tuyển chọn và định danh nấm men có khả năng sử dụng bã mía để lên men cồn

Khả năng lên men trong ống Durham với một số loại đường của các dòng nấm men .... Do đó đề tài “Tuyển chọn và định danh nấm men có khả năng sử dụng bã mía để lên men cồn” được tiến hành

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TUYỂN CHỌN VÀ ĐỊNH DANH NẤM MEN

CÓ KHẢ NĂNG SỬ DỤNG BÃ MÍA ĐỂ LÊN MEN CỒN

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: SINH VIÊN THỰC HIỆN:

Ths VÕ VĂN SONG TOÀN PHAN VĂN DƯ

PGs Ts TRẦN NHÂN DŨNG MSSV:3092392

LỚP:CNSH TT K35

Cần Thơ, Tháng 11/2013

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TUYỂN CHỌN VÀ ĐỊNH DANH NẤM MEN

CÓ KHẢ NĂNG SỬ DỤNG BÃ MÍA ĐỂ LÊN MEN CỒN

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: SINH VIÊN THỰC HIỆN:

Ths VÕ VĂN SONG TOÀN PHAN VĂN DƯ

PGs Ts TRẦN NHÂN DŨNG MSSV:3092392

LỚP:CNSH TT K35

Cần Thơ, Tháng 11/2013

PHẦN KÝ DUYỆT

PGs.Ts TRẦN NHÂN DŨNG

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

………

………

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

LỜI CẢM TẠ

Để hoàn thành đề tài luận văn tốt nghiệp này ngoài sự tự nỗ lực và cố gắng thì những quan tâm, giúp đỡ và chia sẻ từ thầy cô, bạn bè và gia đình là phần quan trọng không nhỏ

Rất biết ơn đến thầy Võ Văn Song Toàn-cán bộ hướng dẫn chính của đề tài, người đã luôn theo sát, tận tình chỉ bảo và hỗ trợ Và cám ơn thầy Trần Nhân Dũng đã cùng hướng dẫn cho đề tài này

Cám ơn đến ban lãnh đạo Viện nghiên cứu và phát triển Công nghệ Sinh học, các thầy cô giảng viên đã giảng dạy và tạo điều kiện thuận lợi cho sinh viên trong quá trình học tập và thực hiện luận văn

Cảm ơn các cán bộ quản lý, các anh chị, các bạn đã giúp đỡ trong suốt thời gian

ở phòng thí nghiệm Đặc biệt là các bạn phòng thí nghiệm Sinh Hóa và những người bạn cùng lớp

Cám ơn các cô chú công nhân viên của Viện đã giúp đỡ trong quá trình làm việc trong và ngoài giờ để đề tài hoàn thành đúng tiến độ qui định

Cảm ơn gia đình và người thân đã là chỗ dựa và nguồn động lực để phấn đấu Xin được biết ơn tất cả!

Cần Thơ, ngày 25 tháng 11 năm 2013

Phan Văn Dư

Từ khóa: bã mía, cồn, Candida inconspicua, exoglucanase, nấm men, phân giải, Pichia kudriavzevii, xơ thô

MỤC LỤC

Trang

PHẦN KÝ DUYỆT

LỜI CẢM TẠ

TÓM LƯỢC i

MỤC LỤC ii

DANH SÁCH BẢNG v

DANH SÁCH HÌNH vii

CÁC TỪ VIẾT TẮT viii

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 2

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về bã mía và các thành phần có trong bã mía 3

2.2 Nấm men và các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình lên men 4

2.2.1.Tổng quan về nấm men 4

2.3.3 Các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình lên men 5

2.3 Khái quát về quá trình lên men ethanol 5

2.4 Sơ lược về hệ enzyme phân hủy bã mía 6

2.4.1 Enzyme thủy phân cellulose 7

2.4.2 Enzyme thủy phân xylan 7

2.5 Sơ lược về một số phương pháp nghiên cứu 8

2.5.1 Các phương pháp phân tích xơ trong bã mía 8

2.5.2 Phương pháp xác định hàm lượng đường khử 8

2.5.3 Phương pháp định lượng hàm lượng ethanol bằng kalidicromate 9

2.6 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 9

2.6.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 9

2.6.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 9

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11

3.1 Phương tiện nghiên cứu 11

3.1.1 Thời gian và địa điểm nghiền cứu 11

3.1.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 11

3.1.3 Nguyên vật liệu 11

3.1.4 Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật 12

3.2 Phương pháp nghiên cứu 12

3.2.1 Phân lập nấm men có khả năng sử dụng bã mía 12

3.2.2 Kiểm tra hoạt tính endoglucanase và exoglucanase của các dòng nấm men 12

3.2.3 Khảo sát và tuyển chọn các dòng nấm men có khả năng lên men một số loại đường trong ống Durham 13

3.2.4 Khảo sát khả năng phối hợp lên men của các dòng nấm men đã tuyển chọn với các dòng vi khuẩn 13

3.2.5 Định danh nấm men bằng phương pháp giải trình tự vùng gene ITS rRNA 14

3.2.6 Xử lý số liệu 15

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 16

4.1 Phân lập các dòng nấm men có khả năng sử dụng bã mía 16

4.2 Hoạt tính endoglucanase và exoglucanase của các dòng nấm men 17

4.3 Khả năng lên men trong ống Durham với một số loại đường của các dòng nấm men 18

4.4 Khả năng phối hợp lên men với các dòng vi khuẩn của các dòng nấm men đã tuyển chọn với các dòng vi khuẩn 20

4.5 Kết quả định danh các dòng nấm men 25

4.5.1 Kết quả PCR 25

4.5.2 Kết quả giảt rình tự và định danh nấm men 25

CHƯƠNG 5 KẾT LUÂN VÀ ĐỀ NGHỊ 28

5.1 Kết luận 28

5.2 Đê nghị 28

TÀI LIỆU THAM KHẢO 29 PHỤ LỤC

PHỤ LỤC 1 Một số hình ảnh trong thí nghiệm

PHỤ LỤC 2 Các phương pháp thí nghiệm

PHỤ LỤC 3 Số liệu thí nghiệm

PHỤ LỤC 4 Phân tích thống kê

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1 Thành phần của các môi môi trường nuôi cấy vi sinh vật 12 Bảng 2 Bố trí thí nghiệm lên men 13 Bảng 3 Đặc điểm của các dòng nấm men 16 Bảng 4 Chiều cao cột khí (mm) sinh ra sau các khoảng thời gian lên men với các loại

đường của các dòng nấm men phân lập 19 Bảng 5 Thể tích khí (ml) sinh ra sau 7 ngày lên men của các dòng nấm men 200 Bảng 6 Đường kính phân giãi CMC và bã mía của các dòng nấm men PL3 Bảng 7 Chiều cao cột khí (mm) sinh ra sau các khoảng thời gian lên men (giờ) với

đường Glucose và Mannose của các dòng nấm men PL3 Bảng 8 Thể tích cột khí (ml) sinh ra sau 7 ngày lên men của các dòng nấm men PL3 Bảng 9 Các chỉ tiêu theo dõi sau khi lên men 7 ngày của các dòng nấm men PL3 Bảng 10 Phân tích phương sai ANOVA và kiểm định LSD 95% đường kính phân giải

CMC và bã mía của các dòng nấm men PL4 Bảng 11 Phân tích phương sai ANOVA và kiểm định LSD 95% chiều cao cột khí

(mm) sinh ra sau 60 giờ lên men đường Glucose của các dòng nấm men PL4 Bảng 12 Phân tích phương sai ANOVA và kiểm định LSD 95% chiều cao cột khí

(mm) sinh ra sau 60 giờ lên men đường Mannose của các dòng nấm men PL4 Bảng 13 Phân tích phương sai ANOVA và kiểm định LSD 95% của các chỉ tiêu theo

dõi sau khi lên men của các dòng nấm men tuyển chọn PL4

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1 Cấu trúc phân tử các thành phần chính trong xơ tế bào thực vật 4

Hình 2 Các dạng tế bào nấm men chụp dưới kính hiển vi quang học 4

Hình 3 Chuyển hóa của một số loại đường trong lộ trình đường phân 6

Hình 4 Phản ứng chuyền hóa pyruvate thành ethanol 6

Hình 5 Đường kính phân giải CMC và bã mía của nấm men 17

Hình 6 Giá trị pH và độ cồn sau 7 ngày lên men 21

Hình 7 Hàm lượng đường khử và ethanol sau 7 ngày lên men 22

Hình 8 Phần trăm DM và CF giảm sau 7 ngày lên men 24

Hình 9 Kết quả PCR bằng cặp mồi ITS1-4 4 dòng nấm men 25

Hình 10 Kết quả tra cứu dữ liệu trên NCBI với công cụ BLAST của dòng nấm men D7 26

Hình 11 Kết quả tra cứu dữ liệu trên NCBI với công cụ BLAST của dòng nấm men D9 26 Hình 12 Kết quả tra cứu dữ liệu trên NCBI với công cụ BLAST của dòng nấm men D11 27 Hình 13 Kết quả tra cứu dữ liệu trên NCBI với công cụ BLAST của dòng nấm men D12 27 Hình 14 Hình dạng khuẩn lạc của các dòng nấm men phân lập được PL1 Hình 15 Biểu đồ đường chuẩn Glucose PL2

CÁC TỪ VIẾT TẮT

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề

Để ổn định và đảm bảo đáp ứng nhu cầu sử dụng năng lượng ngày càng tăng cao của con người cũng như các ngành công nghiệp với sự suy giảm không thể tránh khỏi của nguồn cung cấp năng lượng trên toàn thế giới (Aristidou và Penttila, 2000), việc nghiên cứu tìm ra nguồn năng lượng mới có thể thay thế và sử dụng an toàn đang được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm Chủ yếu là phát triển nhiên liệu sinh học hay cồn sinh học từ sinh khối thực vật đặc biệc là phụ phẩm nông nghiệp Đây là hướng đi đầy triển vọng để thay thế nguồn nhiên liệu hiện nay đang dần cạn kiệt

Sử dụng nhiên liệu sinh học mang lại nhiều lợi ích như giảm thiểu ô nhiễm môi trường vì không chứa các hợp chất thơm, hàm lượng lưu huỳnh thấp, không chứa các hợp chất độc hại Hơn nữa, nhiên liệu sinh học khi thải vào đất có tốc độ phân hủy cao gấp bốn lần so với nhiên liệu dầu mỏ nên giảm ô nhiễm môi trường (Nguyễn Xuân Cự, 2010; Badger, 2002)

Bên cạnh các nguồn nguyên liệu đầu vào trong sản xuất cồn sinh học khác chứa tinh bột hay đường (như ngô, sắn, mía đường, …) nguyên liệu từ phụ phẩm (ví dụ như

bã mía) có chứa đáng kể hàm lượng cellulose và các loại lignocellulose khác được đánh giá co tiềm năng để lên men cồn Theo kết quả của tổng cục thống kê, sơ bộ năm 2012

cả nước có khoảng 297,9 nghìn ha mía với tổng sản lượng đạt khoảng 19.040 nghìn tấn Báo cáo thường niên từ hiệp hội ngành mía đường Việt Nam cho thấy các nhà máy đường ở Việt Nam có công suất tiêu thụ trung bình từ 1000-2000 tấn mía cây nguyên liệu trong ngày Bên cạnh đó một số nước ở có ngành công nghiệp mía đường phát triển

ở khu vực Đông Nam Á như Thái Lan hay trên thế giới như Brazil, Cuba, Ấn Độ, lượng mía tiêu thụ hằng năm rất đáng kể Hơn nữa với vị trí dẫn đầu về sản xuất cồn sinh học từ cây mía, Brazil cũng thải ra một lượng lớn bã mía Vì thế lượng bã mía thải ra hàng năm rất lớn tuy nhiên chỉ được tận dụng một phần để đốt lò hơi, làm phân bón hay làm ván ép trong xây dựng Do đó tồn tại nhiều nguy cơ gây ô nhiễm môi trường nếu sử dụng không triệt để Để tận dụng nguồn bã mía thải ra hằng năm và góp phần giảm thiểu tác động đến môi trường cũng như giải quyết vấn đề năng lượng, sử dụng bã mía như nguồn nguyên liệu đầu vào để sản xuất cồn sinh học là hướng đi mới đầy tiềm năng và triển vọng

Việc nghiên cứu sử dụng phụ phẩm nông nghiệp giàu lignocellulose như bã mía để sản suất cồn sinh học được thực hiện với hai quá trình cơ bản: 1) thủy phân lignocellulose thành đường; 2) lên men đường thành cồn Các nghiên cứu trước đây cho thấy vai trò chủ yếu của hóa chất như acid hay base trong sự đường hóa nguyện liệu lignocellulose và sự lên men chính yếu bới nấm men Việc xử lý với các hóa chất hiện không được xem là an toàn với môi trường tự nhiên và có nguy cơ tổn hại đến con người Sử dụng những biện pháp sinh học để thay thế mang tính bền vững và an toàn hơn không ngừng được chú trọng

Do đó đề tài “Tuyển chọn và định danh nấm men có khả năng sử dụng bã mía

để lên men cồn” được tiến hành nhằm khai thác các dòng nấm men có khả năng sử

dụng bã mía như nguồn dinh dưỡng trong quá trình lên men tạo ethanol đồng thời bước đầu đánh giá được khả năng lên men và quá trình chuyển hóa nguyên liệu bã mía thành cồn sinh học

1.2 Mục tiêu đề tài

Xác định được dòng nấm men có thể phối hợp với vi khuẩn phân giải xơ bã mía để lên men cồn sinh học

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về bã mía và các thành phần có trong bã mía

Bã mía chiếm 25-30 % lượng mía đem ép có trung bình 49 % là nước, 48 % là xơ (trong đó chứa 45-55 % cellulose), 2,5 % là chất hoà tan (đường) Bã mía có thể dùng làm nguyên liệu đốt lò, hoặc làm bột giấy, làm ván ép, sản xuất furfural (FAO) Các thành phần chính trong xơ bã mía bao gồm cellulose, hemicellulose và lignin

tế bào thực vật được cấu tạo từ các liên kết các mắt xích β-D-Glucose Cellulose liên kết chặt với hemicellulose, pectin và lignin tạo thành liên kết bền vững giúp cho các mô thực vật có độ bền cơ học và tính đàn hồi Liên kết 1-4 glucoside trong cellulose thường không bền trong các phản ứng phân giải bằng acid hay hệ enzyme cellulase

Sau cellulose, hemicellulose cũng là một polysaccharide thường gặp trong vách tế bào thực vật, bao gồm: xylan, glucuronoxylan, arabinoxylan, glucomannan và xyloglucan Phân tử hemicellulose nhỏ hơn cellulose nhiều, thông thường không quá

150 gốc đường được nối với nhau bằng liên kết β-1,4, liên kết β-1,3 và β-1,6 glucoside tạo ra mạch ngắn và phân nhánh Vì độ polyme thấp, phân nhánh và hỗn hợp nhiều đường nên hemicellulose không có cấu trúc chặt chẽ và độ bền hóa lý cũng thấp hơn Hemicellulose không tan trong nước, tan trong dung dịch kiềm và phân giải bằng acid

dễ hơn cellulose tạo thành một hỗn hợp gồm các hexose và pentose hay chỉ có hexose Lignin là một loại heteropolyme vô định hình của các loại rượu phenol, phân giải dưới tác dụng của kiềm, bisulfitnatri hay acid sulfuric mạnh Thực vật càng già thì lignin hóa càng cao Điều này làm cho thành tế bào thực vật trở nên cứng và bền vững Lignin đóng vai trò quan trọng trong việc vận chuyển chất dinh dưỡng cho cây bởi hệ thống mô xuyên qua vách tế bào, cũng như ngăn chặn việc xâm nhiễm của các vi sinh vật lạ vào tế bào Lignin và hemicellulose liên kết với nhau bởi cầu nối ester giữa arabinose của hemicellulose và nhóm hydroxyl của lignin (hình 1)

Hình 1 Cấu trúc phân tử các thành phần chính trong xơ tế bào thực vật

(*Nguồn: www.biofuel.webgradern.com ngày 13/09/2013)

2.2 Nấm men và các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình lên men

2.2.1.Tổng quan về nấm men

Hầu hết các loài nấm men ở trạng thái đơn bào và có hình dạng khác nhau Thường thì chúng có hình cầu, hình elip, hình bầu dục và cả hình dài Một số loài nấm

men như Endomycopsis, Candida có tế bào hình dài nối với nhau thành những sợi gọi là

khuẩn ty hay khuẩn ty giả Nấm men có chiều dài khoảng 9 - 10µm, chiều rộng khoảng 2-7µm Hình dạng và kích thước của nấm men không ổn định, phụ thuộc vào tuổi của nấm men và điều kiện nuôi cấy tế bào (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Hình 2 Các dạng tế bào nấm men chụp dưới kính hiển vi quang học

(*Nguồn Nguyễn Lân Dũng, 2003)

2.3.3 Các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình lên men

- Ảnh hưởng của nhiệt độ: Nhiệt độ đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh

trưởng của nấm men Nhiệt độ thông thường thích hợp cho nấm men lên men là

28-30oC Đối với dòng ưa nhiệt trung bình, thì nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển sinh khối là 35oC và nhiệt độ thích hợp cho sự lên men là 40oC Nhiệt độ khoảng hơn 50oC

và dưới 0oC thì sự lên men hầu như bị đình chỉ

- Ảnh hưởng của pH:Nồng độ ion H+ trong môi trường có ảnh hưởng lớn đến

hoạt động của nấm men Chúng có khả năng làm thay đổi điện tích các chất của vỏ tế bào, làm tăng hoặc giảm mức độ thẩm thấu các chất dinh dưỡng cũng như chiều hướng của quá trình lên men Trong điều kiện lên men rượu, pH tối ưu để tạo alcol etylic là 4,5 -5,0 Nếu tăng pH thì dễ bị nhiễm khuẩn, glycerin tạo nhiều hơn và do đó làm giảm hiệu suất lên men

kiện yếm khí, chúng lên men đường tạo thành rượu và CO2 Còn trong điều kiện đầy đủ oxy, chúng có khả năng oxy hóa đường thành CO2 và H2O, đồng thời sinh sản và phát triển mạnh Hàm lượng CO2 hình thành trong quá trình lên men thường hạn chế mạnh

sự sinh sản của nấm men

- Nồng độ rượu: Nồng độ ethanol cũng quan trọng trong quá trình lên men

Nồng độ rượu khi đạt đến 5% có thể ức chế khả năng sinh sản tế bào và khả năng sống sót của nấm men Khi độ rượu đạt 7 - 8% thể tích, sự trao đổi trong nấm men hầu như

bị ngừng trệ

- Nồng độ dịch lên men: Nồng độ dịch đường quá cao làm tăng áp suất và làm

mất cân bằng trạng thái sinh lý của nấm men Kết quả là rượu nhiều ức chế không những các tạp khuẩn mà cả nấm men Mặt khác, đường nhiều dẫn đến tổn thất hoặc phải kéo dài thời gian lên men Ngược lại, nếu nồng độ dịch đường thấp không kinh tế vì làm giảm năng suất thiết bị lên men, tốn hơi khi chưng cất và tăng tổn thất rượu trong bã rượu và nước thải

2.3 Khái quát về quá trình lên men ethanol

Lên men ethanol là quá trình tạo ethanol, CO2 và năng lượng từ carbonhydrtate trong điều kiện kỵ khí dưới tác dụng của hệ thống enzyme của một số vi sinh vật Đây

là quá trình oxi hóa khử cơ chất không có oxi tham gia mà có hiện tượng tách hidro ra

khỏi cơ chất Hidro tách ra được thải ra ở dạng khí hoặc có thể liên kết ngay với các sản phẩm phân giải của chính cơ chất đó Trong quá trình lên men, NADH sinh ra khi đường

dụng với acid pyruvic hoặc các hợp chất sinh ra từ axit pyruvic Các monosaccharide được chuyển thành pyruvate thông qua các phản ứng trong quá trình đường phân sau đó được chuyển thành ethanol bởi pyruvate decarboxylase và acohol dehydrogenase Các loại đường đơn khác glucose như galactose, mannose có sự chuyển hóa khác glucose với các enzyme khác khi vào chu trình đường phân (hình 3)

Hình 3 Chuyển hóa của một số loại đường trong lộ trình đường phân

(*Nguồn: Lehninger, nd)

Khác với hô hấp hiếu khí, sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men ngoài

aldehyde, Việc chuyển hóa từ giai đoạn axit pyruvic trở đi ở các vi sinh vật khác nhau là không giống nhau Người ta thường dùng tên của sản phẩm điển hình được tích lũy trong từng loại men để gọi quá trình lên men ấy

Hình 4 Phản ứng chuyền hóa pyruvate thành ethanol

(*Nguồn: Lehninger, nd)

2.4 Sơ lược về hệ enzyme phân hủy bã mía

2.4.1 Enzyme thủy phân cellulose

Liên kết chủ yếu trong cấu trúc của cellulose là β-(14) glucoside và để phá hủy cấu trúc của này cần có các enzyme cellulase với những tác động đặc trưng riêng biệt

Endoglucanase hoặc 1,4-β-D-glucan glucanohydrolase (EC 3.2.1.4)

Enzyme endoglucanase hoặc 1,4-β-D-glucan glucanohydrolase (còn là carboxyl methyl cellulase) thủy phân liên kết 1,4-β-D-glycoside trong phân tử cellulose bởi tác động ngẫu nhiên trong chuỗi polyme hình thành các đầu chuỗi khử tự do và các chuỗi oligosaccharide ngắn Các endoglucanase không thể thủy phân cellulose tinh thể hiệu quả nhưng nó phá vỡ các liên kết tại khu vực vô định hình tương đối dễ tiếp cận

Exoglucanase

Enzyme exoglucanase gồm cả 1,4-β-D-glucan glucanohydrolase (EC 3.2.1.74), giải phóng D-glucose từ β-glucan và cellodextrin và 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) giải phóng D-cellobiose Tỷ lệ thủy phân của enzyme cellobiohydrolase ngoại bào bị hạn chế bởi sự sẵn có các đầu chuỗi cellulose

Β-glucosidase hay β-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21)

β-glucosidase hay β-D-glucoside glucohydrolase giải phóng phân tử D-glucose

từ đường cellodextrin hòa tan và một loạt các glucoside khác

2.4.2 Enzyme thủy phân xylan

Do tính không đồng nhất của xylan, sự thủy phân của nó đòi hỏi các ảnh hưởng của một hệ thống enzyme phức tạp Enzyme này thường bao gồm hai loại: enzyme không phân nhánh (β-1,4-endoxylanse, β-xylosidase) và enzyme phân nhánh (α-arabinofuranosidase, α-glucuronidase, esterase xylan acetyl và esterase axit phenolic) Tất cả các enzyme này tác động tương hỗ để chuyển đổi xylan thành cấu tử đường của

nó

β-D- Xylosidase

β-D-xylosidase (β-D-xyloside xylohydrolase; EC 3.2.1.37) là enzyme thủy phân các xylooligosaccharide ngắn và xylobiose thành đường xylose Ái lực của enzyme đối với xylooligosaccharide giảm theo mức độ tăng của phản ứng polymer hóa Hầu hết các β-xylosidase đều bị ức chế bởi xylose Nhiều β-xylosidase có hoạt tính transferase, đặc biệt là

ở các nồng độ cơ chất cao, tạo ra sản phẩm phân tử lượng cao

α-L-Arabinofuranosidase

Arabinosidase đóng vai trò quan trọng trong quá trình thủy phân xylan Có hai loại enzyme arabinase, các enzyme α-L-arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55) phân cắt các p-nitrophenly-α-L-arabinofuranoside trên các arabinan phân nhánh, và các enzyme 1,5-α-L-arabinase (EC3.2.1.99), chỉ phân cắt arabinan dạng thẳng

α-Glucuronidase

α-D-Glucuronidase phân giải liên kết α-1,2 giữa axit glucuronic và gốc xylose trong phân tử glucuronoxylan Tính đặc hiệu của α-glucuronidase là khác nhau phụ thuộc vào nguồn gốc của enzyme

Esterase acetylxylan

Esterase acetylxylan là enzyme có thể cắt đứt giữa các nhóm acetyl với hai hoặc

ba vị trí của gốc xylose và góp phần đóng vai trò thủy phân xylan trong tự nhiên

2.5 Sơ lược về một số phương pháp nghiên cứu

2.5.1 Các phương pháp phân tích xơ trong bã mía

Vật chất khô (DM)

Dùng nhiệt làm bay hơi nước có trong nguyên liệu Cân trọng lượng nguyên liệu trước và sau khi sấy khô ở 70oC bằng cân phân tích Phần còn lại là vật chất khô của nguyên liệu (AOAC, 1993)

Xơ thô tổng số (CF)

Lượng xơ tổng số trong mẫu vật là khối lượng còn lại sau khi phân tích và sấy khô được xác định bằng cách đun nóng trong dung dịch acid (H2SO4 1,25%) và kiềm (NaOH 1,25%) để loại bỏ các thành phần khác xơ như glucid và protein

2.5.2 Phương pháp xác định hàm lượng đường khử

Hàm lượng đường khử được sác định bằng phương pháp Nelson-Semogyi (1944) Đây là một phương pháp đơn giản, được sử dụng phổ biến dựa trên phản ứng oxi hóa khử các gốc aldehyde tự do ở đầu không khử của phân tử đường trong môi trường kiềm Dung dịch Cu2+ trước tiên phản ứng với các gốc -CHO, tạo phức Cu+ , sau đó phản ứng với dung dịch thuốc thử arsenomolybdate tạo thành dung dịch có màu và hấp thụ ở bước sóng 520 nm Lượng đường khử được xác định thông qua giá trị hấp thụ OD dựa trên dãy nồng độ chuẩn của dung dịch đường đã biết (đường chuẩn Glucose)

2.5.3 Phương pháp định lượng hàm lượng ethanol bằng kalidicromate

Phương pháp này sử dụng phản ứng oxi hóa khử để xác định khối lượng ethanol

trong dung dịch lỏng Ethanol bị oxi hóa tạo ra acid của ethanol bởi dichromate trong môi trường acid

2Cr2O72- + 16H+ + 3C2H5OH  4Cr3+ + 11H2O + 3CH3COOH

Lượng dichromate chưa phản ứng sau đó dược xác định bằng cách cho phản ứng với dung dịch KI

Cr2O72- + 14 H+ +6I-  2Cr3+ + 3I2 + 7H2O Lượng iod tạo thành được chuẩn độ với dung dịch natri thiosulfate chuẩn và kết quả chuẩn độ được dùng để tính toán nồng độ ethanol trong dung dịch ban đầu

2S2O32- + I2  S4O62- + 2I-

2.6 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

2.6.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Nguyễn Xuân Cự (2010) sau khi nghiên cứu khả năng thủy phân thân cây ngô với acid sulfuric loãng ở 121oC trong 60 phút cho hàm lượng đường khử sinh ra cao (4,2 g/l) và khoảng 70% lượng đường khử trong dung dịch thành ethanol với nồng độ 2,7% theo thể tích Và sơ bộ để sản xuất 1 lýt ethanol cần 3,24 kg thân cây ngô

Nguyễn Xuân Bình (2010) đã nghiên cứu về quy trình sản xuất ethanol từ nguyên liệu giàu cellulose Sau khi tiền xử lý với 5% H2O2 trong 3 giờ ở nhiệt độ 40oC thu được 7,137% glucose Các điều kiện cho quá trình đường hóa là 7% cơ chất, 3% dịch enzyme cellulose, ủ 16 giờ ở pH = 5 và 55oC Sau khi lên men 2 ngày với 0,5% w/v nấm men, thu được 5% v/v ethanol Hiệu suất chung của quá trình đạt 60,63%

2.6.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Anuj (2007) đã nghiên cứu về việc thủy phân bã mía cải thiện sản xuất ethanol bới

Candida shehatae NCIM 3501 Kết quả sau khi thủy phân bã mía với 2.5% (v/v) HCl thu

được 30.29 g/l đường khử tổng số.Quá trình thủy phân với acid khi xử lý qua sắc ký trao đổi ion cắt giảm tối đa furan (63.4%) and hợp chất phenol tổng số (75.8%) Trong khi xử lý với than hoạt tính lượng furan và hợp chất phenol tổng số giảm lần lượt 38.7% và 57.5% Lên men dịch thủy phân lượng ethanol tối đa thu được là 0.48 g/g từ dịch thủy phân trao đổi ion, 0.42 g/g từ dịch thủy phân lọc với than hoạt tính, và thủy phân bình thường là 0.22 g/g

Nghiên cứu sản xuất ethanol từ bã mía thông qua enzyme được tạo thành bởi

phương pháp lên men rắn của Nasim (2011) của hai loại nấm sợi là Aspergillus niger và Trichoderma longibrachiatum Ethanol sau khi lên men thủy phân đồng thời bã mía đã

xử lý với dịch enzyme thô của T.longibrachiatum bởi Sacchaomyces cerevisiae so sánh

với enzyme thương mại là Cellulast 1,5L của Novozymes Hiệu suất sinh ethanol tương ứng là 50% và 81%

Reeta (2013) đã chỉ ra vai trò của β-glucosidases trong quá trình thủy phân cellulose để sản xuất ethanol Theo đó các enzyme β-glucosidases là nhóm enzyme thiết yếu trong hệ cellulase để hoàn tất quá trình thủy phân cellulose thành glucose từ cellobiose Quá trình này được điều hòa và ức chế bởi lượng glucose sinh ra do đó đây

là điểm hạn chế của việc chuyển hóa sinh khối bởi cellulase

Xiushan (2011) đã sử dụng Pichia stipitis được biến dổi để thích ứng với ethanol

và các điều kiện ức chế trong việc sản xuất ethanol từ thân cây bắp sau khi nổ hơi nước

và không loại chất độc nhằm cắt giảm lượng nước tiêu hao và thiết bị đầu tư trong khâu đơn giản hóa quy trình kỹ thuật Thân bắp sau khi nổ hơi nước được thủy phân trực tiếp với enzyme sau đó lên men Sau 48 giờ lên men trong bình lắc và bể lên men, nồng độ ethanol đạt 43,42 g/l, hiệu suất đạt 0,47 gp/gs, tương đương 92,16% hiệu suất theo lý thuyết

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Thời gian và địa điểm nghiền cứu

Địa điểm: được thực hiện tại phòng thí nghiệm Sinh Hóa, phòng thí nghiệm Công

nghệ Enzyme, phòng thí nghiệm CNSH Thực phẩm và phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử thuộc Viện NC&PT Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ

Thời gian: Từ tháng 07/2013 đến tháng 12/2013

3.1.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất

Thiết bị: Cân điện tử Satorius (Đức), kính hiển vi olympus CHT (Nhật), máy đo

OD, máy khuấy từ (Hoa Kỳ), nồi khử trùng nhiệt ướt Pbi-international (Ý), pH kế Orion 420A (Hoa Kỳ), tủ cấy vi sinh vật , tủ lạnh -4oC Akira (Việt Nam), tủ sấy EHRET (Đức), tủ ủ vi sinh vật Incucell 111 (Đức),…

Dụng cụ: Bộ micropipette (Bio-Rad) P10, P20, P200, P1000 (Mỹ), đĩa petri, đèn

cồn, ống nghiệm 15ml (Đức) và một số dụng cụ khác như: que cấy, que thủy tinh, cốc đựng dung dịch, chai lọ thủy tinh, bọc nylon, ống đong,…

Hóa chất: Agar, CaSO4, H2SO4, K2Cr2O7, KI, K2HPO4, KH2PO4, MgSO4.7H2O,

Na2S2O3, (NH4)2SO4, và các hóa chất khác

3.1.3 Nguyên vật liệu

- Bã mía: sau khi thu từ nhà máy đường Vị Thanh, tỉnh Hậu Giang được sấy ở

70oC trong 30 - 45 phút, sau đó nghiền thành bột bằng máy nghiền mẫu RetschMiihle với kích thước lỗ lưới là 0,2mm Bột bã mía sau khi nghiền được rửa với nước lọc nhiều lần để loại đường Lọc thu cặn bã mía, sấy khô ở 70oC Bảo quản nhiệt độ phòng cho các thí nghiệm sau

- Bột men thu ở 3 tỉnh (thành phố): Long An, Tiền Giang và Trà Vinh

- Các giống vi khuẩn Achromobacter xulosoxidans strain BL6, Bacillus subtilis strain S2O và Bacillus subtilis FS321 do phòng thí nghiệm Công nghệ enzyme, Bộ môn

Công nghệ Sinh học Phân tử, Viện NC & PT CNSH cung cấp

3.1.4 Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật

Bảng 1 Thành phần của các môi trường nuôi cấy vi sinh vật

1000 ml

0 g

10 g 0,2 g

(* Nguồn: M1 và M2:Ryckeboer et al., 2003 cải tiến bởi Bùi Thị Thiên Thanh, 2010; M3 và M4: Nguyễn Lân Dũng, 2003)

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Phân lập nấm men có khả năng sử dụng bã mía

Mục đích: phân lập và tuyển chọn được một số dòng nấm men có khả năng sử dụng

bã mía

Vật liệu thí ngiệm: Bột men từ 3 tỉnh thành: Long An, Tiền Giang, Trà Vinh

Tiến hành thí nghiệm:

+ Cho 1 gram bột men vào bình tam giác 50 ml môi trường khoáng PG lỏng (có

giờ, sau đó tiếp tục cấy chuyển đến khi đồng nhất hình dạng tế bào

Chỉ tiêu theo dõi: Đặc điểm khuẩn lạc và tế bào nấm men

3.2.2 Kiểm tra hoạt tính endoglucanase và exoglucanase của các dòng nấm men Mục đích: định tính hoạt tính endoglucanase và exoglucanase của nấm men

Vật liệu thí nghiệm: Các dòng nấm men đã được phân lập

Tiến hành thí nghiệm:

ủ với dung dịch Congo red (0,1% w/v) để khảo sát vòng phân giải bã mía

Chỉ tiêu theo dõi: đường kính vòng phân giải bã mía

3.2.3 Khảo sát và tuyển chọn các dòng nấm men có khả năng lên men một số

loại đường trong ống Durham

Vật liệu thí nghiệm: nấm men đã phân lập với các loại đường khác nhau

(D-Glucose, D-Galactose, D-Xylose, D-Mannose)

Mục đích: chọn được một số dòng nấm men có khả năng lên men tốt trong ống

Durham với các loại đường khác nhau

Bố trí thí ngiệm: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, một nhân tố với 3

lần lập lại Mẫu đối chứng không bổ sung nấm men

Tiến hành thí nghiệm: ở mỗi nghiệm thức bổ sung 10% (v/v) dịch tăng sinh nấm

men mật số 106 tế bào/ml vào các ống nghiệm có ống Durham với nồng độ đường là 2

% (w/v) Ủ ở 30oC từ 1-3 ngày

Chỉ tiêu theo dõi: chiều cao (mm) cột khí trong ống Durham khi lên men ở các

mốc thời gian 6, 12, 18, 36, 48, 60 giờ

3.2.4 Khảo sát khả năng phối hợp lên men của các dòng nấm men đã tuyển

chọn với các dòng vi khuẩn

Mục đích: chọn được một số dòng nấm men có khả năng lên men phối hợp với vi

khuẩn

Vật liệu thí nghiệm:

- Một số dòng nấm men cho kết quả lên men tốt từ thí nghiệm 2 và 3 được chọn để

khảo sát khả năng phối hợp với các dòng vi khuẩn trong quá trình lên men cồn

- Các dòng vi khuẩn BM13, BM21, BM49 (Võ Văn Song Toàn et al., 2013)

Bố trí thí ngiệm: thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với một nhân tố, 3 lần

* Ghi chú: -: không bổ sung; +: có bổ sung; + (121 o C): có bổ sung và đem khử trùng ở 121 o C,

20 phút sau 3 ngày nuôi

Tiến hành thí nghiệm:

Cách bố trí có vi khuẩn (3, 4, 5), 1 % (v/v) dịch vi khuẩn có mật số 107 tế bào/ml

được nuôi tăng sinh trong môi trường M2 trong 3 ngày ở 38oC

Bổ sung 5 % (v/v) dịch nấm men được nuôi tăng sinh trong môi trường M3 với

mật số 106 tế bào/ml vào các cách bố trí (2, 3, 5)

Phối trộn và ủ các nghiệm thức ở nhiệt độ phòng trong 5-7 ngày trong điều kiện kỵ

khí

Chỉ tiêu theo dõi

- Độ cồn và lượng ethanol sinh ra sau khi lên men

- Hàm lượng đường khử

- pH môi trường

- Tỉ lệ CF và DM của bã mía sau khi lên men

- Thể tích khí sinh ra sau khi lên men 1-7 ngày

3.2.5 Định danh nấm men bằng phương pháp giải trình tự vùng gene ITS

rRNA

Mục đích: xác định được tên phân loại của dòng nấm men phối hợp được với tổ

hợp vi khuẩn dạ cỏ lên men có kết quả tốt dựa vào mức độ tương đồng của trình tự vùng

gene ITS rRNA của các dòng nấm men thu nhận được so với dữ liệu trên ngân hàng

gene (Genbank)

Vật liệu thí nghiệm: Các dòng nấm men cho kết quả lên men cao từ thí nghiệm 4

được chọn để giải trình tự và định danh

Tiến hành thí nghiệm:

DNA của nấm men sau khi trích ly được khuếch đại bởi cặp mồi ITS1

(White et al., 1990) Sau đó được giải trình tự với đoạn mồi ITS1

(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)

c) Điện di agarose sản phẩm PCR

Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1% có bổ sung ethidium bromide

(EtBr) Tiến hành chụp gel bằng hệ thống Bio-Rad UV 2000 (Hoa Kỳ)

d) Giải trình tự vùng gene ITS rRNA

Sản phẩm PCR, sau khi được điện di để kiểm tra độ tinh sạch, được tiến hành giải trình tự bằng máy giải trình tự tự động DNA ABI3130 Sau đó sử dụng BLAST để so sánh trình tự đoạn gene của các dòng nấm men đã giải trình tự với trình tự đoạn gene của các dòng nấm men trên ngân hàng gene (GenBank)

3.2.6 Xử lý số liệu

Số liệu được xử lý bằng bảng tính Microsoft Excel 2007 và phân tích thống kê trên phần mềm Stagraphic XV Trình tự của vùng gene ITS rRNA được so sánh với cơ sở dữ liệu bằng BLAST trên NCBI

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Phân lập các dòng nấm men có khả năng sử dụng bã mía

Bảng 3 Đặc điểm của các dòng nấm men

Mô tả khuẩn lạc Mô tả tế bào

Hình dạng Màu sắc

Độ nổi

Dạng bìa

Kích thước (mm)

Hình dạng

Kích thước (μm) (VK 40x)

Vinh

không đều trắng đục phẳng sóng gợn 2-3

elip dẹt (dạng hình ống) 1x4

Vinh

không đều

trắng đục lài

gợn sóng 2-3 elip dẹt 1,5x2,5

Vinh tròn

trắng đục lài nguyên 2

elip dài dạng ống 1x4,5

Vinh tròn

trắng đục phẳng nguyên 2

elip dẹt, ngắn, kích thước nhỏ 1x1,5

trắng đục lài

gợn sóng 1-2

elip dài, hơi dẹt (hình giày)

sóng 3-4

elip dài, dẹt (dạng hình ống)

1x3,5

9 D9 Long An không đều

trắng đục phẳng

gợn sóng 1-2

oval, hơi tròn ở giữa 1,5x3

10 D10 Long An không đều

trắng ngà phẳng răng

cưa 2-3

tế bào hình elip dẹt, ngắn 1,2x2,5

11 D11 Long An tròn

trắng ngã vàng

lài nguyên 1-2

elip ngắn (giống hình trứng)

tròn nhỏ (hình trứng) 1x1,5

trắng đục lài

gợn sóng 3-4 elip dài 1x2,5

Kết quả sau khi phân lập và tách ròng các dòng nấm men từ bột men thu từ các tỉnh (Long An, Tiền Giang, Trà Vinh) thu nhận được 16 dòng nấm men với một số đặc điểm khác biệt về khuẩn lạc và tế bào Chủ yếu có khuẩn lạc không đều và tròn; tế bào hình elip và hình oval Kích thước tế bào trung bình dài 2-5 μm, rộng 1-2 μm Khuẩn lạc to, có kích thước từ 2-4 mm, một số khác nhỏ hơn, có kích thước 1-2 mm

Dựa trên các đặc điểm khuẩn lạc có thể chia làm hai nhóm nấm men có hình dạng tương tự nhau Một nhóm có khuẩn lạc tròn, màu trắng đục, bìa nguyên (D1, D2, D6, D9, D16) Nhóm khác có khuẩn lạc không đều, màu trắng đục, bìa gợn sóng (D3, D4, D5, D7, D12, D13, D14, D15) Thông tin được miêu tả trong bảng 3

4.2 Hoạt tính endoglucanase và exoglucanase của các dòng nấm men

Hình 5 Đường kính phân giải CMC và bã mía của nấm men

*Ghi chú: CMC: Carbohydroxyl methylcellulose; BM: Bã mía; các ký tự giống nhau khác biệt không ý nghĩa thống kê ở mức 5% CV CMC = 7,628 %, CV BM = 6,166%

Hầu hết các dòng nấm men khi kiểm tra hoạt tính endoglucanase và exoglucanase đều xuất hiện các vòng tròn thủy phân (hình 5) Trên cơ chất CMC, đường kính vòng thủy phân khá thấp, dao động từ 2-9 mm Các dòng nấm men D2, D3, D6, D8, D10, D14, D15, D16 đường kính phân giải CMC không cao (trung bình 2-3 mm) Trong khi một số dòng khác (D5, D7, D11, D12) có đường kính phân giải ở mức trung bình (4-6 mm) Dòng D4, D9 và D13 phân giải cơ chất nhiều hơn các dòng nấm men khác (8-9 mm) Điều này có thể cho thấy các dòng nấm men chưa thể hiện hoạt tính endoglucanase mạnh với điều kiện thí nghiệm hiện tại

Ngược lại với endoglucanase, hoạt tính của exoglucanase thể hiện khá rõ trên cơ chất là bã mía Tất cả các dòng nấm men đều có đường kính phân giải (đường kính trung bình 7-15 mm) chỉ trừ dòng D14 là không có kết quả Các dòng nấm men D1, D8, D16 phân giải cơ chất với đường kính khá thấp trên cơ chất bã mía tương đương với trên cơ chất CMC Điều này cho thấy các dòng này cả hai enzyme endo-và exoglucanase chưa được biểu hiện hoạt tính Nhóm các dòng men bao gồm D2, D6, D7, D13 có hoạt tính gần giống nhau và không khác biệt ý nghĩa (đường kính đạt trung bình

12 mm) Với đường kính trung bình là 13 mm nhóm các dòng men D9, D11, D12 có hoạt tính enzyme cao hơn hai nhóm trước Dòng D15 có khả năng phân giải bã mía tốt nhất trong thí nghiệm này Đường kính thủy phân của tất cả các dòng nấm men trung bình chưa được cao bởi vì trong bã mía các thành phần như hemicellulose và lignin chưa bị phá vỡ và loại bỏ nên enzyme exoglucanase của nấm men khó tấn công cắt đứt các phân tử ở đầu mạch một cách dễ dàng được

Exoglucanase không chỉ hiện diện ở các loài thực vật bậc cao, một số dòng vi khuẩn hay nấm mốc và nấm sợi mà còn hiện diện ở một số loài nấm men (Manjusha,

2012) Theo đó, 6 loại β-1,3-glucanase ở loài nấm men Saccharomyces cerevisiae đã được tinh sạch Nấm men Galatosmyces sp cũng đã được nghiên cứu và khảo sát về β-

glucansase

Qua thí nghiệm kiểm tra hoạt tính của hai enzyme trong hệ enzyme phân giải cellulose chứng tỏ ở các dòng nấm men phân lập được có hệ enzyme cellulase và có khả năng sử dụng và đồng hóa cellulose Trong đó dòng D7, D9, D11, D12, D13 có cả hoạt tính endo- và exoglucanase cao

4.3 Khả năng lên men trong ống Durham với một số loại đường của các dòng nấm men

Các dòng nấm men (sau khi được tăng sinh khối trong 24 giờ trong môi trường M3) tiếp tục được kiểm tra khả năng lên men trong một số dung dịch đường (glucose, galactose, mannose, xylose) với nồng độ 2% w/v trong ống Durham ở điều kiện nhiệt

độ phòng Khả năng lên men của các dòng nấm men được thể hiện qua chiều cao cột khí trong ống Durham và được đánh giá tại các thời điểm sau 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ và

60 giờ

Bảng 4 Chiều cao cột khí (mm) sinh ra sau các khoảng thời gian (giờ) lên men với các loại đường của các dòng nấm men phân lập

*Ghi chú: Chiều cao của ống Durham là 25 mm Giá trị trong bảng là trung bình của 3 lần lặp lại Các giá trị có

ký tự giống nhau khác biệt không ý nghĩa về mặt thống kê ở mức 95% CV glucose = 4,46%; CV mannose = 4,30%

Kết quả cho thấy, 16 dòng nấm men không đồng nhất về khả năng lên men trong dung dịch đường và chỉ thể hiện khả năng lên men trên đường glucose và mannose Hai loại đường galactose và xylose không có khí sinh ra Galactose là loại đường không thuận lợi sử dụng nhưng vẫn có thể sử dụng thay thế khi vắng mặt glucose trong môi trường Rất ít nấm men có thể lên men đường pentose như xylose tuy nhiên ở điểu kiện hiếu khí có nhiều loài nấm men sinh trưởng được với môi trường chứa pentose (Mario, 2007)

Từ bảng 4, chiều cao cột khí tăng dần theo thời gian do nấm men biến dưỡng đường

và tăng sinh khối Sau 24 giờ phần lớn nấm men chưa lên men nhiều nên lượng khí sinh ra vẫn còn khá thấp Một số dòng nấm men như D1, D3, D8, D11, D16 có dấu hiệu bắt đầu lên men (đường mannose có thêm dòng D6 và D12) trong khi các dòng men còn lại chưa sinh khí Các dòng nấm men tiếp tục phát triển và tăng chiều cao cột khí nhưng lượng khí tăng khá chậm Sau 48 giờ lượng khí vẫn còn thấp đối với đường glucose và tương đối cao hơn đối với đường mannose Chiều cao cột khí đạt trung bình 10-15 mm Đến mốc thời gian 60 giờ, một số dòng nấm men có khí đạt gần hết chiều cao của ống Durham (25mm)

là D3, D7, D8, D9, D10, D11, và D12đối với đường glucose; D1, D2, D3, D4, D7, D8, D9, D10, D11, D12, D14 và D16 đối với đường mannose

Phương pháp lên men với ống Durham đã đánh giá sơ bộ được khả năng lên men của các dòng nấm men phân lập, trong đó so với đường glucose, đường mannose có kết quả lên men tốt hơn Các dòng nấm men D3, D7, D8, D9, D10, D11, và D12 có khả năng lên men tốt ở cả hai loại đường

Dựa trên kết quả lên men trong ống Durham và hoạt tính của endoglucanase và exoglucanse chọn được bốn dòng nấm men ( D7, D9, D11, D12) cho thí nghiệm lên men phối hợp với vi khuẩn

4.4 Khả năng phối hợp lên men với các dòng vi khuẩn của các dòng nấm men

Các dòng nấm men sau khi tuyển chọn và nuôi sinh khối được tiếp tục kiểm tra khả năng lên men trên môi trường chứa 1% (w/v) bã mía trong chai đồng thời cũng đánh giá khả năng phối hợp với các dòng vi khuẩn dạ cỏ bò khi lên men

Các chỉ tiêu theo dõi được thể hiện bao gồm lượng khí sinh ra khi lên men sau 1 đến 7 ngày, pH sau lên men, độ cồn thu được, lượng đường khử còn lại, lượng ethanol sinh ra, lượng DM và CF giảm sau khi lên men

Bảng 5 Thể tích khí (ml) sinh ra trong 7 ngày lên men

Nghiệm thức Thể tích khí sinh ra sau các khoảng thời gian (ngày)

NT9: + NM (D11) + VK; NT10: + NM (D12) – VK; NT11: + NM (D12) + VK (121 o C); NT12: + NM (D12) + VK;

NT13:- NM – VK; NT14: -NM +VK; NM: nấm men; VK: Vi khuẩn + : có bổ sung; -: không bổ sung Giá trị trong bảng là

trung bình của 3 lần lặp lại Các giá trị có cùng ký tự khác biệt không ý nghĩa thống kê ở mức 5% CV = 7,42 %