phân lập và khảo sát đặc tính vi khuẩn nội sinh cây lúa trồng trên đất ở huyện sơn hòa, tỉnh phú yên

Trong 26 dòng vi khuẩn phân lập được, tám dòng vi khuẩn nội sinh có đặc tính tốt nhất, trong đó 4 dòng khả năng cố định đạm tốt đồng thời cũng có khả năng hòa tan lân khá cao và tổng hợp

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH

VI KHUẨN NỘI SINH CÂY LÚA TRỒNG TRÊN ĐẤT Ở HUYỆN SƠN HÒA,

TỈNH PHÚ YÊN

MSSV: 3092490 LỚP: CNSH TT K35

Cần Thơ, Tháng 11/2013

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

(ký tên) (ký tên)

Cao Ngọc Điệp Trần Hải My

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

………

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

(ký tên)

Tôi xin chân thành cảm ơn:

Gs Ts Cao Ngọc Điệp và Ths Văn Thị Phương Như đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm, góp ý và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp đại học này

Ban Lãnh đạo Viện nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh học, trường Đại học Cần Thơ đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi học tập và thực hiện luận văn

Quý thầy cô Viện nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh học, trường Đại học Cần Thơ đã tận tình giảng dạy và truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập

Chị Nguyễn Thị Xuân Mỵ và chị Trần Thị Giang - cán bộ phòng thí nghiệm vi sinh vật đất và vi sinh vật môi trường Viện nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh học, trường Đại học Cần Thơ đã nhiệt tình chỉ dẫn, giúp đỡ và hỗ trợ thiết bị, dụng cụ cũng như hóa chất giúp tôi thực hiện tốt luận văn

Tập thể lớp Công nghệ sinh học tiên tiến khóa 35 và anh chị em ở phòng thí nghiệm vi sinh vật đất và vi sinh vật môi trường đã giúp đỡ và chia sẻ những khó khăn trong quá trình tôi học tập và thực hiện luận văn

Cuối lời, tôi xin gửi lời cảm ơn đến Cha, Mẹ, những người thân và bạn bè đã luôn ủng hộ, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn tốt nghiệp đại học này

Xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến những sự quan tâm và giúp đỡ quý báo này!

Hai mươi sáu dòng vi khuẩn nội sinh đã được phân lập trên môi trường RMR từ

rễ và thân của 9 mẫu lúa thu ở 3 địa điểm thuộc huyện Sơn Hòa, tỉnh Phú Yên Tất cả các dòng vi khuẩn đều thuộc Gram âm, tế bào có dạng hình que và có khả năng chuyển động Kết quả khảo sát cho thấy tất cả các dòng vi khuẩn này đều có khả năng

cố định đạm, hòa tan lân khó tan và sinh tổng hợp IAA, trừ 2 dòng SH22 và SH26 không có khả năng tổng hợp IAA trong điều kiện không có tryptophan Trong đó, lượng NH 4

+

cao nhất được dòng SH22 tổng hợp (4,175 µg/ml) sau 4 ngày chủng, dòng SH4 hòa tan được lượng P 2 O 5 cao nhất (196,188 µg/ml) ở ngày thứ 15 và dòng SH9 sinh tổng hợp được lượng IAA cao nhất (13,333 µg/ml) ở ngày thứ 4 sau khi chủng trong môi trường RMR không bổ sung tryptophan trong khi dòng SH16 lại tổng hợp được IAA cao nhất (19,250 µg/ml) ở ngày thứ 4 trong môi trường có bổ sung tryptophan Trong 26 dòng vi khuẩn phân lập được, tám dòng vi khuẩn nội sinh có đặc tính tốt nhất, trong đó 4 dòng khả năng cố định đạm tốt đồng thời cũng có khả năng hòa tan lân khá cao và tổng hợp IAA khá tốt so với những dòng khác là SH9, SH15, SH16 và SH18 và 4 dòng SH4, SH6, SH7 và SH17 có khả năng hòa tan lân cao nhất trong tất cả các dòng vi khuẩn phân lập được

Từ khóa: cây lúa, cố định đạm, hòa tan lân, huyện Sơn Hòa, IAA, vi khuẩn nội sinh

Trang

PHẦN KÝ DUYỆT

LỜI CẢM TẠ

TÓM LƯỢC i

MỤC LỤC ii

DANH SÁCH BẢNG iv

DANH SÁCH HÌNH v

TỪ VIẾT TẮT vi

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 2

2.1 Sơ lược về cây lúa 3

2.1.1 Đặc điểm sinh vật học của cây lúa 4

2.1.2 Nhu cầu về dinh dưỡng của cây lúa 5

2.2 Khát quát về vi khuẩn nội sinh 7

2.2.1 Giới thiệu 7

2.2.2 Các nhóm vi khuẩn nội sinh thực vật không thuộc họ đậu 7

2.2.3 Một số đặc tính của vi khuẩn nội sinh 14

2.3 Địa lý và điều kiện tự nhiên huyện Sơn Hòa, tỉnh Phú Yên 18

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 20

3.2 Phương tiện nghiên cứu 20

3.2.1 Dụng cụ, thiết bị 20

3.2.2 Nguyên vật liệu 20

3.2.3 Hóa chất 20

3.3 Phương pháp nghiên cứu 24

3.3.1 Phương pháp thu thập, xử lý mẫu và phân lập các dòng vi khuẩn 24

3.3.2 Quan sát hình thái và đo kích thước khuẩn lạc 25

3.3.4 Xác địnhđặc tính những dòng vi khuẩn nội sinh 26

3.3.5 Phương pháp xử lý số liệu 31

CHƯƠNG 4.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

4.1 Phân lập và đặc điểm của các dòng vi khuẩn nội sinh đã phân lập 32

4.1.1 Phân lập vi khuẩn 32

4.1.2 Đặc điểm của các dòng vi khuẩn phân lập 34

4.3 Khả năng hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn 41

4.4 Khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn 44

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51

5.1 Kết luận 51

5.2 Đề nghị 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Các hình ảnh

Phụ lục 2: Kết quả khả năng tổng hợp đạm của các dòng vi khuẩn

Phụ lục 3: Kết quả khả năng hòa tan lân của các dòng vi khuẩn

Phụ lục 4: Kết quả khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn

1 Kết quả khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn trên môi trường RMR không bổ sung tryptophan

2 Kết quả khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn trên môi trường RMR có bổ sung tryptophan

Trang

Bảng 1: Thành phần môi trường RMR (Elbeltagy et al., 2001) 21

Bảng 2: Thành phần môi trường Burk không đạm (Park et al., 2005) 22

Bảng 3: Thành phần môi trường NBRIP lỏng (Nautiyal, 1999) 23

Bảng 4: Thành phần của dãy đường chuẩn NH4 + 27

Bảng 5: Thành phần của dãy đường chuẩn P2O5 29

Bảng 6: Thành phần của dãy đường chuẩn IAA 30

Bảng 7: Nguồn gốc của các dòng vi khuẩn được phân lập trên môi trường RMR 33

Bảng 8: Đặc điểm của các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường RMR 35

Bảng 9: Tỷ lệ phần trăm về các đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn đã phân lập 36

Bảng 10: Khả năng tổng hợp NH4 + của các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường RMR sau 2 ngày, 4 ngày, 6 ngày và 8 ngày chủng 40

Bảng 11: Khả năng hòa tan lân của các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường RMR sau 5 ngày, 10 ngày, 15 ngày và 20 ngày chủng 43

Bảng 12: Khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn được nuôi trong môi trường RMR không có bổ sung tryptophan sau 2 ngày, 4 ngày, 6 ngày và 8 ngày chủng 46

Bảng 13: Khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn được nuôi trong môi trường RMR có bổ sung tryptophan sau 2 ngày, 4 ngày, 6 ngày và 8 ngày chủng 48

Trang

Hình 1: Cây lúa (*Nguồn: http://tiennong.vn/vn/ct/cay-lua_4.aspx, ngày 17/07/2013) 4

Hình 2: Tổng quát các lộ trình sinh tổng hợp IAA ở vi khuẩn (Spaepen et al., 2007) 17 Hình 3: Vòng pellicle xuất hiện cách mặt môi trường RMR bán đặc 0,5 cm 34 Hình 4: Đặc điểm của một số khuẩn lạc phân lập trên môi trường RMR 37 Hình 5: Lượng đạm tổng hợp trung bình của tất cả các dòng vi khuẩn theo ngày sau

khi chủng 41 Hình 6: Lượng lân hòa tan trung bình của tất cả các dòng vi khuẩn theo ngày sau khi

chủng 44 Hình 7: Lượng IAA tổng hợp trung bình của các dòng vi khuẩn nuôi trong môi trường

RMR không bổ sung tryptophan theo ngày sau khi chủng 47 Hình 8: Lượng IAA tổng hợp trung bình của tất cả các dòng vi khuẩn nuôi ở môi

trường RMR có bổ sung tryptophan theo ngày sau khi chủng 49 Hình 9: Lượng IAA tổng hợp trung bình của 26 dòng vi khuẩn phân lập được nuôi

trong môi trường RMR không có bổ sung tryptophan và có bổ sung tryptophan 49

IAA Indole-3-acetic acid

IAAld Indole-3-acetaldehyde

IAM Indole-3-acetamide

IPA Indole-3-pyruvate

IPDC Indole-3-pyruvate decarboxylase

LSD Least Significant Difference Test

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề

Lúa (Oryza sativa L.) là loại ngũ cốc quan trọng nhất trên thế giới và là nguồn

lương thực của hơn 50% dân số trên thế giới (Gyaneshwar et al., 2001) Với nhu cầu

về lúa gạo ngày càng tăng, sản lượng và chất lượng lúa gạo cũng phải tăng để đáp ứng nhu cầu đó Để đạt sản lượng mong muốn, nông dân đã sử dụng một lượng lớn phân bón hóa học và thuốc trừ sâu trong canh tác lúa

Khoảng 60% phân đạm hóa học được sử dụng để bón cho ngũ cốc, trong đó khoảng 10% sử dụng cho sản xuất lúa gạo Tuy nhiên, cây trồng chỉ sử dụng được hơn 50% lượng phân bón này Việc sử dụng không hiệu quả phân đạm góp phần làm ô nhiễm nitrat trong đất và nước ngầm, dẫn đến ảnh hưởng tiêu cực tới sức khỏe con người và sự phát triển nông nghiệp bền vững Hơn nữa, sản xuất phân đạm đòi hỏi năng lượng nhiều gấp sáu lần so với năng lượng cần thiết để tạo ra phân lân hoặc phân kali (Da Silva et al., 1978)

Ngoài đạm, lân cũng là một nguyên tố dinh dưỡng chính của cây trồng, có tác dụng thúc đẩy sự phát triển và tăng khả năng chống chịu của cây trồng Thiếu lân, năng suất cây trồng bị giảm sút, ngay cả khi được cung cấp đủ đạm (Nguyễn Minh Hưng, 2007) Tuy nhiên, phần lớn lân trong đất ở dạng vô cơ khó tan hoặc hữu cơ mà cây trồng không thể hấp thụ được Nguồn bổ sung chủ yếu là phân lân vô cơ và phân lân hóa học nhưng theo Premono et al (1996) thì cây trồng chỉ có thể hấp thu 0,1% lượng lân bón vào, phần lớn lượng lân còn lại chuyển thành dạng khó tan phải nhờ đến

vi sinh vật chuyển hóa thành dạng lân dễ tan để cây trồng hấp thụ

Để giảm nhu cầu sử dụng phân bón hóa học, vi khuẩn nội sinh thực vật đóng vai trò quan trọng Nhiều nghiên cứu cho thấy vi khuẩn nội sinh được tìm thấy ở rễ, vùng

rễ, thân và lá của nhiều loại cây trồng như lúa, khóm, ngô, mía, sài đất,… và có nhiều đặc tính như khả năng cố định đạm, hòa tan lân khó tan, sinh tổng hợp những hormone tăng trưởng thực vật Tiềm năng ứng dụng vi khuẩn nội sinh thực vật có những đặc tính tốt trong sản xuất phân bón sinh học và canh tác lúa cũng như một số loại cây trồng khác là rất lớn và là một trong những biện pháp hiệu quả để tăng năng suất cây trồng, giảm lượng phân bón hóa học cũng như giảm tác động xấu do phân hóa học gây

ra cho đất, cải thiện nông nghiệp và bảo vệ môi trường

Trên thế giới, nhiều vi khuẩn nội sinh được tìm thấy ở rễ, vùng rễ và thân cây lúa

như Azospirillum sp., Burkholderia sp., Enterobacter sp., Herbaspirillium sp., Klebsiella sp.,… (Koomnok et al., 2007; Mano và Morisaki, 2008) Ở Việt Nam, đặc

biệt ở vùng đồng bằng sông Cửu Long đã có nhiều nghiên cứu và ứng dụng vi khuẩn

nội sinh ở cây lúa như phân lập được Burkholderia vietnamiensis, Azospirillum lipoferum từ cây lúa trồng ở miền Nam Việt Nam (Van et al., 1994; Cao Ngọc Điệp et

al., 2007) Bên cạnh đó, hiệu quả của những dòng vi khuẩn nội sinh trên các giống lúa

cao sản cũng được nghiên cứu như Pseudomonas stutzeri với cây lúa cao sản trồng

trên đất phù sa nông trường Sông Hậu, Cần Thơ (Ngô Thanh Phong và Cao Ngọc Điệp, 2011) Tuy nhiên, việc nghiên cứu và hiểu biết về các loài vi khuẩn nội sinh hữu ích ở cây lúa trồng ở miền Trung, đặc biệt vùng miền núi của tỉnh Phú Yên - Phú Yên

là một trong những vựa lúa lớn của miền Trung - vẫn còn nhiều hạn chế

Vì các lý do trên, đề tài “Phân lập và khảo sát đặc tính vi khuẩn nội sinh cây

lúa trồng trên đất ở huyện Sơn Hòa, tỉnh Phú Yên” được thực hiện

1.2 Mục tiêu đề tài

Phân lập được một số dòng vi khuẩn nội sinh cây lúa và khảo sát đặc tính cố định đạm, hòa tan lân khó tan và sinh tổng hợp IAA của những dòng vi khuẩn nội sinh này

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược về cây lúa

Cây lúa (Oryza spp.) là một trong năm loại cây lương thực chính của thế giới Lúa trồng thuộc hai loài (Oryza sativa và Oryza glaberrima) trong họ Poaceae, có

nguồn gốc ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới khu vực Đông Nam Châu Á và Châu Phi

Oryza sativa, thường được gọi là lúa Châu Á, chứa hai phân loài lớn, thứ (var.) japonica hoặc jinica hạt to và ngắn, phát triển ở vùng khí hậu ôn đới và thứ (var.) indica hạt dài, phát triển ở vùng nhiệt đới Châu Á

Chi Oryza Sativa var japonica thường được trồng trong các khu vực khô, vùng

Đông Á ôn đới, các vùng cao của khu vực Đông Nam Á và các sơn nguyên có độ cao

ở Nam Á, trong khi chi Oryza Sativa var indica chủ yếu là trồng ở vùng đồng bằng

Lúa trồng là các loài thực vật sống một năm, có thể cao tới 1-2 m, đôi khi cao hơn, với các lá mỏng, hẹp bản (1-2,5 cm) và dài 30-100 cm Các hoa nhỏ tự thụ phấn mọc thành các cụm hoa phân nhánh cong hay rủ xuống và dài 20-40 cm Hạt là loại quả thóc (hạt nhỏ, cứng của các loại cây ngũ cốc) dài 5-12 mm và dày 2-3 mm (http://worldrices.blogspot.com/2012/03/cay-lua-trong-he-thong-phan-loai-thuc.html, 2013)

Cây lúa sinh trưởng thích hợp nhất ở nhiệt độ 20º- 30ºC, nhiệt độ càng tăng cây lúa phát triển càng mạnh Khi nhiệt độ trên 40ºC hoặc dưới 17ºC, cây lúa tăng trưởng chậm lại, thấp hơn 13ºC cây lúa ngừng sinh trưởng, nếu kéo dài một tuần lễ cây lúa sẽ chết Cây lúa cần lượng mưa khoảng 900-1000 mm cho một vụ và nhu cầu nước qua các thời kỳ sinh trưởng không giống nhau Trong đất ngập nước, cây lúa phát triển thuận lợi, cho năng suất cao và ổn định nhất Cây lúa có thể trồng trên các loại đất khác nhau nhưng đất trồng lúa tốt cần có khả năng giữ nước tốt, có pH thích hợp trong khoảng 5,5 - 7,5 và giàu các chất dinh dưỡng (Nguyễn Ngọc Đệ, 2008)

Ở Việt Nam, lúa là cây trồng cổ truyền và là cây trồng quan trọng nhất hiện nay

vì diện tích gieo trồng lúa chiếm đến 61% diện tích trồng trọt cả nước (http://cayluongthuc.blogspot.com/2011/08/cay-lua-viet-nam-loi-gioi-thieu.html, 2013) Lúa vừa đảm bảo lương thực cho hầu hết dân số vừa đóng góp vào việc đưa Việc Nam trở thành một quốc gia xuất khẩu gạo đứng thức hai thế giới (Nguyễn Như

Hà, 2006)

2.1.1 Đặc điểm sinh vật học của cây lúa

Các giống lúa Việt Nam có những đặc điểm khác nhau về chiều cao, thời gian sinh trưởng (dài hay ngắn), chịu thâm canh, chịu chua mặn và chống chịu sâu bệnh, Tuy nhiên, cây lúa đều có những đặc tính chung về hình thái, giải phẫu và đều có chung các bộ phận rễ, thân, lá, bông và hạt (http://tiennong.vn/vn/ct/cay-lua_4.aspx, 2013)

Hình 1: Cây lúa (*Nguồn: http://tiennong.vn/vn/ct/cay-lua_4.aspx , ngày 17/07/2013)

Rễ: Rễ lúa là loại rễ chùm, rễ lúa có hai loại: rễ mầm mọc từ phôi hạt, có tác

dụng hút nước và chất dinh dưỡng đến lúc cây có 3 lá và rễ đốt mọc ra từ các đốt thân nằm dưới mặt đất, có tác dụng hút chất dinh dưỡng nuôi cây, trao đổi không khí và giữ cho cây lúa đứng vững

Thân: Là loại thân thảo Thời kỳ mạ và lúa non, thân lúa do các bẹ lá tạo thành

Sau khi làm đốt, thân lúa do các lóng và đốt tạo thành, bên ngoài có bẹ lá bao bọc Số lóng trên mỗi thân phụ thuộc vào giống: giống dài ngày 7-8 lóng, giống trung ngày 6-7 lóng và giống ngắn ngày có 4-5 lóng

Lá: Lúa có lá mầm và lá thật Lá mầm mọc trong quá trình ngâm ủ và thời gian

đầu sau khi gieo.Lá thật là lá mọc trong quá trình sinh trưởng sinh dưỡng của cây lúa

và tồn tại trong suốt quá trình sinh trưởng của cây lúa Số lá trên cây phụ thuộc vào giống: giống dài ngày ≥ 20 lá, giống trung ngày 16-18 lá và giống ngắn ngày 12-15 lá

Bông lúa: Do trên một bông lúa có nhiều hoa lúa, quá trình trỗ lại không đồng

thời nên hoa lúa nở theo quy luật từ trên xuống dưới, từ ngoài vào trong Thời gian nở hoa phụ thuộc vào điều kiện khí hậu, thời tiết Nếu thuận lợi, nhiệt độ thích hợp, đủ nắng, hoa nở rộ vào 8-9 giờ sáng Nếu trời nắng nóng, hoa lúa sẽ nở sớm vào lúc 7-8

giờ sáng Nếu trời âm u, thiếu ánh sáng hoặc gặp rét, hoa lúa sẽ trỗ muộn từ 12-14 giờ trưa Thời gian phơi màu, thụ tinh của hoa lúa từ khi nở vỏ trấu đến lúc khép lại khoảng 50-60 phút

Hạt lúa: Mỗi một hạt lúa được hình thành từ một hoa lúa Các hạt lúa xếp sát và

gối lên nha tạo thành bông lúa Tuỳ vào các giống lúa khác nhau mà độ dài bông, số lượng hạt cũng như mật độ xếp hạt của bông lúa khác nhau (http://www.vaas.org.vn/Images/caylua/10/001_caylua.htm, 2013)

2.1.2 Nhu cầu về dinh dƣỡng của cây lúa

Các chất dinh dưỡng cần thiết, không thể thiếu được đối với sự sinh trưởng và phát triển của cây lúa bao gồm: đạm (N), lân (P), kali (K), vôi, sắt, kẽm, đồng, silic, lưu huỳnh, carbon, oxy và hydro, Phân bón đều có thể cung cấp được tất cả các chất dinh dưỡng trên (trừ carbon, oxy, hydro) cho cây lúa Trong đó, 3 yếu tố dinh dưỡng

mà cây lúa cần với lượng lớn và cũng là các chất cần thiết cho các quá trình sống diễn

ra trong cây lúa là đạm, lân và kali Các nguyên tố khoáng còn lại, cây lúa cần với lượng rất ít và hầu như đã có sẵn ở trong đất, nếu thiếu thì có thể tuỳ theo điều kiện cụ thể mà bón bổ sung Các yếu tố dinh dưỡng cung cấp cho cây lúa có vai trò khác nhau, với hàm lượng cung cấp khác nhau trong quá trình sinh trưởng, phát triển của cây lúa Phân bón có vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng, phát triển của cây lúa,

từ giai đoạn mạ cho đến lúc thu hoạch Cùng với các yếu tố khác, phân bón cung cấp cho cây nguồn nguyên liệu để tái tạo ra các chất dinh dưỡng như: tinh bột, chất đường, chất béo và protein,… Ngoài ra, chúng còn giữ vai trò duy trì sự sống của toàn bộ cây lúa, không có nguồn dinh dưỡng thì cây lúa sẽ chết Tuy nhiên, trong thực tế, cây lúa chỉ hút được khoảng 2/3 - 3/4 lượng phân bón, lượng phân bón còn lại bị trông theo

(http://www.vaas.org.vn/images/caylua/10/039_vaitrophanbon.htm, 2013)

2.1.2.1 Nhu cầu về đạm

Đạm có vai trò quan trọng trong việc phát triển bộ rễ, thân, lá, chiều cao và đặc biệt ảnh hưởng tới quá trình đẻ nhánh của cây lúa (Nguyễn Như Hà, 2006) Theo Ladha và Reddy (2003), đạm cũng là dưỡng chất quan trọng, là yếu tố cấu thành năng suất lúa trồng và 1 kg đạm sản xuất được 15-20 kg lúa hạt Đạm còn có vai trò quan trọng đối với việc hình thành đòng và các yếu tố cấu thành năng suất lúa khác như số hạt/bông, trọng lượng 1000 hạt và tỷ lệ hạt chắc Vì vậy, việc cung cấp đạm đủ và

đúng lúc cho cây lúa có vai trò quyết định đến việc đạt năng suất cao (Nguyễn Như

Hà, 2006) Ngoài ra, đạm cũng làm tăng hàm lượng protein trong gạo, ảnh hưởng tới đặc tính vật lý và sức đề kháng đối với sâu bệnh hại cây lúa (Nguyễn Ngọc Đệ, 2008) Trong quá trình sinh trưởng, cây lúa có nhu cầu đạm tăng từ thời kỳ đẻ nhánh tới thời

kỳ trổ bông, rồi giảm sau khi trổ Cây lúa cần nhiều đạm nhất vào hai thời kỳ: thời kỳ

đẻ nhánh khoảng 70% - là thời kỳ hút đạm có ảnh hưởng lớn nhất đến năng suất lúa và thời kỳ làm đòng khoảng 10-15 % - là thời kỳ hút đạm có hiệu suất cao (Nguyễn Như

Hà, 2006) Cây lúa đòi hỏi lượng phân đạm từ 60-100 kg/ha để đạt năng suất lúa từ 5-8 tấn/ha và cây lúa cần một lượng phân đạm hóa học cao hơn để có năng suất ổn định (Stoltzfus et al., 1997) Tuy nhiên, hiệu suất sử dụng phân đạm cho lúa lại thấp, thường không quá 40% (Nguyễn Như Hà, 2006) dẫn đến việc lạm dụng quá mức phân bón hóa học gây nên ô nhiễm môi trường và làm hại đến sức khỏe của nông dân cũng như người tiêu dùng Bên cạnh đó, giá thành sản xuất phân đạm hóa học không ngừng tăng cũng ảnh hưởng tới thu nhập của nông dân Trong khi đó, ở vùng nhiệt đới, nhiều nghiên cứu cho thấy nguồn đạm sinh học chỉ thỏa mãn được khoảng 50 kg N/ha/vụ (Roger và Ladha, 1992) Hơn nữa, theo Fischer et al (2003), nguồn đạm tự nhiên từ sự

cố định đạm sinh học với vi sinh vật sống tự do chỉ đủ sản xuất ra lúa gạo có năng suất

từ 2 - 3,5 tấn/ha Do đó, nguồn đạm sinh học được cung cấp từ nguồn phân xanh, phân chuồng và phân bón sinh học với những vi sinh vật cố định đạm nội sinh cây lúa sẽ giúp tăng năng suất, đảm bảo chất lượng hạt lúa, giảm chi phí sản xuất, phục hồi độ phì nhiêu cho đất, không gây ô nhiễm môi trường và đảm bảo sự phát triển bền vững

hệ sinh thái nông nghiệp (Sturz et al., 2000)

2.1.2.2 Nhu cầu về lân

Lân có vai trò kích thích cây lúa ra rễ mạnh, hình thành nhiều nốt sần (http://www.vaas.org.vn/images/caylua/05/02_vaitrodinhduong.htm, 2013), có ảnh hưởng tới tốc độ đẻ nhánh của cây lúa, làm cho cây lúa trổ bông đều, chín sớm hơn, tăng năng suất và phẩm chất hạt thóc Để tạo ra một tấn lúa, câu lúa cần khoảng 7,1 kg

P2O5, trong đó có khoảng 6 kg P2O5 tích lũy chủ yếu vào hạt (Nguyễn Như Hà, 2006) Lượng hữu dụng của lân trong đất rất thấp Thời gian ngập nước càng lâu, giúp

pH đất gia tăng và độ hữu dụng của lân cũng gia tăng Do đó, lượng lân hữu dụng lúc chuẩn bị sạ vụ hè thu thì thấp hơn đầu vụ đông xuân Lân rất ít di chuyển, nên bón lân chôn vùi vào trong đất ở độ sâu vùng rễ thì giúp cho lúa hấp thụ tốt hơn Nhu cầu hấp

thụ lân của cây lúa chủ yếu vào thời kỳ sinh trưởng đầu của cây lúa (http://sonongnghiepkiengiang.gov.vn/news.php?id=1922, 2013) Cây lúa hút lân mạnh nhất vào thời kỳ đẻ nhánh và làm đòng nhưng xét về cường độ thì cây lúa hút lân mạnh nhất vào thời kỳ đẻ nhánh (Nguyễn Như Hà, 2006)

2.2 Khát quát về vi khuẩn nội sinh

2.2.1 Giới thiệu

Vi khuẩn nội sinh là vi khuẩn sống trong mô thực vật mà không có những tổn hại đáng kể hay dấu hiệu nhiễm bệnh và hậu quả tiêu cực đối với cây chủ (Kobayashi và Palumbo, 2000) Những vi khuẩn này thường được phân lập từ bề mặt mô hay từ bộ phận của thực vật như rễ, thân, lá và hạt Tuy nhiên, ở hầu hết thực vật, rễ có lượng vi khuẩn nội sinh trong mô cao hơn ở trên bề mặt mô (Santi et al., 2013)

Vi khuẩn nội sinh giúp tăng cường sinh trưởng và chuyển hóa các chất trong cây Chúng có thể xâm nhập mô thực vật qua bề mặt rễ và tìm cách chui vào rễ chính hay

rễ bên; có thể chui vào rễ qua lông hút và có thể nằm giữa các tế bào nhu mô rễ hay biểu bì rễ Chúng cũng có thể xâm nhập vào các mô xuyên qua khí khổng hay các vị trí tổn thương trên cây (Roos và Hattingh, 1983) Sau khi xâm nhập vào cây chủ, các vi khuẩn nội sinh có thể tập trung tại vị trí xâm nhập hay phát tán khắp nơi trong cây đến các tế bào bên trong, đi vào các khoảng trống gian bào hay vào trong hệ mạch (Zinniel

et al., 2002)

2.2.2 Các nhóm vi khuẩn nội sinh thực vật không thuộc họ đậu

2.2.2.1 Vi khuẩn Azoarcus

Azoarcus là vi khuẩn cố định đạm, Gram âm, hình que và có khả năng chuyển

động (Bilal và Malik, 1987; Bilal et al., 1990; Malik et al., 1991; Reinhold et al., 1986) Loài vi khuẩn này vừa có khả năng cố định đạm trong điều kiện vi hiếu khí vừa

có khả năng tổng hợp IAA và phát triển tốt trên môi trường chứa muối acid hữu cơ nhưng không tốt trên môi trường chứa carbohydrate (Malik et al., 1997)

Hầu hết các chi Azoarcus được phân lập từ cỏ Kallar (Leptochloa fusca (L.)

Kunth) trồng ở vùng đất mặn thuộc Pakistan (Reinhold-Hurek et al., 1993; Hurek et

al., 1995) Azoarcus hiện diện trong rễ, bề mặt rễ (Bilal and Malik, 1987;

Reinhold-Hurek et al., 1993) và cả trong thân cỏ Kallar (Reinhold-Hurek et al., 1993, 1994; Egener et al., 1998) Ngoài ra, vi khuẩn này còn được phân lập từ rễ lúa và giúp kích thích sự sinh

trưởng của lúa (Malik et al., 1997; Egener et al., 1998; Engelhard et al., 2000) Theo Malik et al (1980), khi khai phá những vùng có cỏ Kallar phát triển tốt để trồng lúa mì thì thấy lúa mì có năng suất cao mà không cần bón nhiều phân đạm hóa học

Theo Reinhold-Hurek et al (1993), dựa vào nhiều nghiên cứu về hình thái, tính

năng dinh dưỡng và sinh hóa cũng như một số kỹ thuật sinh học phân tử, chi Azoarcus được xác định có 2 loài là A communis và A indigenous Năm 1995, theo một nghiên cứu tại đại học Michigan State, một loài khác thuộc chi Azoarcus - Azoarcus tolulyticus lần đầu tiên được mô tả, là một vi khuẩn cố định đạm tự do, chịu được ở

điều kiện kỵ khí và được phân lập từ đất, biển và nước ngọt bị nhiễm dầu (http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Azoarcus_tolulyticus, 2013)

Theo Peng et al (2006) có 8 loài vi khuẩn cố định đạm thuộc chi Azospirillum được mô tả, bao gồm 2 loài được tìm thấy đầu tiên là Azospirillum lipoferum and Azospirillum brasilense (Tarrand et al., 1978) và 6 loài được lần lượt được mô tả sau

đó là Azospirillum amazonense (Magalhães et al., 1983), Azospirillum halopraeferens

- là vi khuẩn cố định đạm cộng sinh với rễ của cỏ Kallar (Leptochloa fusca (L.) Kunth) (Reinhold et al., 1987), Azospirillum irakense được phân lập từ rễ và đất vùng rễ lúa (Khammas et al., 1989), Azospirillum largimobile (Sly và Stackebrandt, 1999), Azospirillum doebereinerae - là vi khuẩn cố định đạm cộng sinh với rễ cây cỏ C4 Miscanthus (Eckert et al., 2001) và Azospirillum oryzae - được phân lập từ rễ của cây

lúa (Xie và Yokota, 2005) Năm 2006, một loài Azospirillum có khả năng cố định đạm

mới là Azospirillum melinis đã được phân lập từ thân và rễ cỏ molasses (Melinis minutiflora Beauv.) trồng ở Trung Quốc (Peng et al., 2006)

Azospirillum spp có khả năng cố định đạm, hòa tan lân khó tan, hấp thu khoáng

chất, sản xuất nhiều loại kích thích tố thực vật, trong đó chủ yếu là IAA và gibberellins, phân hủy siderophore và sản xuất enzyme (Bashan et al., 2004)

2.2.2.3 Vi khuẩnAzotobacter

Vi khuẩn Azotobacter là nhóm vi khuẩn cố định đạm sống tự do, Gram âm, hiếu

khí (http://en.wikipedia.org/wiki/Azotobacter, 2013), có hình que, di động nhờ chiêm mao (http://www.wisegeek.com/what-is-an-azotobacter.htm, 2013), có nhiều trong đất kiềm hoặc đất trung tính, trong môi trường nước và ở một số loài thực vật (http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Azotobacter, 2013) Azotobacter có tính mẫn cảm với độ pH, nồng độ phosphate cao và nhiệt độ trên 35ºC (Nguyễn Hữu Hiệp

và Cao Ngọc Điệp, 2012) Một số loài của chi Azotobacter có khả năng cố định đạm từ

ammonia; sản xuất vitamin và các chất kích thích tăng trưởng giúp cho sự nảy mầm của hạt; tổng hợp IAA và tổng hợp các hormone kích thích tăng trưởng khác như gibberellin và cytokinin giúp cho sự phát triển của rễ,… (Saikia et al., 2008)

Azotobacter thuộc họ Azotobacteraceae Họ Azotobacteraceae gồm có 2 chi là chi Azomanas với 3 loài: A agilis, A insignis và A macrocytogenes và chi Azotobacter với 7 loài được biết đến là Azotobacter chroococcum (được mô tả bởi Beyerinkom vào năm 1901), Azotobacter vinelandii (được mô tả bởi Lipman năm 1903), Azotobacter beijerinckii (được mô tả bởi Lipman vào năm 1904), Azotobacter nigricans (được mô tả bởi Krasil'nikov vào năm 1949), Azotobacter paspali (được mô

tả bởi Döbereiner et al năm 1966; và Thompson và Skerman vào năm 1980),

Azotobacter armeniacus (được mô tả bởi Thompson và Skerman vào năm 1981) và Azotobacter salinestris (được mô tả bởi Page và Shivprasad vào năm 1991) (Saikia et al., 2008) Trong đó, Azotobacter chroococcum - loài đầu tiên thuộc chi Azotobacter

được phát hiện và mô tả vào năm 1901 bởi nhà thực vật học và vi sinh vật học Hà Lan Martin Beyerinkom - thường được tìm thấy nhiều nhất trong nhiều loại đất trên thế giới (Martyniuk, 2003)

Nhiều nước đã sản xuất phân bón vi sinh có chứa Azotobacter đã được sử dụng

phổ biến dưới dạng bột khô như Amrutham ở Ấn Độ hay dạng dịch lỏng như Azotobacterin (Nguyễn Hữu Hiệp và Cao Ngọc Điệp, 2012)

2.2.2.4 Vi khuẩn Burkholderia

Vi khuẩn Burkholderia là vi khuẩn Gram âm, hình que, có thể sinh trưởng và

phát triển trong điều kiện kỵ khí hoặc hiếu khí nhưng phát triển tốt nhất trong điều kiện ít khí oxy (Caballero-Mellado et al., 2004) Vi khuẩn này sống cộng sinh với cây trồng, có khả năng cố định đạm, kích thích sự tăng trưởng của cây Ngoài ra, một số

dòng của loài Burkholderia như B tropica và B unamae có khả năng hòa tan

phosphate và sản xuất siderophore (Caballero-Mellado et al., 2007)

Theo Coenye và Vandamme (2003) có hơn 40 loài Burkholderia được tìm thấy,

chúng có mặt khắp nơi trong tự nhiên Tuy nhiên, trong một thời gian dài, khả năng cố

định đạm của chi Burkholderia chỉ được tìm thấy ở loài Burkholderia vietnamiensis, là

một loài vi khuẩn được phân lập từ rễ cây lúa trồng ở miền Nam Việt Nam (Gillis et

al., 1995) Theo Estrada-de los Santos et al (2001) cũng tìm thấy Burkholderia vietnamiensis và một loài Burkholderia kururiensis có khả năng cố định đạm trong rễ của bắp, sorghum và cà phê trồng tại Mexico Hiện nay, nhiều loài Burkholderia được xác nhận có khả năng cố định đạm được tìm thấy như B tropica ở thân và trái khóm

(Cruz et al., 2001) và ở cây bắp, cây teosinte trồng tại Mexico, ở rễ cây mía trồng tại

Brazil và Nam Phi (Reis et al., 2004); B phymatum và B tuberum ở rễ cây họ đậu (Vandamme et al., 2002); B unamae ở bắp, mía đường và cà phê (Caballero-Mellado

et al., 2004) và ở vùng rễ cây cà chua trồng tại Mexico (Caballero-Mellado et al.,

2007); B xenovorans ở vùng rễ bắp trồng tại Hà Lan (Salles et al., 2006) và ở vùng rễ cây cà chua trồng tại Mexico (Caballero-Mellado et al., 2007) và B silvatlantica ở bắp

và mía đường (Perin et al., 2006),…

Theo thí nghiệm của Van et al (2000), cây lúa được chủng Burkholderia vietnamiensis dòng TVV75 - một dòng vi khuẩn được phân lập từ đất phèn ở miền

Nam Việt Nam - đã cho những hiệu quả đáng kể như bề mặt lá tăng 30% ở ngày 14, khả năng đâm chồi tăng 33% và số lượng rễ tăng 57% ở ngày 24, sản lượng hạt lúa tăng từ 13-22% và cho năng suất tương đương với lúa trồng được bón phân đạm hơn 25-30 kg N/ha

Hwangbo et al (2003) đã phân lập được loài Enterobacter intermedium từ vùng

rễ một số cây cỏ ở Triều Tiên Loài Enterobacter intermedium này có khả năng hòa

tan các phosphate khó tan để cung cấp cho cây theo cơ chế acid hóa bằng cách sản xuất hợp chất 2-ketogluconic acid

Năm 2010, một dòngvi khuẩn Ah-143T với tên gọi Enterobacter arachidis sp nov được phân lập từ vùng đất rễ của cây lạc (Arachis hypogaea L ‘ALR-2’) thu từ

mảnh đất thí nghiệm của đại học nông nghiệp Tamilnadu thuộc Coimbatore Ấn Độ Dòng vi khuẩn này có khả năng cố định đạm từ không khí và tổng hợp indole-3-acetic acid (IAA), siderophore, phytohormone và 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase (ACCD) (Madhaiyan et al., 2010)

Hardoim et al (2013) đã phân lập được 2 loài Enterobacter mới là Enterobacter oryziphilus sp nov (các dòng REICA_084, REICA_142T và REICA_191) và Enterobacter oryzendophyticus sp nov (các dòng REICA_032, REICA_082T và

REICA_211) từ rễ lúa Cả 2 loài này đều có khả năng cung cấp đạm và phosphor để kích thích sự phát triển của lúa

2.2.2.6 Vi khuẩn Gluconacetobacter diazotrophicus

Năm 1988, một chivi khuẩn nội sinh hấp thụ acid acetic có khả năng cố định đạm

- Acetobacter diazotrophicus được phát hiện và phân lập từ rễ và thân cây mía đường

trồng ở Brazil bởi Cavalcante và Döbereiner Chúng hiện diện trong các khoảng trống gian bào của tế bào nhu mô và được xem là vi khuẩn nội sinh bắt buộc (Cavalcante và

Döbereiner, 1988) A diazotrophicus cũng được phân lập từ những cây trồng khác như cỏ Cameroon (Pennisetum purpureum), coffee (Coffea arabica), trà, chuối, ragi,

lúa và khóm và kể cả trên những côn trùng gây hại cây mía (Muthukumarasamy et al.,

2002) Sau đó, căn cứ vào phân tích trình tự 16s rRNA, Acetobacter diazotrophicus được đổi tên lại thành Gluconacetobacter diazotrophicus (Yamada et al., 1997)

Gluconacetobacter diazotrophicus là vi khuẩn Gram âm, chịu được acid, sống

trong môi trường hiếu khí bắt buộc, có thể tăng trưởng được ở pH rất thấp 3,0 và có khả năng cố định đạm trong điều kiện vi hiếu khí Loài vi khuẩn này sử dụng nhiều nguồn carbon khác nhau như sucrose, gluconate, glucose, fructose, mannitol và arabinose,… nhưng nguồn carbon tốt nhất cho sự phát triển là sucrose ở nồng độ cao 10% và thậm chí ở nồng độ sucrose cao hơn (30%) chúng vẫn có thể phát triển (Muthukumarasamy et al., 2002; Burris, 1994)

Vi khuẩn Gluconacetobacter diazotrophicus có thể cố định đạm trong điều kiện

O2 thay đổi liên tục (Dong et al., 2002), có khả năng nội cộng sinh cố định đạm mà

không gây hại cho cây và có thể cung cấp hơn một nửa lượng đạm ở dạng hữu ích cho

cây trồng (Cojho et al., 1993) Hơn nữa, Gluconacetobacter diazotrophicus còn tổng

hợp được hormone thực vật như auxin, gibberellin, tổng hợp chất kích thích tăng trưởng (phytohormone) như IAA, có thể hòa tan kẽm và lân khó tan, tăng khả năng hấp thu dinh dưỡng của cây và tạo ra vitamin cũng như enzyme giúp cây phát triển (Muthukumarasamy et al., 2002; Munoz et al., 2003; Madhaiyan et al., 2004)

2.2.2.7 Vi khuẩn Herbaspirillium

Vi khuẩn Herbaspirillum thuộc nhóm β-Proteobacteria, là vi khuẩn Gram âm, vi

hiếu khí và là vi khuẩn cố định đạm sống trong rễ của nhiều cây không phải là họ đậu

(James et al., 1997) Hầu hết các loài của Herbaspirillum thuộc nhóm vi khuẩn nội

sinh trong các mô thực vật Chúng có khả năng cố định đạm mạnh trong vùng rễ (Baldani et al., 1986) và phát tán đến cả những vùng ở thân và lá (Barraquio et al.,

1997) Ngoài ra, Herbaspirillum còn tổng hợp được các phytohormone như IAA,

auxin và gibberellin (Muthukumarasamy et al., 2007)

Herbaspirillum được báo cáo lần đầu tiên bởi Baldani et al (1986) như một loài

vi khuẩn cố định đạm cộng sinh với rễ của cây lúa (Oryza sativa), bắp (Zea mays) và cây cao lương (sorghum) (Sorghum bicolor) và được cho là loài Herbaspirillum seropedicae vì ở thời điểm này, chỉ có một loài thuộc chi Herbaspirillum được biết đến Sau đó, Baldani et al (1996) đã phân lập được Herbaspirillum rubrisubalbicans

từ rễ, thân và lá của cây mía (Saccharurn spp.) Cả hai loài vi khuẩn này đã được tìm

thấy ở rễ, thân và cả lá của các cây bắp, cỏ voi, sorghum và mía đường (Olivares et al., 1996); chuối và khóm (Cruz et al., 2001); lúa hoang và lúa trồng (Elbeltagy et al., 2001)

Gần đây, một vài loài Herbaspirillum mới đã được phát hiện như Herbaspirillum frisingense sp nov được phân lập từ rễ của các loài cây C4 cho sợi (Kirchhof et al., 2001) và Herbaspirillum hiltneri sp nov được phân lập từ rễ của lúa mì (Rothballer et

al., 2006)

2.2.2.8 Vi khuẩn Klebsiella

Vi khuẩn Klebsiella thuộc nhóm γ-Proteobacteria, là vi khuẩn Gram âm, có dạng

hình que, không hay ít chuyển động (http://en.wikipedia.org/wiki/Klebsiella, 2013) Chi vi khuẩn này có khả năng cố định đạm, tổng hợp IAA và hòa tan lân khó tan Vi

khuẩn Klebsiella thường xuất hiện tự nhiên trong đất, một số xâm nhập vào cây trồng

và sống nội sinh trong cây Chi Klebsiella có 2 loài quan trọng là Klebsiella pneumoniae và Klebsiella oxytoca Khoảng 30% các dòng của Klebsiella pneumoniae

có thể cố định đạm trong các điều kiện kỵ khí (Postgate, 1998)

Nhiều dòng vi khuẩn Klebsiella đã được phân lập và nghiên cứu về khả năng tổng hợp IAA như Klebsiella pneumonia dòng GR9 ở rễ và thân cây mía (Govindarajan et al., 2007), Klebsiella oxytoca dòng GR-3 ở rễ và thân của cây cỏ đuôi mèo (Typha australis) (Jha và Kumar, 2007), Klebsiella pneumoniae ở vùng rễ của lúa mì (Triticum aestivum) (Sachdev et al., 2009) và dòng Klebsiella SN 1.1 ở đất

vùng rễ lúa (Chaiharn và Lumyong, 2011)

Theo Lü và Song (2000), vi khuẩn Klebsiella oxytoca dòng SG-11 được phân lập

từ rễ lúa có khả năng kích thích sinh trưởng thực vật nhờ vào khả năng cố định đạm từ nitơ không khí và khả năng tổng hợp IAA từ tryptophan theo lộ trình indole-3-pyruvicacid của chúng

Ở Ấn Độ, các nhà nghiên cứu sử dụng K oxytoca dòng GR-3 chủng cho giống

lúa Malviya dhan-36 thì nhận thấy vi khuẩn này giúp gia tăng toàn bộ chiều dài cây và tăng hàm lượng chlorophyll-a có hiệu quả, đồng thời chúng còn kích thích sự thành lập

rễ bên và rễ bất định cho cây (Jha và Kumar, 2007)

Theo nghiên cứu của Chaiharn và Lumyong (2011), dòng Klebsiella SN 1.1 có

khả năng tổng hợp IAA cao nhất (291,97 ± 0,19 ppm) trong môi trường nuôi cấy có bổ sung L-tryptophan và hòa tan phosphat vô cơ cao trong 216 dòng vi khuẩn được phân lập từ đất vùng rễ lúa ở miền Bắc Thái Lan

2.2.2.9 Vi khuẩn Pseudomonas

Chi Pseudomonas thuộc nhóm γ-Proteobacteria, thường là Gram âm, hiếu khí, có

hình que, có chiên mao ở cực và không có khả năng tạo bào tử (http://en.wikipedia.org/wiki/Pseudomonas, 2013) Chúng có khả năng hô hấp hiếu khí hay kỵ khí trong môi trường không có oxy Nhiệt độ phát triển thuận lợi của

Pseudomonas spp là 30-37ºC (Cao Ngọc Điệp, 2011)

Nhiều loài trong chi Pseudomonas được xác định là vi khuẩn nội sinh trong cây

bông vải và bắp ngọt (McInroy và Klopper, 1995), đậu nành (Hung và Annapurana,

2004), cây lúa hoang và lúa trồng (Koomnok et al., 2007),… Pseudomonas fluorescens

và Pseudomonas putida là 2 loài Pseudomonas có sắc tố huỳnh quang chính được tìm

thấy ở vùng rễ chuối (Vlassak et al 1992), ở đất vùng rễ và rễ của cây lanh (flax)

(Linum usitatissinum L.) và cà chua (Lycopersicon esculentum Mill.) (Lemanceau et

al 1995)

Một số loài vi khuẩn Pseudomonas có khả năng cố định đạm như P diminuta, P fluorescens, P paucimobilis, P pseudoflava, P putida, P saccharophila, P stuzeri và

P vesicularis (Chan et al., 1994); có khả năng hòa tan lân ở dạng khó tan thành dạng

dễ tan giúp cây trồng hấp thụ như P chlororaphis, P fluorescens, P putida, và P stuzeri (Cattenlla et al., 1999), có thể tổng hợp kích thích tố tăng trưởng thực vật như

auxin và cytokinin giúp kích thích sự phát triển của rễ cây làm gia tăng khả năng hấp

thu chất dinh dưỡng trong đất ở một số cây trồng bao gồm cả cây lúa như P fluorescens, P putida và P syringae (Glickmann et al., 1998; Vlassak et al 1992)

2.2.3 Một số đặc tính của vi khuẩn nội sinh

2.2.3.1 Khả năng cố định đạm

Đạm là là chất dinh dưỡng cần thiết và quan trọng cho sự phát triển của cây trồng Không khí có khoảng 80% là khí nito nhưng cây trồng không thể hấp thu trực tiếp khí nito trong không khí được Cây trồng chỉ có thể hấp thu đạm có sẵn trong đất

ở dạng ammonium và nitrate thông qua rễ của chúng Các vi khẩn nội sinh thực vật có khả năng sử dụng đạm trong không khí nhờ sự cố định đạm sinh học, là quá trình chuyển nito trong không khí thành thành dạng đạm nguyên tử rồi thành dạng đạm vô

cơ ammonia - dạng đạm mà cây trồng có thể hấp thụ được, sau đó vi khuẩn sẽ chuyển hóa tiếp một phần thành dạng acid amin hữu cơ để vi khuẩn sử dụngnhờ sự xúc tác của enzyme nitrogenase (Santi et al., 2013) Enzyme nitrogenase gồm heterotetrameric protein MoFe liên kết với homodimeric protein Fe Các electron sẽ đi vào homodimeric Fe protein và được vận chuyển tới protein MoFe nhờ năng lượng ATP, qua đó electron được hoạt hóa để phản ứng với nito Mỗi electron được chuyển đến MoFe protein đủ để phá vỡ một liên kết của N2, dù vậy cũng chưa có sự hiểu biết chính xác là 3 chu kỳ như thế sẽ chuyển một phân tử N2 thành ammonia Nitrogenase

sẽ liên kết mỗi nguyên tử nito với ba nguyên tử hidro để tạo ammonia (NH3) (http://en.wikipedia.org/wiki/Nitrogenase, 2013) Phản ứng khử nito với xúc tác của enzyme nitrogenase có thể được tóm tắt như sau:

N2 + 6e- + 12 ATP + 12 H2O → 2 NH4

+

+ 12 ADP + 12 Pi + 4 H+ Quá trình khử này gồm nhiều phản ứng khử kế tiếp nhau:

N2 + 2 H+ → [NH=NH] + 2 H+ → [NH=NH] + 2 H+ → 2 NH3

Ammonia tạo ra trong chu trình tiếp tục được đồng hóa tạo thành những acid amin cung cấp cho cây trồng (Nguyễn Lân Dũng et al., 2007)

Theo Dilworth (1966), enzyme nitrogenase cũng khử C2H2 (acetylene) thành

C2H4 (ethylene) và nhờ điều này các nhà nghiên cứu đã tìm ra phương pháp khử acetylene (ARA) dùng để xác định hoạt động enzyme nitrogenase rất hữu ích trong việc định lượng quá trình cố định đạm, từ đó có thể chọn lọc những dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm tốt

Ở một số sự cộng sinh như Klebsiella sp với cây lúa hay Azospirillum sp với

bắp, việc bổ sung nguồn carbon như sodium malate là rất cần thiết cho hoạt động của enzyme nitrogenase trong quá trình cố định đạm (Santi et al., 2013)

2.2.3.2 Khả năng hòa tan lân khó tan

Lân là một trong những dưỡng chất cần thiết cho sự tăng trưởng, phát triển của cây trồng và cũng là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến năng suất cây trồng Cây trồng chỉ có thể sử dụng được lân dưới dạng hòa tan trong đất Tuy nhiên, nồng độ lân hòa tan trong đất thường rất thấp, ở mức 1 ppm hoặc ít hơn (10M H2PO4

-) (Goldstein, 1994) Lân thường được bổ sung vào đất dưới dạng phân bón dạng hòa tan mà cây trồng dễ sử dụng nhưng lượng lân vô cơ hòa tan này nhanh chóng bị cố định và kết tủa thành dạng không hòa tan và trở nên không có giá trị đối với cây trồng (Rodríguez và Fraga, 1999) Bên cạnh đó, nhều loại đất như đất đỏ bazan, đất đen,… có hàm lượng lân trong đất khá cao nhưng cây lại không hút được để sử dụng do lân ở dạng khó tan Trong đất, lân cũng tồn tại dưới dạng vật chất hữu cơ Lân hữu cơ có thể chiếm đến 30-50% lân tổng số (Paul và Clark, 1988) Các hợp chất lân vô cơ được hình thành do quá trình phân giải lân hữu cơ (còn gọi là quá trình khoáng hóa lân hữu cơ), phần lớn

là các muối phosphat khó tan mà cây trồng không thể hấp thu (Trần Cẩm Vân, 2005) Một số vi khuẩn cộng sinh cố định đạm có khả năng hòa tan lân do chúng có thể tiết ra các acid hữa cơ hòa tan các hợp chất lân khó tan (Yahya and Al-Aseawi, 1989) Các acid hữu cơ này có trọng lượng phân tử thấp, chủ yếu là acid gluconic và acid 2-ketogluconic (Goldstein, 1995; Rodríguez và Fraga, 1999) Các acid hữu cơ khác như acid glycolic, acid oxalic, acid malonic và acid succinic cũng được nhận diện trong một số vi khuẩn có khả năng hòa tan lân (Banik and Dey, 1982; Illmer và Schinner, 1992)

Vi khuẩn tiết ra những acid hữu cơ có thể hòa tan lân khó tan do làm giảm pH, sự chelate hóa của các ion dương và cạnh tranh vị trí hấp thụ trong đất (Nahas, 1996) Theo Kucey et al (1989), sự làm giảm pH đất rất quan trọng trong cơ chế hòa tan lân dạng khó tan trong đất

Ngoài cơ chế acid hóa, theo Moghimi và Tate (1978), các vi khuẩn còn có thể hòa tan lân khó tan bằng sự tạo phức và các phản ứng trao đổi ion Trong đó, phức cation có thể là cơ chế quan trọng trong các trường hợp hòa tan lân khó tan khi có cấu trúc acid hữu cơ thích hợp để tạo ra phức

2.2.3.3 Khả năng tổng hợp indole-3-acetic acid (IAA)

Indole-3-acetic acid (IAA) là một loại auxin phytohormone tự nhiên mà nhiều loài vi khuẩn có khả năng tổng hợp được (Spaepen et al., 2007) IAA chi phối sự phân chia tế bào ở giai đoạn đầu phát tiển của cây trồng, sự giản dài tế bào, phân hóa sinh

mô và phát triển quả và hạt Ngoài ra, IAA kích thích đồng thời sự giãn dài trục lá mầm, ngăn cản sự sinh trưởng của rễ chính, kích thích sự khởi đầu của rễ bên và sự tạo thành lông rễ (Theologis và Ray, 1982; Gray et al., 2001) Theo Spaepen và Vanderleyden (2011) trên 80% vi khuẩn được phân lập từ vùng rễ có khả năng tổng hợp IAA Nhiều loài vi khuẩn cố định đạm sống tự do, vi khuẩn sống cộng sinh có cơ

chế tổng hợp IAA từ tiền chất chính là L-tryptophan như Azospirillum brasilense (Somers et al., 2005), Azotobacter (Ahmad etal., 2005) và Enterobacter cloacae

(Koga et al., 1991) Từ tiền chất là L-tryptophan, có ít nhất 5 lộ trình được mô tả cho

sự tổng hợp IAA, trong đó vi khuẩn tổng hợp IAA chủ yếu qua hai lộ trình là lộ trình indole-3-pyruvate (IPA) và indole-3-acetamide (IAM), các lộ trình khác như lộ trình tryptamine, lộ trình Tryptophan side-chain oxidase (TSO) và lộ trình indole-3-acetonitrile (IAN) (Spaepen và Vanderleyden, 2011)

Hình 2: Tổng quát các lộ trình sinh tổng hợp IAA ở vi khuẩn

(Spaepen et al., 2007)

Lộ trình indole-3-pyruvate (IPA) được tìm thấy ở nhiều loài vi khuẩn như

Azospirillum brasilense, Azospirillum lipoferum, Enterobacter cloacae, Pseudomonas putida và Pseudomonas agglomerans (Spaepen và Vanderleyden, 2011) Lộ trình này

bao gồm 3 bước: đầu tiên, tiền chất tryptophan được chuyển thành IPA nhờ enzyme tryptophan transaminase; sau đó, enzyme indole-3-pyruvate decarboxylase (IPDC)

(được mã hóa bởi gene ipdC) xúc tác sự khử nhóm carboxylở IPA thành

acetaldehyde (IAAld) và IAAld bị oxy hóa thành IAA bởi enyme acetaldehyde oxidase (Ryu et al., 2008)

indole-3-Lộ trình indole-3-acetamide (IAM) là lộ trình được tìm thấy ở vi khuẩn cộng sinh

cố định đạm của các loài thuộc chi Rhizobium và Bradyrhizobium Đầu tiên, enzyme tryptophan-2-monooxygenase (được mã hóa bởi gene iaaM) chuyển tryptophan thành

IAM, tiếp theo IAM được thủy phân thành IAA và ammonia bởi enzyme IAM

hydrolase (được mã hóa bởi gene iaaH) (Spaepen và Vanderleyden, 2011) Theo Glickmann et al (1998), Pseudomonas syringae cũng tổng hợp IAA theo lộ trình này

Lộ trình Tryptophan side-chain oxidase (TSO) chỉ được tìm thấy ở Pseudomonas fluorescens CHA0 Ở lộ trình này, tryptophan được chuyển hóa trực tiếp thành IAAld

qua IPA và IAAld bị oxy hóa thành IAA như ở lộ trình IPA (Oberhansli et al., 1991)

Tuy nhiên, một số loài trong Pseudomonas spp còn có cơ chế tổng hợp IAA

không sử dụng tiền chất tryptophan, trong đó indole-3-glycerol phosphate → IPA → IAAld → IAA (PRinsen et al., 1993)

2.3 Địa lý và điều kiện tự nhiên huyện Sơn Hòa, tỉnh Phú Yên

Sơn Hòa là một huyện miền núi nằm phía Tây tỉnh Phú Yên, có diện tích lớn, nằm trên Quốc lộ 25 nối các tỉnh Tây Nguyên với duyên hải Nam Trung Bộ, trung tâm huyện là thị trấn Củng Sơn với một cao nguyên nổi tiếng khí hậu ôn hòa mát mẻ là cao nguyên Vân Hòa - là một vùng đất đỏ bazan, nằm ở độ cao 400m trên địa bàn các xã Sơn Xuân, Sơn Long và Sơn Định Sơn Hòa có vị trí giáp huyện Đồng Xuân ở phía bắc, giáp huyện Sông Hinh và huyện Tây Hoà ở phía nam, giáp tỉnh Gia Lai ở phía tây

và giáp huyện Phú Hoà và Tuy An ở phía đông

Diện tích tự nhiên là 950,33 km2, trong đó diện tích đất sản xuất nông nghiệp là 20.361 ha (chiếm 21,43% diện tích tự nhiên) với sản lượng cây lương thực là 14.311 tấn/năm

(http://www.vietgle.vn/trithucviet/detail.aspx?key=huy%E1%BB%87n+S%C6%A1n+H%C3%B2a&type=A0, 2013)

Theo kết quả điều tra năm 1987 và kết quả bổ sung chuyển đổi tên đất sang hệ thống FAO năm 1991 của Viện quy hoạch thiết kế nông nghiệp, đất đai Phú Yên được hình thành trên mẫu đất phù sa với 3 loại đá chính là Granit, Bazan và trầm tích (đá phiến sét) Dựa vào hệ thống phân loại sinh học, Phú Yên có 8 loại đất chính, trong đó, huyện Sơn Hòa có các loại đất: đất xám tập trung ở phía đông của huyện, có độ dốc dưới 5º, tầng dày trên 70 cm và có khả năng phát triển nông nghiệp và cây công nghiệp; đất đen hình thành trên sản phẩm phong hóa của đá bọt và đá Bazan, có tầng mỏng, địa hình chia cắt và có nhiều đá lộ đầu; đất nâu vàng - đất nâu đỏ trên đá Bazan phân bố ở cao nguyên Vân Hòa thuộc huyện Sơn Hòa, có thành phần cơ giới nặng, sét

và kết cấu tơi xốp phu-yen-giai-doan-2001-2010-theo-cac-nguyen-tac-phat-trien-ben-vung-2298/, 2013) Huyện Sơn Hòa có khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm, có 2 mùa rõ rệt: mùa mưa từ tháng 9 đến tháng 12 và mùa nắng từ tháng 1 đến tháng 8 (http://vi.wikipedia.org/wiki/%C4%90%E1%BB%8Ba_l%C3%BD_Ph%C3%BA_Y%C3%AAn, 2013), nhiệt độ trung bình là 26ºC và lượng mưa trung bình là 1780 mm (Đài khí tượng thủy văn khu vực Nam Trung Bộ, 2012)

(http://doan.edu.vn/do-an/danh-gia-tinh-hinh-trien-nong-nghiep-Ở vụ lúa hè thu năm 2011, huyện Sơn Hòa với 637 ha diện tích đất trồng lúa đạt năng suất bình quân là 58 tạ/ha, cao hơn vụ hè thu năm 2010 là 2 tạ/ha (http://www.baophuyen.com.vn/Kinh-te-82/2205605905405805359, 2013) Năm

2012, diện tích lúa nước của huyện đạt 1.549 ha với năng suất bình quân 58,41 tạ/ha (http://www.baophuyen.com.vn/Kinh-te-82/4405305205205805406058, 2013)

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian nghiên cứu: từ tháng 01/2013 đến 11/2013

Địa điểm nghiên cứu: phòng thí nghiệm Vi sinh vật đất, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học, trường Đại học Cần Thơ

3.2 Phương tiện nghiên cứu

+ Hóa chất dùng để phân lập vi khuẩn nội sinh

Bảng 1: Thành phần môi trường RMR (Elbeltagy et al., 2001)

hoặc 1,8 g/l cho môi trường bán đặc

Chú ý: Dung dịch A và dung dịch B được khử trùng riêng Sau khi khử trùng,

chúng được trộn lại với nhau và bổ sung thêm 5 µg/l biotin; 1,25 ml dịch trích chồi lúa với ethanol và 1,25 ml dịch trích chồi lúa với nước cất được khử trùng qua màng lọc

+ Hóa chất dùng để kiểm tra khả năng cố định đạm của vi khuẩn

Bảng 2: Thành phần môi trường Burk không đạm (Park et al., 2005)

hoặc 1,8 g/l cho môi trườngbán đặc

Dung dịch EDTA (Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt

-C16H14N2O8Na2.2H2O): hòa tan 6 gram EDTA trong 100ml nước khử khoáng

- Dung dịch Phenol (C5H5OH)-Sodium nitroprusside dihydrate (Na2[Fe(CN)5NO].2H2O): hòa tan 7 gram phenol + 0,034 gram sodium nitroprusside trong 100ml nước khử khoáng

- Dung dịch Sodium hypochloride(NaOCl): hòa tan 1,48 gram NaOH + 4,98 gram Na2HPO4+ 20ml NaOCl (5% - 5,25%) trong nước khử khoáng cho đủ thể tích 100ml

- Dung dịch đạm chuẩn NH4+ 1 µg/ml

+ Hóa chất dùng để kiểm tra khả năng hòa tan lân khó tan của vi khuẩn

Bảng 3: Thành phần môi trường NBRIP lỏng (Nautiyal, 1999)

Hòa tan 1,056 gram acid ascorbic trong 200 ml dung dịch A

Chú ý: Dung dịch B chỉ sử dụng trong ngày, không được để quá 24 giờ

- Dung dịch lân chuẩn P_P2O510 µg/ml

+ Hóa chất dùng để kiểm tra khả năng tổng hợp Indole-3-Acetic Acid (IAA)

- Dung dịch IAA chuẩn 1 µg/ml

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phương pháp thu thập, xử lý mẫu và phân lập các dòng vi khuẩn

Cắt rời thân và rễ ra thành từng đoạn nhỏ 1-2 cm

Cho mẫu vào ống falcon và khử trùng bề mặt mẫu lần lượt bằng cồn 96% trong 3 phút và H2O2 3% trong 3 phút, sau đó, rửa lạivới nước cất vô trùng 4 lần để loại các hóa chất còn thừa

Để kiểm tra vi sinh vật còn sót lại trên bề mặt thân, rễ cây lúa sau khi khử trùng, lấy 200 µl nước cất vô trùng đã rửa mẫu ở lần cuối (lần 4) chủng trên các đĩa chứa môi trường Tryptone -Yeast extract - glucose agar và ủ ở 30ºC trong 24 giờ Nếu sau 24 giờ, các đĩa môi trường này không xuất hiện các khuẩn lạc thì các mẫu thân (rễ) đã khử trùng đạt yêu cầu

Mẫu thân và rễ sau khi đã khử trùng cho vào cối vô trùng với 1 ml nước cất vô trùng, giã nhuyễn và hút dịch trích mẫu cho vào tube 1,5 ml vô trùng, trộn đều bằng máy vortex

+ Chủng dịch trích mẫu thân (rễ) lúa vào môi trường RMR bán đặc

Hút 100 µl dịch trích mẫu lần lượt cho vào các ống nghiệm có chứa 5 ml môi trường RMR bán đặc đã khử trùng nhiệt ướt ở 121ºC trong 20 phút (mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần), sau đó ủ mẫu ở 30ºC trong 2-3 ngày

+ Cấy chuyển vi khuẩn từ môi trường RMR bán đặc sang môi trường RMR đặc

Sau 2-3 ngày, quan sát thấy các ống nghiệm chứa môi trường RMR bán đặc xuất hiện một lớp màng mỏng (vòng pellicle) cách bề mặt môi trường khoảng 0,5 -1

cm, đó là dấu hiệu chỉ thị có sự hiện diện của vi khuẩn nội sinh Sử dụng que cấy đã

hơ nóng dưới ngọn lửa đèn cồn và để nguội, chạm nhẹ vào các vòng pellicle lấy một ít

vi khuẩn cấy chuyển sang các đĩa môi trường RMR đặc đã khử trùng, ủ ở 30ºC Sau

1-2 ngày, chọn các khuẩn lạc nhỏ, rời nghi ngờ (khác nhau về hình dạng, màu sắc, kích thước) nằm trên đường cấy tiến hành cấy chuyển nhiều lần sang các đĩa môi trường RMR đặc đã khử trùng đến khi các khuẩn lạc rời ra Kiểm tra độ ròng của các dòng vi khuẩn phân lập dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần Cấy chuyển vi khuẩn đã ròng sang ống nghiệm chứa môi trường RMR đặc, trữ ở 4ºC và được xem như là một dòng vi khuẩn

3.3.2 Quan sát hình thái và đo kích thước khuẩn lạc

Trong khi cấy chuyển vi khuẩn trên môi trường phân lập đặc, tiến hành đo kích thước và quan sát hình thái các dạng khuẩn lạc bao gồm các chỉ tiêu: màu sắc, hình dạng, độ nổi và dạng bìa khuẩn lạc bằng mắt thường Đối với những khuẩn lạc có kích thước quá nhỏ thì có thể quan sát bằng kính lúp Các khuẩn lạc được đo kích thước bằng milimet (mm) (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002)

3.3.3 Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn

Sau khi phân lập và tách ròng vi khuẩn, tiến hành quan sát hình dạng và sự chuyển động của vi khuẩn bằng phương pháp giọt ép dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần theo Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp (2002)

+ Quan sát mẫu vật dưới kính hiển vi quang học: Nhỏ 15 µl nước cất vô trùng lên kính mang vật (lame), sau đó khử trùng kim cấy trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội, dùng kim cấy lấy một ít khuẩn lạc rồi trải đều lên giọt nước cất vô trùng trên kính mang vật, đậy kính đậy vật (lamelle) lên dịch huyền phù vi khuẩn bằng cách để một cạnh của kính đậy vật tiếp xúc với lame một góc 45º, rồi hạ lamelle xuống từ từ và nhẹ nhàng sao cho không tạo bọt khí trong mẫu vật Quan sát mẫu vật ở độ phóng đại 400 lần, ghi nhận hình dạng và sự chuyển động của vi khuẩn (nếu có)

+ Nhuộm Gram vi khuẩn: Nhỏ một giọt nước cất vô trùng lên lame, dùng que cấy

đã khử trùng lấy một ít vi khuẩn trải đều lên lame, sau đó hơ mẫu vật trên ngọn lửa đèn cồn để cố định vi khuẩn Nhỏ 1-2 giọt Crystal violet lên kính, trải đều rồi để khoảng 1-2 phút Rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô Nhỏ 1-2 giọt dung dịch Iod để 1 phút, rửa mẫu vật bằng nước cất vô trùng, sau đó

rửa lại bằng cồn 70º đến khi không còn màu tím nữa Nhỏ 1-2 giọt Fushin, trải đều để yên 1 phút và rửa lại bằng nước cất vô trùng đến khi mất màu của Fushin, dùng giấy thấm chấm nhẹ để khô nước Quan sát dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần và ghi nhận kết quả Nếu tế bào vi khuẩn có màu tím xanh, vi khuẩn Gram dương vì vách tế bào ăn màu Crystal violet nên

có màu tím xanh Nếu tế bào vi khuẩn có màu hồng đỏ, vi khuẩn Gram âm vì không còn màu của Crystal violet nên có màu hồng của Fushin

3.3.4 Xác địnhđặc tính những dòng vi khuẩn nội sinh

Trong phương pháp Indophenol, phenol và hypochlorite phản ứng trong môi trường kiềm hình thành phenylquinone-monoimine, sau đó phản ứng với ammonium tạo thành Indophenol có màu xanh Sự hiện diệncủa nitroprusside làm tăng hiệu quả của phản ứng lên khoảng 10 lần Phản ứng được minh họa qua phương trình sau:

NH4

+

+ Phenol Hypochloride ion (môi trường kiềm) Indophenol (có màu xanh)

+ Chuẩn bị mẫu

Chủng 1 ml dịch huyền phù vi khuẩn đã được nuôi trong môi trường RMR lỏng

và ủ trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút trong 2 ngày vào ống falcon có chứa 20 ml môi trường Burk không đạm lỏng, lắc trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút Mỗi nghiệm thức lập lại 3 lần

Lấy 1 ml mẫu được nuôi ở thời điểm 2, 4, 6 và 8 ngày để xác định hàm lượng đạm tổng hợp

+ Phương pháp đo đạm (NH 4 + )

Xây dựng đường chuẩn NH4

+: gồm 6 ống nghiệm được đánh số theo thứ tự 2-3-4-5 với ống 0 là ống đối chứng âm, lần lượt thêm các thành phần vào mỗi ống nghiệm như bảng 4 Khi đó, ta được đường chuẩn với hàm lượng các ống theo thứ tự tăng dần là 0, 1, 2, 3, 4, 5µg/ml NH4

0-1-+ (Cao Ngọc Điệp, 2011)

Bảng 4: Thành phần của dãy đường chuẩn NH4 +

2 ml nước khử khoáng 0,5 ml dịch mẫu 0,5 ml dung dịch EDTA

1 ml dung dịch Phenol - Sodium nitroprusside

2 ml dung dịch Sodium hypochloride Trộn đều và để ổn định khoảng 15-20 phút ở nhiệt độ phòng (Cao Ngọc Điệp, 2011)

Tiến hành đo hàm lượng NH4

0 và tiến hành đo giá trị OD của 5 ống còn lại của đường chuẩn Màu xanh đậm dần tương ứng với giá trị OD tăng dần

Sử dụng phần mềm Microsoft Excel để nhập số liệu và vẽ đồ thị xác định phương trình đường chuẩn NH4

+

Phương trình đường chuẩn có dạng: Y = a * X + b, trong đó X là nồng độ của mẫu (µg/ml), Y là độ hấp thụ quang (OD636nm)

Dựa vào phương trình đường chuẩn và giá trị OD636 nm của mẫu để tính hàm lượng đạm NH4+ tương đương lượng NH4+ có trong mẫu theo công thức: X = (Y– b)/a

3.3.4.2 Khảo sát khả năng hòa tan lân khó tan

bị khử thành Mo3+ hoặc Mo2+ làm cho dung dịch có màu xanh Cường độ màu xanh thay đổi theo hàm lượng lân có trong dịch huyền phù vi khuẩn, pH và điều kiện khử của môi trường Đo mẫu trên máy so màu ở bước sóng 880 nm

Trong môi trường acid vừa phải, nồng độ molypdate dư thừa, lượng chất khử cố định, nồng độ lân ở phạm vi nhất định thì mật độ quang học của màu xanh tỷ lệ thuận với hàm lượng lân theo đúng định luật Bir Lambeg

+ Chuẩn bị mẫu

Chủng 1ml dịch huyền phù vi khuẩn đã được nuôi trong môi trường RMR lỏng

và ủ trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút trong 2 ngày vào ống falcon có chứa 20 ml môi trường NBRIP lỏng có bổ sung apatit, lắc trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút Mỗi nghiệm thức lập lại 3 lần

Lấy 2 ml mẫu được nuôi ở thời điểm 5, 10, 15 và 20 ngày để xác định hàm lượng lân hòa tan

+ Phương pháp đo lân (P 2O5)

Xây dựng đường chuẩn P2O5: gồm 6 ống nghiệm được đánh số theo thứ tự 3-4-5 với ống 0 là ống đối chứng âm, lần lượt thêm các thành phần vào mỗi ống nghiệm như bảng 5 Khi đó, ta được đường chuẩn với hàm lượng các ống theo thứ tự tăng dần là 0, 10, 20, 30, 40, 50 µg/ml P_P2O5 (Cao Ngọc Điệp, 2011)

0-1-2-Bảng 5: Thành phần của dãy đường chuẩn P2 O 5

5 ml nước khử khoáng 0,5 ml dịch mẫu

4 ml dung dịch B

3 ml nước khử khoáng Trộn đều và để ổn định khoảng 15-20 phút ở nhiệt độ phòng (Cao Ngọc Điệp, 2011)

Tiến hành đo hàm lượng P_P2O5 bằng phương pháp so màu Oniani ở bước sóng

Dựa vào phương trình đường chuẩn và giá trị OD880nm của mẫu để tính hàm lượng lân tương đương lượng P_P2O5 có trong mẫu theo công thức: X = (Y– b)/a

Chú ý: Nếu hàm lượng lân trong mẫu sau khi ly tâm cao hơn so với đường chuẩn

lân sẽ tiến hành pha loãng mẫu (2, 5, 10, 20, 50 lần) để hàm lượng lân đo được có giá trị chính xác

3.3.4.3 Khảo sát khả năng tổng hợp indole-3-acetic acid (IAA)

+ Phương pháp đo IAA

Xây dựng đường chuẩn IAA: gồm 6 ống nghiệm được đánh số theo thứ tự 3-4-5 với ống 0 là ống đối chứng âm, lần lượt thêm các thành phần vào mỗi ống nghiệm như bảng 6 Khi đó, ta được đường chuẩn với hàm lượng các ống theo thứ tự tăng dần là 0, 10, 20, 30, 40, 50 µg/ml IAA

0-1-2-Bảng 6: Thành phần của dãy đường chuẩn IAA

Ống nghiệm

Trộn đều và để ổn định ở nhiệt độ phòng, trong tối khoảng 15-20 phút để phản ứng tạo màu xảy ra hoàn toàn

Mẫu: các tuýp eppendorf được lấy ra, sau đó đem ly tâm 12000 vòng/phút trong

5 phút Chuẩn bị 1 ống nghiệm cho mỗi mẫu và lần lượt cho vào các thành phần sau:

0,5 ml dịch mẫu

1 ml dung dịch thuốc thử Salkowsky Trộn đều và để ổn định khoảng 15-20 phút ở nhiệt độ phòng, trong tối (Cao Ngọc Điệp, 2011)

Tiến hành đo hàm lượng IAA bằng phương pháp so màu Salkowsky ở bước sóng

530 nm (OD530nm)

Chú ý: Thí nghiệm được thực hiện trong tối

Đo giá trị OD của 6 ống nghiệm đường chuẩn để xây dựng đường chuẩn, sau đó tiến hành đo giá trị OD của các mẫu thí nghiệm

Sử dụng phần mềm Microsoft Excel để nhập số liệu và vẽ đồ thị xác định phương trình đường chuẩn P_P2O5 Phương trình đường chuẩn có dạng: Y = a * X + b, trong đó X là nồng độ của mẫu (µg/ml), Y là độ hấp thụ quang (OD530nm)

Dựa vào phương trình đường chuẩn và giá trị OD530 nm của mẫu để tính hàm lượng IAA tương đương lượng IAA có trong mẫu theo công thức: X = (Y– b)/a

3.3.5 Phương pháp xử lý số liệu

Phần mềm Microsoft Excel được sử dụng để nhập, xử lí số liệu, phân tích ANOVA và so sánh các giá trị trung bình