩn lạc đếm được trong các đĩa ở 2 nồng độ pha loãng liên tiếp

-n1: số đĩa ở nồng độ pha loãng thứ nhất đếm được

-n2: số đĩa ở nồng độ pha loãng thứ hai đếm được

-d: nồng độ pha loãng thứ nhất đếm được

-V: lượng mẫu cấy

Sơ đồ 3.2 Quy trình định lượng tổng số vi khuẩn hiếu khí

3.2.5.3 Phương pháp định lượng Coliforms

Định lượng Coliforms bằng phương pháp đếm khuẩn lạc theo tiêu chuẩn

Cách tiến hành: sau khi pha loãng mẫu, chọn 2 nồng độ liên tiếp, mỗinồng độ chan lên 2 đĩa môi trường VRBL, dùng que chan chan đều lên mặtthạch, lật ngược đĩa lại, ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ Trên môi

trường VBRL khuẩn lạc Coliforms có 2 dạng: điển hình và không điển hình,

khuẩn lạc điển hình có màu đỏ ánh tía, đường kính 0,5mm hoặc lớn hơn, đôikhi có vùng mật tủa hơi đỏ bao quanh Chọn 5 khuẩn lạc không điển hình cấylên môi trường BGBL trong ống nghiệm có Durham, ủ ở nhiệt độ 37oC trong

24 giờ, khẳng định Coliforms khi có bọt khí xuất hiện sau khi ủ.

Sơ đồ 3.3 Quy trình định lượng Coliforms

Cách tính kết quả: chọn các đĩa petri có số khuẩn lạc từ 10 – 150, trên

mỗi đĩa số khuẩn lạc Coliforms điển hình được tính theo công thức:

N=Ađh + Akđh x RTrong đó:

-N: số khuẩn lạc trên đĩa

-Ađh: số khuẩn lạc điển hình đếm được

-Akđh : số khuẩn lạc không điển hình đếm được

-R: tỷ lệ dương tính của khuẩn lạc không điển hình

Coliforms dương tính

Ống Durham

có sinh khí

Môi trườngBGBL đụcBGBL có ống Durham

Khuẩn lạc không điển hình

Đếm khuẩn lạc

Khuẩn lạc Coliforms điển hình

24h

VRBL0,1mlDung dịch pha loãng

Mẫu

37oC

24h

37oC

Công thức tính tổng số Coliforms trong 1 gram mẫu:

C A

1 ,

-A: Tổng số Coliforms trong 1 gram mẫu (CFU/g)

-C: số khuẩn lạc đếm được trong các đĩa ở 2 nồng độ pha loãng liên tiếp

-n1: số đĩa ở nồng độ pha loãng thứ nhất đếm được

-n2: số đĩa ở nồng độ pha loãng thứ hai đếm được

-d: nồng độ pha loãng thứ nhất đếm được

-V: lượng mẫu cấy

3.2.5.4 Định lượng Escherichia coli

a Định lượng E coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc.

Cách tiến hành: sau khi pha loãng mẫu, chọn 2 nồng độ liên tiếp, mỗinồng độ chan lên 2 đĩa MacConkey, dùng que chan chan đều lên mặt thạch, lậtngược đĩa lại, ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ Trên môi trường

MacConkey vi khuẩn E coli hình thành khuẩn lạc to, tròn, màu hồng tím sen

hoặc hồng đậm đến đỏ, mặt khuẩn lạc hơi lồi, kích thước 2 – 3mm

1 ,

-A: Tổng số vi khuẩn E coli trong 1 gram mẫu (CFU/g)

-C: số khuẩn lạc đếm được trong các đĩa ở 2 nồng độ pha loãng liên tiếp

-n1: số đĩa ở nồng độ pha loãng thứ nhất đếm được

-n2: số đĩa ở nồng độ pha loãng thứ hai đếm được

-d: nồng độ pha loãng thứ nhất đếm được

-V: lượng mẫu cấy

b Kiểm tra đặc tính sinh hóa

Kiểm tra đặc tính sinh hóa những khuẩn lạc E coli được chọn qua các

phản ứng KIA, MR, VP, Indole và Citrate

Môi trường Kligler Iron Agar (KIA):

Lấy vi khuẩn từ môi trường NA cấy vào ống nghiệm chứa thạch nghiêngKIA, ủ ở 37oC trong 24 giờ E coli lên men đường glucose và lactose nên phần

thạch đứng và thạch nghiêng có màu vàng, không sinh H2S và sinh hơi

Phản ứng kiểm tra tính sử dụng Citrate:

Lấy vi khuẩn từ môi trường NA cấy vào ống nghiệm chứa thạch nghiêngSimmon citrate, ủ ở 37oC trong 24 giờ

Nguyên tắc: trong môi trường Citrate có chứa Sodium citrate, vi khuẩnnào sử dụng được carbon từ muối Citrate này thì sẽ biến Sodium citrate nàythành những chất làm kiềm hóa môi trường với sự hiện diện của chất chỉ thị

Kiểm tra đặc tính sinh hóa

24h

37oCChọn 2 khuẩn lạc cấy thuần trên NA

24h

MacConkey Agar

0,1ml mẫuĐồng nhất và pha loãng đến nồng độ thích hợp